CN111378710A

CN111378710A - 一种重组蛛丝蛋白的产业化生产方法

Info

Publication number: CN111378710A
Application number: CN201911169158.0A
Authority: CN
Inventors: 马永; 张韬; 赵百学; 王安良
Original assignee: Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jingsen Biomedical New Material Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN111378710B

Abstract

本发明涉及一种适用于蛛丝蛋白原核分泌表达放大的生产工艺路线，对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。本发明采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，而表达量提高50％，纯度提高50％。

Description

一种重组蛛丝蛋白的产业化生产方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及重组蛛丝蛋白大肠杆菌分泌表达的产业化生产方法。

背景技术

蜘蛛丝既有钢般的坚硬,又有橡胶般的弹性。其突出的性能主要表现在:高强度、高弹性、高断裂功,可以说是迄今为止最强韧的材料,被誉为“生物钢”。随着对蜘蛛丝的研究深入,发现蜘蛛丝还具有生物可降解性、超收缩性、耐高温、耐低温及与生物组织的相容性等特性。由于蜘蛛丝这些独特的物理和生物学特性,它在医学、材料、军事和纺织等方面都有着广泛的应用前景。瑞典科学家Jan Johansson利用无刺激性化学物质制造出的人工蜘蛛丝具有良好的生物相容性，可应用于脊髓修复或帮助干细胞生长来修复损伤的心脏组织等再生医学研究中，亦可用于自身防护用具等纺织工业应用中(NatureChemicalBiology,DOI:10.1038/nchembio.2269(2017))。

鉴于蜘蛛丝蛋白巨大的潜在应用性,国内外学者加强对蜘蛛丝的研究,希望蜘蛛丝能够像蚕丝那样大规模地应用于实际。由于蜘蛛无法驯养和天然蜘蛛丝产量少等原因,惟有通过基因工程手段才能大量获取蜘蛛丝，满足蜘蛛丝潜在的应用需求。目前研究人员可以借助大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统进行蜘蛛丝蛋白的生物工程制备。其中，大肠杆菌表达系具有生长快、产量高、生产规模大、成本低、培养条件简单、遗传背景清楚等多重优点，目前被广泛应用于蜘蛛丝蛋白的重组表达研究中，但目前的工艺来说，相关蛛丝蛋白的表达水平仍然有限，无法有效的满足工业化制备的要求。

申请人根据天然蜘蛛丝蛋白的性质设计了衍生自天然蜘蛛丝的蛋白序列，同时将编码重组蜘蛛丝蛋白序列的基因导入到大肠杆菌中进行蛋白表达，本申请旨在建立更高效的重组蜘蛛丝蛋白胞内可溶表达放大工艺。

发明内容

本申请设计了适用于蛋白大肠杆菌分泌表达放大的工艺路线，并对工艺中的关键质量参数进行优化，根据优化条件，完成产业化规模放大。

本发明提供的蛋白分泌表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，高密度发酵的诱导阶段温度为30℃-37℃，pH值为6.8-7.4，诱导剂添加量为0.5M-1M。

作为优选，高密度发酵的诱导阶段温度为35℃-37℃，pH值为7.0-7.4，诱导剂添加量为0.5M。

作为优选，高密度发酵菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm 培养，DO值100％。

作为优选，高密度发酵补料阶段补加甘油和七水合硫酸镁。

作为优选，诱导阶段采用阿拉伯糖作为诱导剂进行诱导表达，并维持DO不低于40％。

蛛丝分泌表达纯化工艺包括菌体破碎、过滤除菌体碎片、加热离心除杂蛋白、盐析收集蛋白、洗涤蛋白，作为优选，菌体破碎过程缓冲液为PBS缓冲液，加热20min除杂蛋白，盐析使用0.8-1.0M硫酸铵溶液，蛋白洗涤液使用50％-70％乙醇。

作为优选，盐析使用0.9M硫酸铵溶液，蛋白洗涤液使用60％乙醇。

本发明的放大工艺具有以下优点：采用的发酵培养基成分简单、成本低廉；发酵工艺中采用特定的控制条件，能耗更低，而表达量提高50％，纯度提高50％。

附图说明

图1：实施例1中发酵产物SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

其中，图1a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量，泳道3为诱导6h后目的蛋白表达量。

图1b为发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图2：实施例2中第一批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

其中，图2a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图2b为发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图3：实施例2中第二批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

其中，图3a为第一批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图3b为发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图4：实施例2中第三批次SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

其中，图4a为第二批次SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图4b为发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图5：实施例3中中试发酵SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

其中，图5a为SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为诱导2h后目的蛋白表达量，泳道2为诱导4h后目的蛋白表达量。图5b为发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图。

图6：实施例3不同加热变性时间获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。

泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为破碎后上清加热10min目的蛋白表达量，泳道2为破碎后上清加热15min目的蛋白表达量，泳道3为破碎后上清加热20min目的蛋白表达量，泳道4为破碎后上清加热25min目的蛋白表达量。

图7：实施例3不同盐析硫酸铵浓度获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。

泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为0.8M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道2为0.8M盐析后上清中目的蛋白，泳道3为0.9M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道4为0.9M盐析后上清中目的蛋白，泳道5为1M盐析后沉淀中目的蛋白，泳道6为1M盐析后上清中目的蛋白

图8：实施例3不同乙醇浓度洗涤获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图。

泳道M为蛋白上样Marker；泳道1为阳性对照，泳道2为50％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白，泳道3为60％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白，泳道4为70％乙醇洗涤后洗涤液中目的蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1重组蛛丝蛋白小规模(3L)高密度发酵工艺

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的重组蛛丝蛋白工作种子库中甘油菌种子(如中国专利CN201810093672.X、201810648563.X中所示，下述也相同)于LB固体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L)划线，37℃恒温恒湿箱培养12h。

步骤2：种子液培养

挑取平板上单克隆菌落于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)， 37℃，220rpm培养至OD₆₀₀≈2，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用种子液。

步骤3：发酵过程

洗净赛多利斯BIOSTAT B生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后配置无机盐培养基(一水合柠檬酸1.7g/L，磷酸二氢钾12g/L，磷酸氢二铵4g/L，葡萄糖20g/L，七水合硫酸镁1.2g/L)作为发酵培养基，倒入罐中，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝7.0±0.2。

将步骤2中得到的种子液按照1:10(V/V，种子液/发酵培养基)比例接入生物反应器中，并按照1ml/L添加微量元素(微量元素配方：FeSO₄·7H₂O 10g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、CuSO₄·5H₂O 15g/L、MnSO₄·5H₂O 5g/L、CaCl₂·7H₂O 1g/L、CoCl₂·6H₂O 1g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1.125 g/L、H₃BO₃ 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L)。发酵开始后定期取样测定OD₆₀₀和菌体湿重。菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，此阶段大约6h，期间DO持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO维持在30％。当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体OD₆₀₀达到30，此时进入补料阶段，此阶段以12 ml/h^-1L^-1的速率补加甘油500g/L和七水合硫酸镁20g/L。降低发酵温度至30℃，待温度稳定后向发酵罐中加入终浓度为1M的阿拉伯糖进行诱导表达，维持DO不低于40％，诱导温度 30℃，诱导pH7.0±0.2。

图1是诱导不同时长目的蛋白表达量，诱导6h目的蛋白表达量相较于诱导4h没有明显提升，而增加诱导时长，可能导致目的蛋白的降解。

实施例2重组蛛丝蛋白小试放大(30L)高密度发酵验证

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于LB固体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨 10g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L)划线，37℃恒温恒湿箱培养12h。

步骤2：种子液培养

步骤3：发酵过程

洗净赛多利斯Cplus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，配置无机盐培养基20L，并倒入发酵罐中,121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝7.0±0.2。

将步骤2中得到的种子液按照1:10(V/V，种子液/发酵培养基)比例接入发酵罐中，并按照1ml/L添加微量元素(微量元素配方FeSO₄·7H₂O 10g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、CuSO₄·5H₂O 15g/L、MnSO₄·5H₂O 5g/L、CaCl₂·7H₂O 1g/L、CoCl₂·6H₂O 1g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1.125g/L、 H₃BO₃ 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L)。发酵开始后定期取样测定OD₆₀₀和菌体湿重。菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，此阶段大约6h，期间DO持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO维持在30％。当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体OD₆₀₀达到30，此时进入补料阶段，此阶段以12 ml/h^-1L^-1的速率补加甘油500g/L和七水合硫酸镁20g/L。降低发酵温度至30℃，待温度稳定后向发酵罐中加入终浓度为1M的阿拉伯糖进行诱导表达，维持DO不低于40％，设定诱导时间4h，不同发酵批次其他诱导条件见表1。

表1重组蛛丝蛋白小试放大高密度发酵工艺条件优化

表1结果表明，相比工艺优化前，工艺优化后目的蛋白(纯化后)产量增加50％，纯度增加50％。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，在小规模条件的基础上完成小试放大规模的验证和优化，发酵产量有明显提升，完全能够进行产业化放大生产。

图2-图4分别是表1中后三个批次的重组蛛丝蛋白SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD₆₀₀和菌体湿重变化趋势图，附图结果显示本实施例的发酵产物以及发酵液OD₆₀₀吸收值、菌体湿重变化趋势均与3L小规模高密度发酵保持一致。

实施例3重组蛛丝蛋白中试规模(300L)高密度发酵验证

步骤1：重组菌株活化

取冻存于-80℃的重组蛛丝蛋白工作种子库中甘油菌种子于LB固体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L)划线，37℃恒温恒湿箱培养12h。

步骤2：摇瓶种子液培养

挑取平板上单克隆菌落于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)， 37℃，220rpm培养至OD₆₀₀≈2，并在显微镜下观察无杂菌，即得到摇瓶种子液。

步骤3：种子罐培养

将步骤2中获得的摇瓶种子液接种至迪沃信BVT-3000型30L种子罐中，采用无机盐培养基，温度为37℃，pH＝7.2±0.2，转速＝300rpm培养，通过通气和转速条件使溶氧保持在45％，最终至OD₆₀₀≈40，湿重达到约80g/L，并在显微镜下观察无杂菌，即得到种子罐发酵液。

步骤4：发酵过程

洗净迪沃信BVT-3000型300L发酵罐，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的 pH计探头，配置无机盐发酵培养基200L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝7.0±0.2。

将步骤3中得到的种子液按照1:10(V/V，种子液/发酵培养基)比例接入发酵罐中，并按照1ml/L添加微量元素(微量元素配方：FeSO₄·7H₂O 10g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、CuSO₄· 5H₂O 15g/L、MnSO₄·5H₂O 5g/L、CaCl₂·7H₂O 1g/L、CoCl₂·6H₂O 1g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1.125 g/L、H₃BO₃ 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L)。发酵开始后定期取样测定OD₆₀₀和菌体湿重。菌体增殖阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，此阶段大约6h，期间DO持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO维持在30％。当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体OD₆₀₀达到30，此时进入补料阶段，此阶段以12 ml/h^-1L^-1的速率补加甘油500g/L和七水合硫酸镁-20g/L。降低发酵温度至30℃，待温度稳定后向发酵罐中加入终浓度为0.5M的阿拉伯糖进行诱导表达，诱导时间4小时，温度35-37℃， pH7.2±0.2，维持DO不低于40％。

目的蛋白表达量1100mg/L。图5是中试发酵重组蛛丝蛋白SDS-PAGE电泳图以及发酵液 OD600和菌体湿重变化趋势图，结果显示本实施例的发酵产物以及说明发酵液OD600吸收值、菌体湿重变化趋势均与30L小试放大规模高密度发酵相比更优。

实施例4重组蛛丝蛋白小试放大表达蛋白纯化处理

本蛛丝蛋白为胞内可溶表达，较易溶于水，且高温稳定，根据其特性进行纯化方法设计，分为以下三个步骤。

步骤1菌体破碎

将发酵菌体通过离心机收集，使用PBS溶液重悬至菌体浓度为100g/L，后进行均质破碎，过程中使用高压均质的压力为800bar，重复3次，充分破碎后，离心收集上清，目的蛋白基本位于上清中，极少部分位于沉淀中。

步骤2杂蛋白去除

根据目的蛋白特性，以及其他蛋白特性能够通过高温的方式将杂蛋白变性后分离，收集目的蛋白。通过加热时长的控制，去除杂蛋白。图6表明60-70℃加热15min依然存在较多的杂蛋白，加热20min后，明显杂蛋白降低。

表2重组蛛丝蛋白杂蛋白去除工艺条件优化

处理批次	加热时长(min)	蛋白回收率(％)	纯度(％)
				批次一	10	82	23％
批次二	15	82	46％
				批次三	20	80	70％
批次四	25	75	65％

步骤3目的蛋白析出和洗涤

将离心收集上清中所含的蛋白通过0.8-1M硫酸铵进行盐析，后使用50％-70％乙醇溶液进行洗涤，后离心收集沉淀即为目的蛋白。图7表明使用不同浓度的硫酸铵对于目的蛋白变性液盐析结果具有较大影响，0.9M浓度硫酸铵目的蛋白纯度较高。图8表明使用不同浓度的乙醇对于目的蛋白盐析洗涤结果具有较大影响，60％浓度乙醇目的蛋白纯度较高，损失较少。

表3重组蛛丝蛋白目的蛋白析出盒洗涤工艺条件优化

处理批次	硫酸铵析出浓度(M)	乙醇洗涤浓度(％)	蛋白回收率(％)	纯度(％)
					批次一	0.8	50	80	70％
批次二	0.9	50	95	80％
					批次三	1.0	50	95	78％
批次四	0.8	60	95	90％
					批次五	0.8	70	96	80％

Claims

1.蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，包括发酵以及纯化工艺，发酵工艺包括重组大肠杆菌活化、发酵种子液培养、高密度发酵，其特征在于：高密度发酵菌体增殖初始阶段发酵温度为37℃，pH＝7.0±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％；高密度发酵的诱导阶段温度为35℃-37℃，pH值为7.0-7.4，诱导剂添加量为0.5M。

2.权利要求1所述蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，其特征在于：高密度发酵补料阶段补加甘油和七水合硫酸镁。

3.权利要求2所述蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，其特征在于：高密度发酵的诱导阶段采用阿拉伯糖作为诱导剂进行诱导表达，并维持DO不低于40％。

4.权利要求1所述蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，其特征在于：蛛丝蛋白包涵体的纯化工艺包括：菌体破碎、过滤除菌体碎片、加热离心除杂蛋白、盐析收集蛋白、洗涤蛋白。

5.权利要求4所述蛛丝蛋白原核分泌表达放大工艺，其特征在于：纯化工艺中菌体破碎过程缓冲液为PBS缓冲液，加热20min除杂蛋白，盐析使用0.8-1.0M硫酸铵溶液，蛋白洗涤液使用50％-70％乙醇。