JP5871234B2

JP5871234B2 - 合成コラーゲンナノファイバーの製造方法

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Publication number: JP5871234B2
Application number: JP2012067627A
Authority: JP
Inventors: 小林　尚俊; 尚俊小林; 堂彦寺田; 正美戸所; 明子島谷; 片岡　之典; 之典片岡
Original assignee: JNC Corp; National Institute for Materials Science
Current assignee: JNC Corp; National Institute for Materials Science
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2016-03-01
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: US20130253099A1; JP2013199713A

Description

本発明は、合成コラーゲンのナノファイバー及びその製造方法に関する。

ナノメートルスケール（１ｎｍ〜１０００ｎｍ）の直径を有する繊維は、マイクロメートルスケール以上の直径を有する繊維とは異なる材料特性を示すことから、一般にナノファイバーと称されて他の繊維とは区別されている。ナノファイバーは単位質量あたりの材料表面積、いわゆる比表面積が非常に大きいことから、機能分子キャリヤ材料、流体との接触反応材料、衣料用素材、産業資材製品、生活資材製品、環境資材製品、燃料電池や二次電池の電極や隔膜、再生医療用材料、超高性能フィルター、電子ペーパー、ウエアラブルセル、防護服等への応用が検討され、さまざまな分野で研究開発が盛んに行われている。また、ナノスケールの材料が細胞へ与える影響などが注目を集めており、各種ナノファイバーを利用した医療用材料に関する研究も数多く報告されている。
このようなナノファイバーを製造する方法としては、エレクトロスピニング法（電界紡糸法）が知られている（特許文献１）。

ところで、タンパク質の一種であるコラーゲンは、汎用的な医用材料として幅広く用いられている。天然の一型コラーゲン分子は三アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しから成る特徴的な一次構造を有する。このポリペプチドが同じ向きに３本寄り集って形成された３重らせんの三次構造をとり、コラーゲン繊維を形成する。
一方、コラーゲン様ペプチドとして創出された、三アミノ酸残基Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙ：プロリンまたはヒドロキシプロリン）の繰り返し構造からなる合成コラーゲン分子も、三重らせん構造をとることが報告されており、種々の機能性材料としての研究がなされている（特許文献２）。

合成コラーゲンからなるナノファイバーは、アミノ酸残基の配列制御、さらには、それらの化学修飾性などを利用して、天然コラーゲンナノファイバーにはない高機能性あるいは多機能性を持った材料になり得ると考えられる。
しかしながら、天然コラーゲン分子とは異なり、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙのみからなる単純な繰り返し構造であるため、かかる合成コラーゲンは高分子ペプチドでありながら分子鎖間の相互作用に乏しく、易水溶性を呈する。そのため、天然コラーゲン繊維様の長繊維の形成はこれまで達成されていなかった。前述のエレクトロスピニング法によっても、ビーズが形成されたり繊維状のものが得られなかったりして達成できていなかった。

特開２００７−３０３０１５号公報国際公開第２００８／０７５５８９号パンフレット

本発明は上記の状況に鑑み、本発明は合成コラーゲン分子を用いて、エレクトロスピニング法によってナノファイバーを製造する方法を提供するものである。

本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、合成コラーゲンをエレクトロ
スピニング法で紡糸する際に紡糸基材としてポリマーを用いることにより、均一かつ長い繊維状のナノファイバーを得られることを見出した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドを含有するナノファイバーの製造方法であって、
前記ポリペプチドとポリマーとを含有する紡糸溶液を調製する工程と、
前記紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを含むことを特徴とする製造方法。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n― （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）
［２］前記紡糸溶液中の前記ポリペプチド濃度が０．１〜１０重量％である、［１］に記載の方法。
［３］前記紡糸溶液中の前記ポリマー濃度が０．１〜１０重量％である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記紡糸溶液における前記ポリペプチドと前記ポリマーの重量比が１０：１〜１：４０である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ポリマーが天然コラーゲン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸から選択される１種又は２種以上である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］式（１）で示されるペプチドフラグメントとポリマーとを含有するナノファイバー。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n― （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）

本発明によれば、合成コラーゲンを含有する均一かつ長い繊維状のナノファイバーを得る手段が提供される。また、これまでナノファイバー化が困難であった合成コラーゲンを含有するナノファイバーが提供され、医療用途をはじめ種々の用途に供する材料とすることができる。

実施例のＳＣ／ＮＣナノファイバーのＳＥＭ画像写真である（ａ，ｂ：実施例１、ｃ、ｄ：実施例２）。実施例３のＮＣ／ＰＧＡナノファイバーのＳＥＭ画像写真である。実施例のＳＣ／ＰＥＧナノファイバーのＳＥＭ画像である（ａ，ｂ：実施例４、ｃ、ｄ：実施例５）。実施例のＳＣ／ＰＶＡナノファイバーのＳＥＭ画像である（ａ，ｂ：実施例６、ｃ、ｄ：実施例７）。

本発明においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。

本発明のナノファイバーの製造方法は、合成コラーゲンとポリマーとを含有する紡糸溶液を調製する工程と、前記紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを含む。以下に、本発明について詳細に説明する。

＜１＞合成コラーゲン
本発明の方法に用いられる合成コラーゲンは、次式（１）で示されるペプチドフラグメント（以降、ポリＰＹＧと記す）を有するポリペプチドである（以降、合成コラーゲンと記す場合もある）。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n― （１）
ここでＹはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。
また、式（１）中、繰り返し数ｎは５〜９０００の整数である。ｎがこの範囲であることにより、ポリペプチドは３重らせん構造形成をとり、ナノファイバー形成が容易となる。また、３重らせん構造の安定性の観点からｎは５〜１０００がより好ましく、１０〜５００がさらに好ましい。
本発明における合成コラーゲンのポリペプチド鎖は、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に３重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその３重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。
なお、ポリペプチドが３重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは３重らせん構造をとっていると考えられる。
また、本発明における合成コラーゲンのポリペプチド鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。

本発明における合成コラーゲンの重量平均分子量は、特に限定されるものではないが、紡糸溶液の調製、紡糸の効率、及び３重らせん構造の安定性の観点から５７０〜７００万が好ましく、２８５０〜３０万がより好ましい。
ここで、合成コラーゲンの重量平均分子量は、例えば特開２００３-３２１５００号公
報に記載されている、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（ＧＥヘルス
ケア・ジャパン株式会社製）、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））分子量標準としてＧｅｌＦｉｌｔｒａ
ｔｉｏｎＬＭＷＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ及びＧｅｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＨ
ＭＷＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を使用したゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法、あるいは、カラム：ＳｕｐｅｒｄｅｘｐｅｐｔｉｄｅＰＥ７．５／３００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）
、流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））、分子量標準としてＧｅｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＬＭＷＣａ
ｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）とヒトインシュリ
ン、グリシンを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法により測定することができる。別の方法として、カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ６０００ＰＷＸＬ−ＣＰ８．０ｘ３００ｍｍ（東ソー製）、移動相２０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₃ＰＯ₄（ｐＨ３．０
）：ＭｅＯＨ＝８：２、カラム温度４０℃、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出はＵＶモニターによる２１５ｎｍ及び示差屈折系、分子量標準として分子量５００００から１６０００００のプルラン（昭和電工製）および分子量１１９０００００のデキストラン（ＰｏｌｙｍｅｒＳｔａｎｄａｒｄｓＳｅｒｖｉｃｅＧｍｂＨ）によるＨＰＬＣゲルパーミエー
ションクロマトグラフィーにより測定できる。また、このＨＰＬＣゲルパーミエーションクロマトグラフィーの検出器にＷｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＤＡＷＮＨＥＬＥＯＳ、ＯｐｔｏｌａｂｒＥＸを用いる事で、ゲル浸透クロマトグラフ／多角度レーザー
光散乱検出器（ＧＰＣ−ＭＡＬＳ）法としても測定する事ができる。本明細書において合成コラーゲンの重量平均分子量は、これらの方法によって測定された値である。

本発明における合成コラーゲンのポリペプチドは、ポリＰＹＧのみからなるものであってもよいが、３重らせん構造の安定性を損なわず、また本発明の効果を損なわない範囲において、ポリＰＹＧの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
本発明における合成コラーゲンのポリペプチドは、ポリＰＹＧとポリＰＹＧの他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリＰＹＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン他のペプチドフラグメント＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有する。

本発明における合成コラーゲンのポリペプチドは、ナノファイバーの紡糸を阻害しない限り、無機酸（塩酸、硫酸等）、有機酸（酢酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン酸等）、金属（ナトリウム、カリウム等）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン等）との塩であってもよい。本発明における合成コラーゲンのポリペプチドの塩化合物は、単独または二種類以上の組合せであってもよい。

ポリＰＹＧを有するポリペプチドは、いずれの方法により得られたものであってもよい。
例えば、既知の固相合成法または液相合成法により取得したポリＰＹＧを構成するアミノ酸からなるペプチドオリゴマーを用いて、縮合反応を行う方法により好ましく取得できる。
上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、原料となるペプチドオリゴマーを溶解（一部または全部を溶解）または懸濁可能なものであればよく、通常、水または有機溶剤が使用できる。具体的には、水、アミド類（ジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）、およびこれらの混合溶媒等である。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが好ましく使用される。

また、上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、脱水剤（脱水縮合剤、縮合助剤）の存在下で行うことが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、脱保護とアミノ酸結合とを繰返す煩雑な処理を経ることなく、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進行する。

脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤（ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ
・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等）、フルオロホスフェート系
縮合剤（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ））等）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）である。

脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。

縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類）、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）等のトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類（ＨＯＮＳｕ等）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類（ＨＯＢｔ等）である。
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。

脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と
縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が挙げられる。

上記ペプチドオリゴマーの縮合反応においては、反応溶液のｐＨを調節してもよく、通常、反応溶液のｐＨは中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）に調整される。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができる。
また、縮合反応に関与しない塩基を反応溶液に添加してもよい。縮合反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、本ペプチドオリゴマーの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。

以上のようにして得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。これは本発明の方法における紡糸工程に影響するため、除去することが好ましい。残存している試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。

また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られた有効成分ポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。ただし、本発明の方法における紡糸工程に影響を与える物質を含有しないことが好ましい。

＜２＞ポリマー
本発明のナノファイバーの製造方法においては、ポリマーを紡糸基材として用いることにより、これまでナノファイバー化が困難であった合成コラーゲンをエレクトロスピニング法にて紡糸することが可能となる。その結果、合成コラーゲンを含有する均一かつ長い繊維状のナノファイバーを得ることができる。

本発明におけるポリマーは、紡糸基材として用いることができるものであれば特に限定されず、合成物でも天然物でもよい。例えばポリエチレングリコール、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル−メタクリレート共重合体、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン−アクリレート共重合体、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリベンズイミダゾール、ポリビニルアルコール、セルロース、酢酸セルロースブチレート、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンサルファイド、ＳＢＳ共重合体、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン６１０、ナイロン６１２、並びにこれらの共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンオキサイド、天然コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリアリレート、ポリプロピレンフマラート、ポリペプチド、タンパク質、コールタールピッチ、石油ピッチ、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、これらのポリエステル樹脂の重合体、ポリパラフェニレンテレフタラミ
ド、ポリパラフェニレンテレフタラミド−３，４′―オキシジフェニレンテレフタラミド共重合体、ポリメタフェニレンイソフタラミド、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニリデンクロリド、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、キチンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、ヒアルロン酸およびその誘導体、コンドロイチンおよびその誘導体、デオキシリボ核酸およびその誘導体、ポリグルタミン酸およびその誘導体、グルコマンナンおよびその誘導体などが挙げられる。これらのポリマーから選択される２種以上のポリマーの混合物が用いられてもよい。これらのうち、生体適合性のあるポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸、天然コラーゲン、などが、得られるナノファイバーを医療材料用途に供するのに適するため、好ましい。

本発明におけるポリマーの重量平均分子量は、特に限定されないが、５万〜１００万であることが好ましく、６万〜９０万であることがより好ましい。なお、かかる重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ法、光散乱法で測定することができる。

＜３＞溶媒
本発明における合成コラーゲンとポリマーとは、溶媒に溶解させて紡糸溶液として用いる。
かかる溶媒としては、合成コラーゲンやポリマーを溶解し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、スルホランアセトン、プロパノール、ジクロロメタン、蟻酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、塩化メチレン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２−ピロリドン、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルカーボネート、アセトニトリル、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、ブチレンカーボネート、１，４−ブチロラクトン、ジエチルカーボネート、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジオキソラン、エチルメチルカーボネート、メチルホルマート、３−メチルオキサゾリジン−２−オン、メチルプロピオネート、２−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。溶媒は一種を単独で用いてもよく、複数の溶媒の混合物であってもよい。

＜４＞その他の任意成分
本発明の方法における紡糸溶液は、前述した必須成分の他に、紡糸を妨げない限りにおいて任意の成分を含有してもよい。かかる任意成分としては、接着剤、電解質などが挙げられる。
接着剤を添加すると、製造されたナノファイバーどうしが接触点で接着されるので、ナノファイバーを不織布の形態で得る際に強力で摩擦によるケバ立ちの少ない柔軟な不織布とすることができる。接着剤としては、製造されたナノファイバーどうしを接着でき、かつ紡糸溶液の溶媒に可溶であれば特に限定されないが、例えばホットメルト樹脂からなる接着剤、エラストマー系の接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤、ビニル系接着剤などが挙げられる。エラストマー系の接着剤としては、ポリクロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブチルゴム、アクリロニトリル・ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、クロロスルフォン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴムが例示され
る。接着剤を添加する場合は紡糸溶液中の合成コラーゲンとポリマーとの総量に対して０．５〜１０重量％添加されることが好ましい。

電解質を添加することによって紡糸溶液表面の電荷密度を上げることが出来、結果として紡糸性を向上させることが可能となる。電解質としては、紡糸溶液に可溶で、紡糸溶液中で電離するものであれば特に限定はされないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸二水素ナトリウム、炭酸マグネシウムが例示される。電解質を添加する場合は、紡糸溶液中の合成コラーゲンあるいはポリマーが塩析しない程度が望ましく、紡糸溶液中の合成コラーゲンとポリマーとの総量に対して０．５〜１０重量％添加されることが好ましい。

＜５＞紡糸溶液の調製工程
本発明の方法は、溶媒に合成コラーゲンとポリマーとを溶解させて紡糸溶液を調製する工程を含む。紡糸溶液の調製方法としては、合成コラーゲンとポリマーとはそれぞれ溶媒に溶解させて各溶液を混合してもよいし、いずれか一方を溶媒に溶解させた溶液に他方を添加して溶解させてもよい。また、調製の際は、合成コラーゲンを変性させない限りにおいて、適宜加温、攪拌等を行ってもよい。
紡糸溶液中の合成コラーゲンの濃度は０．１〜１０重量％であることが好ましく、０．２５〜５．０重量％であることがより好ましい。また、紡糸溶液中のポリマーの濃度は０．１〜１０重量％であることが好ましく、０．２５〜１０重量％であることがより好ましい。合成コラーゲンやポリマーの濃度をこのような範囲にすることにより、紡糸溶液中においてポリマー−ポリマー間またはポリマー−合成コラーゲン間に相互作用が生じ、連続繊維が形成されやすくなる。
紡糸溶液における合成コラーゲンとポリマーとの配合比率は、均一なナノファイバーをある程度の長さで得るためには、重量比で２０：１〜１：１００であることが好ましく、１０：１〜１：４０であることがより好ましい。

＜６＞ナノファイバーの紡糸工程
本発明の方法は、前述したように調製した紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法（電界紡糸法）を行うことによりナノファイバーを紡糸する工程を含む。この工程によりナノスケールの微細かつ均一な径を有する繊維を製造できる。
エレクトロスピニング法は、周知の手段によって行うことができ、具体的には、紡糸溶液を充填したノズルとコレクター（基板）の間に電圧を印加した状態で、ノズルから紡糸溶液を吐出させて、コレクター上に繊維を回収する。エレクトロスピニング法を行う条件は、特に限定されず、紡糸溶液の種類や得られるナノファイバーの用途等に応じて適宜調整すればよい。本発明の方法における一般的な条件としては、例えば、印加電圧は８〜３０ｋＶ、吐出速度は０．０１〜１．００ｍＬ／時、ノズルとコレクターの間の垂直距離は１００〜２００ｍｍとすることができ、ノズルは２２〜２５Ｇの径のものを使用することができる。紡糸環境は、相対湿度１０〜４０％、温度を１０〜２５℃とすることが好ましいが、特段厳密に制御を行わなくてもよい。

本発明の製造方法により、直径５ｎｍ〜５０μｍの繊維を得ることができる。また、紡糸条件の設定・調整により、平均して２００〜３００ｎｍの長く途切れないナノファイバーを得ることができる。また、ナノファイバー中に、塊状のビーズを含まないか含まれても少ない、均一なナノファイバーを得ることができる。
本発明により得られた合成コラーゲンを含有するナノファイバーは、機能性材料として、医療用材料など種々の用途に供することができる。例えば、合成コラーゲンの有する、血液凝固因子等の生体分子への高親和性を利用した吸着剤や、血液凝固能を利用した止血剤に適用したりすることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

エレクトロスピニング法にて、実施例１〜７のナノファイバーを作製した。それらのナノファイバーについて、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。使用機器はＪＳＭ-５
６００（ＪＥＯＬ社製）、加速電圧は２０ｋＶで観察を行った。

＜実施例１＞ＳＣ／ＮＣ（１０：１）ブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）と、天然コラーゲン（ＮＣ；ＮＭＰコラーゲンＰＳ／ＩＰ、ニッポンハム株式会社製）とを、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ；和光純薬社製）にＳＣ／ＮＣ／ＨＦＩＰが５０ｍｇ／５ｍｇ／１ｍＬとなるように溶解させて、紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとコレクターとの間（垂直距離１５０ｍｍ）に高電圧発生装置により１０ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．１ｍＬ／時でコレクター上に押し出した。なお、紡糸環境の湿度及び温度は制御せず、実験室環境下にて紡糸を行った。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径１４５ｎｍでビーズや粒子を含まない比較的均一なナノファイバーが得られたことがわかった（図１ａ，ｂ）。

＜実施例２＞ＳＣ／ＮＣ（１：１）ブレンドナノファイバー
紡糸溶液の濃度を、ＳＣ／ＮＣ／ＨＦＩＰが５０ｍｇ／５０ｍｇ／１ｍＬとした他は実施例１と同様の操作を行い、紡糸した。
ＳＥＭ観察したところ、リボン状ファイバーが得られたことがわかった（図１ｃ，ｄ）

＜実施例３＞ＳＣ／ＰＧＡブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）と、ポリグリコール酸（ＰＧＡ；シグマアルドリッチ社製）とを、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ；和光純薬社製）にＳＣ／ＰＧＡ／ＨＦＩＰが５０ｍｇ／１０ｍｇ／１ｍＬとなるように溶解させて、紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとコレクターとの間（垂直距離１５０ｍｍ）に高電圧発生装置により１２ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．１ｍＬ／時でコレクター上に押し出した。なお、紡糸環境の湿度及び温度は制御せず、実験室環境下にて紡糸を行った。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径７１ｎｍであったが、多くのビーズを含むナノファイバーが得られたことがわかった（図２）。

＜実施例４＞ＳＣ／ＰＥＧ５００ｋブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；重量平均分子量５００，０００、和光純薬社製）の１０重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＥＧ＝２：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離２００ｍｍ）に高電圧発生装置により８ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．０１ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径１１５ｎｍで比較的均一なナノファイバーが得られたことがわかった（図３ａ，ｂ）。

＜実施例５＞ＳＣ／ＰＥＧ９００ｋブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；重量平均分子量９００，０００、シグマアルドリッチ社製）の５重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＥＧ＝２：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした点、及び吐出速度を０．０３ｍＬ／時とした点の他は実施例４と同様の操作を行い、紡糸した。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径８７ｎｍの繊維部分は比較的均一であったが、紡錘形ビーズが多数含まれるナノファイバーが得られたことがわかった（図３ｃ，ｄ）。

＜実施例６＞ＳＣ／ＰＶＡ２０００ブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均重合度２，０００、けん化度９８．０ｍｏｌ％、和光純薬社製）の０．５重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＶＡ＝１：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離２００ｍｍ）に高電圧発生装置により１５ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．２ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径２１３ｎｍでビーズや粒子を含まない比較的均一なナノファイバーが得られたことがわかった（図４ａ，ｂ）。

＜実施例７＞ＳＣ／ＰＶＡ１５００ブレンドナノファイバー
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均重合度１，５００、けん化度７８〜８２ｍｏｌ％、和光純薬社製）の２０重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＶＡ＝１：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離２００ｍｍ）に高電圧発生装置により１２ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．１ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
ＳＥＭ観察したところ、平均直径２０１ｎｍでビーズや粒子を含まない比較的均一なナノファイバーが得られたことがわかった（図４ｃ，ｄ）。

本発明によれば、合成コラーゲンを含有する均一かつ長い繊維状のナノファイバーを得る手段が提供される。また、これまでナノファイバー化が困難であった合成コラーゲンを含有するナノファイバーが提供され、医療用途をはじめ種々の用途に供する材料とすることができるので、産業上非常に有用である。

Claims

式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドとポリマーとを含有するナノファイバーの製造方法であって、
前記ポリペプチドとポリマーとを含有する紡糸溶液を調製する工程と、
前記紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを含み、
前記ポリマーは、天然コラーゲン、ポリエチレングリコール、及びポリビニルアルコールから選択される１種又は２種以上であることを特徴とする製造方法。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n― （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）
前記紡糸溶液中の前記ポリペプチド濃度が０．１〜１０重量％である、請求項１に記載の方法。
前記紡糸溶液中の前記ポリマー濃度が０．１〜１０重量％である、請求項１又は２に記載の方法。
前記紡糸溶液における前記ポリペプチドと前記ポリマーの重量比が１０：１〜１：４０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドとポリマーとを含有し、
前記ポリマーは、天然コラーゲン、ポリエチレングリコール、及びポリビニルアルコールから選択される１種又は２種以上である、ナノファイバー。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n― （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）