BR112018016472A2

BR112018016472A2 - Materiais compostos que compreendem a seda de aranha do tipo fio de segurança sintética.

Info

Publication number: BR112018016472A2
Application number: BR112018016472-0A
Authority: BR
Inventors: Stern Dganit; Dganit STERN; Sklan Ella; Ella Sklan; Shimel Meni; Meni SHIMEL; Ittah Shmulik; Shmulik ITTAH
Original assignee: Seevix Material Sciences Ltd.
Priority date: 2016-02-11
Filing date: 2017-02-12
Publication date: 2020-06-23
Also published as: EP3414373A1; AU2017218794A1; CN109477252A; EP3414373B1; CA3014537A1; JP2019510541A; US11345727B2; KR20180107236A; US20190040110A1; US20230042322A1; EP3414373A4; JP2023017893A; JP7176736B2; EP4375403A2; EP3414373C0; AU2017218794B2; WO2017138002A1

Abstract

MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA. Compostos baseados em um polímero e uma mistura de proteínas derivadas de uma proteína MaSp (espidroína ampolada principal) são fornecidos. Além disso, métodos para a preparação do mesmo e método de uso dos compostos são fornecidos.

Description

MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA

[001] Estepedido reivindica o benefício da prioridade do pedido de patente provisória americano nos. 62/293880, depositado em 11 de fevereiro de 2016, 62/317572, depositado em 03 de abril de 2016 e PCT aplicação de patente PCT/IL2016/050874 depositado em 10 de agosto de 2016. O conteúdo dos documentos acima é incorporado por referência na sua totalidade, como se totalmente estabelecidos aqui.

CAMPO DE APLICAÇÃO DA INVENÇÃO

[002] A invenção atual, em algumas formas de realização, é direcionada a materiais compostos baseados em proteínas derivadas de uma proteína do MaSp (espidroínaampolada principal), e a preparação do mesmo.

ESTADO DA TÉCNICA

[003] A seda da aranha do fio de segurança é conhecida na arte como a seda usada pelas aranhas tecelãs que tecem para construir aestrutura e os raios de suas teias também uma linha da vida quando caem ou o escapam do perigo. Para ser capaz de executar essas tarefas, a fibra de fio de segurança exibe uma dureza notavelmente elevada devido à combinação de alta elasticidade e força, que colocá-la como a fibra mais resistente, seja natural ou artificial. Por exemplo, o fio de segurança é seis vezes mais forte do que o aço de alta elasticidade em seu diâmetro e três vezes mais resistente do que o Kevlar que é uma das fibras sintéticas das mais fortes já feitas.

[004] A seda do fio de segurança consiste em dois polipeptídios principais, referidos principalmente como espidroínaampolada principal (MaSp) 1 e 2, e também para ADF- 3 e ADF-4 em Araneusdiadematus. Estas proteínas têm aparentes massas moleculares na faixa de 200-720 kDa, dependendo da idade da amostra e das condições de análise. [005] A conhecidaespidroínada seda de fio de segurança são compostas de blocos altamente iterados de alternância de segmentos alanina, formando β-folhas cristalinas na fibra, e os segmentos ricos em glicina que são mais flexíveis e, principalmente, falta de estrutura ordenada. A região C-terminal é não-repetitiva, altamente conservada entre as espécies, e adota a conformação α-helicoidal. A região N-terminal de proteínas de seda do fio de segurança foi encontrada igualmente altamente conservada entre o espidroína diferente, e também entre a espécie diferente da aranha.

[006] Inúmeras tentativas foram feitas para criar sinteticamente a seda da aranha, como através da engenharia genética usando bactérias, leveduras, plantas e células de mamíferos na cultura de tecidos e até mesmo caprinos transgênicos.

[007] A patente norte-americana n º 8.461.301 refere-se, inter alia, à sequência de aminoácidos isoladas, incluindo repetições múltiplas de um domínio da proteína de seda semi-sintético, ou qualquer homólogo funcional, variante, derivado, fragmento ou mutante. Esta publicação é incorporada aqui por referência na íntegra.

[008] As publicações adicionais relativas à seda de aranha do fio de segurança incluem Ittah, S., et al. biopolímeros, 93 (5), 458-468, 2010; Ittah, S., et al. Biomacromolecules, 8 (9), 2768-2773, 2007; Ittah, S., et al., Biomacromolecules, 7 (6), 1790-1795, 2006; e Huemmerich, D., Ittah, S., et al., biologiaatual, 14, 2070-2074, 2004. Estas publicações são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

[009] As várias aplicações foram propostas para a utilização de materiais compostos baseados na seda de aranha, incluindo para o revestimento de stents e implantes, têxteis, bem como aplicações de balística.

[010] Há uma necessidade não atendida de composições e métodos melhorados para a produção de fibras com propriedades mecânicas semelhantes à seda natural da aranha.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[011] A invenção atual é direcionada para, inter alia, materiais compostos baseados em proteínas derivadas de uma proteína do MaSp (espidroínaampolada principal), e a preparação do mesmo.

[012] De acordo com alguns aspectos, é fornecido um composto compreendido por uma mistura de proteínas e pelo menos um polímero, onde: a mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína na mistura compreende , independentemente, "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivada ou fragmento dele, onde m e n são, independentemente, um número inteiro entre 2 a 70.

[013] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é caracterizada por uma ou mais propriedades selecionadas do grupo consistindo: (a) a cada repetição tem um peso molecular na faixa de 2 kDa a 3,5 kDa; (b) a proporção de 'n para m' está na faixa de 2:1 a 1:2.

[014] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é na forma de uma fibra.

[015] Em algumas formas de realização, a fibra é anexada ao polímero através de um vinculador. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é anexada a pelo menos uma superfície do polímero.

[016] Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 2:1 a 1:2. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,8:1 a 1:1.8. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está no intervalo de 1,6:1 para 1:1.6. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,5:1 a 1:1,5. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,3:1 a 1:1.3. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,2:1 a 1:1.2. Em algumas formas de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1.1:1 a 1:1.1. Em algumas formas de realização, pelo menos um polímero é um polímero derivado de proteínas não-MaSp.

[017] Em algumas formas de realização, cada uma das proteínas compreende, independentemente, uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq. ID n º: 1 (X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10,em que X1 é, independentemente, em cada instância a ou G em que pelo menos 50% de (X1) z é a, z é um inteiro entre 5 a 30; X2 é S ou G; X3 é G ou E; X4 é G, S ou N; X5 é Q ou Y; X6 é G ou S; X7 é P ou R; X8 é Y ou Q; X9 é G ou S; e X10 é S ou G.

[018] Em algumas formas de realização, a região repetitiva compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido naSeq. ID n º: 3 (AAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS).

[019] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por pelo menos uma propriedade mecânica melhorada em comparação com a propriedade para o polímero livre da mistura de proteínas. Em algumas formas de realização, a propriedade é selecionada a partir do grupo composto por: módulo de Young, força elástica, tensão de fratura, ponto de rendimento, dureza, trabalho para a falha, impacto, força de rasgo, móduloflexural, tensão flexural e estresse no alongamento.

[020] Em algumas formas de realização, a pelo menos uma propriedade selecionada do módulo de Young, força elástica, ponto de rendimento, e estresse no alongamento, é reforçada em pelo menos 5%. Em algumas formas de realização, o módulo do jovem é reforçado em pelo menos 200%. Em algumas formas de realização, a resistência à tração é reforçada em pelo menos 40%. Em algumas formas de realização, o ponto de produção é reforçado em pelo menos 40%.

[021] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 10% da força estrutural resulta da mistura de proteínas.

[022] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força elástica, onde mais de 10% da força elástica resulta da mistura de proteínas.

[023] Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero sintético. Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero termoplástico. Em algumas formas de realização, o polímero é um termofixo. Em algumas formas de realização, o polímero é um epóxi. Em algumas formas de realização, o polímero é poliéster. Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado do grupo composto por Poliamidas, poliuretano, nylon e poliacrilato, policarbonato e silício. Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero cruzado. Em algumas formas de realização, o polímero é copolímero. Em algumas formas de realização, o polímero está na forma de um hidrogel.

[024] Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado a partir do grupo composto por polímeros de cristal líquido, anidrido masculino enxertado polipropileno, Poliamidas, nylon 4, 6, nylon 6, nylon 6, 6, nylon 11, nylon 12, poli(arilamida), polietileno, polibutileno tereftalato de etileno, tereftalato de polietileno, sulfeto de polifenileno, pollifitalamida, polipropileno, poli (fluoreto de vinilideno), poli (metacrilato de 2-hidroxietil) (pHEMA), poliuretano, polivinilbutiral, copolímero de álcool em vinil de etileno, ácido polilactida (PLA), policaprolactona (PCL), xantana, celulose, colágeno, elastina, queratina, algodão, borracha, celulose, lã e qualquer combinação ou mistura.

[025] Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado do grupo consistindo de materiais adesivos e coesos. Em algumas formas de realização, os materiais adesivos e coesos são selecionados a partir do grupo consistindo de epóxi, cianoacrilatos, poliésteres, polions, poliuretanos e poliamidas.

[026] Em algumas formas de realização, uma concentração total das proteínas varia de aproximadamente 0,1 peso por cento a aproximadamente 10 por cento do peso do peso total do composto. Em algumas formas de realização, a concentração varia de aproximadamente 0,5 peso por cento a aproximadamente 3 por cento do peso.

[027] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas e o polímero são substancialmente em um contato contíguo.

[028] Em algumas formas de realização, o composto divulgado tem uma camada de pelo menos 0,5 mícron de espessura.

[029] De acordo com alguns aspectos, é fornecida uma fibra composta por uma mistura de proteínas, onde a mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes peso molecular, em que cada proteína na mistura compreende, independentemente, "n " repete-se uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivada ou fragmento, onde m e n são, independentemente, um inteiro entre 2 a 70, e onde a fibra é anexada a pelo menos um vinculador.

[030] Em uma forma de realização, “m " tipos de proteínas ou uma mistura de proteínas estão na forma de uma fibra, como descrito aqui. Em uma forma de realização, “m " tipos de proteínas ou uma mistura de proteínas são ligadas intermolecularmente. Em uma forma de realização, “m " tipos de proteínas ou uma mistura de proteínas são intermolecularmente vinculados na forma de uma fibra, como descrito aqui. Em uma forma de realização, vinculados intermolecularmente é vinculado não-covalente. Em uma forma de realização, intermolecularmente vinculado é através de Van-der-Waals Bond, ligação iônica, vínculo eletrostático, ligação de hidrogênio, ou qualquer combinação deles. Em uma forma de realização “mistura de proteínas" compreende ou consiste em "m " tipos de proteínas e/ou uma fibra. Em uma forma de realização “m " tipos de proteínas é “m " tipos de peptídeos ou m “tipos de polipeptídios ou m " tipos de uma mistura de polipeptídios e peptídeos.

[031] Em algumas formas de realização, uma pluralidade da fibra é anexada a um outro através do vinculador.

[032] De acordo com alguns aspectos, é fornecido um artigo que compreende o composto divulgado. Em algumas formas de realização, o artigo é estável em uma condição fisiológica. Em algumas formas de realização, o artigo é um dispositivo médico. [033] Em algumas formas de realização, o dispositivo médico é um dispositivo médico implantável. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é selecionado de um enxerto vascular artificial, um diafragma artificial da bomba do coração, um andaime de tecido, um implante ortopédico, um cateter e um stent.

[034] Em algumas formas de realização, o artigo é selecionado a partir do grupo composto por: uma pílula, um comprimido, uma cápsula, e um gel-Cap. Em algumas formas de realização, o artigo compreende um tecido.

[035] Em algumas formas de realização, o artigo é caracterizado por uma ou mais propriedades selecionadas de isolamento térmico, condutividade térmica, isolamento elétrico, condutividade óptica e refração.

[036] De acordo com alguns aspectos, há um processo de fabricação de uma mistura de proteínas e pelo menos um polímero, onde: a mistura de proteínas compreende "m" tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína na mistura compreende, independentemente, "n " repetições de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivada ou fragmento dele, onde m e n são, independentemente, um inteiro entre 2 a 70, o processo que compreende a etapa de fixar a mistura de proteínas ao polímero para formar o composto.

[037] Em algumas formas de realização, o processo compreende uma etapa de derreter o polímero para produzir um polímero derretido e transformar a mistura de proteínas no polímero derretido.

[038] Em algumas formas de realização, o processo compreende uma etapa de dissolver o polímero para produzir um polímero dissolvido e transformar a mistura de proteínas no polímero derretido.

[039] Em algumas formas de realização, o processo compreende uma etapa de extrusão do polímero.

[040] Em algumas formas de realização, o processo compreende a formação de uma ou mais camadas de proteínas por eletrofiação contínua.

[041] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente compreendido por uma das habilidades ordinárias na arte a que pertence a invenção. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste de incorporações da invenção, métodos exemplares e/ou materiais são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo as definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[042] Algumas formas de realização da invenção estão aqui descritas, apenas por exemplo, com referência aos desenhos que o acompanham. Com referência específica agora para os desenhos em detalhe, salienta-se que os detalhes mostrados são, por exemplo, e para fins de discussão ilustrativa das formas de realização da invenção. A este respeito, a descrição tomada com os desenhos faz aparente aos hábeis na arte como as formas de realização da invenção podem ser praticadas.

[043] A Figura 1 apresenta gráficos de barras mostrando a resistência à tração (painel esquerdo), módulo de Young (painel médio), e tensão na ruptura (painel direito) de epóxi – EP-520, tendo diferentes (0%, 1%, 2%) de concentração (WT.) de enriquecimento com as proteínas divulgadas.

[044] A Figura 2 apresenta imagens do microscópio eletrônico de varredura (sem) mostrando aderência das fibras de proteína divulgadas para EP-520 (com 2% de enriquecimento). A aderência das fibras parece criar cavidades no polímero (painel esquerdo), enquanto em alguns casos uma melhor aderência sem cavidades ao redor das fibras foi observada (painel direito, mostrando fibras aderentes com 3,165 µm de comprimento e diâmetro de cerca de 215 nm).

[045] A Figura 3 apresenta gráficos de barras mostrando a resistência à tração (painel esquerdo), módulo de Young (painel médio), e tensão na ruptura (painel direito) da cola Epoxy-EP-502, tendo concentrações de 1% (WT.) do enriquecimento da proteína que compara aos controles (nenhum enriquecimento ou carbono enriquecimento nanotubo (CNT).

[046] As figuras 4a-E apresenta resultados de testes de tração, incluindo o módulo Young (figura 4a), stress a 30% de alongamento (figura 4b) e resistência a 30% de alongamento (figura 4C), stress a 100% de alongamento (figura 4D) e resistência a 100% de alongamento para termofixo PU ( Figura 4E). Todos executados em películas de controle e enriquecidos SS, conforme indicado na inserção de cada gráfico (da esquerda para a direita). Os resultados são apresentados como média ± SD (n = 5 tiras diferentes do mesmo filme, para cada condição).

[047] As figuras 5A-B apresentam gráficos que mostram a força de rasgo (Figura 5a) e as curvas (Figura 5b) de lotes enriquecidos de PU termofixo com percentagens de carga diferentes (controle 3% e 5% da curva inferior à superior, respectivamente).

[048] A figura 6A-C apresenta gráficos de barras que mostram: o módulo do jovem (figura 6A), o ensaio lacrimal (figura 6B) e a força de rasgo (figura 6C) do polímero Tecoflex ® SG-93A, tendo diferentes (0%, 1%, 3%) concentrações (WT.) de enriquecimento com as proteínas divulgadas.

[049] A Figura 7 apresenta gráficos de barras mostrando o módulo do jovem (painel esquerdo), e força elástica (painel direito), de u-2047, sendo enriquecido 1% a 3% com as proteínas divulgadas, vis-à-vis um controle de u-2047 liso (nenhum enriquecimento da proteína).

[050] A Figura 8 apresenta gráficos de barras mostrando a estirpe em fratura (painel esquerdo) e trabalho para falha (painel direito) de U-2047, sendo enriquecido 1% a 3% com as proteínas divulgadas, vis-à-vis um controle da planície U-2047 (nenhum enriquecimento da proteína).

[051] AsFiguras 9a-F apresentam gráficos que mostram as medições de manchas de tensão (Figura 9A, painéis direito e esquerdo, respectivamente) de nylon 12 com fibras de 140 e 250 µm (2% de enriquecimento; Figuras 9a-B referem-se a nylon 12 fios após extrusão). A Figura 9-a apresenta representação sem imagens de fibras proteicas em nylon 12 a 2% de enriquecimento. Figuras 9-c (Figura 9), ponto de rendimento (figura 9D) e curvas de tensão de 2% de enriquecimento (gráfico superior) (figura 9E) de ossos de cão de nylon moldado por injeção 12. A figura 9F mostra a melhoria do gráfico da esforço-tensão (curva superior na tensão = 1) para a amostra de ácido poliláctico enriquecido de 2% SS (PLA).

[052] A Figura 10 apresenta imagens eletrofiadas de 11% (w/w) de poliuretano termoplástico (TPU) como lotes de controle (bar: painel esquerdo, 200 µm; painel direito, 100 µm).

[053] A Figura 11 apresenta imagens de fibras eletrofiadas ~ 10,5% (w/w) TPU + ~ 2% (w/w) enchimentos (SS) (bar: no painel esquerdo-200 µm; no painel direito-100 µm).

[054] A Figura 12 apresenta gráficos mostrando o comportamento reológicas dos lotes de controle em 9, 11 e 13% w/w de conteúdo sólido de TPU (SG-60).

[055] As figuras 13a-B apresentam gráficos de comportamento reológicas mostrando que ao aumentar as quantidades de enchimento adicionados ao SG-60, a viscosidade aumenta ainda o comportamento reológicas permanece não afetado.

[056] A Figura 14 apresenta gráficos de barras mostrando as medições do módulo do jovem de malhas eletrofiadas feitas de 9% w/w SG60 (esquerda) e 11% w/w SG60 (direita) com a fibra divulgada, e com enchimento (0,1%, 2%, ou 3%).

[057] A Figura 15 apresenta curva de tensão por tensão para as configurações de 9% w/w.

[058] A Figura 16 apresenta curva de tensão por tensão para as configurações de 11% w/w.

[059] A figura 17 apresenta um gráfico de zoom na região elástica da configuração de 11% w/w. Mostra-se que na região elástica as malhas enriquecidas têm valores mais altos após o qual há uma mudança e a malha de controle tem valores mais altos.

[060] A Figura 18 mostra curvas de tensão para o material de malha PCL eletrofiadas de diferentes lotes, demonstrando que o enriquecimento de 1,33% A seda de aranha produziu os melhores resultados.

[061] A Figura 19 apresenta estatísticas de propriedades mecânicas para aeletrofiação PCL: módulo jovem (painel esquerdo), força elástica (painel central) e alongamento na ruptura (painel direito).

[062] AFigura 20 apresenta uma fotografia do stent revestido eletrofiadasBombyxmori (BM), mostrando as nano fibras entre as hastes metálicas do stent, formando uma malha nano.

[063] AFigura 21 apresenta uma imagem de microscopia óptica do stent revestido eletrofiadasBombyxmori (BM), mostrando as nano fibras entre as hastes metálicas do stent, formando uma malha nano.

[064] A Figura 22 apresenta uma fotografia (à esquerda) e uma microscopia óptica do stent revestido eletrofiadasA seda de aranha (SS), mostrando a formação de nano fibras nas hastes metálicas do stent e formando o revestimento.

[065] A Figura 23 apresenta uma fotografia que mostra um stent revestido de película utilizando o revestimento DIP do stent na solução BM Hexafluoroisopropanol (HFIP).

[066] A figura 24 apresenta sem imagens mostrando uma malha eletrofiadas de nano- fibras (cerca de 90 a 630 nm), feita de solução de fibras Bombyxmori dissolvidas em HFIP, em várias escalas. Barras de escala em µm, no sentido horário da parte superior esquerda: 100, 10, 2 e 5.

[067] A Figura 25 apresenta sem imagens mostrando malha eletrofiadas de nano fibras feitas de solução de fibras de seda de aranha dissolvidas em HFIP. Barras de escala em µm, no sentido horário da parte superior esquerda: 100, 10, 1, 500, 2 e 5.

[068] A Figura 26 apresenta sem imagens mostrando um aglomerado de fibras proteicas em poli (2-hidroxietil metacrilato) (P-). As barras de escala são 1 µm.

[069] A Figura 27 apresenta uma imagem sem a exibição de fibras proteicas em VeroClear com 2% de enriquecimento. A barra da escala é 2 µm.

[070] A Figura 28 apresenta sem imagens que mostram fibras liofilizadas SS. Barra de escala em µm, da esquerda para a direita: 2 e 10. Os números na figura esquerda indicam o tamanho do diâmetro (179 nm a 1,34 µm)

[071] As figuras 29a-C apresentam gráficos que mostram uma análise mecânica dinâmica (DMA) de enriquecimento VeroClear. O aprimoramento é visto como o direito de deslocamento em Tan Delta Peak. Figura 29A mostra módulo de armazenamento. Figura 29B mostra módulo de perda figura 29B apresenta testes Tan Delta.

[072] AFigura 30 apresenta um exame microscópico de fibras em um buffer de ativação antes da reação descrita na seção exemplos (e.g., exemplo 6) abaixo (barra é 400 µm).

[073] AFigura 31 apresenta um exame microscópico de fibras no buffer de conjugação, após 10 min em reação conforme descrito na seção de exemplos (por exemplo, 6) abaixo (bar é 400 µm).

[074] A Figura 32 apresenta um exame microscópico de fibras no buffer de conjugação após 30 min, conforme descrito na seção exemplos (por exemplo, 6) abaixo (barra é 400 µm).

[075] AFigura 33 apresenta um exame microscópico após o vórtice de operação no buffer de ativação, conforme descrito na seção exemplos (por exemplo, 6) abaixo. Não são observadas alterações na forma e tamanho das fibras (a barra é de 400 µm).

[076] A Figura 34 apresenta imagens microscópicas do silício revestido (fase orgânica à esquerda, fase aquosa à direita).

[077] A Figura 35 apresenta um olhar mais atento em imagens microscópicas do silício revestido (fase orgânica à esquerda, fase aquosa à direita).

[078] A Figura 36 apresenta imagens de microscopia eletrônica de varredura (ESEM) que mostram uma grande gotícula antes (esquerda) e ao atingir uma superfície revestida de fibra (à direita). Seta aponta para uma gota em transição. Linhas brancas/fitas são o contorno, a maior parte da fibra é mais escura.

[079] AFigura 37 apresenta imagens ESEM mostrando gotas formadas em torno das fibras, mas não nas fibras. Seta na imagem esquerda exibe gotículas no substrato que não são vistos na superfície da fibra. A seta na imagem direita mostra a ascensão do nível de água que mergulha a superfície da fibra sem gotas dadas forma na superfície.

[080] AFigura 38 apresenta imagens ESEM mostrando o nível de água subindo e molhando as fibras causando um Halo mais escuro em torno das fibras. Gotas de água são claramente visto em torno das fibras na imagem direita, sem a formação de gotículas na superfície. As barras são 50 µm.

[081] AFigura 39 apresenta imagens ESEM de fibras de celulose mostrando condensação de água em torno das fibras não na superfície da fibra. Os painéis inferiores demonstram água em boa imersão com celulose e menos absorção por celulose. As barras são 100 µm.

[082] AsFiguras 40A-B apresentam etapas para análise da espessura da fibra e número de camadas de células: o canal azul (DAPI) foi usado para contar o número de camadas L929 na visão ortogonal de um cluster definido (figura 40A); 23 áreas contendo aglomerados de células e foram selecionadas para análise. As bordas das regiões escolhidas foram aprimoradas e a imagem foi convertida em modo binário. Os pontos máximos z de cada coordenadas foram definidos em um gráfico, e a espessura média foi calculada. O painel superior da figura 40B apresenta a visão ortogonal do revestimento SS (DAPI + campo luminoso) em uma área selecionada; o painel do meio apresenta a conversão do sinal de campo brilhante para o modo binário, indicando as coordenadas da SS; e o gráfico no painel inferior mostra o quantificação de binárias sinal luminoso de campo indicando a espessura do revestimento SS.

[083] AsFiguras 41a-B apresentam células HEK293 adotar crescimento 3D, bem como padrão de migração único quando semeado em SS em alta densidade 5 dias após a semeadura (figura 41a) vis-à-vis um controle de colágeno (figura 41B) (barras são 400 µm).

[084] A Figura 42 apresenta análise (da mesma forma que a figura 40B) de espessura de fibra, mostrando campos representativos usados para quantificação para examinar a camada de crescimento de células em SS.

[085] As figuras 43a-C presente exame microscópico que mostra a placa do TC revestida com as concentrações diferentes do painel de SS. Left: 1 camada, ~ 6X105 fibras/cm2 (figura 43a); painel médio: 2 camadas, fibras de ~ 12X105/cm2 (figura 43B); painel direito: ~ 24X105 Fibras/cm2 (figura 43c). Diferentes concentrações de fibras produzem um número diferente de camadas, permitindo o crescimento fenotípica diferente das células. As setas na figura 43a ponto em furos no revestimento de superfície, indicando defeitos do revestimento causados por um limite no número de fibras. O revestimento com esta quantidade de fibras (6X105/cm2) resulta em uma média de 1 camada de fibras no revestimento.

[086] AFigura 44 apresenta um exame microscópico que mostra a quantidade de fibras por uma determinada área e o número de camadas resultante. as estruturas 3D estão crescendo e começam a se conectar: painéis à esquerda: 3º dia pós semeadura; painéis médios: 5º dia pós semeadura; painéis à direita: sétimo dia pós semeadura. Barras: painel superior: 200 µm, painel inferior: 1000 µm.

[087] A Figura 45 é uma imagem confocal de esferóides manchada com iodeto de calceína e propidium demonstrando que as células (L929) semeadas em microplacas Nunclon ™ (projetadas para formação de arheroid) geram esferóides com características únicas diferentes na presença de células SS. 5000 foram semeadas em cada poço.

[088] Painel esquerdo: 5 dias de propagação pós, painel direito: 7 dias pós semeadura.

[089] As imagens empilhadas de cada canal foram analisadas para determinar a área máxima do (coloração calceína) e a área do núcleo necrosado (coloração PI).

[090] AsFiguras 46A-C são gráficos de barras mostrando o tamanho e a análise de zonas vivas/necrosadas de células L929: a figura 46A mostra que ao vivo: a proporção de células mortas é 75% maior em esferóides SS; Figura 46B mostra que o volume de SS-contendo esferóides é 3.5-4.8-vezes maior do que o de controle esferóides. A figura 46C mostra que o volume de área viva em esferóides contendo SS é 4,7 vezes maior que o do controle esferóides. Em cada trio de barras, da esquerda para a direita: controle (não tratada), colágeno e SS.

[091] AsFiguras 47A-C mostram imagens microscópicas demonstrando baixa densidade de propagação de HEK293 misturado com SS, (em comparação com o controle de células semeadas sem SS (figura 47A): plano de foco inferior (figura 47B) plano de foco superior (figura 47C). As barras de escala são 200 µm.

[092] AsFiguras 48a-C mostram imagens que demonstram o padrão de crescimento 3D das células HEK293 quando semeadas em uma placa revestida SS, 5000 células/bem, 4 dias pós semeadura: não revestido (Figura 48A); plano inferior (figura 48B) e plano superior (figura 48C).

[093] AsFiguras 49a-B presença de quantificação da mobilidade celular entre células L929 semeadas em poliestireno e células semeadas em placas revestidas de SS como visualizadas no microscópio (figura 49a), e em gráficos de barras mostrando migração de células em poliestireno vs SS (figura 49B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

[094] A presente invenção, em algumas das suas formas de realização, é dirigida a compostos compreendidos por um polímero e uma mistura de proteínas derivadas de uma proteína do MaSp (espidroínaampolada principal), suas propriedades mecânicas melhoradas e a preparação do mesmo.

[095] A presente invenção prevê, em algumas formas de realização, compostos: (a) uma mistura de proteínas com um peso molecular diferente útil para a preparação da seda de aranha sintética de fio de segurança; e (b) um polímero.

[096] Em algumas formas de realização, o termo "Composto" refere-se a um material que é composto de duas ou mais substâncias com características diferentes e em que cada substância retém sua identidade enquanto contribui propriedades desejáveis para o todo.

[097] Em algumas formas de realização, o termo "material " refere-se a um material sólido. Em algumas formas de realização, o termo "material " refere-se a um material semissólido (por exemplo, um gel).

[098] Em algumas formas de realização, os compostos divulgados apresentam propriedades mecânicas superiores.

[099] Em algumas formas de realização, há fibra fornecida que compreende a mistura de proteínas.

[100] Em algumas formas de realização, uma pluralidade da fibra divulgada em algumas formas de realização dele, é anexada a uma outra através do vinculador. Formas de realização do vinculador são descritas prazos aqui abaixo. As proteínas

[101] A invenção atual é baseada, em parte, na descoberta inesperada de que a seda de aranha de fio de segurançasintético, sintetizada usando uma mistura de proteínas de peso molecular diferente e derivado de uma proteína do MaSp, tem propriedades mecânicas excepcionais similares aode fio de segurança da seda de aranha natural.

[102] Em algumas formas de realização, cada proteína na mistura compreende, independente "n " repete-se de uma região repetitiva de uma proteína principal de MaSp, ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento dele, onde m e n são, independentemente, um inteiro entre 2 para 70.

[103] Tal como é utilizado neste documento, o termo "mistura de proteínas" ou "mistura de proteínas" refere-se a uma pluralidade de proteínas, tais como, sem limitação, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 tipos de proteínas , onde cada tipo de proteína tem um peso molecular original e uniforme.

[104] Em algumas formas de realização, o termo "mistura de proteínas" ou "mistura de proteínas" refere-se a 20 a 40 tipos de proteínas ou a 20 a 35 tipos de proteínas. Em algumas formas de realização, a proteína se refere a uma única proteína dobrada.

[105] Os termos "proteína espidroínaampolada" e "proteína espidroína" são usados de forma intercambiável em toda a descrição e englobam todas as principais proteínas espidroínaampolada conhecidas, tipicamente abreviadas como "MaSp", ou "ADF" no caso de Araneusdiadematus. Estas proteínas espidroínaampoladas maiores são geralmente de dois tipos, 1 e 2. Estes termos incluem, além disso, proteínas não- naturais, como divulgadas aqui, com um alto grau de identidade e/ou semelhança com, pelo menos, a região repetitiva do conhecido como proteína espidroínaampolada principal. As proteínas de seda apropriadas adicionais da aranha incluem MaSp2, MiSp, MiSp2, AcSp, FLYS, FLAS, e em disposição compactada.

[106] Como aqui utilizado, o termo "região repetitiva ", "sequência repetitiva " ou "repetido" referem-se a uma sequência de proteína recombinante derivada de unidades de repetição que ocorrem naturalmente várias vezes em sequências de aminoácidos de seda de aranha (por exemplo, na proteína MaSp-1). Um hábil na arte apreciará que a estrutura preliminar das proteínas de seda da aranha é considerada consistir na maior parte de uma série de variações pequenas de uma repetição da unidade. A unidade repete-se nas proteínas que ocorrem naturalmente são frequentemente distintas de se. [107] Ou seja, há pouca ou nenhuma duplicação exata da unidade repete ao longo do comprimento da proteína. Em algumas formas de realização, as sedas sintéticas da invenção são feitas onde a estrutura primária da proteína compreende um número de repetições exatas de uma única repetição da unidade. Em formas de realização adicionais, sedas sintéticas da invenção compõem uma série de repetições de uma unidade de repetição, juntamente com uma série de repetições de uma segunda unidade de repetição. Tal estrutura seria semelhante a um copolímero bloco típico. A unidade repete-se de diversas sequências diferentes pode igualmente ser combinada para fornecer uma proteína de seda sintética da aranha que tem propriedades seriadas a uma aplicação particular. O termo "repetição direta", como usado aqui, é uma repetição em tandem (arranjo de cabeça a cauda) com uma repetição semelhante. Em outra forma de realização, a repetição usada para formar a aranha sintética de seda da invenção é uma repetição direta. Em algumas formas de realização, a repetição não é encontrada na natureza (ou seja, não é uma sequência de aminoácidos naturais).

[108] Uma sequência exemplar, composta por sequências repetitivas, é ADF-4:

AAAAAAASGSGGYGPENQGPSGPVAYGPGGPVSSAAAAAAAGSGPGGYGPENQGP SGPGGYGPGGSGSSAAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGSGGYGPGSQGPSGP GASSAAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGAYGPGGPGSSAAASGPGGYGPGSQG PSGPGGSGGYGPGSQGPSGPGGPGASAAAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGAY GPGGPGSSAAASGPGGYGPGSQGPSGPGAYGPGGPGSSAAAAAAAGSGPGGYGP GNQGPSGPGGYGPGGPGSSAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGVYGPGGPGSSA AAAAAAGSGPGGYGPGNQGPSGPGGYGPGGSGSSAAAAAAAASGPGGYGPGSQG PSGPGGSGGYGPGSQGPSGPGASSAAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGAYGPG GPGSSAAASGPGGYGPGSQGPSGPGAYGPGGPGSSAAAAAAASGPGGYGPGSQG

PSGPGGSRGYGPGSQGPGGPGASAAAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGYQGPS GPGAYGPSasas (Seq ID n º: 10). Em algumas formas de realização, a sequência sintética repetitiva da invenção baseia-se (por exemplo, tem uma alta percentagem de identidade, como definido prazos aqui abaixo) uma ou mais sequências repetitivas derivadas do ADF-4 (Seq ID n º: 10). Como usado aqui, o termo "baseado em " refere- se a uma sequência com uma porcentagem alta de homologia para uma sequência repetitiva.

[109] Em algumas formas de realização, cada sequência repetitiva compreende até 60 aminoácidos, até 55 aminoácidos, até 50 aminoácidos, até 49 aminoácidos, até 48 aminoácidos, até 47 aminoácidos, até 46 aminoácidos, até 45 aminoácidos. , até 44 aminoácidos, até 43 aminoácidos, até 42 aminoácidos, até 41 aminoácidos, até 40 aminoácidos, até 39 ácidos aminados, até 38 aminoácidos, até 37 aminoácidos, até 36 aminoácidos ou até 35 aminoácidos , onde a possibilidade representa uma forma de realização separada da invenção atual. Em algumas formas de realização, cada sequência repetitiva compreende 5 a 60 aminoácidos, 10 a 55 aminoácidos, 15 a 50 aminoácidos, 20 a 45 aminoácidos, 25 a 40 aminoácidos, ácidos, 25 a 39 aminoácidos ou 28 a 36 aminoácidos, onde a possibilidade representa uma forma de realização separada de t Ele apresenta invenção. Em algumas formas de realização, cada sequência repetitiva compreende 30 a 40 aminoácidos, 31 a 39 aminoácidos, 32 a 38 aminoácidos, 33 a 37 aminoácidos, 34 a 36 aminoácidos, onde cada possibilidade representa uma forma de realização separada da invenção presente. Em uma forma de realização adicional, cada sequência repetitiva compreende 35 aminoácidos.

[110] Em algumas formas de realização, n é um inteiro igual a qualquer um dos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 e 70.

[111] Em algumas formas de realização, m é um inteiro igual a qualquer um dos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,

31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 e 70.

[112] Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está no intervalo de 2:1 – 1:2. Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,8:1 – 1:1.8. Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,5:1 – 1:1,5. Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,25:1 – 1:1.25. Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,2:1 – 1:1.2. A proporção de “n para m” está no intervalo de 1.1:1 – 1:1.1, em algumas formas de realização. Em outra forma de realização, ' n' e ' m ' são iguais.

[113] Em algumas formas de realização, o n é idêntico para cada tipo de proteína na mistura. O termo "n é idêntico para cada tipo de proteína na mistura", como é usado neste documento refere-se ao número de sequência repetitiva para cada tipo de proteína, ou seja, para uma ou mais proteínas com um peso molecular idêntico. Como exemplo não-limitativo, para uma mistura de proteínas com 16 tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, cada grupo de proteínas tem um número diferente de sequências repetitivas.

[114] Em algumas formas de realização, os vários grupos de proteínas da mistura têm uma proporção inversa entre o número de sequência repetitiva para cada tipo de proteína e a proporção molar do grupo. Em algumas formas de realização, para cada grupo de proteínas (por exemplo, com um número idêntico de repetições), quanto menor o peso molecular das proteínas, maior a proporção molar do grupo.

[115] Em algumas formas de realização, por "peso molecular diferente" destina-se a referir-se a um peso molecular com um valor que difere pelo menos por exemplo, 0, 1%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 20%, 25%, ou pelo menos 30%.

[116] Em outra forma de realização, cada repetição tem um peso molecular no intervalo de 1,5 kDa para 4,5 kDa, na faixa de 2 kDa a 3,5 kDa, na faixa de 2,1 kDa a 3,4 kDa, na faixa de 2,2 kDa a 3,3 kDa , na escala de 2,4 kDa a 3,2 kDa, na escala de 2,5 kDa a 3,1 kDa, na escala de 2,6 kDa a 3 kDa, ou na escala de 2,7 kDa a 2,9 kDa, onde cada possibilidade representa uma forma de realização separada da invenção atual. Em outra forma de realização, cada repetição tem um peso molecular na faixa de cerca de 2,8 kDa.

[117] Em outra forma de realização, a composição compreende duas ou mais proteínas da mistura com incremento de peso molecular de 2 kDa a 3,5 kDa, de 2,1 kDa a 3,4 kDa, de 2,2 kDa a 3,3 kDa, de 2,4 kDa a 3,2 kDa, de 2,5 kDa a 3,1 kDa , de 2,6 kDa a 3 kDa, ou de 2,7 kDa a 2,9 kDa, onde cada possibilidade representa uma forma de realização separada da invenção atual. Em outra forma de realização, a composição compreende duas ou mais proteínas da mistura com incremento de peso molecular de cerca de 2,8 kDa.

[118] Em algumas formas de realização, a região repetitiva tem um primeiro moiety e um segundo moiety, onde o primeiro moiety e o segundo moiety são contíguos (ou seja, imediatamente adjacentes uns aos outros). Tipicamente, o primeiro moiety e o segundo moiety são ligados por uma ligação do peptídeo.

[119] Em algumas formas de realização, a primeira moiety da região repetitiva é uma sequência de aminoácidos de 5-30 aminoácidos que compreendem pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de resíduos alanina. Em algumas formas de realização, o primeiro moiety pode incluir um ou mais resíduos de glicina. Em algumas formas de realização, o primeiro moiety compreende até 5%, até 10%, até 15%, até 20%, até 25%, até 30%, até 45%, ou até 50% de resíduos de glicina.

[120] Em algumas formas de realização, o primeiro moiety compreende entre um a 50 "n " repete-se de um dipeptídeo alanina-glicina, como na fórmula de: (AG) 1-15. Em algumas formas de realização, o primeiro moiety compreende entre um a 50 "n " repete-se de um dipeptídeo glicina-alanina, como na fórmula de: (GA) 1-15.

[121] Em algumas formas de realização, a segunda moiety da região repetitiva é uma sequência de aminoácidos de 20-60 aminoácidos que compreendem pelo menos 80% de resíduos selecionados do grupo composto por glicina, serina, prolina e tirosina.

[122] Em algumas formas de realização, a segunda moiety da região repetitiva é uma sequência de aminoácidos de 20-60 aminoácidos que compreendem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos

75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% , pelo menos 95% de resíduos selecionados do grupo composto por glicina, serina, prolina e tirosina. Em algumas formas de realização, a segunda moiety da região repetitiva não compreende mais do que um ou dois resíduos de glutamina. Um hábil na arte irá apreciar que a quantidade exata e ordem dos resíduos de glicina, serina, prolina e tirosina na região repetitiva pode diferir, desde que a sequência de formas de fibras automontagem.

[123] Em algumas formas de realização, a região repetitiva compreende: i 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% ou 50% de resíduos de alanina; (II) 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% ou 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% ou 60% de resíduos de glicina; (III) 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% ou 30% de resíduos de serina; (IV) 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% ou 30% de resíduos de prolinas; (v) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de resíduos de tirosina; (vi) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de resíduos de glutamina; e (VII) 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, de resíduos de arginina.

[124] Em algumas formas de realização, a região repetitiva é composta por 13-42% de resíduos alanina, 25-55% de resíduos de glicina, 10-18% de resíduos serina, 12-21% de resíduos prolina, 4-7% resíduos de tirosina, 4-7% de resíduos de glutamina e 0-3% de resíduos de arginina.

[125] Em algumas formas de realização, cada uma das proteínas compreende, independentemente, uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID n º: 1(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10 em que X1 é, independentemente, em cada instância a ou G.

[126] Em algumas formas de realização, pelo menos 50% de (X1) z é a, z é um inteiro entre 5 a 30; X2 é S ou G; X3 é G ou E; X4 é G, S ou N; X5 é Q ou Y; X6 é G ou S; X7 é P ou R; X8 é Y ou Q; X9 é G ou S; e X10 é S ou G.

[127] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é caracterizada por uma ou mais propriedades selecionadas do grupo consistindo: a cada repetição tem um peso molecular na faixa de 2 kDa a 3,5 kDa, e (b) a proporção de “n para m” está na faixa de 2:1 a 1:2.

[128] Em algumas formas de realização, o n é idêntico para cada tipo de proteína na mistura.

[129] Em outra forma de realização, n é um inteiro igual a ou entre 4 e 32. Em outra forma de realização, m é um inteiro igual a ou entre 4 e 32. Em outra forma de realização, a proporção de “n para m” está na faixa de 1,8:1 – 1:1.8. Em outra forma de realização, ' n' e ' m ' são iguais.

[130] Em algumas formas de realização, Z é um inteiro entre 6 a 11, um inteiro entre 6 a 10 ou um inteiro entre 7 a 9. Em uma forma de realização, Z é um inteiro selecionado de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12. Em outra forma de realização, Z é 8.

[131] Em outra forma de realização, a região repetitiva de uma proteína MaSP1 compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID no: 2 (SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS). Em outra forma de realização, a região repetitiva de uma proteína MaSP1 compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID n º: 3 (AAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS).

[132] Em outra forma de realização, o homólogo compartilha pelo menos 50%, pelo menos, 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% , pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com Seq ID n º: 1.

[133] Em outra forma de realização, o homólogo compartilha pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75% , pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos, 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com Seq ID n º: 2.

[134] Em outra forma de realização, o homólogo compartilha pelo menos 50%, pelo menos, 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% , pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com Seq ID n º: 3.

[135] Em outra forma de realização, a região repetitiva de uma proteína MaSP1 compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID n º: 4. em outra forma de realização, a região repetitiva de uma proteína MaSP1 tem a sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID não 10.

[136] Em outra forma de realização, cada proteína da mistura ainda compreende uma única região N-terminal selecionada a partir do grupo composto por: Seq ID n º: 5 (MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLV); SEQ ID n º: 6 (MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLVRPLSNLDNAP); SEQ ID nº: º: 7 (MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLVDPPGCRNSARAGSS), ou qualquer homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento do mesmo. Em outra forma de realização, o homólogo da região C-terminal compartilha pelo menos 70% de homologia com qualquer um dos Seq ID nº: 5-7.

[137] Em outra forma de realização, cada proteína da mistura ainda compreende uma única região C-terminal selecionada a partir do grupo composto por: Seq ID n º: 8 (

VAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNGAAVSGALNSLVSQISASNPGLSGCDALV QALLELVSALVAILSSASIGQVNVSSVSQSTQMISQALS); e Seq ID n º: 9 (GPSGPGAYGPSPSASASVAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNGAAVSGALNSL VSQISASNPGLSGCDALVQALLELVSALVAILSSASIGQVNVSSVSQSTQMISQALS), ou qualquer homólogo funcional, variante, derivado, fragmento ou mutante. Em outra forma de realização, o homólogo da região N-terminal compartilha pelo menos 70% de homologia com Seq ID n º: 8-9.

[138] Em algumas formas de realização, uma ou mais proteínas da mistura compreendem pelo menos uma sequência de etiquetas. Não-limitando exemplos de Tags que podem ser utilizados na presente invenção incluem a sua Tag, uma tag ha, uma tag T7, e similares. Um exemplar seu Tag compreende seis seus resíduos ou consiste em seis seus resíduos, conforme estabelecido em Seq ID n º: 11 (HHHHHH).

[139] Em outra forma de realização, a marca é uma marca composta ou consistindo da sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID n º: 12 (YPYDVPDYA). Em outra forma de realização, a marca é uma marca T7 composta ou consistindo da sequência de aminoácidos conforme estabelecido em Seq ID n º: 13 (MASMTGGQQMG). A pessoa qualificada está bem ciente de etiquetas alternativas adequadas ou outros parceiros de fusão.

[140] "Aminoácido", tal como utilizado neste documento, refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de forma semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente.

[141] Aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. "Os análogos de aminoácido" refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química fundamental como um aminoácido natural, ou seja, um carbono alfa que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil Sulfônio. Tais análogos modificaram grupos de R ou backbones modificados do peptídeo, mas retêm a mesma estrutura química básica que um ácido aminado naturalmente ocorrendo. "Aminoácidos miméticos" refere-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma forma semelhante a um aminoácido natural. Os aminoácidos podem ser referidos aqui por qualquer um dos seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB.

[142] "Sequência de aminoácidos" ou "sequência de peptídeos" é a ordem em que os resíduos de aminoácidos, conectados por títulos de peptídeo, encontram-se na cadeia em peptídeos e proteínas. A sequência é geralmente relatado a partir da extremidade N-terminal contendo amino grupo livre para a extremidade C-terminal contendo carboxila livre grupo de aminoácidos sequência é muitas vezes chamado de peptídeo, sequênciade proteínas se representa a estrutura primária de uma proteína, no entanto deve-se discernir entre os termos "sequência de aminoácidos" ou "sequência de peptídeo" e "proteína", uma vez que uma proteína é definida como uma sequência de aminoácidos dobrado em uma configuração específica tridimensional e que tinha tipicamente submetido a pós-tradução modificações, tais como fosforilação, acetilação, glicosilação, formação de vínculo sulfidrila, clivagem e os gostos.

[143] Como aqui é usado, "isolado" ou "substancialmente purificado", no contexto de sequências de aminoácidos de seda sintética ou moléculas de ácidos nucleicos que codificam o mesmo, como exemplificado pela invenção, significa que as sequências de aminoácidos ou polinucleotídeos foram retirados do seu meio natural ou foram alterados do seu estado natural. Como tal "isolado" não reflete necessariamente a medida em que as sequências de aminoácidos ou moléculas de ácidos nucleicos foram purificados. No entanto, será entendido que tais moléculas que foram purificadas em algum grau são "isolados". Se as moléculas não existem em um meio natural, isto é não existe na natureza, a molécula é "isolada" não obstante onde está atual. Por exemplo, sequências de aminoácidos ou polinucleotídeos que não existem naturalmente em seres humanos são "isolados", mesmo quando estão presentes em seres humanos.

[144] O termo "isolado" ou "substancialmente purificado", quando aplicado a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos, denota que a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos é essencialmente livre de outros componentes celulares com os quais estão associados no estado natural. Pode ser em um estado homogêneo, ou alternativamente em uma solução seca ou aquosa. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas analíticas da química tais como a eletroforese do gel da metalurgia ou a cromatografia líquida do elevado desempenho. Uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que são as espécies predominantes presentes em uma preparação é substancialmente purificado.

[145] Em algumas formas de realização, as repetições são de um homólogo, variante, derivada de uma região repetitiva de uma proteína MaSp1 ou fragmento dele. Em algumas formas de realização, as repetições são de um homólogo, variante, derivada de uma região repetitiva de uma proteína ADF-4 ou fragmento do mesmo.

[146] Como usado aqui, o termo "funcional" como em "homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento", refere-se a uma sequência de aminoácidos que possui função biológica ou atividade que é identificado através de um ensaio funcional definido. Mais especificamente, o ensaio funcional definido é a formação de fibras auto montantes em células expressando o homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento.

[147] Uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos é a de ser um homólogo de uma sequência de aminoácidos correspondente ou de um ácido nucleico, quando a homologia está determinada a ser de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% , pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[148] A homologia, tal como aqui utilizada, pode ser determinada com base na identidade percentual entre dois aminoácidos (peptídeo) ou sequências de ADN. Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. O alinhamento das duas sequências é examinado e o número de posições que dão uma correspondência exata de aminoácidos (ou nucleotídeos) entre as duas sequências determinadas, dividida pelo comprimento total do alinhamento multiplicado por 100 para dar uma identidade percentual Figura. Este número de identidade percentual pode ser determinado em todo o comprimento das sequências a serem comparadas, o que é particularmente adequado para sequências de comprimentos iguais ou muito semelhantes e que são altamente homólogos, ou mais curtos comprimentos definidos, que é mais apropriado para sequências de comprimento desigual ou que têm um nível inferior de homologia. Métodos para comparar a identidade de duas ou mais sequências são bem conhecidas na arte. Assim por exemplo, os programas disponíveis no pacote da análise da sequência de Wisconsin, versão 9,1, por exemplo os programas Gap e BESTFIT, podem ser usados para determinar a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos e a identidade percentual entre dois sequências de polinucleotídeos. BESTFIT usa o algoritmo "homologia local" de Smith e Waterman e encontra a melhor única região de similaridade entre duas sequências. BESTFIT é mais adequado para comparar dois polipeptídios ou duas sequências de polinucleotídeos que são diferentes em comprimento, o programa assumindo que a sequência mais curta representa uma parte do tempo. Em comparação, Gap alinha duas sequências encontrando uma "similaridade máxima" de acordo com o algoritmo de Needler e Wunsch. GAP é mais adequado para comparar sequências que são aproximadamente o mesmo comprimento e um alinhamento é esperado ao longo de todo o comprimento. Preferencialmente os parâmetros "peso da lacuna" e "peso de comprimento" utilizados em cada programa são 50 e 3 para sequências de polinucleotídeos e 12 e 4 para sequências de polipeptídio, respectivamente. Preferencialmente, as identidades percentuais e as semelhanças são determinadas quando as duas sequências que estão sendo comparadas são perfeitamente alinhadas.

[149] Os termos "idênticos", "identidade substancial", "homologia substancial" ou "identidade" por cento ", no contexto de dois ou mais aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (i.e., cerca de 60% de identidade, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou 99% de identidade sobre uma região especificada (por exemplo, sequência de aminoácidos Seq ID n º: 2 ou 3), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada) como medida usando uma explosão ou explosão 2,0 seu algoritmos de comparação com parâmetros padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Tais sequências são então para ser "substancialmente idênticos". Esta definição também se refere a, ou pode ser aplicado a, o elogio de uma sequência de teste. A definição também inclui sequências que têm exclusões e/ou adições, bem como aqueles que têm substituições. Os algoritmos preferenciais podem ser responsáveis por lacunas e outras.

[150] Para comparação de sequências, normalmente uma sequência age como uma sequência de referência, para a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, teste e sequências de referência são inseridas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Preferencialmente, parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, em seguida, calcula as identidades de sequência de porcentagem para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[151] Deve ser apreciado que a invenção ainda engloba a sequência de aminoácidos compreendendo "n " repete de uma variante de qualquer um dos Seq ID n º: 1, 2, ou 3. como é usado aqui, o termo "variante" ou "substancialmente similar" compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes das sequências especificamente identificadas, nas quais um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 ou 25) os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos são excluídos, substituídos ou adicionados. [152] As variantes podem ser alélica variantes que ocorrem naturalmente ou variantes de origem não-natural. A variante ou sequências substancialmente semelhantes referem-se a fragmentos de sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos que podem ser caracterizados pela percentagem da identidade do seu aminoácido ou sequência de nucleotídeos com as sequências de aminoácidos ou nucleotídeos descritos aqui, conforme determinado por algoritmos comuns usados no estado-da-arte. Os fragmentos preferenciais de aminoácidos ou ácidos nucleicos são aqueles que têm uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos com pelo menos cerca de 40 ou 45% da identidade sequencial, preferencialmente em torno de 50% ou 55% da identidade sequencial, mais preferencialmente em torno de 60% ou 65% de identidade sequencial, mais preferencialmente em torno de 70% ou 75% da identidade sequencial, mais preferencialmente em torno de 80% ou 85% da identidade de sequência, ainda mais preferencialmente em torno de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade de sequência, quando comparado com o sequência de referência.

[153] Em uma forma de realização, uma mistura de proteínas é uma fibra. Em uma forma de realização, uma fibra compreende uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, uma fibra compreende "m" tipos de proteínas. Em uma forma de realização “m " tipos de proteínas é uma fibra. Em uma forma de realização “m " tipos de proteínas é uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de peso molecular diferente, em que cada proteína no "m " tipos de proteínas compreende, independentemente, "n " repete de uma região repetitiva de um espidroínaampoladamaio ( MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivativo ou fragmento dele. Em uma forma de realização, uma mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína na mistura de proteínas compreende, independentemente, "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento dele.

[154] Em uma forma de realização, uma mistura de proteínas ou fibras é composta de monômeros. Em uma forma de realização, uma pluralidade de monômeros são organizados em um nanofibril. Em uma forma de realização, uma pluralidade de nanofibris são organizados em uma fibra ou make-up uma fibra. Em uma forma de realização, um monômero ou um nanofibril dentro de uma mistura de proteínas ou uma fibra tem um diâmetro de 4 a 16 nm. Em uma forma de realização, um monômero ou um nanofibril dentro de uma mistura de proteínas ou uma fibra tem um diâmetro de 6 a

14 nm. Em uma forma de realização, um monômero ou um nanofibril dentro de uma mistura de proteínas ou uma fibra tem um diâmetro de 8 a 12 nm. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um diâmetro de 70 a 450 nm. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um diâmetro de 80 a 350 nm. [155] Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um diâmetro de 80 a 300 nm. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um diâmetro de 150 a 250 nm. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é arranjada como uma bobina. Em uma forma de realização, uma única fibra ou uma mistura de proteínas é arranjada como uma bobina. Em uma forma de realização, uma bobina tem um diâmetro de 5 a 800 micrômetros. Em uma forma de realização, uma bobina tem um diâmetro de 5 a 500 micrômetros. Em uma forma de realização, uma bobina tem um diâmetro de 5 a 30 micrômetros. Em uma forma de realização, uma bobina tem um diâmetro de 5 a 20 micrômetros. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um comprimento de 5 a 800 micrômetros. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas tem um comprimento de 30 a 300 micrômetros.

[156] Em uma forma de realização, um composto e/ou uma composição descrita aqui compreende uma quantidade inferior a 5% ou 3% de fibras iguais ou inferiores a 5 micrômetros (de comprimento) do número total de fibras dentro do composto e/ou composição. Em uma forma de realização, um composto e/ou uma composição descrita aqui compreende uma quantidade inferior a 5% ou 3% de fibras iguais ou menores que 8 micrômetros (de comprimento) do número total do teor total de fibras dentro do composto e/ou composição.

[157] Em uma forma de realização, um composto e/ou uma composição descrita aqui compreendem menos de 5% ou 3% de fibras de w/w iguais ou inferiores a 5 micrômetros (de comprimento) do peso total das fibras dentro do composto e/ou composição. Em uma forma de realização, um composto e/ou uma composição descrita aqui compreende uma quantidade inferior a 5% ou 3% de fibras w/w igual ou inferior a 8 micrômetros (de comprimento) do peso total do teor total de fibras dentro do composto e/ou composição.

[158] Em uma forma de realização, fibras iguais ou menores que 5 ou 8 micrometros causam instabilidade. Em uma forma de realização, fibras iguais ou menores que 5 ou 8 micrômetros reduzem a integridade de uma composição ou de um composto como descrito aqui. Em uma forma de realização, fibras iguais ou menores que 5 ou 8 micrômetros reduzem a força física de uma composição ou de um composto como descrito aqui.

[159] Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é ramificada. [160] Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas compreende 1 a 10 ramos. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é livre de carboidratos. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é não-glicosilada. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é livre de gordura ou ácidos graxos. Em uma forma de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas é livre de fósforo. Em uma forma de realização “livre de "é desprovido de "ou essencialmente” "desprovido de".

[161] Em uma forma de realização, pelo menos 50% das proteínas dentro de uma fibra ou uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, pelo menos 55% das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, pelo menos 60% das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, pelo menos 65% das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, pelo menos 70% das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas. Em uma forma de realização, pelo menos 75% das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas são maiores/maiores/mais pesadas (em kDa) do que o peso médio das proteínas dentro de uma fibra ou de uma mistura de proteínas.

[162] Em uma forma de realização, a proporção de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é pelo menos 1:10. Em uma forma de realização, a relação de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é de pelo menos 1:10 a 1:1500. Em uma forma de realização, a relação de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é de pelo menos 1:50 a 1:1000. Em uma forma de realização, a relação de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é de pelo menos 1:100 a 1:1200. Em uma forma de realização, a relação de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é de pelo menos 1:100 a 1:1000. Em uma forma de realização, a relação de aspecto de comprimento para diâmetro de uma fibra ou uma mistura de proteínas é de pelo menos 1:500 a 1:1000.

[163] Os termos derivados e derivados funcionais usados aqui significam a sequência de aminoácidos da invenção com quaisquer inserções, exclusões, substituições e modificações.

[164] Deve ser apreciado que, pelo termo "inserções", como usado aqui, significa qualquer adição de resíduos de aminoácidos para a sequência da invenção, entre 1 a 50 resíduos de aminoácidos, especificamente, entre 20 a 1 resíduos de aminoácidos, e mais especificamente, entre 1 a 10 resíduos de aminoácidos. Mais especificamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 resíduos de aminoácidos. Além disso, a sequência de aminoácidos da invenção pode ser estendida no terminal N-Terminus e/ou C-Terminus com vários resíduos de aminoácidos idênticos ou diferentes.

[165] Aminoácidos "substituições" são o resultado da substituição de um aminoácido com outro aminoácido com características estruturais e/ou químicas semelhantes, ou seja, recolocações de aminoácidos conservadores. As substituições de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbico) incluem alanina, leucina, isoleucina,

valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos carregados positivamente (básico) incluem arginina, lisina e histidina; e negativamente carregada (ácida) aminoácidos incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[166] Em outra forma de realização, a sequência de repetição da invenção tem 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, ou 7 ou menos substituições de aminoácidos para a sequência de qualquer um dos SEQ ID n º: 2 ou 3. Em uma forma de realização, a sequência de repetição da invenção tem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou pelo menos 13 substituições de aminoácidos à sequência de qualquer um dos SEQ ID n º: 2 ou 3.

[167] Em relação às sequências de aminoácidos, uma das habilidades reconhecerá que substituições individuais, exclusões ou adições a um aminoácido, ácido nucleico, peptídeo, polipeptídio, ou sequência de proteínas que altera, acrescenta ou exclui um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante conservadoramente modificada", onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas conservadoras de substituição que fornecem aminoácidos funcionais semelhantes são bem conhecidas na arte. Tais variantes modificadas de forma conservadora estão além e não excluem as variantes polimórficas, as interespécies homólogos e alelos da invenção.

[168] Por exemplo, substituições podem ser feitas em que um aminoácido alifáticos (G, A, i, L, ou V) é substituído por outro membro do grupo, ou substituição, como a substituição de um resíduo polar para outro, como arginina para lisina, glutâmico para aspártico ácido, ou glutamina para asparagina. Cada um dos seguintes oito grupos contém outros aminoácidos exemplares que são substituições conservadoras para um outro: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L),

metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W); 7) serina (S), treonina (T); e 8) cisteína (C), metionina (M).

[169] Substituições de ácidos nucleicos conservadores são substituições de ácidos nucleicos resultantes de substituições de aminoácidos conservadoras como definidas acima.

[170] As variantes das sequências de aminoácidos da invenção podem ter, pelo menos, uma semelhança de 80%, pelo menos 85% semelhança da sequência, 90% similaridade da sequência, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% similaridade da sequência no nível do aminoácido, com uma unidade de repetição indicado por qualquer um dos Seq ID n º: 2 ou 3.

[171] A sequência de aminoácidos da invenção pode incluir "n " repetições de Seq ID n º 1 ou Seq ID n º 3 ou de qualquer fragmento do mesmo. UM "fragmento" constitui uma fração do aminoácido ou sequência de ADN de uma determinada região. Um fragmento da sequência do peptídeo é pelo menos um aminoácido mais curto do que a região particular, e um fragmento de uma sequência do ADN é pelo menos um base-par mais curto do que a região particular. O fragmento pode ser truncado no C-terminal ou N- terminal lados, ou ambos. Um fragmento de aminoácido pode incluir pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, no mínimo 16 , pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 24, pelo menos 26, pelo menos 27, no mínimo 28, pelo menos 29, pelo menos 30, no mínimo, 31, no mínimo 32 , pelo menos 33 ou pelo menos 34 aminoácidos de Seq ID n º: 1 ou 3.

[172] As mutações das sequências de aminoácidos da invenção são caracterizadas na troca de um (ponto mutante) ou mais, cerca de 10, de seus aminoácidos contra um ou mais de outro aminoácido. São a consequência das mutações correspondentes no nível do ADN que conduzem aos códons diferentes.

[173] Ainda mais, a invenção diz respeito aos derivados da sequência de aminoácidos da invenção. Os derivados das sequências de aminoácidos da invenção são, por exemplo, onde grupos funcionais, como os grupos amino, hidroxila, mercapto ou carboxila, são derivatisados, por exemplo, glicosilado, acilatado, amidatado ou esterificados, respectivamente. Em derivados glicosilados um Oligossacarídeo é geralmente ligado a asparagina, serina, treonina e/ou lisina. Os derivados acilatado são especialmente acilatados por um ácido orgânico ou inorgânico de ocorrência natural, por exemplo, ácido acético, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, que geralmente ocorre no grupo amino N-terminal, ou em grupos de hidroxi, especialmente de tirosina ou serina, respectivamente. Ésteres são os de álcoois naturais, por exemplo, metanol ou etanol.

[174] Outros derivados são sais, especialmente produtos farmacêuticos aceitáveis, por exemplo sais metálicos, tais como metais alcalinos e sais de metal alcalinos, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio ou sais de zinco, ou sais de amónio formados com amoníaco ou um Amina orgânica apropriada, tal como um alquilamina mais baixo, por exemplo trietilamina, hidroxi-loweralquilamina, por exemplo 2- hidroxietilamina, e semelhante.

[175] De acordo com alguns aspectos, a invenção diz respeito a uma sequência de ácidos nucleicos isolados que codificam duas ou mais proteínas da mistura de proteínas da invenção atual. De acordo com algumas formas de realização, a invenção fornece uma sequência isolada do ácido nucleico que codifica a mistura da proteína da invenção atual.

[176] O "ácido nucleico" refere-se a uma molécula que pode ser isolada ou duplamente encalhada, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, fosfato e um Purina ou pirimidina. Em bactérias, Lower eucariotas, e em animais e plantas mais elevados, "Ácido desoxirribonucleico" (DNA) refere-se ao material genético, enquanto "ácido ribonucléico" (RNA) está envolvido na tradução da informação do DNA em proteínas.

[177] Devido à natureza degenerativa do código genético, é evidente que uma pluralidade de diferentes sequências de ácidos nucleicos pode ser usada para codificar as sequências de aminoácidos da invenção. Deve ser apreciado que os códons compreendidos na sequência ácida do nucleico da invenção podem ser otimizados para a expressão em células do anfitrião do Sf9.

[178] O termo "códon", como se refere a genes ou a codificação de regiões de moléculas de ácidos nucleicos para a transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou nas regiões de codificação das moléculas de ácidos nucleicos para refletir o uso típico códon de o organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídio codificado pelo ADN. No contexto da presente invenção, os genes e as regiões de codificação do ADN são códon para a expressão ótima em células do anfitrião, e em um exemplo específico, Sf9 Spodopterafrugiperdacélulas de inseto.

[179] O termo "expressão" utilizado neste documento destina-se a significar a transcrição e a tradução para o produto genético de um código genético para a sequência do produto genético. Na expressão, uma codificação da cadeia do ADN para a sequência do produto do gene é transcrita primeiramente a um RNA complementar que seja frequentemente um RNA do Mensageiro e, então, o RNA assim transcrito do mensageiro é traduzido no produto de gene acima mencionado se o produto do gene é um Proteína.

[180] Em algumas formas de realização, a invenção se relaciona com um ou mais vetores de expressão que compõem uma sequência de ácidos nucleicos que codificam a mistura de proteínas da invenção. Em algumas formas de realização, a invenção se relaciona com um ou mais vetores de expressão que compõem uma sequência de ácidos nucleicos que codificam pelo menos uma porção da mistura de proteínas da invenção (por exemplo, dois ou mais grupos de proteínas com um peso molecular diferente). A sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácidos nucleicos compreendida dentro do vector de expressão da invenção pode, opcionalmente, incluir, pelo menos, uma das regiões terminais C (por exemplo, indicadas como Seq ID n º: 8 ou 9); e uma região N-terminal (por exemplo, selecionada a partir de SEQ ID n º: 5 – 7). Note-se que a sequência de ácidos nucleicos está controle de expressão de promotor operado e, opcionalmente, sequências regulatórias.

[181] Comousado aqui, um "vetor", "vetor da expressão" ou "plasmídeo" como referido aqui é um elemento do extra cromossomo que carrega frequentemente os genes que não são parte do metabolismo central da célula, e geralmente no formulário de moléculas dobro-encalhadas circulares do ADN. Pode ser qualquer um de um número de ácidos nucleicos em que uma sequência desejada pode ser inserida por restrição e ligadura para o transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para a expressão em uma célula hospedeira.

Os vetores são compostos tipicamente do ADN embora os vetores do RNA estejam igualmente disponíveis.

Os vetores incluem, mas não são limitados a, plasmídeo e pagemídeos.

Um vetor de clonagem é aquele que é capaz de replicar em uma célula hospedeira, e que é mais caracterizada por um ou mais sites de restrição endonuclease em que o vetor pode ser cortado de forma determinável e em que uma sequência de DNA desejada pode ser ligados tal que o novo o vetor recombinante retém sua capacidade de replicar na célula hospedeira.

No caso dos plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes como o plasmídeo aumenta no número da cópia dentro da bactéria do anfitrião ou apenas uma única vez por o anfitrião antes que o anfitrião se reproduza pela mitose.

No caso do fago, a replicação pode ocorrer ativamente durante uma fase de paralisia ou passivamente durante uma fase lisogênico.

Um vetor da expressão é um em que uma sequência desejada do ADN pode ser introduzida pela limitação e pela ligadura tais que é unida operavelmente às sequências reguladoras e pode ser expressa como uma transcrição do RNA.

Os vetores podem ainda conter uma ou mais sequências do marcador apropriadas para o uso na identificação e na seleção das células que foram transformadas ou transfeccionado com o vetor.

Como usado aqui, a "transformação" ou o "transfecção" são a aquisição de genes novos em uma célula pela incorporação do ácido nucleico.

Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou a sensibilidade a antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas atividades são detectáveis por ensaios padrão conhecidos na arte (por exemplo, fosfatase β-galactosidase ou alcalina), e genes que afetam visivelmente o fenótipo de células transformadas ou transfeccionadas, hospedeiros, colónias ou placas.

Os vetores preferenciais são aqueles capazes de replicação autônoma e expressão dos produtos genéticos estruturais presentes nos segmentos de DNA aos quais estão Unidos, ou seja, a expressão das proteínas sintéticas de seda de aranha.

[182] Emformas de realização específicas, o vetor é um vetor viral, mais especificamente um sistema vetorial Baculovirus ou um sistema vetorial de vírus vacina. Exemplos de tais sistemas de Baculovirus comercialmente disponíveis báculo- Gold ®, Flash-Bac ® e o BAC ao sistema Bac. Outros sistemas vetoriais virais também podem ser usados nesta invenção. De caso a caso, pode ser necessária uma modificação do vetor. Exemplos de novos vetores viral são adenovírus e todos os RNA- vírus da costa negativa, por exemplo, raiva, sarampo, VRS, etc.

[183] Em uma forma de realização, um sistema Baculovirus como usado para expressar a proteína de seda sintética da invenção. Baculovirus são uma família de grandes vírus em forma de haste que podem ser divididas em dois gêneros: nucleopoliedrovírus e granulo-vírus. Eles têm uma gama restrita de hospedeiros que podem infectar que é tipicamente restrito a um número limitado de espécies de insetos intimamente relacionados. Porque baculoviruses não são prejudiciais aos seres humanos são uma opção segura para o uso na pesquisa e nas aplicações comerciais ou industriais. Baculovirus expressão em células de inseto representa um método robusto para a produção de glicoproteínas recombinantes, uma vantagem significativa sobre a expressão prokaryotic que está faltando em termos de glicosilação e, consequentemente, dobradura de proteína adequada.

[184] Como indicado acima, o vector de expressão da invenção está operado com um promotor. Os termos "promotor" e "região promotora" se referem a uma sequência de DNA, geralmente a montante de (5 ′) a sequência de codificação de proteínas de um gene estrutural, que controla a expressão da região de codificação, fornecendo o reconhecimento de RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para a transcrição para começar no site correto. As sequências de promotores são necessárias, mas nem sempre suficientes para impulsionar a expressão do gene. O termo "promotor adequado" se referirá a qualquer promotor eucariótica ou prokaryotic capaz de conduzir a expressão de um gene de variante de seda de aranha sintética.

[185] Os promotores que são úteis para conduzir a expressão de fragmentos do ADN de heteróloga em Sf9 são numerosos e familiares àqueles hábeis na arte. Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir a codificação de genes uma proteína variante de seda é adequado para a invenção presente. Por exemplo, poliedrina, os promotores de proteína básica, P10, OpIE2 e GP4 podem ser promotores apropriados para a expressão.

[186] Uma sequência de codificação e sequências regulamentares são as que devem ser operavelmente ligadas ou Unidas de forma operada quando estão covalentes ligados de modo a colocar a expressão ou a transcrição da sequência de codificação a influência ou o controlo da regulamentação Sequências. Se a sequência de regulamentação é posicionada em relação ao gene de tal modo que a sequência de regulamentação é capaz de exercer um efeito mensurável sobre a quantidade de produto genético produzido, então a sequência de regulamentação está operavelmente ligada ao Gene. Se desejar que as sequências de codificação sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são a ser operavelmente Unidas se a indução de um promotor no 5 ′ sequências de regulamentação resulta na transcrição da sequência de codificação e se a natureza do a ligação entre as duas sequências de ADN não (1) resulta na introdução de uma mutação do alteração da estrutura, (2) interfere com a habilidade da região do promotor de dirigir a transcrição das sequências de codificação, ou (3) interferir com a habilidade do correspondente Transcrição do RNA a ser traduzida em uma proteína. Assim, uma região de promotor seria operada com uma sequência de codificação se a região do promotor fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de DNA de tal forma que a transcrição resultante pudesse ser traduzida para a proteína ou polipeptídio desejado.

[187] A natureza precisa das sequências regulamentares necessárias para a expressão gênica pode variar entre espécies ou tipos de células, mas deve, em geral, incluir, se necessário, 5 ' não-transcrever e 5 ' não traduzir sequências envolvidas com o início da transcrição e Tradução, respectivamente, como uma caixa Tata, sequência de nivelamento, sequência CAAT. Especialmente, tais 5 ' não transcrever sequências regulamentares incluirá uma região de promotor que inclui uma sequência de promotores para o controle de transcrição do gene operado com a companhia. As sequências de regulamentação também podem incluir sequências de aprimoramento ou sequências ativadoras á montante, conforme desejado.

[188] A "regulação" e "regular" referem-se à modulação da expressão gênica controlada por elementos de sequência de ADN localizados principalmente, mas não exclusivamente a montante de (5 ′ a) o início da transcrição de um gene. O Regulamento pode resultar em uma resposta a todos ou nenhuns à estimulação, ou pode resultar em variações no nível de expressão gênica.

[189] Em um aspecto mais adicional, a invenção diz respeito a uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão de acordo com a invenção.

[190] As "células", "células hospedeiras" ou "células hospedeiras recombinantes" são termos usados de forma intercambiável aqui. Entende-se que tais termos não se referem apenas às células específicas do assunto, mas à descendência ou descendentes potenciais de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer na geração bem-sucedida devido a uma mutação ou influências ambientais, tais descendências não podem, de fato, ser idênticas à célula-mãe, mas ainda estão incluídas no escopo do termo usado neste documento.

[191] A "célula hospedeira", como usado aqui, refere-se a células que podem ser transformadas com ADN nu ou vetores de expressão construídos utilizando técnicas de ADN recombinantes. Uma resistência à droga ou outro marcador selecionável destina- se em parte a facilitar a seleção dos transformadores. Adicionalmente, a presença de um marcador selecionável, tal como o marcador da resistência de droga pode ser do uso em manter microrganismos contaminantes da multiplicação no meio de cultura. Tal cultura pura da célula hospedeira transformada seria obtida cultivando as células em condições que requerem o fenótipo induzido para a sobrevivência.

[192] As células hospedeiras da invenção são transformadas ou transportadas com a expressão vector descrita aqui para exprimir a proteína de seda sintética da invenção. "Transformação", como é usado aqui, refere-se a um processo em que o genótipo de uma célula é alterado como resultado da absorção celular de DNA exógenos ou RNA, e, por exemplo, a célula transformada expressa uma forma recombinante da proteína de seda sintética desejada de aranha. O termo "transfecção" significa a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, ADN despido ou um vetor da expressão, em células do receptor pela transferência de gene mediada ácido nucleico.

[193] Em uma forma de realização específica, as células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão de acordo com a invenção são células de inseto. Como células de inseto, células de inseto Lepidoptera pode ser usado, mais especificamente células de Spodopterafrugiperda e de TrichoplusiaNi. Mais especificamente, a célula de inseto é um Sf9, Sf21 ou alto 5 células.

[194] Em algumas formas de realização, a proteína de seda da invenção é desprovida de modificações pós tradução.

[195] Em algumas formas de realização, a proteína de seda da invenção é biodegradável. [196] Esta característica pode ser de importância, por exemplo, no campo da medicina, sempre que as proteínas de seda são destinadas a um uso in vivo, em que a degradação biológica é desejada. Esta característica pode, em particular, encontrar aplicação em materiais de sutura e fechamento de feridas e sistemas de cobertura.

[197] De acordo com alguns aspectos, a invenção diz respeito a um vetor de expressão que compreende a sequência de ácidos nucleicos da invenção atual, onde a sequência de ácidos nucleicos está controle de expressão de um promotor operado e, opcionalmente, regulamentação Sequências.

[198] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas resulta em umaauto montagem com uma estrutura definida. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas está na forma de uma rede. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas está na forma de um complexo. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas induz uma estrutura secundária definida, por exemplo, uma volta beta, volta Gamma, folha beta, conformação de alfa-hélice, e assim por diante.

[199] De acordo com alguns aspectos, a mistura de proteínas divulgadas está na forma de uma fibra. Uma "fibra", como usado aqui, significa um cordão fino de material fibroso composto de dois ou mais filamentos torcidos juntos. Por "filamento" é significado um Delgado, alongado, objeto em forma de segmento ou estrutura de comprimento indefinido, variando de comprimento microscópico a comprimentos de uma milha ou maior. Especificamente, o filamento de seda sintético da aranha é microscópico, e é proteico. Por "biofilamento" significa um filamento criado a partir de uma proteína,

incluindo a proteína de seda produzida de uma aranha. Em algumas formas de realização, o termo "fibra" não engloba agregados ou precipitados não estruturados.

[200] Em algumas formas de realização, a fibra das proteínas é caracterizada pelo tamanho de pelo menos uma dimensão do seu (por exemplo, diâmetro, comprimento). Por exemplo, e sem limitação, o diâmetro da fibra é entre 10 Nm-1 µm, 20-100 nm, ou 10-50 nm.

[201] Em algumas formas de realização, a fibra é composta de nano-fibrilas. Em algumas formas de realização, o nano-fibrilas tem um diâmetro de por exemplo, 1 nm, cerca de 2 nm, cerca de 3 Nm, cerca de 4 nm, cerca de 5 nm, cerca de 6 nm, cerca de 7 nm, cerca de 8 nm, cerca de 9 nm, cerca de 10 nm, cerca de 11 nm, cerca de 12 nm, cerca de 13 nm , cerca de 14 nm, cerca de 15 Nm, cerca de 16 nm, cerca de 17 nm, cerca de 18 nm, cerca de 19 nm, cerca de 20 nm, cerca de 21 nm, cerca de 22 nm, cerca de 23 nm, cerca de 24 nm, cerca de 25 nm, cerca de 26 nm, cerca de 27 nm, cerca de 28 nm , cerca de 30 nm, cerca de 31 nm, cerca de 32 nm, cerca de 33 nm, cerca de 34 nm, cerca de 35 nm, cerca de 36 nm, cerca de 37 nm, cerca de 38 nm, cerca de 40 nm, cerca de 42 nm, cerca de 44 nm, cerca de 46 nm, sobre 48 nm, ou cerca de 50 NM , incluindo qualquer valor ou intervalo ali entre os mesmos. Em uma forma de realização, o nano-fibrilas tem um diâmetro de 3-7 nm. Em uma forma de realização, o nano-fibrilas tem um diâmetro de 4-6 Nm.

[202] Em algumas formas de realização, o comprimento da fibra divulgada está entre 1- 200 µm, 10-100 µm, 100 a 500 µm ou 200-500 µm.

[203] Em algumas formas de realização de qualquer uma das formas de realização descritas aqui, a fibra divulgada é caracterizada por uma estrutura porosa. Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 30% (por exemplo, de 30 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 50% (por exemplo, de 50 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 60% (por exemplo, de 60 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 70% (por exemplo, de 70 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 80% (por exemplo, de 80 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de pelo menos 90% (por exemplo, de 90 a 99%). Em algumas formas de realização, a estrutura porosa é caracterizada por uma porosidade de cerca de 90%.

[204] Aqui, o termo "porosidade" refere-se a uma percentagem do volume de uma substância (por exemplo, um material "como uma esponja") que consiste em vazios. Em outra forma de realização, a porosidade é medida de acordo com os vazios dentro da área de superfície dividida em toda a superfície (porosa e não porosa).

[205] Em algumas formas de realização, a estrutura porosa das fibras divulgadas permite absorver a água de forma eficiente na superfície da fibra. Isto é, e sem ser vinculado por qualquer teoria particular, esta descoberta surpreendente pode ser explicada em vista da estrutura de fibras divulgadas e sua porosidade que está em acentuada distinção de seda nativa aranha encontrada na natureza.

[206] Em algumas formas de realização de qualquer uma das formas de realização descritas aqui, a fibra divulgada é caracterizada por um diâmetro médio é nano dimensionada.

[207] Em algumas formas de realização, a fibra divulgada é caracterizada por um diâmetro médio em uma faixa de 1 a 50 nm. Em algumas dessas formas de realização, o diâmetro médio está em uma faixa de 3 a 50 nm. Em algumas dessas formas de realização, o diâmetro médio está em uma faixa de 5 a 50 nm. Em algumas dessas formas de realização, o diâmetro médio está em uma faixa de 1 a 40 nm. Em algumas dessas formas de realização, o diâmetro médio está em uma faixa de 1 a 30 nm. Em algumas dessas formas de realização, o diâmetro médio está em uma faixa de 5 a 40 nm. Como exemplificado na seção exemplos abaixo, em algumas formas de realização, uma pluralidade das fibras divulgadas pode ser na forma de estrutura ou matriz automontada. Em algumas formas de realização, esta matriz pode ser renderizada apropriada para aplicações biomateriais.

[208] Em algumas formas de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína em Said "m " tipos de proteínas compreende, independentemente, "n " repete de uma região repetitiva de uma proteína espidroínaampoladamaior (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento, onde m é um inteiro entre 2 a 70 e n é um inteiro entre 6 a 70. Em algumas formas de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína em Said "m " tipos de proteínas compreende, independentemente, "n " repete de uma região repetitiva de um espidroínaampoladamaior ( MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento, onde m é um número inteiro entre 2 a 70 e n é um número inteiro entre 7 a

70. Em algumas formas de realização, uma fibra ou uma mistura de proteínas compreende "m " tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína em Said "m " tipos de proteínas compreende, independentemente, "n " repete de uma região repetitiva de um espidroínaampoladamaior ( MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento, onde m é um número inteiro entre 2 a 70 e n é um número inteiro entre 8 a 70. Em uma forma de realização "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp) deve ser igual ou superior a 6, a fim de apoiar eficientemente o crescimento celular, expansão celular e proliferação, conjunto de células de várias camadas, migração de células, redução morte celular, regeneração de tecidos e/ou processos de cura. Em uma forma de realização "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp) deve ser igual ou superior a 7, a fim de apoiar eficientemente o crescimento celular, expansão celular e proliferação, conjunto de células de várias camadas, migração de células, redução morte celular, regeneração de tecidos e/ou processos de cura. Em uma forma de realização "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp) deve ser igual ou superior a 8, a fim de apoiar eficientemente o crescimento celular, expansão celular e proliferação, conjunto de células de várias camadas, migração de células, redução morte celular, regeneração de tecidos e/ou processos de cura. Em uma forma de realização "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp) deve ser igual ou superior a 9, a fim de apoiar eficientemente o crescimento celular, expansão celular e proliferação, conjunto de células de várias camadas, migração de células, redução morte celular, regeneração de tecidos e/ou processos de cura. Em uma forma de realização "n " repete-se de uma região repetitiva de uma grande proteína espidroínaampolada (MaSp) deve ser igual ou superior a 10, a fim de apoiar eficientemente o crescimento celular, expansão celular e proliferação, conjunto de células de várias camadas, migração de células, redução morte celular, regeneração de tecidos e/ou processos de cura.

[209] Em algumas formas de realização, esta matriz é adequada para o crescimento celular, e para manter ou promover a atividade celular, como demonstrados os prazos aqui abaixo.

[210] Em algumas formas de realização, o termo "auto montante refere-se a uma estrutura resultante de um processo de automontagem (por exemplo, processo de automontagem espontânea) com base em uma série de reações químicas associativas entre pelo menos dois domínios da (s) fibra (s), que ocorre quando os grupos de associação em um domínio estão em proximidade suficiente e são orientados de modo a permitir Associação construtiva com outro domínio. Em outras palavras, uma interação associativa significa um encontro que resulta no apego dos domínios de uma fibra ou fibras uns aos outros. Em algumas formas de realização, domínios anexados não são paralelos uns aos outros. Também são contemplados os arranjos em que há mais de dois domínios da estrutura montada, cada um acoplando um plano diferente.

[211] Em algumas formas de realização, a densidade do nano-fibrila também afeta as propriedades das fibras automontadas. Em algumas formas de realização, a densidade (em g/cm3) do nano-fibrila é de 0,5 a 1,5, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, incluindo todo o valor e escala ali entre as mesmas. Em formas de realização exemplares, a densidade de um único nano-fibrila é de cerca de 1,3 g/cm3.

[212] Éimportante salientar que, em algumas formas de realização, a densidade da fibra montada (por exemplo, cerca de 80% de vazios) está na faixa de 0,1 g/cm3 a 0,4 g/cm3 ou de 0,2 g/cm3 a 0,3 g/cm3. Em formas de realização exemplares, a densidade da fibra auto montante é aproximadamente 0,26 g/cm3.

[213] O estudo de umedecimento de superfícies em nano-escala resolução espacial e alta resolução temporal é um campo emergente de ambos os aspectos teóricos e práticos.

[214] Como demonstrado na seção de exemplos que se segue, a fibra divulgada exibiu um alto grau de molhabilidade da superfície exibindo uma habilidade notável para absorver fluidos em comparação com seu volume e peso. Os compostos e as propriedades mecânicas

[215] Em algumas formas de realização, o composto divulgado é caracterizado por uma propriedade mecânica melhorada em comparação com um material de referência. Em algumas formas de realização, o termo "material de referência" refere-se a uma mesma composição química como no composto, sendo livre de uma ou mais proteínas. Em algumas formas de realização, o termo "material de referência" refere-se a um polímero simples (i.e. não compreendendo as proteínas) com peso molecular polimérico (MW) como na composição.

[216] Em algumas formas de realização, o termo "material de referência" refere-se a um polímero simples com o mesmo monômero e configuração molecular (por exemplo, grau e tipo de cristalinidade). Em algumas formas de realização, o termo "material de referência" refere-se a um polímero liso com a mesma configuração molecular (por exemplo, grau e tipo de cristalinidade). Em algumas formas de realização, o termo "material de referência" refere-se a um polímero simples com uma espinha dorsal derivada das mesmas unidades monômeros. Em algumas formas de realização, o termo "material de referência " refere-se ao monômero correspondente.

[217] Por "Propriedade mecânica melhorada " destina-se a se referir a ter uma propriedade mecânica mais desejável.

[218] Em algumas formas de realização, o composto está na forma de uma matriz. Aqui, o termo "Matrix " (incluindo "Core Matrix "), pode se referir a uma matriz de várias camadas. Em algumas formas de realização, o termo "Matrix " refere-se a uma ou mais camadas de um ou mais polímeros que incluem ainda a mistura de proteínas incorporadas na (s) camada (s) e/ou interpostas entre as camadas.

[219] Em algumas formas de realização, a propriedade mecânica melhorada refere-se a um módulo elástico. Em algumas formas de realização, a frase "módulo elástico " refere-se ao módulo de Young. Em algumas formas de realização, a frase "módulo elástico " é determinada pela resposta de um material à aplicação de tensão elástica (por exemplo, de acordo com os procedimentos conhecidos na arte).

[220] Em algumas formas de realização, como mostrado na seção exemplos abaixo, a propriedade mecânica aprimorada refere-se ao módulo flexural. Como usado aqui e na arte, o módulo flexural (também conhecido como "módulo de flexão ") é a proporção de estresse para a tensão na deformação flexural, ou a tendência de um material para dobrar. O módulo flexural pode ser determinado a partir da inclinação de uma curva de tensão.

[221] Em algumas formas de realização, a propriedade é selecionada a partir de, sem ser limitado a ele, o módulo de Young, força elástica, tensão de fratura, ponto de rendimento, dureza, rigidez, resistência à fluência, trabalho-a-falha, estresse e percentual de alongamento.

[222] A rigidez refere-se à inclinação da porção linear de uma curva de deformação de carga. Trabalho para falha refere-se à área a curva de deformação de carga antes da falha. Cada um destes pode ser medido e calculado por métodos padrão conhecido na arte.

[223] Em algumas formas de realização, a resistência à tração de um material refere-se à quantidade máxima de estresse elástico que pode levar antes da falha, por exemplo, quebrando.

[224] Em algumas formas de realização, o termo "força elástica" como é usado aqui é a quantidade máxima de força medida por exemplo, em Newton ' s que um material pode suportar sem ou antes de rasgar, quebrar, pescoço formando micro rachaduras ou fraturas.

[225] Por "rasgando, quebrando, dando forma a micro rachaduras ou fraturas " destina-se a se referir a uma deformação permanente. Em algumas formas de realização, o termo "deformação permanente " não inclui micro rachaduras ou fraturas. Em algumas formas de realização, por "deformação permanente " destina-se a referir-

se em relação a pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, ou 1% da dimensão original ou estrutura, incluindo qualquer valor ali entre os mesmos.

[226] Em algumas formas de realização, o termo "cepa de fratura" significa a tensão (deslocamento) na fratura, conforme determinado por exemplo, pela curva de tensão em um teste de tração.

[227] Em algumas formas de realização, o termo "Ponto de escoamento " refere-se ao estresse no qual a curva de tensão tem um platô e o limite elástico é atingido.

[228] Como usadoaqui, "fluência " é uma medida da variação na tensão elástica quando uma amostra de polímero é submetida a um stress de tração constante, por exemplo, a gravidade ou aplicada estresse mecânico ou físico. Diferentemente, fluência é a tendência de um material contínuo a mover-se lentamente ou deformar-se permanentemente a influência de um esforço elástico constante. Como usado aqui, o termo resistênciafluência refere-se a capacidade de um polímero para resistir a qualquer tipo de distorção quando uma carga durante um longo período de tempo. "Resistência à fluência aprimorada " refere-se à melhoria por exemplo, 20% do tempo para, por exemplo, 5% de tensão elástica.

[229] Em algumas formas de realização, o termo "stress no alongamento" refere-se à força que atua sobre o material na condição esticada. Por exemplo, "estresseà 100% alongamento " refere-se à força que atua sobre o material esticado para o dobro do seu comprimento.

[230] Em algumas formas de realização, uma ou mais propriedades selecionadas do módulo de Young, a resistência à tração, o ponto de escoamento e o stress no alongamento, são reforçados por exemplo, pelo menos 1%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% , pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos em 24%, pelo menos 25% , pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou pelo menos 500%.

[231] Em algumas formas de realização, pelo menos duas propriedades selecionadas do módulo de Young, a resistência à tração, o ponto de escoamento e o stress no alongamento, são reforçados por exemplo, pelo menos 1%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% , pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos em 24%, pelo menos 25% , pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou pelo menos 500%.

[232] Em algumas formas de realização, pelo menos três propriedades selecionadas do módulo de Young, a resistência à tração, o ponto de escoamento e o esforço de alongamento são reforçados por exemplo, pelo menos 1%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% , pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos em 24%, pelo menos 25% , pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou pelo menos 500%.

[233] Em algumas formas de realização, o módulo do jovem é aprimorado por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos em 20%, pelo menos em 21%. , pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, ou pelo menos 500%.

[234] Em algumas formas de realização, a força elástica é reforçada por e.g., pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos

19%, pelo menos em 20%, pelo menos em 21%. , pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, ou pelo menos 50%.

[235] Em algumas formas de realização, o ponto de produção é aprimorado por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos em 20%, pelo menos em 21%. , pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, ou pelo menos 50%.

[236] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 1% da força estrutural resulta da fibra proteica.

[237] Sem ser vinculado por qualquer teoria particular, deve-se entender que a mistura de proteínas resulta em um auto montantebem sucedido que, por sua vez, resulta em uma fibra de proteína. A aplicação de um composto polimérico é derivada da (s) fibra (s) nela (s) incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 5% da força estrutural resulta da incorporação das fibras proteicas. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 10% da força estrutural resulta da incorporação da fibra proteica.

[238] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 20% da força estrutural resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 30% da força estrutural resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada.

[239] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 1% da força elástica resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 5% da força elástica resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 10% da resistência à tração resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força estrutural, onde mais de 20% da resistência à tração resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada. Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma força elástica, onde mais de 30% da força estrutural resulta da (s) fibra (s) de proteína incorporada.

[240] Em algumas formas de realização, a frase "força estrutural ", como usado aqui, refere-se às propriedades mecânicas, tais como, sem ser limitado a ele, módulo elástico, tensão elástica, alongamento (estirpe) e dureza [e.g., combinação de tensão elástica e alongamento (estirpe)].

[241] Em algumas formas de realização, o termo "polímero ", como usadoaqui através do mesmo, descreve uma substância, por exemplo, uma substância orgânica, mas, alternativamente, uma substância inorgânica, composta de uma pluralidade de repetição de unidades estruturais (referida de forma intercambiável como unidades de backbone ou unidades monômeros) covalentemente conectados uns aos outros e formando a espinha dorsal polimérico do polímero. O termo "polímero " utilizado neste documento engloba polímeros orgânicos e inorgânicos e engloba ainda um ou mais homopolímero, um copolímero ou uma mistura destes (por exemplo, uma mistura). O termo "homopolímero " como usado aqui descreve um polímero que é composto de um tipo de unidades monômeros e, portanto, é composta de unidades de backboneHomogênea. O termo "copolímero " como usado aqui descreve um polímero que é composto de mais de um tipo de unidades monômeros e, portanto, é composta de unidades de backbone profissionalmente heterogêneo. As unidades de backbone profissionalmente heterogêneo podem diferir uns dos outros pelos seus grupos pendentes.

[242] Por uma questão de simplicidade, os termos "polímero " e "backbone polimérico " como usadoaqui através do mesmo de forma intercambiável, referem-se tanto a homopolímeros, copolímeros e suas misturas.

[243] Em algumas formas de realização, o polímero é hidrofóbico. Em algumas formas de realização o polímero é curado UV.

[244] Em algumas formas de realização, o composto divulgado é tabelabios. Em algumas formas de realização, o composto divulgado é biocleavel. Em algumas formas de realização, o composto divulgado é biodegradável.

[245] Em algumas formas de realização, o termo "tabelabios " descreve um composto ou um polímero que permanece intacto em condições fisiológicas (por exemplo, não é degradado in vivo, e, portanto, não é biodegradável ou não-biocleavel).

[246] Em algumas formas de realização, o termo biodegradável descreve uma substância que pode se decompor condições fisiológicas e/ou ambientais em produtos de discriminação. Tais condições fisiológicas e/ou ambientais incluem, por exemplo, hidrólise (decomposição via clivagem hidrolítica), catálise enzimática (degradação enzimática) e interações mecânicas. Este termo refere-se tipicamente às substâncias que decompõem estas condições tais que 50 por cento do peso da substância decompõem dentro de um período de tempo mais curto do que um ano.

[247] Em algumas formas de realização, o termo "biodegradável " como usado no contexto de formas de realização da invenção, também engloba o termo "bioreabsorvíveis", que descreve uma substância que se decompõe em condições fisiológicas para quebrar os produtos que submeter-se bioreabsorção ao organismo hospedeiro, ou seja, tornar-se metabolitos dos sistemas bioquímicos do organismo hospedeiro. Os polímeros

[248] Em algumas formas de realização, o polímero é ou compreende um polímero sintético. Em algumas formas de realização, o polímero é ou compreende um polímero natural. UM polímero natural pode referir-se a um polímero feito de, sem limitação, uma fonte natural, tais como plantas, fontes de animais e minerais, ou pode ser tecida a partir de fibras naturais, tais como algodão, linho, juta, linho, rami, sisal e cânhamo, uma estrutura de fibras de queratina (cabelo) e lã.

[249] Outro polímero natural exemplar é composto por polilactida, colágeno, queratina, celulose, atina, miosina, chita, seda Bombyxmori.

[250] Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero termoplástico. Em algumas formas de realização, o polímero é um termofixo. Em algumas formas de realização, o polímero é um epóxi. Em algumas formas de realização, o polímero é poliéster (por exemplo, poliésteres alifáticos). Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado a partir do grupo composto por Poliamidas, poliuretano e nylons. [251] Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero cruzado. Em algumas formas de realização, o polímero é copolímero. Em algumas formas de realização, o polímero está na forma de um hidrogel.

[252] Em algumas formas de realização, os materiais poliméricos são dois ou mais materiais-componente (por exemplo, copolímero). Como demonstrado na seção de exemplo que segue, componente (também conhecido como "parte ") a pode ser o principal (base) de polímero, e parte B pode ser, por exemplo, um endurecedor ou um catalisador.

[253] As famílias de substâncias químicas endurecedoras variam de acordo com a base do polímero, mas inclui aminas, isocianatos, peróxidos e poucos outros.

[254] O copolímero pode ser produzido por um mecanismo selecionado do processo de polimerização radical (por exemplo, usando Azobisisobutironitrila (abreviado AIBN)), uma polimerização de etapa de crescimentoe uma polimerização de crescimento em cadeia.

[255] O termo "epóxi ", como é usado aqui, refere-se a um grupo reativo que é uma molécula heterocíclicos de três membros com um oxigênio e dois grupos de metileno, com uma fórmula molecular de-C2H3O.

[256] Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado de, sem ser limitado a, polímeros de cristal líquido, anidrido masculino enxertado polipropileno, poliamida poliamidas 4, 6, nylon 6, nylon 6, 6, nylon 11, nylon 12, poliacrilatos, como PMMA ( polimetilmetacrilato), poli(arilamida, polietileno (PE), PE de alta densidade (HDPE), PE de baixa=-densidade (LDPE), polietileno ultra-high-molecular-peso (UHMWPE), tereftalato de polibutileno, tereftalato de polietileno, sulfeto de polifenileno, pollifitalamida, polipropileno, poliestireno, poli (fluoreto de vinilideno), poli (2-hidroxietil metacrilato) (pHEMA), poliuretano termofixo e termoplástico, policarbonato, polivinilbutiral, copolímero de álcool em vinil de etileno, cloreto de polivinila ( PVC), polímeros Fluroinatada tais como politetrafluoretileno (PTFE), ácido poliláctico (PLA) ou um copolímero dele (por exemplo, poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), policaprolactona (PCL) ou um copolímero, polietileno glicol, látex, borracha (por exemplo, natural borracha, borracha sintética, borracha de butadieno, borracha de estireno-butadieno, borracha de cloropreno, borracha de butil, borracha do nitrilo, borracha de isopreno, borracha de poliuretano, acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS)), polieterketona (PEK), polieter (Peek), polieterketoneketona (PEKK) e polieteretherketoneketona (PEEKK). Elastômeros termoplásticos, borracha copolímero de estireno-butadieno (SBR)), xantana, celulose, colágeno, elastina, queratina, algodão, lã, seda e qualquer combinação ou mistura dessas.

[257] Por "celulose " destina-se também a incluir um derivado do mesmo, incluindo, sem ser limitado a ele, nitrato de celulose, celulose triacetil (TAC) e propionato de acetato de celulose (cap).

[258] Em algumas formas de realização, o polímero é selecionado a partir de, sem ser limitado, materiais utilizados como adesivos, selecionados a partir de, sem ser limitado a, epóxi, cianoacrilato, poliésteres, poliois, poliuretanos, e poliamidas.

[259] Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero derivado da proteína. [260] Em alguns o polímero derivado da proteína não é derivado da proteína do MaSp.

[261] Em algumas formas de realização, o polímero é um polímero derivado da não- proteína.

[262] Como usado aqui, o termo "hidrogel " refere-se a uma rede tridimensional fibrosa contendo de cerca de 50%, ou de cerca de 80%, e até 99,9% (por massa) de água. Um hidrogel pode ser considerado como um material que é na maior parte água, contudo se comparar como um sólido ou um semissólido devido a uma rede tridimensional do ligado dentro do líquido, feito de correntes poliméricos naturais e/ou sintéticas.

[263] De acordo com algumas formas de realização da presente invenção, um hidrogel pode conter cadeias de polímeros de vários comprimentos e composições químicas que podem originar-se de monômeros, oligômeros, unidades poliméricos, que são interligadas (ligado) por ligações químicas (por exemplo, covalentes, hidrogénio e ligações iônicas/complexas/metálicas).

[264] Em algumas formas de realização, o hidrogel pode conter elementos poliméricos e/ou fibrosos que não estão quimicamente ligados à rede ligado principal, mas que são, em vez disso, entrelaçados mecanicamente e/ou imersos nelas. Tais elementos fibrosos macromolecular podem ser tecidos (como, por exemplo, uma estrutura de malha), ou não-tecidos, e podem, em algumas formas de realização, servir como materiais de reforço da rede fibrosa do hidrogel. Exemplos não-limitantes de tais macromoléculas incluem policaprolactone, gelatina, metacrilato de gelatina, alginato, metacrilato de alginato, quitosana, quitosana metacrilato, glicol quitosana, glicol quitosana metacrilato, ácido hialurônico (ha), ha metacrilato, e outros não-ligado natural ou sintético cadeias poliméricos e os gostos.

[265] Em algumas formas de realização, o hidrogel pode conter elementos adicionais que o tornam útil para aplicações específicas, tais como agentes terapêuticos e de rotulagem, como estes são discutidos abaixo, andaime e outros elementos estruturais, células vivas, celulares componentes e assim por diante.

[266] Em algumas formas de realização, o material polimérico, por exemplo, hidrogel ainda compreende um ou mais construtores de surfactantes, espessantes e uma ou mais enzimas.

[267] Em algumas formas de realização, hidrogéis pode tomar uma forma física que varia de soft, frágil e fraco para o material duro, elástico e resistente. O hidrogéis macio pode caracterizar-se por parâmetros reológicas, incluindo parâmetros elásticos e viscoelástico, enquanto os hidrogéis rígidos são mais adequadamente caracterizados por parâmetros de resistência à tração, elástico, armazenamento e perda modular, uma vez que estes termos são definidos aqui acima ou são conhecidos na arte.

[268] Em algumas formas de realização, o termo "termofixo" refere-se a um polímero sintético que foi irremediavelmente curado por qualquer técnica, incluindo a cura por aquecimento, por reação química (por exemplo, como em epóxi) ou irradiação. Exemplos de polímeros térmicos incluem, sem limitação, os poliésteres termofixo (por exemplo, como usado em fibra de vidro), poliuretanos, borrachas vulcanizada, fenol- formaldeído (por exemplo, polímero de baquelite ®), Duroplast, uréia-formaldeídos (por exemplo, como usado em contraplacado), resinas de melamina, resinas epóxi, poliamidas, ésteres ciane e policianuratos.

[269] Em algumas formas de realização, o termo "termoplástico " refere-se a um polímero que é suficientemente macio acima de uma certa temperatura, de modo a permitir prontamente a deformação plástica do polímero, e que é suficientemente rígida abaixo de uma certa temperatura, de modo a reter um forma desejada. O abrandamento de um polímero termoplástico ocorre frequentemente a temperaturas próximas e/ou acima de uma temperatura de transição (por exemplo, uma temperatura de transição de vidro, um ponto de fusão) do polímero. Tal temperatura de transição pode ser determinada, por exemplo, por calorimetria.

[270] Afrase "temperatura de amaciamento ", tal como aqui utilizada, refere-se à temperatura mais baixa entre a faixa de temperatura de transição de vidro de um polímero termoplástico.

[271] Em algumas formas de realização, uma concentração total (também referida como "% carregando" ou "% enriquecendo") das proteínas dentro do composto varia de cerca de 0,1 peso por cento para cerca de 10 por cento de peso do peso total da composição. Em algumas formas de realização, uma concentração total das proteínas dentro do composto varia de aproximadamente 0,5 peso por cento a aproximadamente 3 por cento do peso.

[272] Em algumas formas de realização, uma concentração total das proteínas dentro do composto é, por exemplo, cerca de 0,1 peso por cento, cerca de 0,5 peso por cento, cerca de 1 peso por cento, cerca de 1,5 peso por cento, cerca de 2% de peso, cerca de 2,5 peso por cento, cerca por cento, cerca de 3,5 peso por cento, cerca de 4% de peso, cerca de 4,5 peso por cento, cerca de 5 por cento de peso, cerca de 5,5 peso por cento, cerca de 6 peso por cento, cerca de 6,5 peso por cento, cerca de 7 por cento de peso, cerca 8,5 peso por cento, cerca de 9% de peso, cerca de 10% de peso, cerca de 20 por cento de peso, cerca de 30% de peso, cerca de 40 peso por cento, cerca de 50 peso por cento, incluindo qualquer valor ou intervalo ali entre os mesmos.

[273] Em algumas formas de realização, o polímero compreende um ou mais aditivos que não as proteínas divulgadas. Em algumas formas de realização, o termo "aditivo "

pode referir-se a um material que pode ser adicionado a um material polimérico sem ser prejudicial ao seu uso pretendido. Em algumas formas de realização, os aditivos são selecionados a partir do grupo consistindo, e sem ser limitado a ele, um antioxidante, um pigmento, um aditivo antiestático, e um retardador de chama. Em algumas formas de realização, os aditivos são usados para facilitar e/ou controlar o carregamento da mistura de proteína nele/lá. Em algumas formas de realização, o termo "aditivo " refere-se a um surfactante ou a um dispersante.

[274] Em algumas formas de realização, o aprimoramento de uma ou mais propriedades mecânicas como descrito aqui acima (por exemplo, módulo de Young, força elástica, ponto de produção e estresse no alongamento) correlaciona-se com a concentração total das proteínas. O termo "correlaciona " ou "correlacionar " como usado aqui refere-se a uma associação entre instâncias de dois eventos, por exemplo, tendo uma relação causal, complementar, paralela ou recíproca, entre o carregamento% e as propriedades mecânicas da composição.

[275] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas e o polímero são substancialmente em um contato contíguo.

[276] Em algumas formas de realização, o polímero é transparente e é assim adequado para uso onde a visão é uma exigência, por exemplo, janelas de veículos, etc.

[277] Em algumas formas de realização, o polímero é substancialmente uma placa, se curvo, plana, compreendendo uma ou mais superfícies planas substancialmente, ou uma combinação deles, por exemplo, de modo a evitar a formação de pontos fracos, e/ou permitir contato substancialmente contíguo com as proteínas.

[278] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas e o polímero são, pelo menos, parcialmente em um contato contíguo. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas e o polímero são substancialmente em um contato contíguo.

[279] Em algumas formas de realização, a mistura divulgada de proteínas e/ou a fibra divulgada derivada da mistura de proteínas é definida como ainda mais composta por um vinculador. Tal um vinculador pode ser um moiety químico que serve para acoplar outro agente, moiety de destino, ou uma superfície, enquanto não afetando adversamente a função de segmentação, ou segmentação moiety.

[280] Em algumas formas de realização, uma pluralidade da mistura divulgada de proteínas e/ou a fibra divulgada derivada da mistura de proteínas são não- covalentemente anexado a um outro (por exemplo, por ligação eletrostática).

[281] Em algumas formas de realização, uma pluralidade da mistura divulgada de proteínas e/ou a fibra divulgada derivada da mistura de proteínas são covalentes em ligação cruzada a uma outra. Em algumas formas de realização, a forma cruzada da fibra é reversível (por exemplo, por aquecimento).

[282] Em algumas formas de realização, a ligação cruzada covalente é afetada na vivo. Alternativamente, a ligação cruzada covalente é afetada ex vivo.

[283] Em algumas formas de realização, a presença de cruzamento covalente está associada a uma propriedade mecânica mais forte, como descrito neste documento.

[284] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é anexada ou depositada em pelo menos uma superfície de um polímero.

[285] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é anexada ou depositada em pelo menos uma superfície de um substrato inorgânico. Substratos exemplares de substrato inorgânicos constituem um ou mais materiais selecionados de, mas não limitados a, silício, cerâmica como alumina, Titania, níquel, vidro, Nitinol etc.

[286] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é anexada ou depositada em pelo menos uma superfície do polímero através de um vinculador. Em algumas formas de realização, o vinculador é um vinculador orgânico. Em algumas formas de realização, o vinculador é um vinculador inorgânico. Em uma forma de realização, o vinculador orgânico é um único, vinculador cadeia reta. Em algumas formas de realização, o vinculador também pode incluir cadeias ramificadas.

[287] Em algumas formas de realização, o vinculador também pode incluir vinculadores não-clivados (por exemplo, compostos por ligações dissulfeto).

[288] Os vinculadores exemplares adicionais podem ser agentes solúveis em água, incluindo, sem limitação, pontes heterofuncional como 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES), NHS (N-Hidroxisuccinimida), peguilado aminoácido da forma carboxi-Peg-

amina contendo quatro ou mais unidades de polietileno glicol, e BS3 (bis [sulfosuccinimidil] suberato).

[289] Os vinculadores exemplares adicionais podem ser agentes solúveis em água, incluindo, sem limitação, n'-Diisoproplcarbodiimida (DIC), Carbonyldiimidazol (CDI), 4- (dimetilamino) piridina (DMAP), glutaraldeído (GA).

[290] Em algumas formas de realização, um vinculador funcionaliza as fibras com outros grupos funcionais, por exemplo, para um maior apego ou criação de laços covalentes com as matrizes de polímeros testados.

[291] Em algumas formas de realização, o termo "vinculador" refere-se a uma ligação, por exemplo, uma ligação covalente. Em uma forma de realização, o vinculador orgânico compreende o grupo reativo que forma uma parte do vinculador.

[292] Comousado aqui, a frase "grupo reativo " descreve um grupo químico que é capaz de passar por uma reação química que normalmente leva a uma formação de vínculo. [293] Reações químicas que levam a uma formação de vínculo incluem, por exemplo, nucleofílica e eletrofílica substituições, nucleofílica e eletrofílica reações de adição, alquilos, reações de eliminação de adição, reações cicloadição, reações de rearranjo e quaisquer outras reações orgânicas conhecidas que envolvam um grupo funcional, bem como suas combinações.

[294] O grupo reativo pode, opcionalmente, incluir uma porção não reativa (por exemplo, um alquil) que pode servir, por exemplo, para anexar uma parte reativa do grupo reactivo a um moiety.

[295] Emformas de realização exemplares, o vinculador é composto por um grupo carbonila, Amina ou sulfidrila ou grupo carboxílicos.

[296] Em algumas formas de realização, o vinculador pode criar um grupo intermediário que facilite outros grupos funcionais para atuarem como um grupo nucleófilo de outra forma.

[297] Em algumas formas de realização, o termo "vinculador inorgânico" refere-se a uma entidade vinculativa inorgânica, como, sem limitação, um grupo Silanol.

[298] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma espessura de e.g., 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 30 µm, 40 µm, 50 µm, 60 µm , 70 µm, 80 µm, 90 µm, 100 µm, 200 µm, 300 µm, 400 µm, 500 µm, 600 µm, 700 µm, 800 µm, 900 µm, 1 mm, 10 mm, 50 mm, 100 mm, incluindo qualquer valor ou faixa ali entre os mesmos.

[299] Em algumas formas de realização, a composição é caracterizada por uma espessura de por exemplo, pelo menos 100 nm, pelo menos 200 nm, pelo menos 300 nm, pelo menos 400 nm, pelo menos 500 nm, pelo menos 600 nm, pelo menos 700 nm, pelo menos 800 nm, pelo menos 900 nm , pelo menos 1 µm, pelo menos 5 µm, pelo menos 10 µm, pelo menos 20 µm, pelo menos 30 µm, pelo menos 40 µm, ou pelo menos 50 µm.

[300] Em algumas formas de realização, as fibras divulgadas são anexadas a uma superfície de metal ou a um material polimérico. Em algumas formas de realização, as fibras divulgadas revestem um metal ou um material polimérico.

[301] Comousado aqui, o termo "Coat " é usado para identificar pelo menos 10%, 20%, 30% 50, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% cobrindo de uma parte externa revestida (substrato).

[302] Em algumas formas de realização, um processo de revestimento é aplicado para depositar a fibra divulgada em pelo menos uma porção de uma superfície do substrato.

[303] Exemplos não-limitantes do método do revestimento incluem o revestimento do mergulho, revestimento do pulverizador, revestimento da escova, revestimento da faca, revestimento do rolo, revestimento do carretel-à-carretel, revestimento da rotação, revestimento da cópia, impressão da tela e carcaça da película. Conforme descrito na seção exemplo abaixo, em alguma forma de realização, o revestimento da fibra divulgada em uma métrica (um stent) é aplicado por um processo de fiação eletro. Os artigos

[304] De acordo com um aspecto de algumas formas de realização da presente invenção, é fornecido um artigo (por exemplo, um artigo de fabricação) que compreende o composto descrito aqui.

[305] Em algumas formas de realização, o artigo é um dispositivo médico. Em algumas formas de realização, a frase "dispositivo médico " refere-se a qualquer dispositivo utilizado no tratamento de um assunto, preferencialmente um sujeito humano.

[306] Em algumas formas de realização, o dispositivo médico é um dispositivo médico implantável. O dispositivo médico pode ser usado para implantação, injeção, ou de outra forma colocado totalmente ou parcialmente dentro do corpo, e, portanto, é desejável que o dispositivo será um dispositivo de eluidor de drogas. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico é para aplicações transdérmicas e/ou tópicas em um assunto. Tal dispositivo médico deve causar irritação do tecido mínimo quando usado para tratar um determinado tecido e, portanto, a inclusão de drogas com isso é benéfico. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico é um dispositivo médico implantado, por ser implantado em um órgão corporal de um sujeito.

[307] Afrase "dispositivo implantável " é usada aqui para descrever qualquer dispositivo médico que é adequado para ser colocado dentro de uma cavidade corporal para um prolongado (por exemplo, de algumas horas, a alguns anos e até mesmo para a vida) período de tempo.

[308] Os dispositivos implantáveis exemplares não limitantes incluem, uma placa, uma malha, um parafuso, um pino, uma tachinha, uma haste, uma âncora de sutura, enxertos de aorta, tubulação arterial, articulações artificiais, membranas oxigenadoras do sangue, tubulação do oxigenador sanguíneo, implantes corporais, cateteres, membranas de diálise, sistemas de entrega de medicamentos, endoproteses, tubos endotraqueal, fios-guia, válvulas cardíacas, balões intra-aórtico, marca-passo, ligações em marca-passo, stents, membranas ultrafiltração, enxertos vasculares, tubos vasculares, tubos venosos, fios, implantes ortopédicos, bombas de difusão implantadas e portas de injeção.

[309] Os dispositivos exemplares que podem ser usados para aplicação transdérmica incluem, sem limitação, uma sutura, um emplastro adesivo e um remendo da pele. Outros dispositivos exemplares que podem ser usados para aplicação tópica incluem, sem limitação, uma sutura, uma tira adesiva, uma atadura, um emplastro adesivo, um curativo e um remendo da pele.

[310] Os dispositivos exemplares não limitantes adicionais incluem um grampo ou um plugue da anastomose, um implante ou um dispositivo dental, um dispositivo do enxerto do aneurisma aórtico, um shunt do atrioventricular, um cateter da hemodiálise,

um dispositivo de cura da fratura óssea, um dispositivo de recolocação do osso, um dispositivo de substituição comum, um dispositivo de regeneração de tecidos, um enxerto de hemodiálise, um cateter arterial de habitação, um cateter venoso de habitação, uma agulha, um dispositivo de fecho séptico, um stent por exemplo, stent vascular, um stent traqueal, um stent esofágico, um stent uretral , um stentretal, um enxerto de stent, uma sutura, um fio, um tubo, um oclusão vascular de aneurisma, um grampo vascular, um filtro protético vascular, uma bainha vascular e uma porta de entrega de droga, uma válvula venosa e um arame.

[311] Exemplos de sítios corporais onde um dispositivo médico pode ser implantado incluem, sem limitação, pele, couro cabeludo, cabelo, uma camada dérmica, um olho, uma orelha, um pequeno tecido intestinal, um grande tecido intestinal, um rim, um pâncreas, um fígado, um tecido digestivo ou cavidade, um tecido do trato respiratório ou cavidade, um osso, uma articulação, um tecido de medula óssea, um tecido cerebral ou cavidade, uma membrana mucosa, uma membrana nasal, o sistema sanguíneo, um vaso sanguíneo, um músculo, um tecido pulmonar ou cavidade, um tecido abdominal ou cavidade, uma artéria , uma veia, um capilar, um coração, uma cavidade cardíaca, um órgão reprodutivo masculino, um órgão reprodutivo feminino e um órgão visceral.

[312] Como observou aqui acima, em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é um stent. O stent pode ser de vários tipos, formas e materiais. Qualquer stent disponível comercialmente, presentemente ou no futuro, pode ser utilizado de acordo com as incorporações da invenção.

[313] Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é um enxerto vascular artificial. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é um diafragma artificial da bomba cardíaca, folhetos da válvula cardíaca implantável. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é um andaime de tecido.

[314] Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é um implante ortopédico. Em algumas formas de realização, o dispositivo médico implantável é selecionado a partir de, sem ser limitado a ele, implante dentário, enchimento de cavidade, e dispositivo ortodôntico.

[315] Os compostos da invenção e dos artigos que compreendem o mesmo podem ser usados mais para a proteção de uma ameaça cinética. O artigo pode ter uma forma selecionada a partir de, sem ser limitado a isso, uma armadura, um colete à prova de bala, uma armadura, um painel de porta, um painel de chão, um painel de parede, uma janela reforçada, um tubo, um capacete, vidro, um assento, uma aeronave, um veículo blindado, e um motor Veículo. Por exemplo, o artigo é útil para proteger um objeto de uma ameaça cinética. Que o, o composto divulgado (e/ou artigo que inclui o mesmo) pode fornecer proteção contra múltiplos hits de ameaças cinéticas, tais como balas de espingarda. O método de proteger um objeto de uma ameaça cinética que inclui fornecer o objeto com o artigo descrito aqui, isto é, compreendendo o composto como descrito acima.

[316] Em algumas formas de realização, o artigo é selecionado a partir do grupo composto por: uma pílula, um comprimido, uma cápsula, e um gel-Cap. Outros exemplos não-limitantes de artigos de acordo com a invenção incluem tiras adesivas médicas, enxertos de pele, ligamentos de substituição e malha cirúrgica; e em uma escala larga de produtos industriais e comerciais, tais como a tela da roupa, forro da veste à prova de balas, tela do recipiente, saco ou cintas da bolsa, cabo, corda, linha de pesca, material obrigatório adesivo, material não-adesivo da ligação, material de cintagem, tampas e peças automotivas, material de construção de aeronaves, material de impermeabilização, material de partição flexível, equipamentos esportivos; e, de facto, em quase todo o uso da fibra ou da tela para que a força e a elasticidade de alta elasticidade são características desejadas. A adaptabilidade e o uso do produto da fibra estável em outras formas, tais como um revestimento seco do pulverizador, grânulo- como partículas, ou uso em uma mistura com outras composições são contemplados também pela invenção atual.

[317] Em algumas formas de realização, o artigo é estável em condições fisiológicas como descrita acima (por exemplo, sendo tabelabios).

[318] Em algumas formas de realização, o artigo é composto por um tecido. Em algumas formas de realização, o termo"tecido” refere-se a um artefato de tecido ou não tecido feito da fibra da proteína da invenção. Opcionalmente, a tela é feita com um tamanho de forma, dimensão, porosidade e/ou poro controlado.

[319] Em algumas formas de realização, o artigo é caracterizado por um isolamento térmico. Em algumas formas de realização, o artigo é composto de material plástico rígido, poliuretano com alto grau de resistência térmica e, portanto, agindo como isolamento térmico. O uso deste material como isolamento térmico é conhecido na arte, como o isolamento térmico incluído em veículos e equipamentos refrigerados.

[320] Nasformas de realização ainda o artigo divulgado ou composto pode ser uma composição de cosmética. O termo "composição cosmética" refere-se a uma composição, tendo a pele benéfica ou outras propriedades estéticas de tecido superficial, como melhoria ou aumentando o tom de pele e cor, reforço de estruturas de queratina, melhora o cabelo e as unhas e chicotes do olho lisura, espessura, cor do cabelo e brilho, cabelo, alisamento, esconder imperfeições de tecidos superficiais como manchas e cicatrizes, ou prevenção de danos futuros ou cumulativo, como a luz solar, danos e envelhecimento da pele. Neste documento por "melhoramento" também deve ser incluído o reforço, coloração, alongamento e espessamento.

[321] Composições dermatológicas ou cosméticas para o tratamento de acordo com a invenção são aplicadas topicamente na epiderme como pomada pomadas, loções, cremes e géis e nas membranas mucosas como as emulsões Água tais como cremes, loções ou géis. Os produtos cosméticos podem ser produzidos usando uma composição tal incluir produtos como creme de barbear, creme para as mãos, xampu, sabonete, condicionador, creme de corpo, pele-proteção do sol, creme facial ou loção para o corpo. [322] A relação dos componentes da composição de cosméticos pode ser ajustada de acordo com a aplicação planejada da composição cosmética.

[323] Outras artigos são selecionados a partir, mas não estão limitados a, aditivo para materiais de impressão 3D, tais como tinta relacionados com materiais, polímeros termoplásticos para FDM (Modelagem por Deposição de Material Fundido) e pós de polímero para SLS (sinterização seletiva a laser), diafragmas de alto-falantes, filtros e sequências de caracteres. O processo de

[324] A presente invenção fornece também um processo de fabricação do composto divulgado, compreendendo a etapa de anexar a mistura de proteínas para o polímero, a fim de formar o composto.

[325] Em algumas formas de realização, o processo é composto por uma etapa de fusão do polímero para produzir um polímero fundido e transformando o polímero fundido com a mistura de proteínas. Em geral, transformando o polímero derretido em uma forma final inclui resfriamento o polímero fundido, para que a estrutura desejada do composto de polímero-proteínas ou matriz é formada.

[326] Métodos exemplares para moldar o composto na forma desejada incluem métodos conhecidos na arte de polímeros tais como moldagem, moldagem por injeção, moldagem por compressão e extrusão do polímero fundido.

[327] Em algumas formas de realização, anexar a mistura de proteínas para o polímero inclui entrar em contato com a mistura de proteínas com o polímero de modo a causar a mistura de proteínas para aderir ao polímero, por exemplo, pela composição, conforme descrito na seção de exemplos abaixo. Tais formas de realização são úteis quando os dois componentes (ou seja, o polímero e a mistura de proteínas) são mutuamente aderentes, ou por exemplo, quando localizado o derretimento do apenas a superfície de contato do polímero produz um vínculo suficientemente tenaz de proteínas e o polímero, por exemplo, produzir um composto unitário.

[328] Em algumas formas de realização, anexar o polímero e a mistura de proteínas inclui as proteínas transformando o polímero fundido e mantendo contato do polímero e a mistura de proteínas. Em algumas formas de realização, o polímero é colocado dentro de um molde ou o polímero fundido é colocado para o molde.

[329] Em algumas formas de realização, anexar o polímero e a mistura de proteínas inclui o uso de pelo menos um adesivo (por exemplo, uma resina termofixa (polímero) ou uma resina termoplástica como discutida acima) para auxiliar a anexar o polímero para a mistura de proteínas. Em algumas formas de realização, usando um adesivo inclui aplicar o adesivo, por exemplo através da pulverização do adesivo, pintando o adesivo, escovando o adesivo, depositando o adesivo, derramando o adesivo ou colocando uma folha de adesivo para um ou ambos os dois componentes. Em algumas formas de realização, os dois componentes são posteriormente reuniu e mantidos firmemente no lugar, normalmente, mas não exclusivamente com aquecimento, até o adesivo de moda. [330] Algumas formas de realização, um promotor de aderência é aplicado para a superfície de contato do polímero para aumentar a tenacidade de adesão do adesivo para o polímero. Em algumas formas de realização, o polímero inclui pelo menos um promotor de aderência. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas inclui um ou mais promotores de adesão. Em uma forma de realização, promotor de adesão de pelo menos um é adicionada ao polímero derretido. Em uma forma de realização da presente invenção, promotor de adesão de pelo menos um é adicionado para o adesivo. [331] Em algumas formas de realização, o polímero inclui pelo menos um modificador de impacto. Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas inclui pelo menos um modificador de impacto. Em algumas formas de realização, modificador de impacto pelo menos uma é adicionada ao polímero fundido. Em algumas formas de realização, a etapa de anexar a mistura de proteínas para o polímero compreende dissolvendo o polímero para produzir um polímero dissolvido e transformando o polímero dissolvido com a mistura de proteínas.

[332] Em algumas formas de realização, o processo é afetado pela dissolução do polímero, por exemplo, em solução aquosa ou uma solução orgânica (ou solvente) e entrar em contato com as proteínas com a solução em que o polímero é dissolvido, seguido por evaporação de solvente a fim de criar o produto final, (conhecido como "solvent casting"). Em algumas formas de realização, o processo é seguido por extrusão a derreter.

[333] Em algumas formas de realização, a mistura de proteínas é dissolvida, por exemplo, em um solvente miscível com água, antes de entrar em contato com a pluralidade de peptídeos com o polímero e a solução aquosa.

[334] Em algumas formas de realização, o polímero, ou o polímero e a mistura de proteínas, são eletrofiadas. Eletrofiação é conhecida por ser apropriado para a fabricação de estruturas de vários tipos de polímeros tais como, sem limitação, micro e nano --fios. Uma vantagem do processo deeletrofiação para fabricar o composto de formas de realizaçãodo presentes é que tal processo de produção pode ser executado em temperaturas relativamente baixas, permitindo, assim, incorporar a mistura de proteínas em uma fase inicial do processo. Outra vantagem é que o polímero eletrofiadas é capaz de transportar uma quantidade relativamente alta da mistura de proteínas.

[335] A outra vantagem de formas de realização da presentes é que o processo de eletrofiação pode fornecer o polímero eletrofiadas, portanto, também a composição das formas de realização presentes, com propriedades mecânicas reforçadas, excedendo as propriedades mecânicas do compostos tradicionais.

[336] As propriedades mecânicas dependem diversas variantes, que podem ser controladas durante o processo de fabricação. Uma variante é a natureza química do polímero. Esta variante pode ser controlada por uma escolha apropriada do polimero(s) usado em, por exemplo, o processo de eletrofiação. Outra variante é a área de contato entre os fluidos do corpo e do polímero eletrofiadas, que pode ser controlado, por exemplo, pela variação da superfície livre das fibras de polímero eletrofiadas.

[337] Os eletrofiação parâmetros de processo, por exemplo, tensão, velocidade de injeção e a velocidade de coletor, podem permitir controlar o recurso dos produtos finais que podem ser adaptados de acordo com a demanda. O processo de eletrofiaçãotambém pode ser utilizado para dispositivo médico do revestimento (por exemplo, cateter) que foram mencionados antes. É para ser entendido que os vários métodos de revestimento podem ser utilizados para produzir as fibras divulgadas, incluindo, sem limitação, spin revestimento, molhado-fiação, fiação seca e gel de fiação. Crescimento da célula e cultura

[338] Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são usados como um material biocompatível ou implantável ou juntamente com um material implantável ou biocompatível. Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para a propagação de célula. Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para manutenção, conservação e/ou induzindo a viabilidade celular. Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para reduzir e/ou minimizando a morte celular. Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para induzir a migração celular. Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para induzir o acessório de celular. Em uma forma de realização, um andaime de tecido é composto por fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, fibras são fibras conforme descrito neste documento.

[339] Em Forma de realização, é aqui apresentada uma composição compreendendo um material biocompatível e fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, um material biocompatível é a vida do corpo material implantável. Em uma forma de realização, um material biocompatível é um material adaptado para entrar em contato com as células ou tecidos. Em uma forma de realização, um material biocompatível é um material que promove a viabilidade das células ou tecidos.

[340] Em uma forma de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é/são utilizados para induzir a regeneração óssea. Em uma forma de realização, uma composição de regeneração óssea ou andaime é composto por fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma composição que inclui: (1) células; e (2) fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma composição que inclui: (1) meios de cultura de células; e (2) fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma composição que inclui: (1) um material abiótico; e (2)

fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

[341] Em uma forma de realização, aqui apresentada uma ferida cura composição compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma composição farmacêutica compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

[342] Em uma forma de realização, desde aqui um dispositivo médico adaptado para entrar em contato com um tecido corporal, compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, desde aqui um dispositivo médico adaptado para unir os tecidos do corpo após uma lesão ou cirurgia, compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma sutura cirúrgica compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma sutura cirúrgica, revestida com: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma ferida cuidados curativos compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma almofada estéril ou compressa compreendendo: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

[343] Em uma forma de realização, aqui apresentada uma composição que inclui: (1) células, mídia de célula ou ambos; e (2) fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, aqui previsto um método para manter ou crescer células composto por entrar em contato com as células com uma composição que inclua: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, desde aqui um método para montar uma multi camada celular cultura, composta por entrar em contato com as células com uma composição que inclua: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, desde aqui um método para montar uma multi camada celular cultura, composta por entrar em contato com as células com uma superfície composta por: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

[344] Em uma forma de realização, aqui previsto um método para montar o número pré-definido de camadas celulares que inclui entrar em contato com as células com uma superfície composta por: uma quantidade predefinida de: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação destes com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, uma quantidade predefinida de: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero é uma espessura pré-definida de uma superfície adaptada para entrar em contato com as células. Em uma forma de realização, células dentro de uma composição ou um método conforme descrito neste documento Cruz-interagem em 3D. Em uma forma de realização, aqui apresentada um método para a fabricação de um determinado número de camadas de células em que as células Cruz interagir. Em uma forma de realização, aqui apresentada é um método para a fabricação de um determinado número de camadas de células em que as células Cruz interagem e estão vinculadas às fibras.

[345] Em uma forma de realização, o número de "pré-definido de camadas de célula" ou "a definir o número de camadas de células" é determinada pela quantidade de: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero aplicado sobre uma célula-crescente superfície tais como mas não limitado a uma célula crescendo placa ou uma célula crescendo o prato. Uma forma de realização, o número de "pré-definido de camadas célula" ou "a definir o número de camadas de células" é determinada pela quantidade de: fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero aplicada sobre uma superfície de crescimento celular como um material biocompatível.

[346] De incorporação em um, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 1 x103 fibras/cm2 para 8 x105 fibras/cm2 mantém apenas uma camada de célula única pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 1 x102 fibras/cm2 a 1 x106 fibras/cm2 mantém apenas uma camada de célula única pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 4 x105 fibras/cm2 para 18 x105 fibras/cm2 mantém uma camada de dois celulares pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 8 x105 fibras/cm2 para 14 x105 fibras/cm2 mantém uma camada de dois celulares pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 10 x105 fibras/cm2 para 14 x105 fibras/cm2 mantém uma camada de dois celulares pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. [347] Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 15 x105 fibras/cm2 ou mais mantém três ou mais camadas de células pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 18 x105 fibras/cm2 ou mais mantém três ou mais camadas de células pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero.

Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 20 x105 fibras/cm2 ou mais mantém três ou mais camadas de células pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, de acordo com os métodos e as composições conforme descrito neste documento 24 x 105 fibras/cm2 ou mais mantém três ou mais camadas de células pelo menos 70% ou 80% de uma superfície revestida com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, multicamadas, camadas de várias células ou mais de duas camadas de células resultam em uma interação de célula para célula 3D dentro de cada camada. Em uma forma de realização, multicamadas, camadas de várias células ou mais de duas camadas de células resultam em uma interação de célula para célula 3D dentro de cada camada e entre as camadas.

[348] Em uma forma de realização, SS, mecanicamente, protege as células. Em uma forma de realização, SS fornece proteção mecânica às células vinculado à SS. Em uma forma de realização, SS fornece proteção mecânica às células encapsulado com o SS.

[349] Em uma forma de realização, multicamadas, camadas de várias células ou mais de duas camadas de células resultam em uma interação de célula para célula 3D e 3D interação célula-a-SS dentro de cada camada. Em uma forma de realização, multicamadas, camadas de várias células ou mais de duas camadas de células resultam em uma interação de célula para célula 3D e 3D interação célula-a-SS dentro de cada camada.

[350] Em uma forma de realização, aqui apresentada uma jangada, composta por: (1) fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero; (2) células aderiram a balsa. Em uma forma de realização, aqui apresentada uma jangada, composta por: (1) fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero; (2) solitárias células aderiram a balsa. Em uma forma de realização, a jangada encapsula as células. Em uma forma de realização, as células estão associadas com a jangada.

[351] Em uma forma de realização, aqui previsto um método para crescimento, manutenção ou células solitárias em expansão, compreendendo as células de mistura com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, desde aqui um método para crescer, manter ou expandir células solitárias que exigem célula superfície anexo, compreendendo as células de mistura com fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação com ou sem um polímero. Em uma forma de realização, um método para crescer, manter ou expandir células solitárias é um método in vitro.

[352] Em algumas formas de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação exigem pelo menos 6 repetições (n). Em algumas formas de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação destes exigem pelo menos 7 repetições. Em algumas formas de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação dos respectivos conforme descrito neste documento exigem pelo menos 8 repetições. Em algumas formas de realização, fibras, uma mistura de proteínas, "m" tipos de proteínas ou qualquer combinação destas tal como descritos neste documento exigem: 70-6, 7, 8-70, 9-70, 10-70, 11-70, 12-70, 70-13, 14-70, 70-15, 16-70, 17-70, 18- 70, 19-70 ou 20-70 se repete ("n"conforme definido aqui).

[353] Em uma forma de realização, um método, conforme descrito neste documento é um método in vitro. Em uma forma de realização, um método, conforme descrito neste documento é um método de ex-vivo. Geral

[354] Como usado aqui, o termo "cerca" refere-se a 10%. "Comprende os termos", "comprendendo", "inclui", "incluindo", "ter" e seus conjugados médios "incluindo mas to não limitado". O termo "consistindo de meios"incluindo e limitada". O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou peças que não materialmente altera as características básicas e romance do alegado composição, método ou estrutura.

[355] A palavra "exemplar" é usada aqui para significar "servindo como um exemplo, a instância ou a ilustração". Qualquer incorporação descrita como "exemplar" não é necessariamente ser interpretado como excluir preferencial ou vantajoso sobre outras incorporações e/ou para a incorporação de recursos de outras formas de realização. A palavra "opcionalmente" é usada aqui para significar "é fornecido em algumas formas de realização e não fornecido em outras formas de realização". Qualquer incorporação particular da invenção pode incluir uma pluralidade de "opcionais", a menos que tais características em conflito.

[356] Como usado aqui, a forma singular de "a" e "o” incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dita de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "em pelo menos um composto" poderá incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.

[357] Durante esta aplicação, várias formas de realização desta invenção podem ser apresentadas em um formato de leque. Deve ser entendido que a descrição em formato de alcance é apenas para conveniência e concisão e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Nesse sentido, a descrição de um intervalo deve ser considerada para ter divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis bem como valores numéricos individuais dentro do intervalo. Por exemplo, deve considerar-se a descrição de uma faixa como de 1 a 6 que tenham especificamente divulgados subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, 2-6, de 3 a 6 etc. , além de números individuais dentro do intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto aplica-se independentemente da amplitude do intervalo. Sempre que um intervalo numérico é indicado neste documento, pretende incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As frases "variando/varia entre" um primeiro indicar número e um segundo indicam o número e "variam/variam de" um primeiro indicar o número "para" um segundo indicar número são usados neste documento alternadamente deve incluir o primeiro e segundo indicado números e todos o ali entre os mesmos de numerais fracionários e integral.

[358] A palavra "exemplar" é usada aqui para significar "servindo como um exemplo, a instância ou a ilustração". Qualquer incorporação descrita como "exemplar" não é necessariamente ser interpretado como excluir preferencial ou vantajoso sobre outras incorporações e/ou para a incorporação de recursos de outras formas de realização. A palavra "opcionalmente" é usada aqui para significar "é fornecido em algumas formas de realização e não fornecido em outras formas de realização". Qualquer incorporação particular da invenção pode incluir uma pluralidade de "opcionais", a menos que tais características em conflito.

[359] Como usado aqui, a forma singular de "a" e "o"incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dita de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "e pelo menos um composto" poderá incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.

[360] Durante esta aplicação, várias formas de realização desta invenção podem ser apresentadas em um formato de leque. Deve ser entendido que a descrição em formato de alcance é apenas para conveniência e concisão e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Nesse sentido, a descrição de um intervalo deve ser considerada para ter divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis bem como valores numéricos individuais dentro do intervalo. Por exemplo, deve considerar-se a descrição de uma faixa como de 1 a 6 que tenham especificamente divulgados subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, 2-6, de 3 a 6 etc. , além de números individuais dentro do intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto aplica-se independentemente da amplitude do intervalo. Sempre que um intervalo numérico é indicado neste documento, pretende incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As frases "variando/varia entre" um primeiro indicar número e um segundo indicam o número e "variam/variam de" um primeiro indicar o número "para" um segundo indicar número são usados neste documento alternadamente deve incluir o primeiro e segundo indicado números e todos o ali entre os mesmos de numerais fracionários e integral.

[361] Como usado aqui "método o termo" refere-se a boas maneiras, meios, técnicas e procedimentos para a realização incluindo uma determinada tarefa, mas não limitado a, esses modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos, ou prontamente desenvolvido de maneiras conhecidas, meios, técnicas e procedimentos pelos praticantes das artes químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[362] Como usado aqui, o termo "tratamento" inclui que revoga, substancialmente inibindo, retardar ou reverter a progressão de uma condição, melhorando substancialmente sintomas clínicos ou estéticos de uma doença ou substancialmente, prevenindo o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma doença.

[363] É apreciado que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de diferentes formas de realização, também podem ser fornecidas em combinação em uma única forma de realização. Por outro lado, várias características da invenção, que são, por questões de brevidade, descritas no contexto de uma única forma de realização, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer combinação de sub apropriado ou como adequado em qualquer outra forma de realização descrita da invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias formas de realização não são devem ser consideradas características essenciais dessas formas de realização, a menos que a forma de realização é inoperante sem esses elementos.

[364] Várias formas de realização e aspectos da presente invenção como acima delineada e como alegado na seção declarações abaixo encontram apoio nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[365] Materiais e métodos plasmídeos: sequência de DNA em um plasmídeo PCR- ScriptAmpSK(+) obtidos de Geneart (Regensburg, Alemanha). pFastBacHTa obtido de Invitrogen.

[366] Enzimas de Restrição: PstI, HindIII, NsiI, obtidos de (New EnglandBiolabs, MA, EUA).

[367] Transfecção e Transformação: células de competentes E. coli DH10BAC, contendo bacmid e um plasmídeo ajudante (Invitrogen). Reagente de Transfeccao de escolta (Sigma-Aldrich).

[368] Media: FSE 921 inseto meio de cultura celular, soro livre, obtidos de sistemas de expressão, ou SF 900 II SFM; Soro livre, obtidos de GIBCO; PropidiumIodid (SIGMA, ISRAEL); Calceína AM (Cayman, EUA); e DAPI (ibidi, Alemanha).

[369] Imagem: inverso microscópio de contraste de fase, EVOS XL, Life Technologies. Para imagens confocal: microscópio de fluorescência Olympus BX51. Câmera Magnafire SP foi de Optronics.

[370] Procedimentos Experimentais para a formação de misturas da proteína: síntese de uma sequência de codificação para uma única unidade de repetição de uma proteína de seda do fio de segurança da seda da aranha: aminoácido 35 A longa sequência que representa uma sequência de consenso média dos 15 repete que constituem a região repetitiva do ADF-4 (Genbank entrada U47856) foi projetado. A sequência de peptídeo de sequência consenso média é: SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAAAAAAAA (SEQ ID n º 14), que é codificada por uma sequência de pares de bases do DNA 105: 5 ' -

TCTGGTCCTGGAGGTTATGGCCCAGGAAGCCAAGGACCATCTGGTCCAGGAGGAT ATGGTCCAGGCGGACCTGGCTCTAGTGCAGCAGCTGCCGCAGCAGCTGCA-3 ' (SEQ ID N: 15). O DNA sintético acima foi obtido em um plasmídeo PCR- ScriptAmpSK(+). A sequência foi otimizada para expressão de acordo com o uso de códon de Spodopterafrugiperda, células de que são usadas para a síntese das fibras e proteínas de seda de aranha.

[371] A construção do plasmídeo do doador: ScriptAmpSK(+) o plasmídeo foi extirpado com Xba eu e Xho eu e uma sequência de 136-bp contendo o basic repetir sequência ladeado com Nsi I e Pst eu locais da limitação foi isolado e clonado no local de clonagem múltipla (MCS) do baculoviralpFastBacHTa de plasmídeo de doador. Assim, a codificação de plasmídeo de doador básica para um domínio artificial de 49 aminoácido N-terminal e um domínio do núcleo de 35 aminoácidos foi gerada.

[372] Multimerisação de repetição única: O módulo básico de codificação para uma repetição (monômero) da proteína de seda de aranha é flanqueada pelas enzimas restrição sites NsiI e PstI, que são compatíveis. Na primeira etapa, o monômero é lançado pela dupla limitação e é inserido no quadro do mesmo plasmídeo doador corte com PstI. Só se a inserção é ligada na orientação correta sentido será um lançamento duplo corte um dímero [site restrição entre as duas repetições foi eliminado após ligadura]. Em uma segunda etapa o dímero foi lançado e depois reinserido da mesma forma para obter um vetor com quatro repetições. Seguindo as etapas, este procedimento foi reiterado para obter um plasmídeo de doadores contendo várias repetições sintéticas. Restrições resultantes das ferramentas de biologia molecular empregadas e a natureza repetitiva da sequência de limitam o número máximo possível de repetições idênticas.

[373] Ligação nativa C-Terminal domínio a jusante para o sintético se repete: inserção do domínio C-terminal de aminoácidos ADF4 114 teve lugar usando PCR com primers a seguir: uma cartilha de sentido, tendo a sequência 5 '- ATATGCTGCAGGCCCTAGTGGTCCTGGA-3. ' (SEQ ID n: 16) contendo um sítio de restrição PstI (sublinhado) e uma primeira demão antitendo sentida a sequência 5 '- TCGACAAGCTTGGTACCGCA-3 ' (SEQ ID n: 17) que codifica para um sítio de restrição HindIII 3 ' (sublinhado). Os vetores de plasmídeo de doador com número diferente de repetições e o produto do PCR foram extirpados com PstI e HindIII, purificado e ligados, resultando em um pFastBacHTa doador do plasmídeo que codifica para uma marca de His6, que faz parte de um domínio artificial do terminal N, seguido de um variado número de repetições idênticas (os inventores obtidas construções contendo 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32 repetições da sequência do ácido nucleico) e o domínio de terminal nativo C.

[374] Cultura de célula: células Sf9 foram propagadas a 27° C. em 921 FSE meio de cultura celular de soro livre de insetos. Sf9 células foram crescidas como monocamadas na lamínulas em 6 pratos bem ou em frascos de abanador agitados a 130 rpm.

[375] Produção de Baculovirus recombinante: células de competentes E. coli DH10BAC, contendo bacmid (baculovirusshuttle vector plasmídeo) e um plasmídeo ajudante, foram usados para gerar bacmids recombinante de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Inserção do gene no bacmid foi verificada pelo PCR. Sf9 células foram transfectadas com DNA recombinante bacmid usando o reagente de

Transfeccao de escolta em placas 6-boas. As células foram incubadas por 5 h a 27° C., lavadas e incubadas por outro 72 h. mídia foram colhidas, centrifugada, e o vírus contendo sobrenadante foi usado para infecções sucessivas 2-3, resultando em amplificação do título do virion.

[376] Expressão de sintético ADF-4 com base em proteínas: células Sf9 (3 * 106 células/ml) foram infectadas com os vírus recombinantes com vários MOIs (multiplicidade de infecção) que variam de 0,1 a 10. Quatro dias pós infecção células foram colhidas por centrifugação a 16000 g durante 10 minutos.

[377] Enriquecimento de propriedade dos polímeros: no processo de desenvolvimento de produtos diversos materiais potenciais foram testados para o enriquecimento de propriedades com a seda de aranha divulgada. O objetivo é enriquecer certas propriedades do material para a resposta da indústria às necessidades e dificuldades, ou seja, maior dureza, maior resistência ao impacto, maior tenacidade à fratura e maior estresse e módulo de elasticidade.

[378] Uma variedade de materiais com diferentes aplicações, que vão desde resinas epóxi foram usados para materiais compostos, polímeros termoplásticos e termofixos chapas de poliuretano e filmes e hidrogelbiocompatível, incluindo pHEMA, materiais de jato de tinta para 3D indústria de impressão.

[379] Lista de materiais testados:

1. Epóxi resinas: (a) EP-520 por polímero Gvulot; e (b) EP-502 por polímero Gvulot;

2. Poliuretanos termoplásticos (TPU): (a) Tecoflex® SG-93 pela Lubrizol; (b) EG- 72 pela Lubrizol; e (c) PE399 por Huntsmann;

3.Termofixos poliuretanos (PU): (a)-2047 por Gvulot de polímero;

4. Nylon 12 sob a forma de paletes fornecido por PolyRam;

5. Nylon 12 sob a forma de pó fornecido pela ARAN;

6.pHEMA fornecido por Sigma-Aldrich;

7. Butvar (B-98) fornecido pela Sigma-Aldrich;

8. EVOH (EVAL F101B) fornecido pela Kuraray;

9. PLA (2003D) fornecido pela NatureWorks LLC;

10. PCL (CAPA 80) fornecido pela CAPA 80 Perstorp;

11. PCL (80 Mn) fornecido pela Sigma-Aldrich;

12. Silício-184 Sylgard fornecidos pela Dow Corning;

13. VeroClear – acrílico UV-curado inkjet fornecido pela Stratasys.

[380] Várias técnicas de processamento para análise e preparação da amostra foram testadas, incluindo: solvente fundição, fundição, solvente eletro-fiação do molde e derreter a composição. EXEMPLO 1 COMPOSTOS, COMPOSTO POR RESINAS EPÓXI

[381] Duplo componente dos sistemas foram testados como matrizes para materiais compostos. O objetivo é melhorar as propriedades da matriz para permitir melhores propriedades mecânicas para todo o sistema. Um feito por PTFE moldes foram utilizados para a preparação de material.

[382] Experimental para sistemas de duplo componente à base de epóxi:

[383] Em procedimentos exemplares, parte A – a base de resina e B - endurecedor foram pesados de acordo com as recomendações do fabricante. A seda de aranha ("SS", também referido neste documento em todo como "SSS") fibras foram pesadas em percentagens diferentes de carregamento de 0, 1% e 2% w/w e derramadas em moldes. Perfil de cura era 24h na temperatura de quarto, seguida por 3 h a 80 ° C. Espécimes foram removidos do molde e foram testados para propriedades mecânicas pelo testador de tração para a amostra à tração, módulo de elasticidade, tensão e trabalho a energia falha. Cada teste conjunto consistia de 5-6 espécimes para estabelecer dados estatísticos.

[384] Epóxi – EP-520 por polímero Gvulot: módulo de The Young foi melhorado (aumento) em cerca de 10% (Figura 1). Adesão de fibras-matriz parece ser pobre (como mostrado nas imagens SEM do painel esquerdo de figura 2). Embora em alguns casos foi detectada uma melhor aderência com nenhuma cárie ao redor das fibras (painel direito de figura 2: apresentando fibra SS, tendo um comprimento de 3.165 µm e um diâmetro de cerca de 215 nm).

[385] As medições foram feitas por microscópio FEI em diferentes resoluções e velocidades de aceleração de elétrons diferentes de 10-30keV, modo HRSEM foi utilizado para uma melhor visualização e medições de diâmetro e comprimento da fibra.

[386] Epóxi - EP-502: Os resultados dos ensaios mecânicos (resistência à tração, módulo de Young e ponto de escoamento; 1% enriquecimento com SS), são mostrados na Figura 3 (também em relação ao enriquecimento de CNT de 1% e resumidos na tabela 1 adiante.

[387] Tabela 1 Melhoria no módulo de Young [%] 314 % Melhoria no módulotênsil[%] 47% Melhoria no ponto de escoamento 133% [%]

[388] Resultados em dobra: em procedimentos de exemplares adicionais, os experimentos de flexão foram testados em amostras de 1% enriquecido e controle.

[389] Tipo da espécime e dimensões foram 63,5 * 12,7 * 13.1 mm.

[390] Os resultados estão sumarizados na tabela 24 abaixo, mostrando-se, nomeadamente, um avançado módulo de Young da dobra, e um trabalho reduzido do fracasso da 1% enriquecido espécimes.

[391] Tabela 2 Dobrage Dobragem no Estresse Estresse máximo m no módulo de máximo de de módulo Young(MPa)1 dobragem(M dobragem(MPa)1 de %SS Pa) -Controle %SS Young(M Pa) - Controle significa 2943.98 3271 significa 111.40 73.33 do do SD 177.08 160.49 SD 5.64 1.44 variação 6.01% 5% variação 5.06% 1.96%

[%] [%] Máxima Máxima tensão Operação Operação até tensão na na ruptura 1% até falha falha (Nmm) ruptura - SS (Nmm) 1%SS Controle Controle significa 0.09 0.03 significa 1164.98 186.43 do do SD 0.00 0.00 SD 136.69 14.99 variação 4.28% 8.41% Variação 11.73% 8.04% [%] [%] EXEMPLO 2

[392] COMPOSTOS compreendendo TERMOPLÁSTICOS e TERMOFIXOS POLIURETANOS (PU) diversos poliuretanos foram testados. Avaliaram-se as melhorias na resistência ao rasgo e resistência à tração. Termofixos PU foram principalmente um sistema de dois componentes, enquanto termoplástico PUs foram fornecidos em forma de folha ou pelotas e dissolvido em um solvente orgânico, a qual SS fibras foram adicionadas. Soluções foram molde fundido e permitiram evaporar.

[393] Exemplares procedimentos experimentais para polímeros termoplásticos: Os lençóis fornecidos foram dissolvidos em vários solventes orgânicos para testar a taxa de dissolução. A dissolução também afetou as propriedades mecânicas finais produzidas a partir de espécimes finais. O método de preparação foi uniforme para todas as amostras.

[394] Pe-399 HUNTSMAN (polímero de poliuretano alifático) foi dissolvido 10% em peso de 1,4-dioxano, depois à esquerda para evaporar durante 24 horas. Após a evaporação terminou o filme foi cortado às tiras de 8 mm de largura e 80 mm de comprimento e esticado por testador de resistência à tração. Ensaio de tração de acordo com ASTM D-882. Dimensões de amostra eram tiras de 7 cm de comprimento e 0,8 cm de largura.

[395] Nas figuras 4A-D os resultados de ensaio de tração, incluindo o módulo de Young (figura 4A), estresse no alongamento de 30% (Figura 4B) e a resistência no alongamento de 30% (Figura 4) estresse no alongamento de 100% (Figura 4) e a dureza em 100% alongamento figura 4E). Todos realizados no controle e SS enriquecido filmes, como consta a inserção de cada gráfico. Os resultados são apresentados como média ±SD (n = 5 tiras diferentes do mesmo filme, para cada condição).

[396] A figura 5A apresenta resultados de força após enriquecimento com SS – cada barra representa o resultado de um espécime. Figura 5B apresenta rasgo típico teste gráfico mostrando controle, 3% e 5% enriquecido filme.

[397] As fibras chegaram a dispersão completa em solução de droga e filmes curados (ver figuras 4A e 4B). Como pode ser visto na figura 4A, que o módulo de Young aumentou de 34% a 150% e o stress e o comportamento da dureza em 30% e 100% alongamento (figuras 4B-E) tem aumentado significativamente também. Como pode ser visto nas figuras 5A-B a resistência ao rasgo e a tenacidade à fratura aumentou em dose aumentou de maneira dependente por 40-105% como concentração de fibras no filme.

[398] Tecoflex® SG-93 (alifáticos baseados em poliéter poliuretanos termoplásticos) da Lubrizol foi dissolvido 10% p/v em vários solventes: THF, tolueno, clorofórmio e dioxano depois à esquerda para evaporar durante 24 horas. A seguir, o filme foi cortado às tiras de 8 mm de largura e 80 mm de comprimento e esticado por testador de resistência à tração.

[399] Resultados dos testes de ruptura: os resultados são mostrados na figura 6A-C e o aumento do módulo de Young e resistência ao rasgamento.

[400] Exemplares procedimentos experimentais para poliuretano termofixo: U-2047 composto de poliuretano de dois componentes-base (parte A-poliol) e agente de cura (parte B – IDH). Fornecido por polímero-G-formulação de sucesso. A preparação de dois componentes, de acordo com as instruções do fabricante. No caso de enriquecimento de fibras, as fibras foram misturadas com parte A antes de misturar com a parte B. A mistura foi centrifugada durante 4 minutos a 1000 RPM para de gaseificação e então foi limpada por 7 minutos a 100mBar para de gaseificação adicionais. O perfil de cura era 24h à temperatura seguida de cura post por 3 h a 80° C.

[401] Experimentos realizados com os seguintes lotes: controle, lotes de SS 1%, 2% e 3%. Melhoria de propriedades observada em todos os 4 parâmetros medidos, testados pelo testador de resistência à tração de LLOYD.

[402] Os resultados são apresentados nas figuras 7 e 8 e ainda mais resumidos na tabela 3 abaixo mostrando a taxa de melhoria de: módulo de Young, resistência à tração, tensão na ruptura e trabalhar ao fracasso.

[403] Tabela 3 Taxa de melhora 1% 2% 3% Módulo de Young 23%+ 40%+ 49%+ Forçatênsil 17%+ 26%+ 48%+ Tensãonaruptura 8%+ 3.5%+ 32%+ Operaçãoatéfalha 15%+ 40%+ 52%+

[404] Materiais: poliuretano termofixo 2047 fornecido pelo "Polymer G Ltd". Dimensões dos espécimes foram 60 mm * 20 mm * 0,8 mm. Em procedimentos exemplares, duas amostras de controle foram usados (1% carregado espécimes). Os resultados são mostrados na tabela 4A-B abaixo, demonstrando melhoria de 244% na resistência ao rasgo dos espécimes carregados.

[405]Tabela 4A Controle 1% carregado Taxa de melhora [%] Resistência ao rasgamento [N/mm] 74 254.7 244% +

[406]Tabela4B Taxa de melhoria 1% 2% 3% Módulo de Young +22.5% +39.5% +48.5%

Forçatênsil +17% +26% +48% Tensãonaruptura +5.5% +1% +28.5% Operaçãoatéfalha +20.4% +46.5% +59.5% EXEMPLO 3

COMPOSTOS COMPREENDENDO NYLON PRODUZIDOS POR COMPOSIÇÃO E POR MOLDAGEM POR INJEÇÃO

[407] O uso de Nylon 6, Nylon 6, 6 e 12 de Nylon é generalizada na indústria. Reforçando o nylon com a seda de aranha mostrou-se uma melhoria significativa nas propriedades mecânicas. Primeiros testes foram realizados em Pelotas como recebido. Isto causou problemas na fase quando as pelotas grandes não derretem completamente de mistura e mistura suficiente com SS foi não alcançado. Os testes foram realizados em uma forma de pó fino de Nylon 12. Exemplar dos procedimentos, composição foi feita em um DSM Xplore do gêmeo-parafuso micro compositor (DSM, Heerlen, Países Baixos). O procedimento de preparação é a seguinte: filamentos de cerca de 100 µm de diâmetro foram obtidos utilizando um compositor micro e foram testados para propriedades mecânicas. 5 amostras foram testadas.

[408] Os resultados são apresentados nas figuras 9A, e a melhoria das propriedades mecânicas de 2%, 4% fibra enriquecimento e comparação CNT (módulo de Young, Stress @ 150% alongamento e ponto de rendimento) são apresentados na tabela 5 abaixo.

[409] Tabela 5 Melhoria no módulo de Young [%] 96% Estress @ 150% melhoria na elongação 32% [%] Melhoria no ponto de escoamento [%] 75%

[410] É notável que mesmo que o percentual de enriquecimento indicada é de 4%, a porcentagem de carga eficaz é menor do que isso. No processo de produção, uma parte das fibras permaneceu no alimentador do compositor. Além disso, as fibras na composição aglomeradas assim sua contribuição para a composto força diminuiu. Presume-se que a porcentagem de enriquecimento real é de cerca de 2%.

[411] A Figura 9A apresenta as medições de stress-mancha de Nylon 12 com fibras de diâmetros de 140 e 250 µm (2% avanços por extrusão). Figura 9B apresenta imagens SEM representante da secção transversal das fibras em Nylon 12 no enriquecimento de 2%, apresentando fibras de SS com um diâmetro de cerca de 120 nm a 180 nm. Pode ser visto que vários pontos em que a seda de aranha é bem aderida e meio painel na figura 9B mostra uma fibra em tensão imerso na matriz polimérica.

[412] Nylon-12 foi também fabricado usando injeção usando Minijet Pro sistema por Hakke. Amostras de osso de cão foram injetadas usando pó fino de Nylon 12. Amostras de SS enriquecido de 2% foram preparadas para avaliação no sistema de tração testador e os resultados são mostrados na figuras 9 C-E.

[413] Em procedimentos adicionais que a composição foi feita com ácido polilático (PLA; 130 µm de diâmetro), de acordo com os seguintes parâmetros: Temperatura da Velocidade de Velocidade de coleta Tempo em extrusora aperto [R.P.M.] [R.P.M.] mistura [min]. [R.P.M.]. 185°c 50/30 250-300 0.5 - 1

[414] Os resultados são apresentados em melhoria de 9F figura da curva tensão- deformação para os 2% de SS enriquecido amostra PLA. EXEMPLO 4

COBRINDO COM A SEDA DE ARANHA POR ELETROFIAÇÃO

[415] Eletrofiação é um método onde os fios muito finos podem ser produzidos pela aceleração do campo elétrico das fibras em um solvente orgânico e polímero dissolvido. [416] O método funciona por evaporação rápida do solvente pela aceleração do conteúdo para o coletor que está negativamente carregado a uma tensão de 30 kV. O alta elétrico potencial diferença formas campo elétrico que desenha o conteúdo da gota do polímero e o solvente para o coletor, o solvente evapora rapidamente e o polímero se solidifica no coletor e permite a formação de nano para micro fibras de acordo com os parâmetros de configuração do sistema.

[417] Em procedimentos exemplares, as fibras compostos foram produzidos com diâmetro de 1-10 µm. Matrizes de polímero testadas: TPU (poliuretano termoplástico) e PCL (policaprolactona); e várias percentagens de enriquecimento testaram com diferentes espessura porosidade e malha recebida. Enriquecimento de TPU: SG-60, TPU foi comprado de Tecoflex e usado como recebido.

[418] Preparação de solução de droga: em procedimentos exemplares, o TPU (SG60D) foi dissolvido em uma mistura de DMF e THF (7:3 (w/w)) para obter um 9, 11 ou 13% (w/w) soluções. Cada configuração foi enriquecida com 1, 2 ou 3% percentagem de a seda de aranha, um teste de matriz de 12 configurações de construção.

[419] Processo de fiação: nos procedimentos exemplares, foi a configuração de solução de controle: fluxo de i. de 0,9 mL/h; II. eletrostático campo ~ 1.2 kV/cm; III. temperatura de 26° C; IV. umidade ~ 60%; e v. fieira (agulha 23G).

[420] Em procedimentos exemplares, a configuração de solução enriquecido foi: taxa de fluxo de i. 0,9 1,2 mL/h; II. eletrostático campo ~ 1.2 kV/cm; III. temperatura de 26° C; IV. umidade ~ 60%; v. fieira (agulha 23G)

[421] Avaliação de propriedades mecânicas: esteiras eletrofiadas foram investigadas por meio de testes de tração à temperatura ambiente, usando um testador de resistência à tração, Lloyd com uma célula de carga de 500N. As amostras foram aproximadamente 20 mm comprimento, 5 mm de largura e 0,15 mm de espessura. Stress−Strain curvas foram gravadas em uma taxa de alongamento de 1mm/min. O estresse foi calculado de acordo com a área efetiva da amostra de acordo com a seguinte equação: Σ = F/(A·ρmat/ρbulk), onde F é a força medida, A é a seção transversal medida, a densidade aparente é ρmat/ρbulk, onde ρbulk é a densidade de pó de amido sob escuta, e ρmat é a densidade de esteira de fibra.

[422] Reologia de soluções da droga: A reologia de soluções foi estudada por um reômetro TA Discovery 2.

[423] Enriquecimento PCL: PCL, 80000 Mn, foi comprado da Sigma e foi usado como recebido.

[424] Em procedimentos exemplares, as soluções foram feitas com CHCl3:DMF razão de 6:4, e a seguir foram preparada: controle-10w/w PCL PCL 9,75 e 0,7 a seda de aranha, a seda de aranha 9.5PCL e 1,33; ou a seda de aranha 9.25PCL e 1,77 (os números representa wt.% em relação aos sólidos do polímero). Configuração de eletrofiação era semelhante ao mencionado acima para SG60D.

[425] Resultados TPU: Eletrofiação de processo: processo de eletrofiação rendeu processo estável de TPU 12% (w/w) com fibras com diâmetro médio 0,8 hum, e estável de 16% (w/w) TPU processar com fibras com diâmetro médio de 3.0.... Soluções enriquecidas foram encontradas para ser demasiado viscosas então foram diluídas para cerca de 10,5%.

[426] A figura 10 apresenta fibras eletrofiadas TPU de 11% (w/w) como lotes de controle. [427] A Figura 11 apresenta fibras eletrofiadas ~10.5% (w/w) TPU + enchimentos de ~ 2% (w/w). A Figura 12 apresenta comportamento reológico de lotes de controle às 9, 11 e 13% w/w de teor de sólidos de SG-60. Figuras 13A-B demonstram que, quando a quantidade crescente de enchimento adicionado ao SG-60, a viscosidade aumenta ainda o comportamento reológico é afetado.

[428] Os resultados das propriedades mecânicas estão resumidos na tabela 6, mostrando uma melhoria no módulo de Young.

[429] Tabela 6 Porosidad SD Modul SD Forçatêns SD Dureza SD e o il (MPa) (J/mm3 (MPa) ) 9% Control 43% 4% 19.80 0.08 36.415 0.37 25.729 1.85 e 7 6 1% 40% 13 19.77 3.88 24.143 4.34 12.149 2.38 % 9 4 2% 22% 8% 33.79 1.41 35.101 1.51 19.739 2.04 0 6 3% 14% 6% 38.34 2.53 37.704 1.45 26.578 3.89

11 Control 36% 3% 31.26 8.23 37.222 2.39 33.795 6.29 % e 4 0 1% 14% 9% 44.80 1.75 33.488 1.72 42.358 6.58 7 7 2% 20% 7% 50.23 4.65 27.593 3.06 33.707 5.49 3 4

[430] A Figura 14 apresenta imagem de lado esquerdo dos de Young módulo resultados apresenta os resultados de módulo para 9% de teor de sólidos de TPU, onde é visto esse enriquecimento significativo é alcançado em carregamento de 2% e 3% de SS. Imagem do lado direito apresenta os resultados de módulo para 11% de teor de sólidos de TPU onde ele viu que enriquecimento significativo é alcançado em carregamento de 2% de SS.

[431] Curvas tensão-deformação mais são apresentadas neste documento: Figura 15 apresenta a curva de tensão-deformação para as configurações de w/w de 9%.

[432] A Figura 16 apresenta a curva de tensão-deformação para as configurações de w/w de 11%.

[433] A Figura 17 apresenta zoom-in em região elástica da configuração de 11% w/w. Na região elástica enriquecidas malhas têm valores mais elevados depois que lá é uma mudança e a malha de controle tem valores mais altos.

[434] PCL resultados: os resultados para o teste de eletrofiação PCL são resumidos na tabela 7 abaixo para o teste de eletrofiação PCL:

[435] Tabela 7 Controle 9.75PCL-0.7SS 9.5PCL-1.33SS 9.25PCL-1.7

SD SD SD Efetividade noMódulo de 232.337 13.390 116.230 16.538 241.661 50.347 216.090 38 Young (MPa)

Percentagemforçanaruptura 84.669 6.374 81.470 4.352 96.075 6.009 82.534 9 Efetividade naForça tênsil 83.069 5.297 43.421 4.040 108.467 8.908 94.747 13 (MPa)

[436] Curva de tensão-deformação mais é apresentada neste documento. A Figura 18 mostra as curvas tensão-deformação para lotes PCL eletrofiação, demonstrando que a 1,33% A seda de aranha enriquecimento produzido os melhores resultados. Figura 19 apresenta as estatísticas dos resultados para a eletrofiação PCL.

[437] Sistema solvente, polaridade, fibra dissolução e evaporação: A fibra é solúvel em Hexafluoroisopropanol (HFIP), ácido sulfúrico concentrado ou meta-cresol. Isto é devido às fortes ligações de hidrogênio e a morfologia das fibras cristalino denso. Com base em dados experimentais, o selecionado solvente utilizado para dissolver totalmente as fibras é HFIP, devido à sua alta pressão de vapor e polaridade, tornando- se excelente transportadora por eletrofiação. Após dissolução completa, as amostras foram colocadas em seringa conectada com agulha de 22g Luerlock.

[438] A velocidade de bomba de seringa: analisou-se a velocidade da bomba de seringa entre os intervalos de 0.001-1,0 ml/min. Em procedimentos exemplares, tornou-se uma solução de 4-5% (wt/vol) das fibras liofilizadas em HFIP. O processo de dissolução levou cerca de 2h, dissolver e formar clara uma solução viscosa. O HFIP foi então evaporado no bairro, até que o volume foi reduzido e a concentração estava em 8-13% (wt/vol). A tensão foi definida como 30kV.

[439] Em exemplares procedimentos adicionais, as soluções de fibras foram eletrofiadas, inicialmente, formar uma malha coletados na folha de alumínio ou na rotação do mandril. [440] Em seguida, as fibras foram coletadas em stents, para demonstrar a viabilidade de revestimento sobre dispositivos médicos. Foram feitos dois tipos de soluções de fibra. A referência era de fibras de Bombyx Mori (BM), dissolvidas em HFIP, e o outro era sintético fibras de seda (SS) de aranha, liofilizado, pós- produção e re-dissolvidos em HFIP por eletrofiação.

[441] AFigura 20 apresenta uma imagem de fotografia mostrando uma cesta (emerge um duto oco fino inserido para as artérias enquanto dobrado) revestida com nano fibras, formando o nano de malha. O revestimento foi realizado usando as fibras de Bombyx Mori, em afirmando o stent.

[442] AFigura 21 apresenta uma imagens de microscopia óptica mostrando o cesto revestido com nano fibras, formando o nano de malha.

[443] Em procedimentos exemplares adicionais, uma técnica de revestimento foi aplicado usando a solução de (SS) de seda de aranha para revestir as hastes de cesta.

[444] Como mostrado na Figura 22, micro revestimento foi formado usando a técnica de revestimento eletrofiação, e como pode ser visto pela microscopia óptica, o tingco é composto por fibras de nano.

[445] Em procedimentos exemplares adicionais, outra técnica de revestimento do stent na solução HFIP fibras de mergulho foi examinado.

[446] AFigura 23 apresenta um stent revestido de filme usando revestimento de mergulho da cesta. em solução BM HFIP, demonstrando uma uniforme fina película que reveste o stent todo.

[447] Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização: A eletrofiação de referência era de fibras de Bombyx Mori (BM), dissolvidas em HFIP, e o outro era sintético fibras de seda (SS) de aranha, liofilizado, pós-produção e re- dissolvidos em HFIP por eletrofiação. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (HR-SEM; Sirion, FEI Company Eindhoven, Países Baixos) foi usado para analisar a morfologia de superfície do revestimento. O HR-SEM micrografias foram tiradas usando uma escala de tensão de 3-7 kV para as amostras poliméricas. Antes da análise, as amostras foram revestidos por pulverização catódica por 60 segundos, formando a camada de ouro/platina cerca de 10 nm a fim de impedir o carregamento.

[448] Ultra-alta resolução espacial foi usada para análise estrutural e de alta resolução.

[449] Uma medição de espectroscopia (EDAX) energia dispersiva de raio-x foi usada na microanálise para detectar os valores dos raios x característicos gerados dentro do microscópio. As micrografias são mostradas nas figuras a seguir: Figura 24 para o Bombyx Mori e figura 25 para as fibras de seda de aranha sintética. A seguinte tabela 8, resume o diâmetro medido fibras medido usando as micrografias de SEM.

[450] Tabela 8

Bombyx Mori A seda de aranha Diâmetromédio[nm] STDEV [nm] Diâmetromédio [nm] STDEV [nm] 205 166 54 38

[451] A análise de HR-SEM demonstrou-se que ambos os materiais permitem a formação de fibras de uniformes. As fibras do BM são mais espessas, com diâmetro médio de 205±166 nm e as fibras de SS exibir diâmetro médio de 54±38 nm. A malha de fibra SS era composta por fibras de pequeno diâmetro de alta densidade e pode funcionar com alto desempenho para várias aplicações.

[452] Pode concluir-se que essa técnica pode ser utilizada para fazer o revestimento de fibra para stents e malhas, sendo uma ferramenta eficiente para o revestimento e refazer as fibras da solução e exibindo boa aderência à superfície. O resultado foi fibras na espessura na escala do nanômetro, com a densidade de fibras, sendo alto o suficiente para executar um revestimento benéfico para várias aplicações. É de notar que, para revestimento de tais dispositivos, o composto de fibras eletrofiadas é mais benéfico do que a pura seda BM ou SS dissolvido em HFIP desde que as propriedades mecânicas das fibras podem ser danificadas durante a solubilização HFIP. EXEMPLO 5 COMPOSTOS, COMPREENDENDO BUTVAR, EVOH, PHEMA E FORMULAÇÃO DE UV-CURABLE ACRILATO

[453] Para caracterizar as propriedades mecânicas das fibras sintéticas foram preparadas amostras de matrizes de polímero reforçadas por fibras sintéticas. As matrizes de polímero escolhidas para ser estudadas foram: • pHEMA (Polihidroxietilmetacrilato) • Polivinilbutiral resina (Butvar B-98) • Vero Clear (material de jato de tinta, UV-curado fornecido pela Stratasys)

[454] As fibras foram dispersadas na solução de polímero & então a solução curado por polimerização. As amostras foram enriquecidas com diversos por cento de enriquecimento entre 0 - 5%. Após a cura, as amostras foram cortadas às tiras de 80mm de comprimento, 8 mm de largura e espessura de 0,9 mm. As amostras de

VeroClear foram injetadas em um molde realizado entre 2 folhas de vidro. UV-curado processo realizou-se uma lâmpada de mercúrio em 150W para 10-15 minutos de tempo de cura. [455] Após a cura, a amostra lançada do molde e cortado para uma tira de 80 mm de comprimento, 8 mm de largura e espessura de 1-2 mm. Os espécimes foram esticados pelo testador de resistência à tração (cisalhamento 4502 de acordo com a ASTM D628 com a modificação necessária). Os resultados estão detalhados no seguinte:

[456] Tabela9A (pHEMA 48%) Melhoria no módulo de Young [%] 44% Melhoria no módulotênsil[%] 78% Melhorianaelongação [%] 59%

[457] Tabela9B(pHEMA50%) Melhoria no ponto de escoamento [%] 100% Melhoria no módulotênsil[%] 38% Melhorianaelongação[%] 47%

[458] Tabela9C(pHEMA 60%) Melhoria no módulo de Young [%] 55%

[459]Tabela9D (Butvar) Melhoria no módulo de Young [%] 37% Melhoria no módulotênsil[%] 71%

[460] Tabela9E (Vero Clear) Resultado do Parametro Teste enriquecimento 33% Modulo (MPa) Teste tênsil -17% Força tênsil na quebra (MPa)

-55% Elongaçãonaquebra 15% Modulo (MPa) Teste flexural 38% Forçatênsil at break (MPa) -67% Elongaçãonaquebra

[461] O módulo de Young é calculado na base dos resultados Vero clara e de acordo com a regra das misturas: 𝐸 =𝐸 𝑉 +𝐸 𝑉

[462] Por causa da dispersão aleatória das fibras na matriz sua pode-se supor que com 1% de enriquecimento apenas aproximadamente 0,7% contribuir no eixo de tensão. De acordo com que o cálculo será: 561 − (420 ∗ 0.993) 𝐸 = = 14143 𝑀𝑃𝑎

0.007

[463]O valor obtido para o módulo de fibras de Young é 14 GPa.

[464] AFigura 26 apresenta um aglomerado de fibras em pHEMA. Figura 27 apresenta fibras em enriquecimento de 2% de VeroClear. Figura 28 apresenta SEM imagens de fibras liofilizadas. Figuras 29A-C apresentam uma análise mecânica dinâmica (DMA) de enriquecimento VeroClear de uma referência de amostra (armazenamento módulo versus Temp). Os gráficos mostram uma mudança na transição vítrea de ~ 3° como visto no pico do gráfico Tan Delta. O mesmo comportamento geral é derivado de quantidade pequena de enriquecimento. No geral, um módulo melhorado é derivado de enriquecimento. EXEMPLO 6

LINCAGEM CRUZADA DAS FIBRAS SINTÉTICAS

[465] Os procedimentos de exemplares adicionais foram destinados a criar mais fibra contínua com base na teia de aranha para alcançar Propriedades de final de têxteis para permitir que a tecelagem em fios, cabos, etc. O processo baseia-se na química úmida, usando lincagemcriuzada em uma solução baseada em buffers inorgânicos em níveis de pH diferentes. As fibras são adicionadas para o buffer de dispersão, agente dQlincagemcriuzada é adicionado. Parâmetros de processo, tais como o nível de pH,

temperatura, concentração de lincagemcriuzada, tempo de incubação influenciam o grau de reticulação alcançado. Parâmetros de processo, tais como o processo de injeção com diferentes velocidades de injeção permitem que o agente de reticulação, entrar em contato com as fibras, a fim de criar um processo contínuo para a produção de fibra é desenvolvido. Outros processos que são fieira com base em processos como molhado-fiação, seco-fiação, fiação gel também pode ser usada como processos de produção para a produção de fibra. Os seguintes agentes do lincagemcriuzadasão utilizados em reações à base de água, alguns são executadas utilizando solventes orgânicos como detalhado abaixo

[466] Procedimentos exemplares com EDC/NHS: materiais: EDC (1-etil - 3-[3- dimetilaminopropil] carbodiimida cloridrato); NHS (N-Hidroxisuccinimida); Buffer de conjugação: tampão fosfato salino (PBS), de sódio de 100mM; fosfato, 150mM de NaCl; pH 7,2; e buffer de ativação: 0,1 M pH MES, 0,5 M de NaCl, 6.0.

[467] Métodos: em procedimentos exemplares, mistura de proteínas para Cruz ligando foi preparada por imersão quantidade de ~ 5 mg no buffer de ativação. EDC e NHS em seguida foram adicionados para o buffer para criar o grupo éster reativos que permite a reação de amina com aquele grupo, resultando em uma ligação Amida. Um buffer de conjugação foi adicionado para o buffer para aumentar o pH e a eficiência da reação. O tempo de reação foi 10 minutos no RT (25oC).

[468] Resultados: como lincagemcriuzadae agregação poderiam levar a um comportamento semelhante, controle de lotes foram preparados e examinados também. [469] Enquanto agregados podem ser quebrados com Vortex ou com pequeno impacto sobre o slide as proteínas de ligação cruzada manteve-se estável.

[470] AFigura 30 apresenta um exame microscópico das fibras no buffer de ativação antes da reação (bar é 400µm). Figura 31 apresenta um exame microscópico das fibras no buffer de conjugação, após 10 min na reação (bar é 400µm). Figura 32 apresenta um exame microscópico das fibras no buffer de conjugação após 30 min (bar é 400µm).

[471] Figura 33 apresenta um exame microscópico após funcionamento vórtice sobre o buffer de ativação. Nenhuma mudança na forma e tamanho das fibras são observados (bar é 400µm). EXEMPLO 7

REVESTIMENTO DE LIGAÇÃO COVALENTE

[472] Materiais e métodos: Material Fabricante EDC, (1-ethyl-3-[3-dimetilaminopropilcarbodiimida Merck Milipore hydrochloride), NHS, (N-hydroxysuccinimide) Merck Milipore CDI Merck Milipore MES buffer, 0.1M, 0.15% NaCl Self-prepared PBS buffer, 0.1M BI

[473] A superfície do substrato A foi revestido com a seda de aranha covalentemente ligado. Em procedimentos exemplares, superfície de silício ativado por solução de piranha, seguida de um tratamento de trietoxIsilano (APTES) 3-aminopropil, para ancoragem de grupo amina. Em procedimentos exemplares, piranha solução foi preparada misturando-se 30ml de H2SO4 98% e 10 ml de H2O2 (30%) lentamente. As superfícies foram imersas para ser tratado para a solução de piranha para ativação de superfície por 30 minutos e em seguida foram lavadas com água bidestilada (DDW).

[474] Ativação de superfície foi testada pelo teste de gotículas de água.

[475] Tratamento de superfície APTES: solução foi preparada pela seguinte receita: 68,25 ml de etanol; 3,75 ml de DDW; 3ml de ácido acético. Mesmo antes de imergir os slides 2ml de APTES foi adicionado. As superfícies foram imersas para ser tratado à solução seguida por colocar no forno de vácuo a 60° C, 100 mbar para 20 minutos, estufa a 120° C, 100mbar para 1h e lavar em seguida com etanol, secagem e colocar de volta no forno a vácuo. Em procedimentos de exemplares adicionais, superfície do substrato foi posteriormente inserido em água bidestilada (DDW), conforme descrito abaixo.

[476] A fase da fibra Dope solução de água: 10mg de A seda de aranha fibras foram colocados em 5ml de PBS 0,1 M de tampão. 3 lâminas foram imerso 30 min com agitação contínua.

[477] A fase orgânica da fibra Dope solução de água: 10mg de A seda de aranha fibras foram inseridos em 5ml de DMSO. 3 lâminas foram imersos por 30 min com agitação contínua.

[478] Solução de fase de água de reticulação: 5ml de MES 0.1 M + 0,15 M NaCl, pH6 foram adicionados a 200mg de EDC e 130mg Sulfo-NHS.

[479] O CED, NHS ou sulfo-NHS foram incubado à temperatura ambiente antes de abrir os recipientes. 3 lâminas foram imersos durante a noite, com agitação contínua.

[480] Solução de fase orgânica de reticulação: em 5ml de dimetil sulfóxido (DMSO) 50 mg de CDI foram adicionados. CDI foi incubado à temperatura ambiente antes abertura do recipiente. 3 slides em seguida foram imersas durante a noite, com agitação contínua.

[481] A Figura 34 apresenta imagens microscópicas do silício revestido (fase orgânica na fase aquosa, à esquerda à direita). Figura 35 apresenta um olhar mais atento das imagens microscópicas do silício revestido (fase orgânica na fase aquosa, à esquerda à direita). EXEMPLO 8

ESTUDO DE UMECTAÇÃO DA SS NA ESEM

[482] Os materiais e métodos: foram preparadas várias amostras: SS liofilizado fibras dispersas em etanol e depositadas sobre lamínulas e secas ao ar; Fibras de SS liofilizadas espalhar na fita de carbono; Fibras de SS liofilizadas propagação em folha de quartzo; e fibras de celulose, dispersos em etanol e depositados em um deslizamento da tampa como um experimento de controle.

[483] A medida foi realizada na FEI Quanta 200F ESEM, onde as gotas de água foram espalhadas ao redor da amostra após entrar na câmara do vácuo. Aumentando a pressão da câmara de água foi evaporada e condensada no suporte da amostra permitindo medir comportamento dinâmico umectante.

[484] Os resultados: os dois principais métodos de imagem para estudo da molhabilidade em alta resolução espacial são a microscopia de força atômica (AFM) e a ambiental microscopia eletrônica (ESEM). O AFM fornece estudo de molhabilidade das gotículas de nano-escala sobre superfícies sólidas, limitando-se a resolução de tempo de alguns minutos enquanto molhando o estudo por ESEM é geralmente restrito a mícron-tamanho gotículas sobre superfícies em massa com 1 s tempo de resolução.

[485] Condensaçãoin situ e evaporação experimentos em ESEM em superfícies lisas e texturizadas em massa fornece estáticos ângulos de contato, bem como ângulos de retardamento e avançando pela análise de refletida elétrons secundários devido a interação elétron-amostra.

[486] O ESEM fornece uma alta resolução espacial e uma relativamente grande profundidade de campo de dez mícron, que foi necessário para a caracterização da superfície áspera de materiais fibrosos antes e após a condensação de gotículas in situ. [487] Deixando cair algumas gotas de água nas imediações da amostra e aumentando a câmara de pressão um pode condensar água sobre a amostra durante a medição, permitindo a medição do ângulo de contato na superfície pequena. O ângulo de visão das gotas de água é crítico para analisar corretamente a forma e o ângulo da queda. As gotículas não são iguais em volume no entanto quando chega gotas são utilizadas para o cálculo de um podem estudar a variação.

[488] Para calcular corretamente o ângulo de contato, o ângulo da imagem é visualizado lateralmente e não exatamente acima da queda. Além disso, vários pressupostos são tomados em consideração, incluindo a forma esférica da gota que não é sempre o caso.

[489] Como conjunto em cima para estudar o SS comportamento na dinâmica umectantes observou-se que não há gotículas formada na superfície da fibra, insinuando um umectante muito pequeno ângulo ou comportamento higroscópico das fibras atuando como uma "esponja" absorvendo a água condensada na porta- amostras, conforme mostrado na Figura 36. Cada linha na Figura 36 representa uma linha de tempo diferente, considerando que o tempo avança pode-se ver as gotas aumentam de tamanho. Foram encontradas várias observações: como as gotas cheguem à superfície das fibras imediatamente quebram e molhado; Ocorrer a condensação de água na superfície do substrato e não sobre as fibras como visto em várias imagens, levando à conclusão de que as fibras estão absorvendo as gotas de água ou são demasiado elevados volume de condensar em nano-filamento baseado estrutura de SS ( Ver figura 37); Que o tempo avança a água atinge e reúne em torno das fibras, levando a uma aparência mais escura, até à obtenção de imersão total (ver figura 38). Observou-se um comportamento de similar para o controle de celulose levando à mesma conclusão pode ser visto na figura 39. O comportamento semelhante de celulose na fase de umectação está de acordo com esta conclusão que estruturas porosas são difíceis de medir ângulos de umectação na. [490] No entanto, as fibras de celulose tinham contraído um halo branco em torno deles, enquanto as fibras SS absorveram a água, vista como áreas mais escuras, conforme as figuras 38 e 39. Esta experiência de umectação mostra que fibras SS são "esponjoso" fibras com grande afinidade para a absorção de água em comparação com a celulose. EXEMPLO 9 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS 3D NA TEIA DE ARANHA

[491] Em procedimentos exemplares, a avaliação do crescimento de células 3D na teia de aranha foi realizada em vários aspectos: morfologia, apego, proliferação e comparação para 2D crescimento de células em cultura sem revestimento prato e prato de cultura revestido de colágeno.

[492] Materiais, equipamentos e materiais descartáveis: Material Fabricante Cat. No. NCTC clone 929 (L929) ATCC CCL-1 MEM-NEAA, Earle's salts, non-essential Biological Industries 01-040-1A amino acids Donor Horse Serum (DHS) Biological Industries 04-004-1A Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A Sodium Pyruvate Biological Industries 03-042-1B

L-glutamine Biological Industries 03-020-1B Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Biological Industries 03-033-1B Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA Biological Industries 03-052-1B (0.05%) Trypan Blue, 5mg/ml in Saline Biological Industries 03-102-1B Equipamento Fabricante Model/Cat No.

Laminar flow cabinet, Biological hazard Labcono Purifier class ii biosafety cabinet delta series Inverse phase contrast microscope Life Technologies EVOS XL Incubator, 37oC, humidified, 5% CO2 Heraeus Hera Cell o Water bath, 37 C QSR Technologies VMS-20 Hemocytometer Marienfeld Neubauer - improved Nunc™ Cell Culture Treated EasYFlasks™ Thermo Fisher Scientific 156472 96-well tissue culture microtiter plate- Seevix Material Sciences NA coated with SS Ltd. 24-well tissue culture plate-coated with SS Seevix Material Sciences NA Ltd.

Pipettes Eppendorf Research Plus 8-12 channel pipettes Labnet International, Inc.

BioPette PLUS Pipette aid VMR Accurpette 1 ml, 5 ml, 10 ml Disposable Polystyrene Greiner Bio One 07-200-571, 07- Serological Pipettes 200-573, 07- 200-574 10 µl, 100 µl, 1000 µl pipette tips Axygen T-10-CRS, T- 200-CRS, T- 1000-CRS

[493] Cultivo L929 e outras células: em procedimentos exemplares, L929 foram cultivadas em meio MEM-timina, suplementado com 10% DHS, 2mM L-glutamina, piruvato de sódio 1mM, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina e 0,25 µ g/ml anfotericina.

[494] Remoção de células do prato de frasco de cultura por digestão enzimática: exemplar dos procedimentos, o médio foi removido de células cultivadas num balão T75 com uma pipeta sorológica e descarte. A monocamada de células foi lavada com 4 ml de PBS para retirar o soro. 2 ml foi adicionado à tripsina/EDTA no balão de monocamadas e redemoinho de célula para cobrir toda a superfície. O balão foi devolvido para a incubadora por 5-10 minutos até que as células foram desanexadas. As células foram re-suspendidas em 10 ml de meio fresco, contendo soro para inativar a tripsina e trituradas 5 vezes com uma pipeta sorológica para separar as células umas das outras.

[495] Com 50 µ l de células foram misturados com 50 µ l 5 mg/ml tripan azul, e 10 µ l da mistura foi aplicado a um hemocitometro. As células foram verificadas principalmente ser separado e viabilidade é > 95% (células mortas distinguem células viáveis por sua absorção de azul de tripan mancha). As células foram então contadas.

[496] Semeadura de células na seda de aranha (SS) revestido de placas: Em 96 placas bem: células foram diluídas com mídia fresca para uma densidade de 200.000 células L929 / ml. 200 µ l de suspensão de células foram adicionados aos poços designação e foram colocados em uma incubadora de 37oC umidificado, 5% CO2 (final de semeadura concentrações: 40.000 células/poço).

[497] Em 24 placas bem: células foram diluídas com mídia fresca para uma densidade de 240.000 células L929 / ml. 1ml da suspensão celular foi adicionada aos poços designação e foi colocado em uma incubadora de 37oC umidificado, 5% CO2 (final de semeadura concentrações: 240.000 células/poço). Como um controle para o crescimento celular normal, as células foram semeadas na mesma concentração em placas de colágeno-revestido ou não-revestidas.

[498] A cultura estava crescido para 10 dias. Para cultura a longo prazo das células fortemente aderentes, o meio de cultura celular foi semi trocado a cada 2-3 dias. A placa foi inclinação e metade do meio de cultura antigo era muito cuidadosamente aspirado com uma ponta de pipeta e descartados. Uma quantidade igual de meio fresco foi adicionada a cada poço.

[499] Avaliação do 3D-crescimento de células em SS: As células semeadas na SS dividem e crescem lateralmente bem como em 3 estruturas tridimensionais, formando aglomerados de células viáveis. Crescimento e morfologia da cultura são examinados todos os dias, usando um microscópio invertido. São observadas células usando um microscópio sob diferentes ampliações e aviões de foco diferente. A partir do fundo do prato a cultura, o marcador é rodado lentamente para se concentrar em um plano superior. Grupos formados por células semeadas na SS é visto em vários planos de foco, revelando o contorno das células diferentes em cada nível de foco.

[500] Os resultados obtidos a partir dessas experiências indicaram que enquanto colágeno suportado o crescimento de uma única camada de células SS suportado o crescimento de 2-5 camadas de células. (Ver figura 40A, 40B e figuras 41A-B, 42) e dependendo da espessura do SS aplicado à placa (figuras 43A-C). Assim, o atual sistema permite pré-fabricação de um determinado número de camadas de células em que as células Cruz interagem. Especificamente, é mostrado que um prato coberto com 1-6 x 105 fibras/cm2 com suporte apenas uma única camada em que 12 x105 fibras/cm2 suportado o crescimento de duas camadas de células (pelo menos 80% das camadas foram organizado em duas camadas). 24 x105 fibras/cm2 suportado o crescimento de uma média de 3,7 camadas de células (pelo menos 80% das camadas, organizaram-se em camadas de 3-4). Novamente, essas configurações o colágeno revestido nas placas rendidas apenas uma única camada, independentemente da espessura do colágeno aplicado (dados não mostrados).

[501] Como mostrado na figura 44 semeadas em placas revestidas com SS comparado a organização solitária dentro de placas de controlo (semeado com a mesma quantidade de células) de células formaram não só multicamadas com interações de célula para célula, mas na verdade é organizado em um conectivo estrutura do tecido ou microestrutura. Neste conjunto de experimentos foi claramente demonstrado que a motilidade das células cultivadas em SS é pelo menos 2 vezes maior do que as células cultivadas em placa de cultura de tecido revestido, poliestireno de colágeno (Veja também figuras 49A-C).

[502] Como mostrado na Figura 45 células semeadas em placas de indução esferoides, na presença de SS desenvolvido em esferoides que são significativamente maiores do que as células semeadas (com a mesma quantidade de células) na presença de colágeno ou sem um suplemento. Após 7 dias de incubação a SS – contendo esferoides mantida cerca de 4,7 células mais viáveis em comparação com os colágeno- esferoides ou controlar esferoides sem um suplemento. A área de superfície das esferoides crescido com SS foi cerca de 4,1 vezes maior em comparação com a área de superfície das esferoides cultivadas com colágeno ou sem um suplemento. Estas experiências não apenas mostram que SS apoiar fortemente a proliferação de células, mas também inibem a morte celular dentro de esferoides como mostrado nas figuras

46. º-C.

[503] Em resumo, estes dados fornecem evidências conclusivas sobre os benefícios inesperados da SS no cultivo e manutenção de células. Surpreendentemente verificou- se que pelo menos 4 repetições (n) foram necessárias para manter a proliferação e a viabilidade celular. Os resultados recentes indicaram também que, de preferência, 8 ou mais repetições devem ser usadas a fim de maximizar os parâmetros de crescimento celular. EXEMPLO 10 SEMEADURA DE CÉLULAS SOBRE A SEDA DE ARANHA (SS) DE PLACAS

REVESTIDAS E SEMEADURA DE CÉLULAS MISTURAM COM SS EM PLACAS NÃO REVESTIDAS

[504] As células HEK293 foram semeadas em placas revestidas com SS e em placas nuas no qual SS foi misturado com os meios de cultura de células. Foram utilizadas as seguintes matérias de cultura de células:

Material Fabricante Cat.

No.

SS- A seda de aranhaSuspension, Seevix Material NA Sterile, 150,000 Units/µl Sciences Ltd.

HEK293 cells ATCC CRL-1573 Dulbecco's Modified Eagle Medium, Biological Industries 01-055-1A without L-glutamine Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-121-1A L-glutamine Biological Industries 03-020-1B Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Biological Industries 03-033-1B Trypsin EDTA Solution B (0.25%), Biological Industries 03-052-1B EDTA (0.05%) Trypan Blue, 5mg/ml in Saline Biological Industries 03-102-1B

Equipamento Fabricante Model/Cat No.

Laminar flow cabinet, Biological Labconco Purifier class ii biosafety hazard cabinet delta series Inverse phase contrast microscope Life Technologies EVOS XL Incubator, 37oC, humidified, 5% CO2 Heraeus Hera Cell Water bath, 37oC QSR Technologies VMS-20 Hemocitomêtro Marienfeld Neubauer emmelhoria Nunc™ Cell Culture Treated Thermo Fisher 156472 EasYFlasks™ Scientific 96-well tissue culture microtiter plate- Seevix Material NA coated with SS Sciences Ltd. 24-well tissue culture plate-coated Seevix Material NA with SS Sciences Ltd.

Pipettes Eppendorf Research Plus 8-12 channel pipettes Labnet BioPettePLUS International, Inc. Pipette aid VMR Accurpette 1 ml, 5 ml, 10 ml Disposable Greiner Bio One 07-200-571, 07-200-573, Polystyrene Serological Pipettes 07-200-574 10 µl, 100 µl, 1000 µl pipette tips Axygen T-10-CRS, T-200-CRS, T-1000-CRS

[505] Procedimento de cultura HEK293cell: HEK293 foram cultivados em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% FBS, 2mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina e 0,25 µ g/ml anfotericina. Células do prato de frasco de cultura foram retiradas por digestão enzimática. Seguido de lavagens e re- suspensão em meio contendo soro fresco para inativar a tripsina. As células foram então misturadas com tripan azul e viabilidade foi avaliada.

[506] Semeadura de células na SS revestido de placas: as células foram diluídas em mídia fresca para uma densidade de 50.000 HEK293 células/ml e uma densidade de

200.000 células / ml. 200 µ l de suspensão de células foram adicionados ao designado poços de cultura de células e foram colocados em um 37oC umidificado incubadora, 5% CO2 (Final de semeadura concentrações: 10.000 células/poço e 40.000 células/poço). [507] As células foram cultivadas por até 6 dias sem substituição médio.

[508] Células cultivadas em meio enriquecido SS: células foram diluídas em mídia fresca para uma densidade de 50.000 HEK293 células/ml e uma densidade de 200.000 células / ml. SS foi adicionado às células suspensas em uma concentração final de

400.000 unidades de SS /ml (2,5 µ l S/ml). 200 µ l de suspensão de células SS foram adicionadas aos poços de cultura de células designadas e foram colocados em uma incubadora de 37oC umidificado, 5% CO2 (Final de semeadura concentrações: 10.000 células/poço e 40.000 células/poço). As células foram cultivadas por até 6 dias sem substituição médio. Resultados

[509] Células semearam em placas de SS revestido: Clusters de HEK293 foram observados a semeadura de células de 3-4 dias. Tanto alta densidade e células de baixa densidade semeadas na ss revestimento foram mostradas para organizar em uma estrutura de multicamadas 3D (Fig. 47A) dentro de 5 dias após a semeadura. Controle de células semeado em placas não revestidas, cresceu como uma monocamada (figura 47B). Morte celular era inferior a 5%. Na maioria dos campos 3 ou mais camadas de células foram observadas.

[510] Células cultivadas em meios enriquecidos com SS em "nua" placas: Clusters de HEK293 foram observados 3-4 dias após a semeadura de células foram mostrados para aderir às fibras. Conforme mostrado nas figuras 48A-C muitas células foram crescidas sem qualquer apego físico à placa. Estas células foram aderiu à SS. Não só que SS apoiou a superfície de fixação de células, mas também células aderiram à SS proliferaram através das fibras de SS, aumentar a altura dos clusters. Assim, as células que necessitam de fixação foram cultivadas nas fibras que foram parcialmente Unidas a placa ou a outras células anexadas à placa.

[511] AsFiguras 49A-B apresentar célula motilidade quantificação-comparação entre células semeadas no poliestireno e semeadas em placas de SS-revestido de células.

[512] Um prato de cultura de tecidos foi parcialmente revestido com SS L929 células foram semeadas em uma densidade de células/poço 70.000. Na parte revestida com SS aglomerados de células formaram-se, enquanto uma única camada foi observada na parte não revestida. Uma série de fotos de lapso de tempo da fronteira das duas partes foram tomadas, e foi analisada a motilidade das células únicas. A motilidade média de uma célula cultivada na SS é 2.2-fold superior a motilidade das células cultivadas na superfície não revestida de poliestireno. Além disso, a alta mobilidade de células semeado na SS correlaciona-se positivamente à densidade dos clusters de célula.

[513] Embora a invenção tem sido descrita em conjunto com incorporações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações será evidente para aqueles qualificados na arte. Por conseguinte, se destina a abraçar todas essas alternativas, modificações e variações que caem dentro do espírito e o vasto âmbito das reivindicações acrescentadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo um composto compreendendo uma mistura de proteínas e pelo menos um polímero, caracterizado por: a referida mistura de proteínas compreender tipos "m" de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína na referida mistura compreende, independentemente, "n" repetições em repetitivas regiões de uma proteína espidroína ampolada principal (MaSp) ou um homólogo, variante, derivado ou fragmento funcional do mesmo, em que "m" e "n" são independentemente, um número inteiro entre 2 e 70.

2. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto da reivindicação 1, caracterizado por a referida mistura de proteínas ser caracterizada por uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em: (a) cada repetição tem um peso molecular no intervalo de 2 kDa a 3,5 kDa; (b) a razão de 'n' para 'm' está na faixa de 1,5:1 a 1: 1,5; (c) na forma de uma fibra, opcionalmente uma fibra com uma porosidade de pelo menos 30%.

3. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado por o referido polímero ser um polímero sintético, um polímero termoplástico, um termoconjunto, um epóxi, um poliéster, uma poliamida, um poliol, um poliuretano, Nylon, um poliacrito, um policarbonato, ácido poliláltico (PLA) ou um copolímero de um silício, um polímero de cristal líquido, polipropileno enxertado com anidrido maleico, policaprolactona (PCL), borracha, celulose, ou qualquer combinação dele, opcionalmente em que pelo menos um polímero é um polímero não derivado da proteína MaSp.

4. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por cada uma das referidas proteínas compreende,

independentemente, uma sequência de aminoácidos tal como apresentada na SEQ ID NO: 1: (X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10, em que X1 é independentemente, em cada caso A ou G em que pelo menos 50% de (X1)Z é A, Z é um inteiro entre 5 e 30; X2 é S ou G; X3 é G ou E; X4 é G, S ou N; X5 é Q ou Y; X6 é G ou S; X7 é P ou R; X8 é Y ou Q; X9 é G ou S; e X10 é S ou G.

5. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a referida região repetitiva compreender a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 3 (AAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS).

6. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado por (i) pelo menos uma propriedade mecânica melhorada em comparação com a propriedade do polímero livre da referida mistura de proteínas, em que a dita propriedade é selecionada do grupo que consiste em: módulo de Young, resistência tênsil, tensão em fratura, ponto de escoamento, tenacidade, operação de trabalho até falha, resistência ao impacto, resistência ao rasgo, módulo de flexão, flexão de tensão e tensão a um alongamento percentual específico, ou (ii) uma camada de pelo menos 0,5 mícron de espessura.

7. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por uma concentração total das referidas proteínas varia de cerca de 0,1 por cento em peso a cerca de 10 por cento em peso do peso total do referido composto.

8. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo um artigo caracterizado por compreender o composto de qualquer uma das reivindicações 1-7, o artigo opcionalmente ainda compreende um material biocompatível ou um material implantável.

9. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo uma composição farmacêutica, compreendendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

10. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo um processo de fabricação do composto de qualquer uma das reivindicações 1-7, compreendendo a etapa de anexar a referida mistura de proteínas ao referido polímero de modo a formar o referido composto.

11. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo o processo da reivindicação 10, compreendendo pelo menos uma etapa selecionada de: (i) fusão do referido polímero para produzir um polímero fundido e transformar a referida mistura de proteínas no referido polímero fundido; (ii) dissolução do dito polímero para produzir um polímero dissolvido e transformação da referida mistura de proteínas no referido polímero derretido; (iii) extrusão do dito polímero; (iv) formação de uma ou mais camadas de proteínas referidas por eletrofiação contínua.

12. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo uma composição caracterizada por: (a) uma fibra compreendendo "m" tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, caracterizado por cada proteína nos referidos tipos "m" de proteínas compreender, independentemente, "n" repetições de uma região repetitiva de uma proteína espidroína ampolada principal (MaSp), ou um de seu homólogo, variante, derivado ou fragmento funcional, em que m e n são, independentemente, um número inteiro entre 2 a 70; e c(b) um material biocompatível, meio de cultura celular, células ou qualquer combinação destes.

13. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo uma composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido material biocompatível é uma estrutura de suporte de tecido, um dispositivo médico, uma gaze de tratamento de feridas ou uma sutura cirúrgica.

14. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo um método para aumentar a migração celular, aumentando a proliferação celular, inibindo a morte celular, aumentando a ligação celular ou qualquer combinação dos mesmo, caracterizado por compreender o contato da referida célula com um composto compreendendo uma fibra compreendendo “m” tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína nos referidos tipos de proteínas "m" compreende, independentemente, "n" repetições de uma região repetitiva de uma proteína espidroína ampolada principal (MaSp), ou um homólogo, variante, derivado ou fragmento deste, em que m e n são, independentemente, um inteiro entre 2 a 70, opcionalmente em que a composição é aderida a uma superfície ou é misturada com meios de cultura celular.

15. “MATERIAIS COMPOSTOS QUE COMPREENDEM A SEDA DE ARANHA DO TIPO FIO DE SEGURANÇA SINTÉTICA”, sendo um método in-vitro ou ex-vivo para a montagem de um número pré-definido de camadas celulares em uma superfície, caracterizado por compreender: aplicação de uma quantidade predefinida de uma fibra compreendendo "m" tipos de proteínas de diferentes pesos moleculares, em que cada proteína nos referidos tipos "m" de proteínas compreende, independentemente, "n" repetições de uma região repetitiva de uma proteína espidroína ampolada principal (MaSp), ou um homólogo funcional, variante, derivado ou fragmento deste, em que m e n são, independentemente, um número inteiro entre 2 a 70, para com dita superfície, em que a referida quantidade predefinida é correlacionada com um número predefinido de camadas de células, opcionalmente em que o dito número predefinido de camadas de células é entre 1 a 4 camadas de células, ainda opcionalmente em que qualquer uma: (i) 1 camada requer: 1 x103 a 8 x105 das ditas fibras/cm2 (ii) 2 camadas requerem: 4 x105 a 18 x105 das ditas fibras/cm2 (iii) 3 a 4 camadas requerem: mais de 18 x105 das ditas fibras/cm2.