DE3931933A1

DE3931933A1 - Verfahren zur expression eines eukaryontischen gens

Info

Publication number: DE3931933A1
Application number: DE19893931933
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dipl Biol Brinkmann; Ralf Prof Dipl Biol Dr Mattes; Stephan Dipl Biol Dr R Fischer
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-09-25
Publication date: 1990-05-17

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli nach Transformation mit einem Expressionsvektor, der das rekombinate Gen enthält.

Die gentechnologische Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten ist eines der Hauptziele der modernen Biotechnologie. Da sich vor allem Prokaryonten aufgrund ihrer leichten Fermentierbarkeit zur Herstellung großer Proteinmengen eignen, wurde bereits vielfach versucht, auch eukaryrontische Gene in Prokaryonten zu exprimieren. Hierbei ergeben sich jedoch Schwierigkeiten dahingehend, daß eukaryontische Proteine in Prokaryonten-Zellen oft nur in geringen Mengen hergestellt werden und die Zellen Fermentations/Wachstumsschwierigkeiten bei erhöhter Produktion der Proteine zeigen.

Derartige Probleme bei der Expression werden unter anderem bei dem Gewebe(tissue type)-Plasminogen-Aktivator t-PA beobachtet. Die Herstellung dieses Proteins ist jedoch ein erstrebenswertes Ziel, da es sich bei der klinischen Erprobung als zur Behandlung von Infrarotkrankheiten geeignet erwiesen hat. Obwohl E. coli-Zellen die auf einem Plasmid oder Vektor eingeführte t-PA-cDNA in an sich befriedigender Menge exprimieren und t-PA produzieren können, lassen die Zellen jedoch bei der Bildung von Biomasse während der Fermentation stark nach, so daß insgesamt die Produktion von t-PA nicht den Stand erreicht, den man erwarten könnte, wenn man von der Produktion einer einzelnen Zelle ausgeht. Auch ist die Plasmidstabilität in den E. coli-Zellen gering, und durch Verlust des kodierenden Plasmids nimmt die Produktionsrate weiter ab. Bisher ist es daher nur möglich, eine Expression von ca. 5% des Gesamtzellproteins an t-PA zu erreichen (Rothstein und Bertonis, Gene 61 (1987), 41-50).

Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das es ermöglicht, rekombinante Gene, deren Expression nach den bisher genannten Verfahren zu einem deutlich verschlechterten Wachstum der Wirtszellen und Plasmidinstabilität und damit zu geringen Ausbeuten an Genprodukt führt, mit erhöhter Ausbeute zu exprimieren.

Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch Verfahren zur Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli nach Transformation mit einem Expressionsvektor, der das rekombinate Gen enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die in den E. coli-Zellen vorhandene Menge von t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG und AGA erkennt, auf mindestens das Fünffache der normalerweise in diesen Zellen vorkommenden Menge erhöht.

Hierbei ist im Rahmen der Erfindung unter dem Begriff t-RNA, welche AGA/AGG-Kodons erkennt und Arginin einbaut, nicht nur die natürliche in E. coli vorkommende, entsprechende t-RNA zu verstehen, sondern auch jegliche synthetische, mutierte oder Suppressor-t-RNA, die die genannten Eigenschaften aufweist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, rekombinante Gene, deren Expression bisher aufgrund von schlechtem Wachstum der E. coli-Wirtszellen nur in geringen Ausbeuten zu den gewünschten Proteinen führte, in deutlich erhöhten Mengen herzustellen. Dieser erreichte technische Effekt ist insofern unerwartet, da bei einem Mangel an der erfindungsgemäßen eingesetzten t-RNA bei der Proteinsynthese in den Zellen davon auszugehen gewesen wäre, daß das Fremdgen schlecht exprimiert würde, und nicht, wie tatsächlich der Fall ist, das Fremdgen gut exprimiert wird, aber die Zelle kümmert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge der t-RNA, die AGA/AGG-Kodons erkennt und Arginin einbaut (im weiteren auch nur mit t-RNA bezeichnet, in den E. coli-Zellen dadurch erhöht, daß man mindestens ein für eine derartige t-RNA kodierendes Gen in die Zelle einführt. Dies kann vorzugsweise dadurch geschehen, daß man ein oder mehrere t-RNA-Gene auf einem extrachromosomalen Expressionsvektor in die Zelle einführt.

Die natürliche t-RNA, welche in E. coli Arginin einbaut und die Kodons AGA und AGG erkennt, ist ein Produkt des dnaY-Gens, das von Garcia et al., in Cell 45 (1986), 453-459, beschrieben wurde. Dieses Gen ist in seiner gesamten Sequenz bekannt, es enthält 118 essentielle Basenpaare und wird bevorzugt zur Erhöhung der t-RNA-Menge in E. coli durch Einführung des Gens verwendet. Es ist jedoch auch möglich, ein Gen für eine synthetische, mutierte oder Suppressor-t-RNA, die Arginin einbaut und die AGA/AGG-Kodons erkennt, in die Zellen einzuführen. Ebenso kann das Gen der t-RNA aus dem Phagen T₄ verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bringt man das oder die t-RNA-Gene zusammen mit dem eukaryontischen Gen auf dem selben Expressionsvektor in die Zelle ein. Hierbei ergibt sich, wenn der Expressionsvektor ein High-copy-plasmid ist, bereits eine ausreichende Erhöhung des intrazellulären t-RNA-Spiegels, so daß keinerlei negative Auswirkungen auf die Wirtszellen bei der Expression des eukaryontischen Gens zu beobachten sind.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bringt man das t-RNA-Gen und das eukaryontische Gen auf verschiedenen Expressionsvektoren in die E. coli-Zellen ein. Die positiven Auswirkungen der Bereitstellung einer t-RNA Arg(AGG/AGA) während der Expression rekombinanten Proteins in E. coli ist nämlich nicht davon abhängig, daß das Gen für diese t-RNA cis-ständig aus dem jeweiligen Expressionsvektor vorhanden ist. Diese t-RNA kann auch auf einem zweiten Vektor codiert sein (transaktiv). Dieser Zusatzvektor muß allerdings mit dem Expressionsvektor in der E. coli-Zelle kompatibel sein, d. h. eine von dem als Expressionsplasmid verschiedenen Replikationsursprung aufweisen.

Hierbei ist es möglich, einen Vektor mit geringerer Plasmidkopienzahl als das Expressionsplasmid zu benutzen, aber auch durch Verwendung eines Vektors, der in höherer Kopienzahl vorliegt als der Expressionsvektor, auf dem das eukaryontische Gen sich befindet, einen gegenüber dem eukaryontischen Gen noch höheren t-RNA-Spiegel zu erreichen. Im Falle des Einbringens des t-RNA-Gens und des eukaryontischen Gens auf dem selben Expressionsvektor, ist es sowohl möglich, die beiden Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren, oder aber die beiden Gene in Form eines Operons unter der Kontrolle desselben Promotors einzusetzen. Wesentlich ist hierbei nur, daß sich zwischen dem eukaryontischen Gen und dem t-RNA-Gen ein Stopcodon befindet, so daß sich bei der Transkription kein Fusionsprotein ergibt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung integriert man das oder die t-RNA-Gene in das Chromosom der Wirtszelle. Hierbei ist es besonders bevorzugt, das Gen derart zu integrieren, daß es unter einem starken Promotor exprimiert wird. Hierzu wird vorzugsweise das oder die t-RNA-Gene gleich zusammen mit einem starken Promotor, unter dessen Kontrolle die t-RNA exprimiert wird, eingeführt.

Zur Einführung eines t-RNA-Gens in das Chromosom werden ebenso wie zur Einführung des Gens in einen Expressionsvektor, sowie für die Transformation der Wirtszellen an sich bekannte Methoden angewandt. Zur Einführung in das Chromosom werden vorzugsweise Methoden unter Verwendung von Transposons oder Phagen und unter Ausnutzung von Rekombinationsereignissen angewandt.

Eine weitere bevorzugte Möglichkeit, die t-RNA-Menge in der Zelle zu erhöhen liegt darin, daß man den natürlichen Promotor des chromosomalen Gens, das für diese t-RNA codiert, derart verändert, daß die t-RNA in größerer Menge gebildet wird. Hierzu wird besonders bevorzugt der gesamte natürliche Promotor gegen einen stärkeren, vorzugsweise induzier- oder/und reprimierbaren Promotor ausgetauscht. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt, ebenso die Verfahren zum Austausch der Promotoren, die wiederum vorzugsweise unter Verwendung von Transposons oder Phagen durchgeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli durch Transformation mit einem Expressionsvektor, der das rekombinante Gen enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen E. coli-Stamm selektioniert, der mindestens die fünffache Menge der normalerweise in E. coli vorkommenden Menge an t-RNA, die die Kodons AGG und AGA erkennt und Arginin einbaut, enthält und diesen Stamm als Wirtszellen verwendet.

Bisher bekannte Stämme weisen meist nur eine derart geringe Menge an t-RNA, die Arginin einbaut und die Kondons AGA/AGG erkennt, auf und es treten die in der Einleitung beschriebenen Folgen bei Expression eines Fremdgens ein. Als Standard für E. coli-Stämme mit der normalen geringen Menge der erfindungsgemäß eingesetzten t-RNA können beispielsweise die Stämme DSM 3689, DSM 2102, HFR 3000 und C600 (DSM 2093) (die beiden letzteren siind bei Bachmann, Bacteriol. Rev. 36 (1972), 180-230 beschrieben) aufgeführt werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können nun gegebenenfalls E. coli-Stämme aufgefunden werden können, welche von Haus aus eine höhere, nämlich mindestens die doppelte Menge dieser t-RNA enthalten. Hierzu selektioniert man bevorzugt derart, daß man Gesamt-RNA der E. coli-Zellen herstellt und diese gegen ein markiertes Oligonukleotid hybridisiert, das einem spezifischen Teil der DNA-Sequenz der t-RNA entspricht. Bevorzugt wird daher die Northernblot-Technik verwendet. Die Northernblot-Technik ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben. Zur Hybridisierung verwendet man vorzugsweise ein radioaktiv markiertes Oligonukleotid, jedoch können auch alle anderen Markierungen für DNA-Fragmente vorteilhaft verwendet werden. Unter einem spezifischen Teil der DNA-Sequenz der t-RNA, die die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, versteht man die DNA-Sequenzen am und in der direkten Nachbarschaft des Anticodons in der tRNA, der sogenannten Anticodon-Schleife. Im Gegensatz zu der Pseudouridin- oder Dihydrouridin-Schleife ist dieser Bereich einer tRNA nicht sehr homolog zu anderen tRNAs, so daß ein Oligonukleotid der Sequenz

5′-CACGACTTAGAAGGTCGTTG-3′

oder auch z. B. der kürzeren Sequenz

5′-GACTTAGAAGGTCGTT-3′,

sowie die jeweils komplementären Oligonukleotide

(5′-CAACGACCTTCTAAGTCGTG-3′), (5′-AACGACCTTCTAAGTC-3′)

als spezifische Sonde zur Detektion und Charakterisierung dieser tRNA verwendet werden können. Erfindungsgemäß verwendet man vorzugsweise ein Oligonukleotid, das zwischen 14 und 30 Basenpaare lang ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle rekombinanten Gene, vorzugsweise werden eukaryontische Gene bzw. deren cDNA exprimiert, und besonders solche, die eine größere Anzahl von AGG oder/und AGA-Kodons enthalten. Dies sind z. B. menschliche Urokinase, t-PA oder Derivate davon, HIV-Proteine (z. B. gp41, p24), α-Gluocosidase aus Hefe. Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt hierbei auch darin, daß die rekombinanten Gene konstitutiv exprimiert werden können.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von t-PA, indem man als rekombinantes Gen das t-PA-Gen (beschrieben von Pennica et al., Nature 301 (1083) 214-221) oder eine Variante davon exprimiert. Gegenüber der bisher im Stand der Technik bekannten Expressionsrate von etwa 5% t-PA pro E. coli Gesamtzellprotein kann erfindungsgemäß die Ausbeute mehr als 30% gesteigert werden. Dies bedeutet eine 600%ige Steigerung der Ausbeute mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung exprimiert man das Plasmid pUBS 98.skyl, DSM 4898, in E. coli, das das Gen für t-PA und das dnaY-Gen enthält.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind Expressionsvektoren, die ein rekombinantes Gen und ein Gen für eine t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, enthalten. Hierbei können beide Gene jeweils unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren stehen, wobei die für das jeweiligen Gen homologen oder aber auch heterologe Promotoren verwendbar sind, oder aber, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors in Form eines Operons stehen.

Ein allgemein zur Klonierung und Expression von rekombinanten Genen in E. coli verwendbarer bevorzugter Expressionsvektor besteht aus

- einem konstitutiven oder regulierbaren in E. coli transkribierbaren Promotor (z. B. lac-, tac-, trp-, E. coli ribosomale Promotoren, Bacillus stearothermophilus α-Galactosidase-Promotor,
- wahlweise gefolgt von einer Ribosomenbindestelle zur Translationsinitiation,
- wahlweise gefolgt von einem Translationsinitiationscodon (bevorzugt ATG)
- gefolgt von einem Polyklinker zur Klonierung des zu exprimierenden Gens/cDNA,
- wahlweise gefolgt von einer mBNA- stabilisierenden Sequenz,
- gefolgt von einem Transcriptionsterminator (vorzugsweise fd-Terminator),
- einem Resistenzgen (vorzugsweise Kanamycinresistenzgen),
- einem in E. coli zur stabilen Plasmidpropagation fähigen Replikationsorigin,
- sowie einem Gen für eine tRNA Arg(AGG/AGA).

Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Plasmid ist pUBs 98.skyl, DSM 4898. Dieses Plasmid enthält sowohl das dnaY-Gen als auch das t-PA-Gen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionshilfsvektoren, die das Gen für eine t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, enthalten und einen von dem der ColE1-Plasmide und deren Abkömmlingen verschiedenen Replikationsursprung besitzen.

Hierdurch wird eine Cokultivierung zusammen mit einem ColE1-Expressionsvektor in E. coli-Zellen ermöglicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht das Gen für die t-RNA unter der Kontrolle seines in E. coli natürlichen, also homologen Promotors, in einer anderen bevorzugten Ausführungsform unter der eines heterologen Promotors, besonders bevorzugt des lac-, tac-, mgl- oder trp-Promotors, oder des α-Galactosidase-Promotors aus Bacillus stearothermophilus.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind die Verwendung der obigen Expressuionsvektoren zur Expression des darin vorhandenen rekombinanten Gens, wobei stark erhöhte Ausbeuten erhalten werden, und die Verwendung der obengenannten Expressionshilfsvektoren zur Erhöhung der Ausbeute bei der Expression eines Gens, das in Form einer zur Expression des Gens geeigneten rekombinanten DNA in eine E. coli-Zelle eingebracht wird. Erfindungsgemäß läßt sich hierbei, bei Verwendung eines konstitutiven Promotors, das rekombinante Gen konstitutiv exprimieren.

Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit der Abbildung die Erfindung weiter.

Fig. 1/Tabelle 1 zeigt die Steigerung der Expressionsleistung von rekombinantem t-PA bei Induktion und Cotransfektion mit einem Expressionshilfsplasmid, sowie die positiven Auswirkungen des Expressionshilfsplasmides auf die Vitalität der Zellen bei t-PA-Expression.

Beispiel 1 Konstruktion von t-PA-Expressionsplasmiden a) Plasmid pePa 126.1

Als Ausgangsplasmid zur Konstruktion eines verbesserten t-PA-Expressionsplasmids wurde das Plasmid pePa 98.1 (EP-A 2 42 836) verwendet. Die ca. 400 bp lange 3′-untranslatierte Region der t-PA-cDNA in diesem Plasmid wurde durch Deletion eines 361 bp langen XhoII-Fragmentes auf ca. 40 bp verkürzt.

Das resultierende Plasmid erhielt den Namen pePa 126.1, und kann von pePa 98.1 z. B. dadurch unterschieden werden, daß bei einem Doppelverdau dieser Plasmide mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII bei pePa 98.1 zwei Fragmente der Länge 2234 bp und 4372 bp nachgewiesen werden können, bei Plasmid pePA 126.1 hingegen zwei Fragmente der Länge 1873 bp und 4372 bp.

b) Plasmid pUBS 98.skyl

Das Expressionsplasmid pUBS 98.skyl enthält ein ca. 3000 bp großes DraI-Fragment von Plasmid pDM 201, welches ein Gen (dnaY) für eine t-RNA Arg(AGG/AGA) enthält (Garcia et al., Cell 45, 1986, 453-459), das in ein DraI geschnittenes t-PA-Expressionsplasmid insertiert wurde, welches ein kanamycinresistentes Derivat des oben beschriebenen Plasmids pePa 126.1 ist. pUBS 98.skyl wurde unter der Nummer 4898 bei der deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) hinterlegt.

Beispiel 2 Expression von t-PA in E. coli mit einem Expressionshilfeplasmid

Das Gen für die t-RNA Arg(AGG/AGA) wurde auf ein Plasmid kloniert, welches kompatibel ist mit dem t-PA-Expressionsvektor pePa 126.1, welcher einen ColE1-Replikationsorigin besitzt (ein pBR322-Derivat ist).

Plasmid pACYC 177 (Chang und Cohen, J. Bact. 134, 1978, 1141-1156), DSM 3693P, wurde hierzu mit DraI geschnitten und ein 3230 bp-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem ca. 3000 bp DraI-Fragment aus Plasmid pDM 201, welches das dnaY-Gen enthält ligiert, und der Ligationsansatz in E. coli, DSM 2102, transformiert.

Kanamycinresistente Klone, die das Plasmid pUBS 400 bzw. pUBS 401 enthalten, wurden durch Koloniefilterhybridisation mit dem Oligonukleotid

[5′-A G C A A C G A C C T T C T A A G T C G T G G G-3′]

identifiziert und isoliert. Die derart isolierten Plasmide pUBS 400 und pUBS 401 unterscheiden sich von pACYC 177 durch ein 3000 bp Insert in der DraI-Schnittstelle, auf welchem sich das Gen für eine t-RNA Arg(AGG/AGA) befindet, und untereinander in der Orientierung des 3000 bp-DraI-Inserts (Beispiel 1) im Vektor.

pUBS 400 wird dadurch charakterisiert, daß in Southernanalysen HindII-HindIII-doppelverdauter Plasmid-DNA ein ca. 3300 bp-Fragment mit dem synthetischen Oligonukleotid

[5′-A G C A A C G A C C T T C T A A G T C G T G G G-3′]

hybridisiert. pUBS 401 wird dadurch charakterisiert, daß in analog durchgeführten Analysen ein ca. 1700 bp-Fragment hybridisiert.

Das Plasmid pIQ 500 ist ein pACYC 177-Derivat, welches das la I^q-Gen enthält. Das Plasmid pIQ 500 enthält das la I-Gen (P. J. Farabaugh, Nature 274, 765-769, 1978) mit der iq-Promotormutation (Calos, Nature 274, 762-765, 1978) als HindII-Fragment (partial aus pMCl Calos 1978 s. o) insertiert in HindII-geschnittenes Plasmid pACYC 177 (Chan and Cohen J. Bact. 134, 1978, 1141-1156).

pIQ 500 enthaltende E. coli-Zellen sind kanamycinresistent und (- im Gegensatz zu pACYC 177 enthaltend) ampicillinsensibel), und enthalten eine wesentlich höhere Konzentration an Lac-Repressormolekülen (lacI) als vergleichbare E. coli ohne dieses Plasmid, pIQ 500 wurde zur Unterstützung der Repression rekombinanter Gene im nicht induzierten Zustand verwendet, sofern diese Gene unter Kontrolle des lac-Promotors oder Derivaten davon, z. B. tac; trc usw. transkribiert werden, und die Expressionsplasmide kompatibel mit pIQ 500 sind (wie z. B. pKK 223-3-Derivate).

Die Klonierung eines t-RNA-Arg(AGG/AGA)-Gens auf dieses Plasmid zusätzlich zum lac I^q-Gen ermöglicht es, der E. coli-Zelle nicht nur die zur Repression im nicht induzierten Zustand erforderlichen Engen an lac-Repressor, sondern auch die während der Expression eukaryontischer Proteine benötigten großen Mengen an t-RNA Arg(AGG/AGA) zu liefern.

Plasmid pIQ 500 wurde mit DraI geschnitten, und ein 4836 bp Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem ca. 3000 bp DraI-Fragment aus Plasmid pDM 201, welches das dnaY-Gen enthält ligiert, und der Ligationsansatz in E. coli, DSM 2102, transformiert.

Kanamycinresistente Klone, welche das Plasmid pUBS 500 bzw. pUBS 501 enthalten, wurden durch Koloniefilterhybridisation mit dem synthetisch hergestellten Oligonukleotid

[5′-A G C A A C G A C C T T C T A A G T C G T G G G-3′]

identifiziert und isoliert.

Die derart isolierten Plasmide pUBS 500 und pUBS 501 unterscheiden sich von pIQ 500 durch ein 3000 bp Insert in der DraI-Schnittstelle, auf welchem sich das Gen für eine t-RNA Arg(AGG/AGA) befindet, und untereinander in der Orientierung des 3000 bp-Inserts im Vektor. pUBS 500 wird dadurch charakterisiert, daß in Southernanalysen HindII-verdanter Plasmid-DNA ein ca. 4000 bp-Fragment mit dem synthetischen Oligonukleotid

[5′-A G C A A C G A C C T T C T A A G T C G T G G G-3′]

hybrisiert. pUBS 501 wird dadurch charakterisiert, daß in analog durchgeführten Analysen ein ca. 1700 bp-Fragment hybridisiert.

Die Expressionshilfsplasmide pUBS 400 und pUBS 500 sind in der Lage, transaktiv die negativen Auswirkungen der t-PA-Expression mit dem Plasmid pePa 126.1 durch Bereitstellung der nötigen t-RNA Arg(AGG/AGA) zu kompensieren.

Expression bei Cotransformation von gängigen E. coli-Laborstämmen (z. B. C-600) mit Plasmid pUBS 400 oder pUBS 500 und pePa 126.1 führt zu Ausbeuten und Vitalität wie bei t-PA-Produktion mit pUBS 98.skyl.

Tabelle 1 und Fig. 1 zeigen den Vergleich der Expression von rekombinanten t-PA aus pePa 126.1 in E. coli, DSM 2102, cotransformiert mit pIQ 500 (Probe A) bzw. pUBS 500 (Probe B) bei Induktion mit 5 mM IPTG.

Tabelle 1

Beispiel 3 Vergleich der Expression von t-PA in E. coli

Die Plasmide pePA 133 (DE 36 13 401), pePA 126.1 (Beispiel 1) und pUBS 98.skyl, DSM 4898, wurden in E. coli, DSM 3689, transformiert, der ein I^q-Plasmid enthält. Transformanten wurden auf LB-Platten (Maniatis, (1982) supra) mit 25 µg/ml Kanamycin (bei pePa 133 und pUBS 98.skyl) und 50 µg/ml Ampicillin (bei pePa 126.1) angezogen.

Plasmidhaltige Zellen wurden in LB bis zur OD 550 nm = 0,3 angezogen, induziert (Zusatz von 10 mmol/l IPTG) und bei 37°C fermentiert. Das Wachstum der Kulturen wurde durch Kontrolle der Zelldichte (OD 550) in regelmäßigen Abständen kontrolliert.

4 Stunden nach Induktion wurden die Zellen geerntet und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Das so gewonnene Zell-Lysat wurde elektrophoretisch analysiert (Coomassieblau gefärbte SDS-Gele), t-PA wurde in Westernblots mit polyklonalen Antikörpern gegen t-PA aus Ziege nachgewiesen und über densitometrische Auswertung coomassiegefärbter SDS-Gele nach vorhergegangener Proteinbestimmung des Zellysates quantifiziert.

Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der Ausbeuten und anderer Parameter bei der Expression der genannten Plasmide in E. coli, DSM 3689.

Tabelle 2

Die t-PA-Expression mit Plasmid pePa 133,6 ist schon in der DE-36 13 401 beschrieben.

Die Expression mit Plasmid pePa 126.1 beeinträchtigt das Wachstum produzierender E. coli in 5 mol Rollerkulturen nur unwesentlich, wesentlich jedoch im Fermentationsmaßstab (10 l), und außerdem wird intakter t-PA nur in geringer Menge produziert, statt dessen t-PA-Fragmente in großer Menge.

Expression von t-PA in E. coli mit Plasmid pUBS 98.skyl ermöglicht eine sehr hohe Expressionsleistung intakten t-PA's (30% des Gesamtzellproteins), ohne negative Auswirkungen auf den Produktionsorganismus, t-PA produzierende Zellen wachsen mit diesem Plasmid sehr schnell und zu hohen Zelldichten, t-PA läßt sich sogar konstitutativ exprimieren.

Beispiel 4 Vergleich der Expression von verschiedenen Proteinen in E. coli mit und ohne Expressionshilfsplasmid

Die Plasmide pUBA 110 (enthaltend die Sequenz für menschliche Pro-Urokinase ohne Signalpeptid, Holmes et al., Biotechnology 3 (1985) 923-929), pGP41 (enthaltend die codierende Sequenz für das p41-Protein des menschlichen HIV-Virus, Ratner et al., Nature 313 (1985) 277-284), pKK 177-3/GLUCPI (enthaltend die Sequenz für α-Glocosidase aus Hefe, EPA 03 00 425), pBT 102 (DSM 2091) (α-Glucosidase aus E. coli) und Plasmid pUR 289 (enthaltend die Sequenz für β-Glacatosidase aus E. coli, Rüther und Mulker, EMBO J. 2 (1983) 1791-1794) wurden in E. coli, DSM 3689, der ein I^q-Plasmid enthält, transformiert. Die Anzucht der Transformanten sowie die Fermentation wurden analog Beispiel 3 durchgeführt.

Tabelle 3 zeigt den Vergleich der Expression der rekombinanten Proteine mit und ohne das Expressionshilfsplasmid pUBS 500.

Tabelle 3

Es zeigt sich, daß bei Expression von Pro-Urokinase und HIV-GP 41, deren mRNA einen sehr hohen AGG- und AGA-Gehalt aufweist, bei Expression ohne Expressionshilfsplasmid die Expressionsausbeute und Vitalität der exprimierenden E. coli-Zellen deutlich reduziert ist. Durch Zugabe des Expressionshilfsplasmids pUBS 500 wird eine sehr hohe Expressionsleistung sowie eine hohe Vitalität der Klone erreicht.

Auch die Expression der α-Glucosidase wird durch das Expressionshilfsplasmid gesteigert. Da dieses Gen jedoch weniger AGG/AGA-Codons beinhaltet als Pro-Urokinase und HIV-GP 41, ist auch die beobachtete Expressionssteigerung bei Zugabe des Expressionshilfsplasmids nicht so drastisch wie für Pro-Urokinase und HIV-GPG 1.

Das Gen für die α-Galactosidase aus E. coli beinhaltet noch weniger AGG/AGA-Codons als der α-Glucosidase-Gen aus Hefe. Deshalb ist die Steigerung der Expression durch Zugabe des Expressionshilfsplasmids relativ gering, aber immer noch deutlich sichtbar.

Claims

1. Verfahren zur Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli nch Transformation mit einem Expressionsvektor, der das rekombinante Gen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die in den E. coli Zellen vorhandene Menge von t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG und AGA erkennt, auf mindestens das Fünffache der normalerweise in diesen Zellen vorkommenden Menge erhöht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein für diese t-RNA kodierendes Gen in die Zelle einführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene auf einem extrachromosomalen Expressionsvektor in die Zelle einführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene und das rekombinante Gen auf dem selben Expressionsvektor einführt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene und das rekombinante Gen auf verschiedenen Expressionsvektoren einführt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene in das Chromosom der Wirtszelle integriert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene derart in das Chromosom integriert, daß sie unter einem starken Promotor exprimiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das oder die t-RNA-Gene zusammen mit einem starken Promotor, unter dessen Kontrolle die t-RNA-exprimiert wird, einführt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den natürlichen Promotor des chromosomalen Gens, das für diese t-RNA kodiert, derart verändert, daß die t-RNA in größerer Menge gebildet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den natürlichen Promotor des chromosomalen Gens, das für diese t-RNA kodiert, gegen einen stärkeren, vorzugsweise induzier- oder/und reprimierbaren Promotor austauscht.

11. Verfahren zur Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli durch Transformation mit einem Expressionsvektor, der das rekombinante Gen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm selektioniert, der mindestens die fünffache Menge der normalerweise in E. coli vorkommenden Menge an t-RNA, die die Kodons AGG und AGA erkennt und Arginin einbaut, enthält und diesen Stamm als Wirtszellen verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man selektioniert, indem man Gesamt-RNA der E. coli-Zellen isoliert und diese gegen ein markiertes Oligonukleotid hybridisiert, das einem spezifischen Teil der DNA-Sequenz der t-RNA entspricht.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Oligonukleotid verwendet, das 14 bis 30 Basenpaare lang ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als rekombinantes Gen ein eukaryontisches Gen bzw. die cDNA dieses Gens exprimiert.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man t-PA-cDNA exprimiert.

16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pUBS 99. sky 1, DSM 4898, exprimiert.

17. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein rekombinantes Gen und ein Gen für eine t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, enthält.

18. Expressionsvektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens das t-RNA- Gen unter der Kontrolle eines E. coli-Promotors für eine derartige t-RNA steht.

19. Expressionsvektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens das t-RNA-Gen unter der Kontrolle des lac-, tac-, mgl-, trp- oder des Bacillus stearothermophilus α-Galactosidase-Promotors steht.

20. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Gen und das Gen für die t-RNA unter der gemeinsamen Kontrolle eines Promotors stehen.

21. Plasmid pUBS 98 sky.1, DSM 4898.

22. Expressionshilfsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er das Gen für eine t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, enthält und exprimiert und kompatibel zu einem Expressionsvektor mit einem ColE1-Replikationsursprung ist.

23. Expressionshilfsvektor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das t-RNA-Gen unter der Kontrolle eines in E. coli natürlichen Promotors für eine derartige t-RNA steht.

24. Expressionshilfsvektor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das t-RNA-Gen unter der Kontrolle des lac-, tac-, mgl-, trp- oder Bacillus stearothermophilus α-Galactosidase-Promotors steht.

25. Verwendung eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 17 bis 21 zur Expression des rekombinanten Gens in E. coli.

26. Verwendung eines Expressionshilfsvektors, der das Gen für eine t-RNA, die Arginin einbaut und die Kodons AGG oder/und AGA erkennt, enthält zur Erhöhung der Ausbeute bei der Expression eines rekombinanten Gens, das AGA- oder/und AGG-Kodons für Arginin enthält, in E. coli durch Cotransfektion von E. coli-Zellen mit dem Expressionshilfsvektor und einem, das rekombinante Gen enthaltenden Vektor, wobei der Expressionshilfsvektor einen von dem das rekombinante Gen enthaltenden Vektor verschiedenen Replikationsursprung aufweist.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man einen das rekombinante Gen enthaltenden Vektor mit einem ColE1-Replikationsursprung und einen Expressionshilfsvektor nach einem der Ansprüche 22 bis 24 verwendet.