DK175456B1 - Fremgangsmåde til ekspression af et eukaryot gen - Google Patents

Description

DK 175456 B1 i

Oen foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til ekspression af et rekombinant gen, som indeholder AGA- og/eller AGG-codonen for arginin, i E. coli efter transformation med en ekspressionsvektor, som indeholder det rekombinante gen.

5

Oen genteknologiske fremstilling af proteiner eller protein-holdige genprodukter er et af den moderne bioteknologis hovedmål. Da prokaryoter på grund af deres lette fermenterbarhed frem for alt egner sig til fremstilling af store protei nmæng-10 der, er det allerede flere gange blevet forsøgt også at udtrykke eukaryote gener i prokaryoter. Herved forekommer der imidlertid vanskeligheder i den henseende-, at eukaryote proteiner ofte kun fremstilles i ringe mængder i prokaryotcel1 er, og at cellerne udviser fermenter ings/vækstvanskeligheder ved 15 forhøjet produktion af proteinerne.

Sådanne problemer ved ekspressionen iagttages blandt andet i tilfælde af vævs(tissue type)-pi asmi nogen-akt ivatoren t-PA. Fremstillingen af dette protein er imidlertid et bestræbe!ses-20 værdigt mål, da det ved den kliniske prøvning har vist sig egnet til behandling af i nfarktsygdomme. Selv om E. coli-cel-ler kan udtrykke det på et plasmid eller en vektor indførte t-PAtcONA i en i og for sig tilfredsstillende mængde og kan.producere t-PA, giver cellerne imidlertid ved dannelsen af bio-25 masse stærkt efter under fermenteringen, så at produktionen af t-PA alt i alt ikke når op på det niveau, man kunne forvente, når man går ud fra en enkelt celles produktion. PI asm idstabi-liteten i E. coli-cellerne er også ringe, og på grund af tab af det kodende plasmid aftager produktionshastigheden yder-30 ligere. Hidtil har det derfor kun være muligt at opnå en ekspression af t-PA på ca. 5% af det samlede celleprotein (Roth-stein og Bertonis, Gene 61 (1987), 41-50).

Til grund for opfindeIsen lå nu den opgave at stille en frem-35 gangsmåde til rådighed, som med forøget udbytte gør det muligt at udtrykke rekombi nante gener, hvis ekspres i on ifølge de hidtil kendte metoder førte til en tydeligt formindsket vækst af

DK 175456 B1 I

værtscellerne samt piasmidustabi1 itet og dermed til formind- I

skede udbytter af genprodukt. I

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved hjælp af en frem- I

5 gangsmåde til ekspression af et rekombinant gen, som indehol- I

der AGA- og/eller AGG-codonen for arginin, i E. coli efter I

transformation med en ekspressionsvektor, der indeholder det I

rekombinante gen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, I

at man forøger den i E. coli-cellerne tilstedeværende mængde I

10 t-RNA, som indbygger arginin og genkender codonerne AGG og I

AGA, til mindst fem gange den normalt i disse celler forekom- I

mende mængde. I

Herved skal der inden for den foreliggende opfindelses rammer I

15 ved begrebet t-RNA, der genkender AGA/AGG-codoner og indbygger I

arginin, ikke alene forstås den naturlige i E. coli forekom- I

mende, tilsvarende t-RNA, men også enhver syntetisk t-RNA, I

muteret t-RNA eller suppressor-t-RNA, som har de nævnte egen- H

skaber. H

20 I

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at fremstille H

rekombinante gener, hvis ekspression hidtil på grund af ringe H

vækst af E. col i-værtscel lerne kun førte til de ønskede pro- H

teiner i ringe udbytter, i tydeligt forhøjede mængder. Denne H

25 opnåede tekniske virkning er uventet, for så vidt som man i I

tilfælde af en mangel på den ifølge opfindelsen benyttede t- I

RNA i cellerne ved proteinsyntesen måtte gå ud fra, at det I

fremmede gen måtte blive dårligt udtrykt, og ikke, som det i I

virkeligheden er tilfældet, at det fremmede gen bliver udtrykt I

30 godt, men får cellen til at vantrives. I

I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen forøges mæng- I

den af t-RNA, som genkender AGA/AGG-codonen og indbygger argi- I

nin (i det efterfølgende også kun betegnet som t-RNA), i E. I

35 coli-cellerne ved, at man indfører mindst et for en sådan t- I

RNA kodende gen i cellen. Dette kan fortrinsvis ske ved, at

man i cellen indfører et eller flere t-RNA-gener på en ekstra- I

kromosomal ekspressionsvektor. I

DK 175456 B1 3

Den naturlige t-RNA, som indbygger arginin i E. coli og genkender codonerne AGA og AGG, er et produkt af dnaY-genet, som blev beskrevet af Garcia et al., i Cell 45 (1986), 453-459.

Dette gen er kendt i sin samlede sekvens, det indeholder 118 5 essentielle basepar, og det anvendes fortrinsvis til forøgelse af t-RNA-mængden i E. coli ved indføring af genet. Det er imidlertid også muligt at indføre et gen for en syntetisk t-RNA, en muteret RNA eller en suppressor-t-RNA, som indbygger arginin og genkender AGA og AGG-codonen, i cellerne. Ligeledes 10 kan genet anvende t-RNA fra fagen T^.

I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen bringer man t-RNA-genet eller t-RNA-generne ind i cellen sammen med det eukaryote gen på den samme ekspressionsvektor. Når ekspressions-15 vektoren er et High-copy-plasmid, opnås der allerede herved en tilstrækkelig forøgelse af det intracellulære t-RNA-spejl, så at ingen som helst negative virkninger kan iagttages på værtscellerne ved ekspressionen af det eukaroyte gen.

20 I en anden foretrukken udførelsesform bringer man t-RNA-genet og det eukaryote gen ind i E. coli-cellen på forskellige ekspressionsvektorer. De positive virkninger af at stille en t-RNA Arg(AGG/AGA) til disposition under ekspressionen af det rekombinante protein i E. coli er nemlig ikke afhængig af, at 25 genet for denne t-RNA findes cis-stillet på den pågældende ekspressionsvektor. Denne t-RNA kan også være kodet (transaktiv) på en anden vektor. Denne yderligere vektor skal ganske vist være kompatibel med ekspressionsvektoren i E. coli-cellen, dvs. have en rep 1 ikationsoprinde1 se, der er forskellig 30 fra repli kat ionsopri ndel sen som ekspressionsplasmid.

Herved er det muligt at benytte en vektor med mindre plasmid-kopital end ekspressionsplasmidet, men også ved anvendelse af en vektor, der foreligger i højere kopital end ekspressions-35 vektoren, på hvilken det eukaryote gen befinder sig, at opnå et i forhold til.det eukaryote gen endnu højere t-RNA-spejl. I tilfælde af indføring af t-RNA-genet og det eukaryote gen på

I DK 175456 B1 I

I I

I den samme ekspressionsvektor er det muligt både at indsætte de I

I to gener under kontrol af forskellige promotorer og at indsæt- I

I te de to gener i form af en operon under kontrol af den samme I

I promotor. Væsentligt er det herved kun, at der mellem det eu- I

5 karyote gen og t-RNA-genet befinder sig en stopcodon, så at I

der ved transkriptionen ikke fremkommer noget fusionsprotein. I

I I en anden foretrukken udførelsesform for opfi ndel sen integre- I

I rer man t-RNA-genet eller t-RNA-generne i værtscellens kromo- I

I 10 som. Herved foretrækkes det især at integrere genet således, I

I at det udtrykkes under kontrol af en stærk promotor. Med hen- I

blik herpå indføres t-RNA-genet eller t-RNA-generne fortrins- I

vis sammen med en stærk promotor, under hvis kontrol t-RNA ud- I

I trykkes. I

I 15 I

I Til indføring af et t-RNA-gen i kromosomet anvendes lige som I

I til indføringen af genet i en ekspressionsvektor og til trans- I

formationen af værtscellerne i og for sig kendte metoder. Til I

I indføringen i kromosomet anvendes fortrinsvis metoder under I

20 benyttelse af transposoner eller fager og under udnyttelse af I

rekombinationshændelser. I

En yderligere foretrukken mulighed for at forøge t-RNA-mængden I

i cellen består i, at man forandrer den naturlige promotor for I

25 det kromosomale gen, som koder for denne t-RNA, således at t- I

RNA dannes i større mængde. Hertil foretrækkes det især at I

udskifte den samlede naturlige promotor med en kraftigere, I

fortrinsvis inducerbar og/eller reprimerbar promotor. Sådanne I

promotorer kendes af fagmanden ligesom fremgangsmåderne til I

30 udskiftning af promotorerne, hvilke fremgangsmåder atter for- I

trinsvis gennemføres under anvendelse af transposoner eller I

fager.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til ekspression

35 af et rekombinant gen, som indeholder AGA- og/eller AGG-codo- I

nen for arginin, i E. coli ved transformation med en ekspres- I

sionsvektor, som indeholder det rekombinante gen, hvilken I

DK 175456 B1 5 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man udvælger en E. coli-stamme, som indeholder den femdobbelte mængde af den normalt i E. coli forekommende mængde t-RNA, som genkender codonerne AGG og AGA og indbygger arginin, og at man benytter denne stamme 5 som værtsceller.

Hidtil kendte stammer indeholder for ,det meste kun en så lille mængde t-RNA, som indbygger arginin og genkender codonerne AGA/AGG, og der forekommer de i indledningen beskrevne følger 10 ved ekspression af et fremmed gen. Som standard for E. coli-stammer med den norma.le ringe mængde af det· ifølge opfindelsen benyttede t-RNA kan eksempelvis anføres stammerne OSM 3689, DSM 2102, HFR 3000 og C600 (DSM 2093) (de to sidstnævnte er beskrevet af Bachmann, Bacteriol. Rev. 36 (1972), 180-230).

15 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der nu eventuelt findes frem til E. coli-stammer, som fra begyndelsen af indeholder en højere, nemlig mindst den dobbelte mængde af denne t-RNA. Hertil udvælger man fortrinsvis således, at man fremstiller E. coli-cellernes total-RNA og hybridiserer denne mod 20 et mærket o 1igonukleotid, som svarer til en specifik del af t-RNA'ens DNA-sekvens. Fortrinsvis anvendes derfor Northern-af-tryksteknikken. Northern-aftryksteknikken kendes af fagmanden og er eksempelvis beskrevet af Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora-25 tory, Cold Spring Harbor, New York. Til hybridi seri ngen anvender man fortrinsvis et radioaktivt mærket o 1 igonuk1eotid, men også alle andre mærkninger til DNA-fragmenter kan fordelagtigt anvendes. Ved en specifik del af t-RNA'ens DNA-sekvens, hvilken t-RNA genkender codonerne AGG og/eller AGA, forstår man 30 ONA-sekvenserne véd og i direkte naboskab til anticodonen i t-RNA, den såkaldte anticodon-sløjfe. I modsætning til pseudo-uridin- eller dihydrouridin-s1øjfen er dette område i en t-RNA ikke meget homologt i forhold til andre t-RNA'er, så at et oligonukleotid med sekvensen 5'- CACGACTTAGAAGGT 35 C G T T G -3' eller også f.eks. den kortere sekvens 5’- G A C TT AGAAGGTCGTT -3', samt det komplementære oligonukleotid (5*- CAACGACCTTCTAAGTCGTG -3’)»

DK 175456 B1 I

(5'- AACGACCTTCTAAGTC -3’) kan anvendes som I

specifik sonde til påvisning og karakterisering af denne I

t-RNA. Ifølge opfindelsen anvender man fortrinsvis et oligo- I

nukleotid, som er mellem 14 og 30 basepar langt. H

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig til alle rekombi- I

nante gener, idet fortrinsvis eukaryote gener eller deres cDNA I

fortrinsvis udtrykkes, og især sådanne, som indeholder et H

større antal AGG- og/eller AGA-codoner. Disse er f.eks. human H

10 urokinase, t-PA eller derivater deraf, HIV-proteiner (f.eks. H

gp41, p24) og α-glucosidase fra gær. En stor fordel ved frem- H

gangsmåden ifølge opfindelsen består herved også i, at de H

rekombinante gener kan udtrykkes konst i tut ivt. H

15 Særlig foretrukken er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til H

fremstilling af t-PA, hvorved man som rekombinant gen udtryk- H

ker t-PA-genet (beskrevet af Pennica et al., Nature 301 (1983) H

214-221) eller en variant deraf. I forhold til det hidtil fra H

teknikkens standpunkt kendte ekspressionsomfang på ca. 5% t-PA I

20 per E. coli-samlet celleprotein kan udbyttet ifølge opfindel- I

sen forøges mere end 30%. Dette betyder en 600% stigning i ud- I

byttet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. H

I en yderligere foretrukken udførelsesform for opfindelsen H

25 udtrykker man plasmidet pUBS 98.skyl, DSM 4898, i E. coli, som H

indeholder genet for t-PA samt dnaY-genet. I

Genstand for opfindelsen er endvidere ekspressionsvektorer, H

som indeholder et rekombinant gen og et gen for en t-RNA, som H

30 indbygger arginin og genkender codonerne AGG og/eller AGA. I

Herved kan de to gener stå under kontrol af forskellige promo- H

torer, hvorved de for det pågældende gen homologe eller også H

heterologe promotorer er anvendelige, eller, ifølge en fore- I

trukken udførelsesform for opfindelsen, også står under kon- H

35 trol af en fælles promotor i form af en operon. H

En generelt til kloning og ekspression af rekombinante gener i H

E. coli anvendelig foretrukken ekspressionsvektor består af I

DK 175456 B1 7 - en konstitutiv eller regulerbar i E. coli transkriberbar promotor (f.eks. lac-, tac-, trp-, E. coli ribosomale promotorer, 8acillus stearothermophi lus a-galactosidase-promo-tor), 5 - eventuelt fulgt af et ribosombindingssted til translations-initiering, - eventuelt fulgt af en translationsinitieringscodon (for-.

10 trinsvis ATG), - fulgt af en polylinker til kloning af det til ekspression bestemte gen/cDNA, 15 - eventuelt fulgt af en mRNA-stabi1iserende sekvens, - fulgt af en transkriptionsterminator (fortrinsvis fd-termi-nator), 20 - et resistensgen (fortrinsvis kanamycinresistensgen), - en i E. coli til stabil plasmidpropagation egnet replika-tionsorigin, 25 - samt et gen for en tRNA Arg{AGG/AGA).

Et ifølge opfindelsen særligt egnet plasmid er pUBS 98.skyl, OSM 4898. Dette plasmid indeholder både dnaY-genet og t-PA-ge-net.

30

Opfindelsen angår endvidere ekspressionshjælpevektorer, som indeholder genet for en t-RNA, der indbygger arginin og genkender codonerne AGG og/eller AGA, og har en repli kat i onsoprindelse, der er forskellig fra Col El-.p 1 asm i der nes og deres 35 afledningers replikat i onsoprindelse.

Herved bliver en cokultivering sammen med en ColEl-ekspres-sionsvektor muliggjort i E. coli-celler.

DK 175456 B1 I

I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen står genet for H

t-RNA under kontrol af sin i E. coli naturlige, altså homologe H

promotor, og i en anden foretrukken udførelsesform under kon- H

trol af en heterolog promotor, særlig foretrukket lac-, tac-, I

5 mgl- eller trp-promotoren, eller under kontrol af α-galactosi- I

dasepromotorer fra Bacillus stearothermophi1 us . I

Fremdeles angår opfindelsen anvendelsen af de ovenfor nævnte I

ekspressionsvektorer til ekspression af det deri tilstedevæ- I

10 rende rekombinante gen, hvorved kraftigt forøgede udbytter I

opnås, samt anvendelsen af de ovenfor nævnte ekspressionshjæl- I

pevektorer til forøgelse af udbyttet ved ekspressionen af et H

gen, som indføres i en E. coli-celle i form af en til ekspres- I

sion af genet egnet rekombinant DNA. Ved anvendelse af en I

15 konst i tut iv promotor kan det rekombinante gen herved ifølge H

opfindelsen udtrykkes konstitutivt. H

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere i forbinde!- H

se med tegningen. H

På tegningen viser fig..l/tabel 1 stigningen i ekspressions- I

omfanget af rekombinant t-PA ved induktion og cotransfektion H

med et ekspressionshjælpep 1 asm id samt de positive virkninger H

af ekspressionshjælpeplasmi det på cellernes vitalitet ved I

25 t-PA-ekspression. H

EKSEMPEL 1 I

Opbygning af t-PA-ekspressionsplasmider' I

a) Plasmid pePa 126.1 I

Som udgangsplasmid til opbygning af et forbedret t-PA-eks- I

press ionsplasm id blev plasmidet pePa 98.1 (EP-A 242 836 } I

35 benyttet. Den ca. 400 bp lange 3’-utrans 1aterede region af I

t-PA-cONA i dette plasmid blev ved fjernelse af et 361 bp I

langt XholI-fragment forkortet til ca. 40 bp. Det resulte- I

DK 175456 B1 9 rende plasmid får navnet 126.1 og kan skelnes fra pePa 98.1, f.eks. ved at to fragmenter af længden 2234 bp og 4372 bp kan påvises ved en dobbelt digestion af dette plasmid med restriktionsendonukleaserne BamHI og Hindlll i 5 tilfælde af pePa 98.1, hvorimod der i tilfælde af plasmid pePa 126.1 kan påvises to fragmenter af længden 1873 bp og 4372 bp.

b) Plasmid pUBS 98.skyl 10

Ekspressionsplasmidet pUBS 98.skyl indeholder et ca. 3000 bp stort Oral-fragment af plasmid pOM 201, som indeholder et gen (dnaY) for en t-RNA Arg(AGG/AGA) (Garcia et al..

Cel! 45, 1986, 453-459), som blev indsat i et Dral-skåret 15 t-PA-ekspressionsplasmid, der er et kanamycinresi stent de rivat af det ovenfor beskrevne plasmid pePa 126.1. pUBS 98.skyl blev under nummer 4898 deponeret hos Deutsche Samm-lung fϋr Mikroorganismen (DSM).

20 EKSEMPEL 2

Ekspression af t-PA i E. coli med et ekspressionshjælpeplasm id.

Genet for t-RNA Arg(AGG/AGA) blev klonet på et plasmid, som er 25 kompatibelt med t-PA-ekspressi onsvektoren pePa 126.1, der har en Col El-rep 1 i kat ionsori g in (er et p8R322-derivat} .

Plasmid pACYC 177 (Chang og Cohen, J. Bact. 134, 1978, 1141-1156), OSM 3693P, blev med henblik herpå skåret over med Dral, 30 og et 3230 bp-fragment blev isoleret. Dette fragment blev ligeret med det ca. 3000 bp Dral-fragment fra plasmid pDM 201, som indeholder dnaY-genet, og ligeringssammensætningen blev transformeret i E. coli, DSM 2102. 1

Kanamycinresi stente kloner, der indeholder plasmidet pUBS 400 eller pUBS 401, blev identificeret ved hjælp af ko 1 on ifilter-hybr i d i ser i ng med oligonuk1eoti det (5'- AGCAACGACCT

DK 175456 B1 I

TCTAAGTCGTGGG -3'] og isoleret. Oe således iso- I

lerede plasmider pUBS 400 og pU8S 401 adskiller fra pACYC 177 I

ved en 3000 bp indsætning på Oral-snitstedet, på hvilket genet I

for en t-RNA Arg(AGG/AGA) befinder sig, og indbyrdes ved I

5 orienteringen af den 3000 bp Oral-indsætning (eksempel 1) i I

vektoren. I

pUBS 400 karakteriseres ved, at ved Southern-analyser og I

Hi ndiI-Hi ndiII-dobbeltdi gest i on opnået plasmid-DNA hybridi- I

10 serer et ca. 3300 bp-fragment med det syntetiske oligonukleo- I

tid ( 5' - AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGGG -3']. I

pUBS 401 karakteriseres ved, at et ca. 1700 bp-fragment hybri- I

diserer ved analogt gennemførte analyser. I

15 Plasmidet pIQ 500 er et pACYC 177-derivat, som indeholder lac I

I^-genet. Plasmidet pIQ 500 indeholder lac I-genet (P.J. Fara- I

baugh, Nature 274, 765-769, 1978) med iq-promotormutationen I

(Calos, Nature, 274, 762-765, 1978) som HindII-fragment (del- I

vis fra pMCl, Calos 1978 s.o.), der er indsat i det Hindu- I

20 overskårne plasmid pACYC 177 (Chang og Cohen, J. Bact. 134, I

1978, 1141-1156). E. coli-celler indeholdende pIQ 500 er kana- I

mycinresi stente og (- i modsætning til pACYC 177-holdige) I

ampici 11 infølsomme’, og de indeholder en væsentlig højere kon- I

centration af lac-repressormolekyler (lad) end dermed sammen- I

25 lignelige E. coli uden dette plasmid. pIQ 500 blev benyttet I

til understøttelse af repressionen af rekombinante gener i I

ikke-induceret tilstand, såfremt disse gener transkriberes I

under kontrol af 1ac-promotoren eller derivater deraf, f.eks. I

tac, tre osv., og ekspressionsplasmiderne er kompatible med I

30 pIG 500 (såsom eksempelvis pKK 223-3-derivater). I

Kloningen af et t-RNA-Arg(AGG/AGA)-gen på dette plasmid foru- I

den lac I^-genet gør det muligt at tilføre E. coli-cellen ikke I

alene de til repressionen i ikke-induceret tilstand nødvendige I

35 mængder af lac-repressor, men også de under ekspressionen af I

eukaryote proteiner nødvendige store mængder t-RNA Arg(AGG/ I

AGA). I

DK 175456 B1 11

Plasmid pIQ 500 blev skåret over med Oral, og et 4836 bp fragment blev isoleret. Dette fragment blev ligeret med det ca.

3000 bp Dral-fragment fra plasmid pOM 201, som indeholder dnaY-genet, og ligeringssammensætningen blev transformeret i 5 ε. col i, OSM 2102.

Kanamycinresi stente kloner, som indeholder plasmidet pUBS 500 eller pUBS 501, blev identificeret og isoleret ved hjælp af kolonif i 1 terhybridisering med det syntetisk fremstillede oli-10 gonukleotid [5'- AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGG

G -3*3.

De således isolerede plasmi.der pUBS 500 og pUBS 501 adskiller sig fra pIQ 500 ved en 3000 bp indsætning på Oral-sni tstedet, 15 på hvilket genet for en t-RNA Arg(AGG/AGA) befinder sig, og indbyrdes ved orienteringen af den 3000 bp-indsætning i vektoren. pUBS 500 karakteriseres ved, at ved Southern-analyser og Hindll-digestion opnået plasmid-ONA hybrid i serer et ca.

4000 bp-fragment med det syntetiske oligonuk1eotid [5’* A G C 20 AACGACCTTCTAAGTCGT GGG -3’]· pUBS 501 karakter i seres ved, at et ca. 1700 bp fragment hybridiserer ved analogt gennemførte analyser.

Ekspressionshjælpeplasmiderne pUBS 400 og pUBS 500 er i stand 25 til transaktivt at kompensere for de negative virkninger af t-PA-ekspressionen med plasmidet pePa 126.1 ved at stille den nødvendige t-RNA Arg{AGG/AGA) til disposition.

Ekspression ved cotransformation af gængse E. col i -1 aborato-30 riestammer (f. eks. C-600) med plasmid pU8S 400 eller pUBS 500 og pePa 126.1 fører til udbytter og vitalitet som ved t-PA-produktion med pUBS 98.skyl.

Tabel 1 og f i g. 1 viser sammenligningen af ekspressionen af 35 rekombinante t-PA fra pePA 126.1 i E. coli, OSM 2102, som er cotransformeret med pIQ 500 (sonde A) eller pUBS 500 (sonde B) ved induktion med 5 mM IPTG.

I DK 175456 B1

I TABEL 1 I

Sonde E. coli % Rec. protein OD 550 OD 550 I

I Plasmid (intakt t-PA) ved 3 timer ef- I

I af samlet protein induktion ter induktion I

I 5 _________

I E. co1 i I

DSM 2102 ' I

I A + pePa 126.1 2-5 0,1 0,4 I

+ pIQ 500 I

E. coli I

I 10 DSM 2102 B + pePa 126.1 >30 0,1 1,2 I + pUBS 500

I EKSEMPEL 3 I

Sammenligning af ekspressionen af t-PA i E. coli I

Plasmiderne pePA 133 (DE 36 13 401), pePA 126.1 (eksempel 1) I

og pUBS 98.skyl, DSM 4898, blev transformeret i E. coli, DSM I

I 20 3689, som indeholder et I^-plasmid. Transformanter blev dyrket I

på LB-plader (Maniatis, (1982) supra) sammen med 25 pg/ml I

kanamycin (i tilfælde af pePa 133 og pUBS 98.skyl) og 50 μς/ml I

I ampicillin (i tilfælde af pePa 126.1). I

I 25 Plasmidholdige celler blev dyrket i LB indtil OD 550 nm = 0,3, I

I induceret (tilsætning af 10 mmol/1 IPTG) og fermenteret ved I

37*C. Væksten af kulturerne blev kontrolleret ved kontrol af I

I celletætheden (00 550) i regelmæssige afstande. I

30 4 timer efter induktion blev cellerne høstet og oplukket ved I

hjælp af ultralydbehandling. Det således udvundne cellelysat I

I blev analyseret elektroforetisk (coomassieblåt farvede S DS- I

I geler), t-PA blev påvist ved Western-aftryk med polyklonale I

I antistoffer mod t-PA fra får og kvantificeret via densitome- I

35 trisk bedømmelse af coomassiefarvede SDS-geler efter forud- I

I gående proteinbestemmelse af cel 1elysatet. I

I 13 I

DK 175456 B1 I

I Tabel 2 viser en sammenligning af udbytterne og andre para- I

I metre ved ekspressionen af de nævnte plasmider i E. coli, OSM I

I 3689. I

I 5 TABEL 2 I

I Plasmid t-PA Udbytte, Vitalitet Plasmid- I

I kvalitet intakt stabilitet I

I pePA 133.6 intakt 3-5% god n.d. I

I pePA 126.1 fragment 5% dårlig dårlig I

I pUBS 98.skyl intakt >30% god god I

I t-PA-ekspressionen med plasmid pePa 133.6 er tidligere beskre- I

I vet i DE-36 13 401. I

Ekspressionen med plasmid pePa 126.1 påvirker kun uvæsentligt I

I væksten af producerende E. coli i 5 ml rul lekul turer, men væ- I

I sentligt i fermenteringsmålestok (M0 1), og endvidere produ- I

I ceres intakt t-PA kun i ringe mængde og i stedet t-PA-fragmen- I

I ter i stor mængde. I

I Ekspression af t-PA i E. coli med plasmid pUBS 98.skyl mulig- I

-»e gøret meget højt ekspressionsomfang af intakte t-PA'er (30% I

I af det samlede celleprotein) uden negative virkninger på pro- I

I duktionsorganismen. t-PA-producerende celler vokser med dette I plasmid meget hurtigt og til høje celletætheder, og t-PA kan I endog udtrykkes konsti tutivt.

EKSEMPEL 4 I Sammenligning af ekspressionen af forskellige proteiner i E.

I coli med og uden ekspressionshjælpeplasmid.

I Plasmiderne pUPA 110 (indeholdende sekvensen for human pro- I urokinase uden signalpeptid. Holmes et al., Biotechnology 3 I DK 175456 B1 H (1985) 923-929), pGP41 (indeholdende den kodende sekvens for p41-proteinet i det humane HIV-virus, Ratner et al., Nature 313 (1985), 277-284), pKK 177-3/GLUCPI (indeholdende sekvensen for α-glucosidase fra gar, EPA 0 300 425), p8T 102 (DSM 2091) 5 (α-gl ucosidase fra E. coli) samt plasmidet pUR 289 (indehol- H dende sekvensen for ø-galactosidase fra E. coli. Ruther og

Mulker, EMBO J. 2 (1983), 1791-1794) blev transformeret i E.

coli, DSM 3689, som indeholder et Il-plasmid. Dyrkningen af

transformanterne samt fermenteringen blev gennemført analogt I

10 med eksempel 3. I

Tabel 3 viser sammenligningen af ekspressionen af de rekombi- I

nante proteiner med og uden ekspressionshjælpeplasmidet pUBS I

500.

i I

I 25 I 1

35 I

30 i

DK 175456 B1 I

«*- 3 I

(0 0) C

> O

w 0) 1) u M C (Λ ---1.0) >- 0) c. « — —

Ur α I + I *· + + + + I

•H — w — — — •r- d) X.

> o ω O ri m o o o o · · -

ΙΛ *j C-rtOJiDOO'UTJ

I 3 </> ........

α 0) o o-—-oocccc v o > si e> I c I <d σι

I C

o —' < I O +* C3 I IO X. IO Ifl O O Ifl Kl 11) Ifl < I 103 HHrtrIHrtHiH N.

I 3 3 C3 o o» c οοοοοοσο o O > -r- < I__σ> c.

I < I c <

I -r φ Z

to o) ·>- 3 o: V +1 Ol 1

_l o C

ai l tj w <o a— e c.

«£ o c ai μ- 4-> jC -·- 3 I C U 0) 3 10 o u

C «*- O åP&å&éV&åeåfiå# O

-r-t_ p-o<MOinooo o I ,Π-ι-Ο. CO V CO «-* <o CM (O a> I ε a λ I o -μ* ή (/)

I φ 0) CQ

0) C ·— 3 uoe o.

0) <0 £- ΙΛ ‘μ- Ι *° I —— +j I 0) 3 ·> I *r ε E CM O O O O (Λ (/) OOOOOOOO <0 n ouoolrtocoom ιο io m io o.

0. Cfl (Λ CO (/) (Λ ffio σο σαι σκι ,r -,-3-.-^-.-3-.-3 -W (Λ

CM 0.0.0.0.0.0.0.0. ·— CO

-re o __ε L.

DO)

3 *C O

--- CO CO -i- O

ε o o i i m (Λ HH t* t· O) 0) (0 HHHHt-C-C0C0 ---- O" I— ^^HHIMN H -- o. < < o.

- α.α.α.α.οονοΐ£ΐΕ 3 33UO)C^33 — <-< ao.Q.aaao.0. e <n I DK 175456 B1

I . I

Det viser sig, at ved ekspression af pro-urokinase og HIV- I

I GP41, hvis mRNA har et meget højt AGG- og AGA-indhold, ved I

ekspression uden ekspressionshjælpeplasmid, er ekspressionsud- I

byttet og vitaliteten af de til ekspression bestemte E. coli- I

5 celler tydeligt formindsket. Ved tilsætning af ekspressions- I

I hjælpeplasmidet pUBS 500 opnås en meget høj ekspressionsgrad I

samt en høj vitalitet af klonerne. I

Også ekspressionen af α-glucosidase forøges ved hjælp af eks- I

I 10 pressionshjælpeplasmidet. Da dette gen imidlertid indeholder I

H færre AGG/AGA-codoner end pro-urokinase og HIV-GP Al, er også I

I den iagttagede ekspressionsstigning ved tilsætning af ekspres- I

I sionshjælpeplasmidet ikke så drastisk som for pro-urokinase og I

I HIV-GPG 1. I

15 I

I Genet for α-ga1actosi dasen fra E. coli indeholder endnu færre I

I AGG/AGA-codoner end α-g1ucosidase-genet fra gær. Derfor er I

I. stigningen i ekspressionen ved tilsætning af ekspressionshjæl- I

I peplasmidet relativt lille, men stadig tydeligt synlig. I

I 20 I

I 25 I 1

I 35 I

30 I

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til ekspression af et rekombinant gen, som I 5 indeholder AGA- og/eller AGG-codonen for arginin, i E. coli I efter transformation med en ekspressionsvektor, som indeholder I det rekombinante gen, kendetegnet ved, at man I forøger den i E. coli-cellerne tilstedeværende mængde t-RNA, I som indbygger arginin og genkender codonerne AGG og AGA, til i 10 det mindste fem gange den normalt i disse celler forekommende I mængde.· I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, I at man i det mindste indfører ét for denne t-RNA kodende gen i I 15 cel len. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man forandrer den naturlige promotor for det kromosomale gen, der koder for denne t-RNA, således, at t-RNA'en dannes i 20 større mængde.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man udskifter den naturlige promotor for det kromosomale gen, som koder for denne t-RNA, med en kraftigere, fortrinsvis 25 inducerbar og/eller reprimerbar promotor.

5. Fremgangsmåde til ekspression af et rekombinant gen, som indeholder AGA og/eller AGG-codonen for arginin, i E. coli ved transformation med en ekspressionsvektor, som indeholder det 30 rekombinante gen, kendetegnet ved, at man udvælger I en stamme, som indeholder i det mindste fem gange den normalt I i E. coli forekommende mængde t-RNA, som genkender codonerne I AGG og AGA og indbygger arginin, og at man anvender denne I stamme som værtsceller. I 35

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet, ved, I at man udvælger, idet man isolerer den samlede RNA fra E. I DK 175456 B1 co1 i-ce11 erne og hybridi serer denne mod et mærket oligonukleo- tid, som svarer til en specifik del af t-RNA's DNA-sekvens.

7. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den 5 indeholder et rekombinant gen og et gen for en t-RNA, som ind- bygger arginin og genkender codonerne AGG og/eller AGA.

8. Plasmid pl)8S 98 sky.l, DSM 4898. 10

9, Ékspressionshjælpevektor, kendetegnet ved, at I den indeholder og udtrykker genet for en t-RNA, som indbygger I arginin og genkender codonerne AGG og/eller AGA, og er kom- I patibel med en ekspressionsvektor med en ColEl-replikations- I H oprindelse. I I 15

10. Anvendelse af en ekspressionsvektor ifølge krav 7 eller 8 I H til ekspression af det rekombinante gen i E. coli. I

11. Anvendelse af en ekspressionshjælpevektor, som indeholder I 20 genet for en t-RNA, som indbygger arginin og genkender codo- I I nerne AGG og/eller AGA, til forøgelse af udbyttet ved ekspres- I sionen af et rekombinant gen, som indeholder AGA- og/eller I AGG-codonen for arginin, i E. coli ved cotransfekti on af E. I coli-celler med ekspressionshjælpevektoren samt en vektor, der I I 25 indeholder det rekombinante gen, idet ekspressionshjælpevekto- I ren har en fra vektoren indeholdende det rekombinante gen for- I skellig replikationsoprindelse. I I 30 ‘I I 35 I