CN104988163A - 斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因、重组表达载体、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因，命名为DrDes基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1。DrDes基因是根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源于斑马鱼的脂肪酸去饱和酶基因序列进行优化设计获得新的去饱和酶基因。由DrDes基因指导编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。本发明同时提供包含DrDes基因的重组表达载体及其构建方法。该重组表达载体的表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1或家蚕脂肪体组织特异性启动子Lp3。包含DrDes基因的重组表达载体可应用于获得高亚油酸或α-亚麻酸含量家蚕转基因品系。本发明还提供提高家蚕组织中亚油酸或α-亚麻酸含量的方法，是将斑马鱼脂肪酸去饱和酶DrDes基因导入家蚕胚胎中，经筛选，得到目标家蚕转基因系。
Description
技术领域
本发明涉及一种去饱和酶基因及编码蛋白，及其实现的提高家蚕亚油酸或α-亚麻酸含量方法。属于基因工程、转基因动物育种领域。
背景技术
在生物体内，许多代谢过程都在膜上进行或与膜有关，而不饱和脂肪酸是细胞膜磷脂的重要组成成分。由于脂肪酸的凝固点随其不饱和度升高而降低，因此膜脂中的不饱和脂肪酸含量越高，其相变温度越低，流动性越大。进而，细胞膜的各种功能，如细胞识别、转运作用和膜结合酶的活性等等都和细胞膜的流动性密切相关，因此不饱和脂肪酸在生物体内直接或间接的发挥着重要的功能，如抗癌抗肿瘤活性、免疫调节活性、促生长发育活性和降低胆固醇活性等。
家蚕是重要的经济昆虫。蚕蛹不仅是优质的饲料蛋白源，而且富含丰富的不饱和脂肪酸。家蚕组织内，脂肪酸占干重的约30％，其中不饱和脂肪酸约占70％，以α-亚麻酸为主。但是目前蚕蛹的加工利用方式主要是用于家畜饲料的蛋白源添加组分，其组织中脂肪酸成分利用非常有限。因此，提高蚕蛹不饱和脂肪酸含量尤其是主要的亚油酸和α亚麻酸含量对蚕蛹的进一步综合利用有着重要意义。近几年来，家蚕转基因技术的建立以及成熟使家蚕成为了新型的真核生物反应器，已有研究者通过将家蚕作为反应器成功的表达了多种高附加值产物，如人成纤维细胞生长因子、猫干扰素和人Ⅲ型前胶原蛋白等。然而用家蚕转基因技术在家蚕体内表达外源脂肪酸去饱和酶基因，进而通过外源脂肪酸去饱和酶基因的表达而改变脂肪酸含量的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的就是提供一种斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因、由该基因指导编码的蛋白，以及由该基因重组表达载体实现的提高家蚕亚油酸或α-亚麻酸含量方法。为实现上述目的，本发明技术方案分别如下：
本发明首先提供一种斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因。
一种斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因，命名为DrDes基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.1。
上述斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因DrDes是根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源于斑马鱼的脂肪酸去饱和酶基因序列(NCBI登陆号为：NP_571720.2)进行优化设计，优化后获得新的去饱和酶基因，命名为DrDes，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
由上述斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因DrDes指导编码的蛋白质，其技术方案如下：
一种由上述斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因DrDes指导编码的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
上述由DrDes基因指导编码的蛋白由444个氨基酸组成，具有由8个保守的组氨酸残基构成3个组氨酸富集区，另外其N端含有一个细胞色素b5结构域，使其酶活更高。
利用上述DrDes基因可以得到重组载体、表达盒、转基因细胞系统或重组菌株，其技术方案如下：
一种包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。
上述重组表达载体，其表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1或家蚕脂肪体组织特异性启动子Lp3。
进一步地，上述重组表达载体是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白DsRed作为表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后带有以IE1启动子启动优化后的DrDes基因；或者是以加强型绿色荧光蛋白EGFP作为表达盒，加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有以Lp3启动子启动优化后的DrDes基因。
本发明还提供构建上述包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体的方法。
构建包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体的方法，其特征在于：是将所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒IE1-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-DsRed]得到重组表达载体；或者，是将所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒Lp3-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-EGFP]得到重组表达载体。
上述重组表达载体在获得高亚油酸或α-亚麻酸含量家蚕转基因品系中的应用。
本发明还提供提高家蚕组织中亚油酸或α-亚麻酸含量的方法，其技术方案如下：
提高家蚕组织中亚油酸或α-亚麻酸含量的方法，其特征在于：将斑马鱼脂肪酸去饱和酶DrDes基因导入家蚕胚胎中，经筛选，得到目标家蚕转基因系。
进一步地，上述方法，是利用piggyBac重组表达载体将DrDes基因整合入家蚕基因组，piggyBac重组表达载体是将含有DrDes基因的表达盒插入到出发载体pBac[3×P3-DsRed]或pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到的载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)设计优化并人工合成了适用于家蚕体内表达的斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因(DrDes)。(2)根据家蚕基因组序列数据中内源编码序列密码子的偏好性，对斑马鱼去饱和酶基因(DrDes)序列进行了优化设计，使人工合成的DrDes基因更有利于在家蚕个体中表达。(3)提供了包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。(4)包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体可应用于获得高亚油酸或α-亚麻酸含量家蚕转基因品系。(5)利用piggyBac转座子结合BmNPV极早期启动子IE1或家蚕脂肪体组织特异性启动子Lp3驱动其表达，从而获得了可稳定在家蚕中表达斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因(DrDes)的家蚕转基因系，该品系蚕蛹期组织含有高含量亚油酸和α-亚麻酸。
附图说明
图1是重组载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]结构图。
图2是重组载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-SV40]结构图。
图3-1是IE1-DrDes家蚕转基因系各时期荧光鉴定图。
图3-2是Lp3-DrDes家蚕转基因系各时期荧光鉴定图。
图4是对照组蚕蛹脂肪酸甲酯气相色谱。
图5是IE1Dr转基因系蚕蛹气相色谱。
图6是Lp3Dr转基因系蚕蛹气相色谱。
图7是亚油酸和α-亚麻酸含量变化图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
实施例一
斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因DrDes制备。
来源基因：斑马鱼的脂肪酸去饱和酶基因序列(NCBI登陆号为：NP_571720.2)
根据家蚕基因组序列数据中编码基因表达序列密码子的偏好性，对来源基因进行优化设计，优化后得到斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因DrDes，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名为DrDes基因。
由DrDes基因指导编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例二
构建家蚕转基因重组载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]。
如图1所示，将DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒IE1-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-DsRed]得到重组表达载体。
具体实施操作：
步骤S1、制备载体pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]
将DrDes基因连接于pUC57载体质粒；通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒，回收得到DrDes基因片段(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，将回收片段与相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kitVer2.1使用说明进行连接，即将pGH序列替换为DrDes序列，得到载体pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]。
步骤S2、制备IE1启动子序列
PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增IE1启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，经T-A克隆到载体pMD19-T，获得质粒；将获得的pMD19-T载体质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切；回收IE1启动子序列(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)。
所需PCR反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。
PCR扩增上下游引物分别：
IE1-F(SEQ ID No.3)：5’CGgaattcTTGCAGTTCGGGACATAAATG3’
IE1-R(SEQ ID No.4)：5’CGggatccTAGATCCCTAGTCGTTTGGT3’
步骤S3、制备中间载体pSL1180[IE1-DrDes-SV40]
通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切步骤S1所制得载体pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]，将Ser1启动子切除，回收载体骨架(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，载体骨架与步骤S2获得的IE1启动子序列按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得中间载体pSL1180[IE1-DrDes-SV40]。
步骤S4、制备表达盒片段IE1-DrDes-SV40
通过AscⅠ单酶切pSL1180[IE1-DrDes-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段IE1-DrDes-SV40。
步骤S5、制备载体骨架
通过BglⅡ单酶切载体pBac[3×p3-DsRed](参见参考文件1)，按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收载体骨架并补平去磷酸化，得到载体骨架。
步骤S6、制备目标载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]
将步骤S4制得表达盒片段IE1-DrDes-SV40与步骤S5制得pBac[3×p3-DsRed]骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接获得目标载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]。
本实施例构建获得的转基因重组载体以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsRed)的表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，其后含有以IE1启动子启动优化后的斑马鱼脂肪酸去饱和酶(DrDes)基因的表达。
参考文件1：Tomita M,Munetsuna H,Sato T,et al.Transgenicsilkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons.NatBiotechnol,2003,21:52～56.
实施例三
构建家蚕转基因重组载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-SV40]。
如图2所示，将所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，或将完整的含有DrDes基因的表达盒Lp3-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-EGFP]得到重组表达载体。
具体实施操作：
步骤S1、制备载体pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]
同实施例二。
步骤S2、制备Lp3启动子序列
PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增Lp3启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，经T-A克隆到载体pMD19-T获得质粒，将获得的pMD19-T载体质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切；回收Lp3启动子序列(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)。。
所需PCR反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。
PCR扩增上下游引物分别：
Lp3-F(SEQ ID No.5)：5’CGgaattcACGAGACGGCCGACGTTTCAG3’
Lp3-R(SEQ ID No.6)：5’CGggatccTTGGAGCGTCGAGTCCTGC 3’
步骤S3、制备中间载体pSL1180[Lp3-DrDes-SV40]
通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切步骤S1所制得载体pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]，切除Ser1启动子回收载体骨架(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，与S2获得的Lp3启动子序列按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得中间载体pSL1180[Lp3-DrDes-SV40]。
步骤S4、制备表达盒片段Lp3-DrDes-SV40
通过AscⅠ单酶切pSL1180[Lp3-DrDes-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段Lp3-DrDes-SV40；
步骤S5、制备载体骨架
通过BglⅡ单酶切pBac[3×p3-EGFP](参见参考文件2)，按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行，回收载体骨架并补平去磷酸化，得到载体骨架；
步骤S6、制备目标载体pBac[3×p3-EGFP+LP3-DrDes-SV40]
将步骤S4制得表达盒片段Lp3-DrDes-SV40与步骤S5获得的pBac[3×p3-EGFP]骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接获得目标载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]。
本实施例构建获得的转基因重组载体以眼和神经特异的启动子3×P3启动的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒，加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，其后含有以Lp3启动子启动优化后的斑马鱼脂肪酸去饱和酶(DrDes)基因的表达。
参考文件2：Horn C,Wimmer E A.A versatile vector set for animaltransgenesis.Dev Genes Evol,2000,210:630～637.
实施例四
培育斑马鱼脂肪酸去饱和酶(DrDes)基因的家蚕转基因系。
用商业化多化性家蚕品系305作为原始材料，亲代蚕卵经正常桑叶饲养并化蛾交配产卵。
取10nL～15nL浓度为400ng/μL的实施例二所制得重组载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]和实施例三所制得重组载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]分别与辅助质粒pHA3PIG混合。将混合液分别注射至400粒家蚕品系305雌蛾产下2h～6h的蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化。孵化后pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]获得122头G0代蚁蚕，pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]获得67头G0代蚁蚕。
所得蚁蚕用桑叶饲养至蚕蛾，将获得蚕蛾回交或自交。pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]获得24蛾圈，pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]获得13蛾圈。
蛾圈G1代蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察，经筛选pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]获得3个眼睛发红色荧光的蛾圈，转化效率为12.5％；pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]，共获得1个眼睛发红色荧光的蛾圈，转化效率为7.8％。
图3-1是IE1-DrDes家蚕转基因系各时期荧光鉴定图，图3-2是Lp3-DrDes家蚕转基因系各时期荧光鉴定图。图3-1显示在体式荧光显微镜下，IE1-DrDes转基因系家蚕的胚胎期、幼虫期、蛹期和蛾期的眼睛部位均能观察到筛选标记红色荧光蛋白DsRed的表达，图3-2显示在在体式荧光显微镜下，Lp3-DrDes转基因系家蚕的胚胎期、幼虫期、蛹期和蛾期的眼睛部位均能观察到筛选标记加强型绿色荧光蛋白EGFP的表达。
将获得的阳性转基因家蚕饲养至上蔟采茧并进一步自交选纯，即获得能稳定遗传的在蚕蛹中表达斑马鱼脂肪酸去饱和酶(DrDes)基因的家蚕转基因系，分别是IE1-DrDes-SV40转基因家蚕系、Lp3-DrDes-Sv40转基因家蚕系。
测试例一
检测实施例四所得斑马鱼脂肪酸去饱和酶(DrDes)基因家蚕转基因系组织亚油酸和α-亚麻酸含量。
通过检测转基因蚕蛹的亚油酸和α-亚麻酸含量，结果图4～图7所示。结果显示，IE1-DrDes-SV40转基因家蚕蛹期3天的亚油酸含量和α-亚麻酸含量相比非转基因305家蚕品系分别增加了90.6％、90.5％；Lp3-DrDes-Sv40转基因家蚕蛹期3天的亚油酸含量和α-亚麻酸含量相比非转基因305家蚕品系分别增加了107.9％、106.5％。
上述结果显示，获得的IE1-DrDes-SV40转基因家蚕系和Lp3-DrDes-Sv40转基因家蚕系在蛹期3天的亚油酸含量和α-亚麻酸含量均有显著提高。
Claims (10)
1.斑马鱼脂肪酸去饱和酶基因，命名为DrDes基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.1。
2.由权利要求1所述的DrDes基因指导编码的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.包含核苷酸序列如SEQ ID No.1的重组表达载体或基因表达盒或转基因细胞系或重组菌株。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：表达框的启动子是BmNPV极早期启动子IE1或家蚕脂肪体组织特异性启动子Lp3。
5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：
是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白DsRed作为表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后带有以IE1启动子启动优化后的DrDes基因；或者，
是以加强型绿色荧光蛋白EGFP作为表达盒，加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有以Lp3启动子启动优化后的DrDes基因。
6.构建权利要求4所述的重组表达载体的方法，其特征在于：
是将权利要求1所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒IE1-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-DsRed]得到重组表达载体；或者，
是将权利要求1所述DrDes基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点得到中间载体，然后再将完整的含有DrDes基因的表达盒Lp3-DrDes-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-EGFP]得到重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：以如下方案之一实施：
方案一：
将DrDes基因连接于pUC57载体质粒；通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒，回收得到DrDes基因片段，将回收片段连接进相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体，得到pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体；
PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增IE1启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，经T-A克隆进同样酶切处理的pMD19-T载体获得质粒；通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切所获得质粒，回收IE1启动子序列；
通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体，回收载体骨架，并与IE1启动子序列连接获得中间载体pSL1180[IE1-DrDes-SV40]；
通过AscⅠ单酶切pSL1180[IE1-DrDes-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段IE1-DrDes-SV40；
通过BglⅡ单酶切载体pBac[3×p3-DsRed]，按试剂盒要求回收载体骨架并补平去磷酸化，得到pBac[3×p3-DsRed]载体骨架；
将表达盒片段IE1-DrDes-SV40与pBac[3×p3-DsRed]载体骨架连接获得最终载体pBac[3×p3-DsRed+IE1-DrDes-SV40]；
方案二：
将DrDes基因连接于pUC57载体质粒；通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切pUC57载体质粒，回收得到DrDes基因片段，将回收片段连接进相同酶切的pSL1180[Ser1-pGH-SV40]载体，得到pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体；
PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增Lp3启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，经T-A克隆进pMD19-T载体获得质粒；通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切所获得质粒，回收Lp3启动子序列；
通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切pSL1180[Ser1-DrDes-SV40]载体，回收载体骨架，与Lp3启动子序列连接获得中间载体pSL1180[Lp3-DrDes-SV40]；
通过AscⅠ单酶切pSL1180[Lp3-DrDes-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段Lp3-DrDes-SV40；
通过BglⅡ单酶切pBac[3×p3-EGFP]，按试剂盒要求回收载体骨架并补平去磷酸化，得到pBac[3×p3-EGFP]载体骨架；
将表达盒片段Lp3-DrDes-SV40与pBac[3×p3-EGFP]载体骨架连接获得最终载体pBac[3×p3-EGFP+Lp3-DrDes-Sv40]。
8.权利要求4所述的重组表达载体在获得高亚油酸或α-亚麻酸含量家蚕转基因品系中的应用。
9.提高家蚕组织中亚油酸或α-亚麻酸含量的方法，其特征在于：将权利要求1所述的DrDes基因导入家蚕胚胎中，经筛选，得到目标家蚕转基因系。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：利用piggyBac重组表达载体将所述DrDes基因整合入家蚕基因组，所述piggyBac重组表达载体是将含有所述DrDes基因的表达盒插入到出发载体pBac[3×P3-DsRed]或pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到的载体。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107043782A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-08-15 | 西南大学 | 一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104988163B (zh) | 2018-11-02 |
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