KR100323550B1 - 누에의형질전환방법과형질전환된누에 - Google Patents

Abstract

본 발명은 p 전이 인자를 이용하여 매우 높은 삽입율로 미세주사하여 되는 누에의 형질전환방법과 산업상 유용물질을 대량 생산할 수 있는 형질전환누에를 제공한다.

Description

누에의 형질전화 방법과 형질전환된 누에

본 발명은 미세주입법에 의한 누에의 형질전환에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 유전공학기법을 이용하여 진핵생물인 누에를 형질전환시키는 방법과 형질전환된 누에에 관한 것이다.

생물체의 형질이 DNA에 의하여 전환되는 현상이 1944년 박테리아에서 처음으로 관찰되었다. 그리고 1968년 이후 배양된동물세포에 외부 유전자를 도입시키는 DNA transfection기술이 개발되어 유전자 발현의 기작이나 다양한 세포활동에 관여하는 유전자들의 기능연구는 물론 백신, 항체 및 의약품의 생산 등에 매우 중요한 도구로 사용되고 있다. DNA transfection에 사용되는 도입 운반체(벡터)는 일시적 유전자 발현(transient gene expression)을 하기도 하고 안정한 유전자 발현(stable gene expression)을 하기도 한다. 일시적 유전자발현은 발현벡터가 세포 핵의 염색체밖에 존재하기 때문에 세포 분열 후 희석되어 없어지게 되거나 또는 발현 효율이 높지 않은 단점들이 있다. 반면, 안정한 형질전환 체계에서는 일부 발현벡터가 발현되지만 그 효율이 매우 낮은 것이 일반적이다. 그리고 이러한 DNA transfection방법은 외래유전자가 도입되는 세포가 영구적으로 생장 가능한 종양세포나 그 이외의 무한생장 세포계이어야 하며, 이들 세포는 정상적인 체세포의 성질과 같지 않은 단점이 있다.

세포상호작용에 의한 고등생물의 발생에 대한 유전적 조절을 연구하거나 조직 특히 유전자 발현을 결정하는 유전요소를결정하거나 배 발생 등의 연구에, 또는 도입된 유용 외래 유전자를 지속적으로 발현시키기 위해서는 형질전환 생물이 필요하다. 형질전환 동물(transgenic animal)을 생산하는 기술은 Gordon등에 의해개발되어진 기법으로 외래의 유전자를 인위적으로 수정란에 주사하여 형질을 전환시키는 기술이다. 1982년 super mouse가 탄생됨으로서 더욱 주목의 대상이 되었으며, 국내에서도 super mouse가 만들어졌다. 최근에는 동물이나 식물을 형질전환시켜내병성, 내충성 등의 신품종을 육종하려 시도하고 있고 이로부터 의약품이나 단백질, 약물의 생산 등에 이용하고자 활발한 연구가 진행중에 있다. 그러나이러한 형질전환 된 동,식물은 품종육성에는 성공하지 못하고 있는 실정이다. 누에의 형질전환체를 만드는 시도는 1990년초대에 일본의 잠사, 곤충 농업기술연구소의 Tamura를 중심으로 시도되었다. 이들은 누에의 알에 CAT유전자를 포함하는 plasmid를 미세주사방법으로 도입시켜 CAT유전자가 발현되는 것을 확인하였다, 그러나 주사한 CAT유전자는 시간이 지나면서 회석되며 결국 없어지게 말았다. 이 현상은 바로 CAT유전자가 누에의 제놈에 도입되지 못했기 때문이었다. 그러나 1950년 McClintock에 의해 전이인자가 발견되고 1970년대에 대장균에서 사람에 이르기까지 거의 모든 생물체가 전이인자를 갖고 있는 것이 발견되었다. 전이 인자는 retrovirus와 같이 생물체 제놈에 삽입(insertion)되기도 하고 이탈(excision)되기도 하여 숙주의 자손에 유전되는 성질을 갖고 있다. 1982년 Rubin등은 초파리의 인자를 분석하고 숙주 내에서 전이되는 성질을 이용하여 전이 벡터로 개발하여 초파리 알에서 미세주사하여 수많은 형질 전환체를 만들어 내었다. 이들은 P인자의 전이에 필요한 기작을 잘 연구하여 전이에는 31bp의 LTR과 전이 효소가 필요하다는 것을 알았다. 이와같은 전이벡터의 개발은 누에에서도 형질전환체를 만들 수 있는 가능성을 크게 시사하고 있다.

현재, 형질전환 동물을 생산하기 위하여 사용되는 벡터는 도입할 외부 유전자를 포함하는 DNA분절로서 구성되어 있으며, 제놈내에 무작위적인 삽입이나 또는 homologous recombination에 의해 도입시키고 있다. 그러나 이러한 방법은 그 효율이 매우 낮을 뿐만 아니라 그 통제가 불가능하다. 누에의 형질전환 기술은 현재 마커유전자를 plasmid에 삽입시킨 상태로 미세주사하기 때문에 발생초기에는 남아 있으나, 성장과 함께 희석되어 버린다. 이와같은 문제를 해결하기 위해서는누에의 전이인자 연구가 선행되어져야 하나 이 분야는 극히 초보적인 단계이다.

유전공학의 발달로 현재는 유전자 산물을 대장균과 같은 미생물에서 대량생산하고 있으나 앞으로는 인간이 원하는 특성을 지닌 생물체 자체를 만드는 방향으로 연구가 진행될 것이다. 그러나 진핵생물에서 이와같은 형질전환생물체를 만드는 시도는 하고 있으나 아직 초보적인 단계에 있으며, 오직 초파리에서만 p인자를 이용한 형질전환파리는 연구가 잘되어 잇다.이와 같은 초파리에서 성공할 수 있었던 이유는 첫째 곤충은 알이 크고 발생과정이 세포막이 없이 핵만 분열하는 표할을 하기 때문에 발생초기의 곤충 알에 외래유전자를 주사하면 핵에 도입될 가능성이 높다. 그리고 둘째로 전이인자인 p벡터를 이용함으로써, 제놈에 쉽게 전이되기 때문이다. 초파리의 경우 전이율은 수%에 이른다. 그러므로, 전이인자를 벡터로 이용하여 누에의 제놈 안에 외래유전자를 도입시키는 기술이 개발되면, 바이러스 저항성, 강건성, 다수확 품종 육성은물론이고, 인슐린과 같은 고부가가치의 의약품 등의 대향 생산방법으로도 활용 할 수도 있을 것으로 생각된다.

Gordon등에 의해 개발된 형질전환 동물 생산 기법은 1982년 수퍼 마우스가 탄생됨으로써 더욱 주목의 대상이 되었다. 그리고 최근에는 형질전환된 동물이나 식물을 생산하여 새로운 품종육성이나, 이로부터 의약품이나 단백질, 약물의 생산 등에 이용하고자 활발한 연구가 진행중에 있다.

현재 형질전환 동물을 생산하기 위해 활용되는 유전자 이식 방법에는 미세주사법, retroviral infection법, 그리고Embryonic stem(ES)세포를 이용하는 방법등이 있다. Retroviral infecion법은 감염조작이 용이하지만, retrovirus 는 2세포기 이후에만 수정란에 감염되고 숙주 DNA의 삽입이 일어나므로, 얻어지는 형질전환동물이 모자이크 형태이고, 삽입되는 DNA의 크기도 제한을 받는 등의 단점이 있어 아직 연구개발 단계에 있다. 또한, ES 세포를 이용한 방법은 Homologous recombination에 의한 gene targeting이 가능하므로 특정 유전자를 knock out시키는 실험에 활발히 이용되고 있으나, 현재까지 생쥐 이외의 포유동물에서 ES세포가 개발되어 있지 않고, selection marker를 사용해야 되는 점 등으로 활용에 한계가 있다.

그러나, 곤충은 알이 크고 발생 초기에 세포 분열을 하지 않고 핵분열만 일어나는 독특한 발생과정을 거치기 때문에 외래유전자를 도입시키는데 아주 유리하다. 미세주입법은 1세포기 수정란에 미세 주사침을 사용하여 DNA용액을 직접 미세 주입하는 방법으로 미세조작기를 이용하는 기술이 요구되지만, DNA의 삽입 효율이 좋고, 일단 염색체 상에 삽입된 외래유전자가 자손으로 형질이 유전되기 때문에 오늘날 가장 널리 이용되고 있다. 이러한 방법 등으로 외래 유전자를 도입시킬 때 사용되는 벡터는 플라스미드나 바이러스 유래의 벡터가 주로 사용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 제놈내에 삽입되는 효율이 매우 낮을 뿐만 아니라 유전적으로 안정되지 않는 문제점이 있다.

최근에는 전이성 인자를 이용한 벡터가 개발되고 있는데 노랑초파리의 p인자를 이용한 벡터가 가장 잘 연구되어져 있다. 이러한 전이성 인자를 벡터로 이용할 경우 제놈내에 도입되는 효율이 매우 높으며 도입 유전자가 유전적으로 안정하게 다음세대로 전달될 수 있다. 이렇게 안정하게 도입된 외래 유전자는 정상유전자와 같이 조직 특이적, 발생단계에서 특이적 발현을 나타내어 유전자의 발현조절 과정을 연구하거나, 농업적으로 유용한 산물을 지속적으로 생산할 수도 있다. 그러나, 초파리 이외에는 전이 인자를 이용하는 벡터개발이 전혀 되어 있지 않는 실정이다. 이와같이 전이성 인자를 이용한 벡터개발은 형질전환 동물을 생산하기 위한 가장 효율적인 방법으로 누에에서도 개발이 시급하다.

누에는 견섬유를 생산하는 유용한 산업곤충으로써, 우리 나라의 양잠업은 오랜 역사와 전통을 가지고 있다. 그리고 예로부터 우리 농가의 중요한 수입원으로서 1960년대에는 외화획득에 지대한 공헌을 하여왔으며, 세계적으로 국내의 잠업은 일본과 더불어 가장 앞서 있고 누에의 사육기술이나 품종의 보유, 관리가 잘 되어 있다. 그러나 최근에는 국내 인건비상승과 같은 국내 여건의 변화와 후개발도상 국의 값싼 인건비에 의한 값싼 고치의 수입에 의해 국내 잠업은 매우 어려운 실정이나 세계각국의 경제성장과 인구증가로 인하여 자연고급섬유의 선호경향을 보이고 있어 생사의 수요량을 반대로 증가될 것으로 추측된다. 그러므로 앞으로 국제 시상에서 국내 잠업이 우위를 차지하기 위해서는 중국과 같은 개발 도상국이 생산할 수 없는 고부가가치의 생사를 생산하는 전략이 시급하다. 국내의 우수한 잠사기술이나 최근에 연구되어지고있는 누에의 분자유전학적 기술을 바탕으로 고부가가치 생사를 생산할 수 있는 형질전환된 누에를 창출하는 기술을 확립하고, 그 품종을확보하는 것을 매우 중요하다. 이러한 기술이 확립되고 고부가가치의 고치 생산이 가능한 형질전환 누에가 창출된다면 국제 시장에서 우위를 선점할 수 있을 뿐만 아니라 이로 인한 수출의 증대 및 중요한 농가수입원으로써 농촌의 경제와 고용의 증대를 기대할 수 있어 농촌 경제에 크게 기여할 수 있다.

최근 국내의 경제성장과 세계각국의 경제성장으로 자연 고급섬유인 실크의 수요가 급증하고 있으며, 특히 수요의 다양성으로 제품 개발도 다양화하고 있다. 이와같은 변화는 생사의 생산에서도 예를 들면 태섬도, 세섬도와 같은 지금까지의 생사와 다른 것을 요구하고 있다. 그리고 누에 이외의 견사충인 천잠, 작잠의 실크를 이용한 고가의 제품이 개발되고 있다, 천잠사의 경우 누에의 실크보다 더 강하고 염색시에 독특한 문양이 생기는 특성으로 누에 생상의 약 20배의 가격으로 거래되고 있다. 이와같이 국내 잠업의 나아갈 길을 양산보다는 고부가가치의 신소재 개발이 중요하다고 생각되어 진다. 최근 유전공학의 발달로 형질전환 누에의 창출여건이 국내에도 갖추어졌으므로 친잠의 생사를 생산할 수 있는 누에의 품종이나 누에의 실크와 천잠의 실크가 혼합된 새로운 신소재인 hybrid silk를 생산하는 품종육성이 시급히 요구된다.

본 발명은 상기 문제점과 과제의 시급성을 해결하기 위하여 미세주사법에 의한 누에의 형질전환기술을 제공함을 그 목적으로 한다. 본 발명의 또 다른 목적은 p 전이벡터를 운반체로 하는 누에의 형질전환 방법을 제공함에 있다.

상기 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 p 전이인자를 이용하여고율의 삽입율로 형질전환된 누에를 작출하기 위한 미세주사법을 확립하고 누에의 알에 주사한 벡터가 누에의 제놈내에 전이여부를 PCR방법을 이용하여 확인하며 전이벡터에 포함된 lac Z reporter유전자의 활성을 X-Gal염색으로 조직특이적 발현여부를 관찰하며 이밖에 생식세포내에 전이여부를 확인하기 위하여 형질전환된 자손을 F3까지 얻고 성충(나방)의 신경절을 X-Gal염색으로 발현여부를 확인하였다.

도 1a는 미세주사하기 직전의 알의 모습을 보인 사진도이고,

도 1b는 미세주사후 주사된 부분을 파라핀으로 씌운 다음 알의 발생이 진행된 모습을 보인 사진도이며,

도 1c는 부화직후의 모습을 보인 사진도이다.

도 2a는 형질전환된 누에를 확인한 것으로 전이벡터의 reporter유전자인 lac Z의 발현을 확인하기 위하여 X-Gal로 염색한사진. 신경질에 특이적인 발현을 보인 성충의 해부사진도이고

도 2b는 전이벡터의 reporter유전자인 lac Z의 발현을 확인하기 위하여X-Gal로 염색한 사진으로 견사선에 염색된 것을 보인 사진도이며.

도 2c는 전이벡터의 reporter유전자인 lac Z의 발현을 확인하기 위하여 X-Gal로 발현한 사진으로 생식세포(정소와 난소)가 염색된 것을 보인 사진도이다.

도 3a는 미세주사하여 부화된 5령기 유충의 genomic DNA를 추출하여 전이벡터의 부위를 primer로 하여 PCR로서 전이를 확인한 전기영동사진도이다.

Lane M: Kb ladder DNA Size marker

Lane 1: 전이벡터 DNA plasmid

Lane 2-3: positive control

Lane 4-27: 부화된 개체분석

도 3b는 PCR산물을 확인하기 위하여 제한효소로 절단하여 확인한 전기영동사진도이다.

Lane M: Kb ladder DNA Size marker

Lane 1: PCR산물

Lane 2: PCR산물(SalⅠ)

Lane 3: PCR 산물/BamHI

Lane 4: PCR 산물/EcoRⅠ

Lane 5: PCR 산물/PstⅠ

도 4a는 F3세대 성충(나방)의 형질전환되지 않는 누에를 확인한 것으로 X-Gal로 염색하였으나 신경절에 특이적인 발현을보이지 않고 있는 사진도이다.

도 4b는 F3세대 성충(나방)의 형질전환된 누에를 확인한 것으로 전이벡터의 reporter유전자인 lac Z의 발현을 확인하기위하여 X-Gal로 염색한 사진으로 신경절에 특이적인 발현을 보인 성충의 해부사진도이다.

본 발명은 다음 공정으로 구성된다. 즉, 누에의 알에 외래유전자를 미세주사법으로 삽입하는 공정, 외래유전자의 전이여부를 확인하여 위하여 PCR을 수행하는 공정, X-Gal염색을 수행하여 조직 및 생식세포내에 전이여부를 확인하는 공정으로 이루어진다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 실시예에 기재한 사항에만 제한되지 않는다.

실시예 1 : 누에 알에 미세주사(Microinjection)

누에 스트레인(strain) 백옥잠 세포에 미세주사법을 사용하여 외래유전자를 삽입하기 위하여 미세한 유리관을 마이크로퓰러(micropuller)로 가늘게 뽑아 마이크로그라인더(microgrinder)로 유리관 끝을 주사기 바늘의 끝처럼 예리하게 연마하였다. 이같이 만든 마이크로인젝터(microinjector)로 미리 준비된 벡터(pUChsneo vector) lng/λ와 헬퍼(pπ 25.7wc)0.2ng/λ를 난할시기의 누에 알에 동시주입 (coingection)하였다.

주입부위를 파라핀(paraffin)으로 실링(sealing)하였다. 미세주사하기 전의누에 알의 모습은 도 1a에 미세주사후 주사부위를 파라핀으로 씌운 다음 알의 발생이 진행된 모습은 도 1b에 각각 나타내었다.

실시예 2 : 파라핀으로 실링하지 않은 누에알의 휴면처리

상기 실시예1의 방법으로 얻은 누에 알을 파라핀으로 실링하지 않고 25℃에 2일간 보관한 다음 4℃에 42일간 보관한 후 다시 18℃에 1일, 25℃ 10일 합계 2개월간 보관하여 개미누에를 얻었다. 미세주사한 4037개의 알을 잠종처리(인공부화법을 사용하지 않고 휴면에 들어가게 함)한 결과는 표 1과 같으며 정상적인 개체의 발생을 보인 것은 275개로 6.8%의 착색율을 나타냈다.

[표 1]

미세주사후 휴면 처리 결과

실시예 3 : 파라핀으로 실링한 누에알의 휴면처리

파라핀으로 실링한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 잠종처리한 결과는 표 2와 같다. 실험결과, 8595개의 미세주사된 누에 알중 정상적인 개체 발생을 보인 숫자는 2195개로서 26%의 착색율을 나타내어 파라핀으로 실링한 누에 알이 실링하지 않은 것에 비해 착색율이 높은 것으로 나타났다.

[표 2]

미세주사후 휴면 처리 결과

실시예 4 : 파라핀으로 실링하지 않은 누에 알의 침산처리

실시예 1의 방법으로 미세주사한 누에 알 5106개를 파라핀으로 실링하지 않고 부화를 촉진시키기 위하여 침산처리 하였다. 즉 포름알데히드로 소독하고 비중 1.110인 HCL용액에 15℃에서 50분간 침지한 후 30분간 세척한 다음 개체 발생을 확인한 결과는 표 3과 같다.

[표 3]

미세주사후 침산처리결과

실시예 5 : 파라핀으로 실링한 누에 알의 침산처리

파라핀으로 실링하는 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 침산처리한 결과는 표 4와 같다.

실험결과, 미세주사하고 침산처리한 6893개의 2%에 해당하는 누에 알 중 106개가 개체로 발생하였으며 알깨기(부화)까지된 것은 0.7%에 해당되는 50개나 되었다. 부화된 유충의 모습은 도 1c에 나타냈다.

[표 4]

미세주사후 침산처리결과

실시예 6 : X-Gal 염색

상기 실시예에 따라 전이벡터의 reporter유전자 lac Z(외래유전자)의 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 5에서 부화된 개체 23마리를 X-Gal로 염색하였다. 염색결과 100%의 누에 모두가 양성반응을 나타냈다. 그 중 신경절에 특이적 발현을 보인 성충의 해부사진은 도 2a에, 견사선에 특이적 발현을 보인 성충의 해부사진은 도 2b에 그리고 정소와 난소에 특이적 발현을 보인 성충의 해부사진은 도 2c에 각각 나타냈다. 실험결과 미사주사법에 의해 헬퍼(helper P)로 구성된 플라스미드와 pUChneo 벡터를 동시 주입하여 p 전이인자에 의해 외래유전자가 생식세포에도 전이되었음을 확인하였다,

실시예 7 : PCR 및 전기영동실험

미세주사하여 부화된 개체 중 5령기 유충의 제놈 DNA를 추출하여 전이 Vector부위를 primer로 하여 PCR을 수행하였다.전이를 확인하기 위하여 PCR산물을 전기영동한 실험결과는 도 3a와 같다. 사진도에서 확인되듯 전이 Vector와 동일 크기인 5.1kb밴드 7개를 얻었다.

또, PCR산물을 확인하기 위하여 제한 효소 Sal Ⅰ, Bam MⅠ, EcoR Ⅰ, PstⅠ으로 절단한 다음 전기영동을 수행한 실험결과는 도 3b와 같다.

실시예 8 : F3 세대의 성충에 대한 X-Gal염색

실시예1의 방법과 동일하게 미리 준비된 Vector와 Helper P를 난할 시기에 Coinjection하여 얻은 개체의 성충과 Wildtype의 백옥잠과 교배하여 ♂1, ♂3의 F1을 얻었다. 다시 F2성충을 얻어 실시예 5와 동일한 방법으로 X-Gal로 염색하여 암수 양성을 확인하였다.

그 다음 성충에서 얻어진 알 일부는 월년처리하고, 일부를 침산처리한 다음 F3을 얻은 후 실시예 5와 동일한 방법으로 X-Gal로 염색한 다음 월년처리 하였다. 실험결과 F3성충에 대한 신경절이 X-Gal에 의한 염색결과는 도 4b에 나타내었다.

형질전환된 누에(Transgenic silkworm)의 세대별 X-Gal염색결과 양성반응은 표 5에 나타냈다. 표 5에 나타낸 바와 같이 본 발명에 의한 형질전환 방법에 의하면, 외래유전자가 p 전이인자에 의해 누에의 생식세포 내로 삽입되어 4세대 까지도 그 형질이 유전이 된다.

[표 5]

pUChneo DNA를 미세주사한 형질전환 누에

이상 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 노랑초파리의 p 전이인자를 이용하여 외래유전자가 누에의 게놈 내에 고율로 삽입되어 3대 까지 유전이 되는 누에의 새로운 형질전환 방법을 제공하는 효과가 있으며 이와같은 방법으로 형질전환된 누에로부터 유용한 물질을 대량생산할 수 있는 효과가 있으므로 생명공학 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

1. 누에 알에 외래유전자를 포함하는 벡터와 노랑초파리의 p 전이인자를 운반체로 하는 것을 특징으로 하는 누에의 형질전환방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 외래유전자를 포함하는 벡터와 노랑초파리의 p 전이인자 운반체를 누에 알에 직접 미세주사하여 파라핀으로 실링한 후 침산처리하는 것을 특징으로 하는 누에의 형질전환 방법.