CN101230329A - 一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法，属于微生物基因工程和发酵工程领域。本发明提供了一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法，待遗传转化的DNA分子，先进行地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶介导的甲基化；特异性甲基化的DNA分子用优化的电穿孔法，实现地衣芽孢杆菌工业生产菌株的遗传转化。运用此方法，地衣芽孢杆菌工业生产菌株的遗传转化率达到25～1250个/μg DNA。特别是，本发明可以用于现有遗传转化方法不能实现遗传转化的地衣芽孢杆菌菌种的遗传转化。

Description

一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法

技术领域

一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法，属于微生物基因工程和发酵工程领域。

背景技术

地衣芽孢杆菌是生产高温α-淀粉酶、碱性蛋白酶、新型抗菌肽、新型生物可降解聚合物(如聚谷氨酸、聚赖氨酸等)的主要菌株。实现对其高效遗传改良将是实现上述重要工业产品工业化生产和产业化的重要保障。然而，无论是地衣芽孢杆菌试验菌株还是工业菌株，由于有效的遗传转化技术的缺乏，对其进行目标导向性遗传改良是极为困难的和很少能成功的。因此，研究和解决地衣芽孢杆菌的遗传转化体系，实现其遗传转化，对定向遗传改造地衣芽孢杆菌成为高效工业生产菌种具有极为重要的意义。

从自然界获得的微生物菌种的生产性能往往达不到商业开发价值，需要对其进行性能改造--育种。微生物育种的本质是对微生物菌种进行遗传改良和异源基因的高效表达。微生物菌种遗传改良即对微生物细胞的遗传信息的储存载体即DNA或基因进行改变，由此改变其遗传信息，进而改变其生理生化特性，获得生产性能更好的菌种。基因指的是一段编码具有特定功能多肽的DNA序列，是遗传功能作用发挥的基本单位或功能单位，一个生物体所有基因的总和为一个基因组。每个基因都具有完整的、能够发挥其功能的特定结构，即具有特殊的核苷酸(组成基因的化学物质，主要为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C))序列。异源基因主要用分子克隆技术从其它生物体中获得。异源基因的表达也是微生物菌种改良的重要组成部分。

微生物菌种育种的方法有多种，如传统的诱变法、杂交法、原生质体融合法，以及现代的分子育种法。分子育种法是现代微生物菌种育种的最主要组成部分。工业上使用的优良菌种有超过90％的菌种是通过分子育种获得的。

分子育种指的是运用分子克隆和体外重组等现代技术直接改变微生物菌种的基因(基因型改变)，由此赋予微生物菌种新的优良性状(表现型改变)。分子克隆和体外重组技术于1973年建立。其核心或通用过程是：运用物理、化学或生物手段将决定微生物菌种特定性状或指导特定产物合成的基因分离、纯化、单克隆化，然后再在限制性酶和连接酶等的作用下重新组合成新的基因，即体外重组；再将此新的基因转移入微生物菌种内并让其发挥功能。这里的限制性酶系能够特异性切割DNA特定序列的酶，如来源于大肠杆菌的EcoRI能够特异性切割DNA分子中的GAATTC序列。这里的连接酶指的是能够将两个或多个两段靠近的DNA分子连接起来，形成一个新的DNA分子。

微生物菌种的分子育种，需要将上述获得的基因转移入微生物菌种内。基因转移技术是实现微生物菌种分子改良的关键技术之一。

实现为微生物菌种基因转移的方法有感受态转化法、原生质体转化法、电穿孔法、脂质体介导法、转染法、基因枪法、微注射法等。适合微生物，特别是细菌遗传转化常用方法主要有感受态转化法、原生质体转化法、电穿孔法等。

感受态转化法是对大肠杆菌进行基因转移的基本方法。此方法是利用大肠杆菌在特定培养和诱导条件下可以形成摄取外源DNA分子并将其运送到其细胞内的特殊生理状态(即感受态)，将外源DNA分子与形成了感受态的大肠杆菌混合一段时间，在此感受态下将外源DNA分子吸收并运送入其细胞中。

原生质体转化法(诸葛健、王正祥.工业微生物实验技术手册，1994)是实现若干细菌遗传转化的有效方法。其基本技术路线是：新鲜培养的细菌在高渗溶液中用适宜的酶(如溶菌酶)将其细胞壁(细菌细胞膜外侧的结构，主要由多糖和蛋白质组成)水解，获得仅有细胞膜包围的原生质，即原生质体；将制备好的待遗传转化的DNA分子混入其中，加入适量的转化促进剂(如聚乙二醇)，共同孵育一段时间；将此转化混合物涂布或掺入补加有一定选择压力(如抗生素)的原生质体再生培养基中进行3～7天的再生培养，让其重新生长出细胞壁(即再生)，并通过抗生素选择(选择培养)出已经获得外源DNA分子的菌种(即转化子)。

电穿孔法(诸葛健、王正祥.工业微生物实验技术手册，1994)是实现绝大多数细菌遗传转化的有效方法。其基本技术路线是：新鲜培养的细菌与制备好的待遗传转化的纯化DNA分子混合，在电穿孔仪的协助下，通过瞬间高压电场的作用力将DNA分子送入细胞内；将此转化混合物涂布或掺入补加有一定选择压力(如抗生素)的培养基中进行2～3天的选择培养，获得转化子。

原生质体转化法和电穿孔法相比较，前者操作复杂，但不需要特殊仪器，技术实现周期长是其最主要缺点。此外，不是所有细菌都能通过酶解获得原生质体，也不是所有的细菌的原生质体能够有效再生。后者操作相对简单，但需要特殊仪器(电穿孔仪)。几乎所有的细菌都可以通过电穿孔法实现遗传转化。因此，电穿孔法是目前实现工业生产细菌遗传转化的主要方法。

地衣芽孢杆菌为革蓝氏阳性、内生芽孢、好氧型杆菌，广泛分布于自然界。地衣芽孢杆菌不同菌株间的性能存在较大不同，其中一些菌种已经育种成功用于工业酶制剂、生物聚合材料、药物生物素等重大产品的工业化生产。它的代表性菌株(实验菌株)ATCC14580(与DSM13为同一菌株)的基因组已经得到解析(Veith B et al，J Mol Biotechnol，2004)。

实验菌株与工业菌株的不同之处是，前者可以带有多种遗传标记，其特定产品的生产水平一般都很低，主要用于科学探索中的实验研究材料，如ATCC14580；后者为经过多重育种方法获得的、主要用于特定工业产品的工业化生产的生产菌株，如我国的碱性蛋白酶生产菌株地衣芽孢杆菌6816。与实验菌株相比，工业菌株的遗传背景一般不清楚，育种过程中也不希望改变其原有的优良属性。

地衣芽孢杆菌不具有感受态形成所必需的全部组份，因而不能象大肠杆菌那样，通过感受态转化法进行基因转移(Veith B et al，J Mol Biotechnol，2004)。实现其基因转移仅能依靠原生质体转化法和电穿孔法。

地衣芽孢杆菌基因组中含有两个限制基因转移的I型限制性修饰系统(R-M系统)(Veith B et al，J Mol Biotechnol，2004)。R-M系统主要由限制性酶和甲基转移酶两部分组成，在此R-M系统的作用下，地衣芽孢杆菌基因组DNA的限制性酶切位点被甲基转移酶识别并甲基化(修饰)，从而可以防止/免除其限制性酶的剪切；外来DNA分子因未被甲基转移酶甲基化而被其限制性酶酶切降解。象其它生物体一样，地衣芽孢杆菌通过这一系统的功能发挥来保证其遗传性状的稳定性。

经过优化的原生质体转化法和电穿孔法，可以实现对地衣芽孢杆菌特定菌株的遗传转化(Xue GP et al，J Microbiol Methods，1999；徐敏等，无锡轻工大学学报，2004；Waschkau B et al，Appl Microbiol Biotechnol，2007)。但无论是原生质体转化法或是电穿孔法用于对地衣芽孢杆菌的遗传转化，其遗传转化实验是不稳定的，通常需要有经验的操作者进行反复实验操作。而且，若干地衣芽孢杆菌菌株至今不能实现遗传转化(Waschkau B et al，Appl Microbiol Biotechnol，2007；Vary PS et al，Appl Microbiol Biotechnol，2007；Leonard CG et al，J Bacteriol，1964；Gwinn DD&Thome CB，J Bacteriol，1964)。

限制或障碍地衣芽孢杆菌基因转移的主要原因是地衣芽孢杆菌具有多重I型限制性酶。此外，无感受态形成和芽孢(微生物细胞的休眠状态)形成周期也是限制地衣芽孢杆菌基因转移的重要原因。因此，发展和建立一种稳定的地衣芽孢杆菌遗传转化体系对地衣芽孢杆菌工业菌株的遗传改良极为重要。

有效解决受体菌对外源DNA分子的降解和排斥的技术目前报道的有如下几种方法。热处理法灭活产生的限制性酶；先破坏受体菌的限制性系统(即通过基因操作和分子克隆技术对其限制性修饰系统中的限制性酶编码基因进行缺失突变)，再实施基因转移；或对外源DNA分子先进行特异性甲基化，再实施基因转移(Murray NE，Microbiol Mol Biol Rev，2002)。

就地衣芽孢杆菌而言，原生质体转化法和电穿孔法，可以解决其芽孢形成以及无感受态生理状态出现等对遗传转化的限制。删除地衣芽孢杆菌基因组中的两个R-M系统的限制性酶编码基因，则可以消除限制性酶对外源基因分子的降解，可以实现对地衣芽孢杆菌的遗传转化(Waschkau B et al，Appl MicrobiolBiotechnol，2007)。但从地衣芽孢杆菌R-M系统缺失突变株获得的质粒用于地衣芽孢杆菌的遗传转化并没有明显优势(Waschkau B et al，Appl MicrobiolBiotechnol，2007)；并且从地衣芽孢杆菌分离和纯化质粒DNA(微生物分子改良的重要分子材料，其本质是能够独立进行自主复制的、存在于染色体外的遗传物质)也十分困难。此外，我们不可能对地衣芽孢杆菌工业生产菌株的R-M系统进行缺失突变，因为这样所获得的遗传改良的工业菌株所具有的遗传信息将会十分不稳定。为此，研究一种在完全保留工业菌株的R-M系统完整性的前提下，实现其基因转移的新方法将是十分重要的。

发明内容

本发明的目的是获得一种在完全保留工业菌株的R-M系统完整性的前提下，实现其遗传转化新方法。

在分析地衣芽孢杆菌基因组组成的基础上，获得地衣芽孢杆菌R-M系统组成特征，分析和研究其甲基转移酶的特征及其可能的甲基化功能，接着通过分子克隆技术对地衣芽孢杆菌的甲基转移酶编码基因进行克隆并在大肠杆菌中实现表达，再将需要转化入地衣芽孢杆菌中的DNA转化入含有地衣芽孢杆菌的甲基转移酶的大肠杆菌中进行甲基化，最后从大肠杆菌中获得特异性甲基化的DNA，再用优化的电穿孔法，实现地衣芽孢杆菌工业生产菌株的基因转移。

本发明提供了应用于地衣芽孢杆菌遗传转化的体内特异性甲基化DNA制备方法；提供了体内甲基化的甲基转移酶表达载体；提供了运用此方法实现地衣芽孢杆菌工业菌株遗传转化技术。

本发明的技术方案：一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法：

(1)在转化地衣芽孢杆菌工业生产菌株前，先在特异性甲基转移酶催化下，对待遗传转化的DNA分子中腺嘌呤(A)碱基进行甲基化，由此制备获得不被地衣芽孢杆菌I型核酸限制性酶分解的甲基化DNA分子；

(2)用电穿孔法，将此甲基化的DNA分子遗传转化地衣芽孢杆菌工业生产菌株，运用此方法，地衣芽孢杆菌工业生产菌株的遗传转化率达到25～1250个/μg DNA。

DNA分子的甲基化所用的特异性甲基转移酶是运用基因克隆技术获得的、在大肠杆菌表达的、地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶；其甲基化方式是，在大肠杆菌细胞内，地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶对外源DNA分子进行甲基化，即体内甲基化。

细菌培养：

地衣芽孢杆菌和大肠杆菌于LB培养基(1％酵母膏，1％蛋白胨，0.5％NaCl，pH7.2)，37℃培养1～3天。必要时在培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL四环素或5μg/mL卡那霉素。

地衣芽孢杆菌DNA甲基化酶基因的克隆和重组大肠杆菌的构建：

分析地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组(GenBank登录号：AE017333；VeithB et al，J Mol Biotechnol，2004)，在其基因组存在一种I型地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶编码基因。设计并化学合成一对寡核苷酸引物。再运用PCR(聚合酶链反应)技术，以地衣芽孢杆菌ATCC 14580染色体DNA为模板，以上述寡核苷酸为引物，用Pfu DNA多聚酶(BBI公司)扩增出地衣芽孢杆菌DNA特异性甲基化酶编码基因Bli-met。将基因Bli-met克隆入表达载体pKK223-3(Brosius&Holy，PNAS，1984)的tac启动子下游获得大肠杆菌表达重组质粒pKK-met；再将重组质粒pKK-met转化入大肠杆菌DH5α，获得重组大肠杆菌Ec(met)。

DNA分子体内甲基化，是经过表达质粒pKK-met，在大肠杆菌细胞内高表达地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶实现的。

特异性甲基化DNA分子的体内制备：

将大肠杆菌-地衣芽孢杆菌质粒(如pHY 300plk(Ishiwa H&Shibahara H，JpnJ Genet，1985)；pDG-148(Stragier P et al，Cell，1988)或pHY-WZX(Niu DD&Wang ZX，J Ind Microbiol Biotechnol，2007))转化入重组大肠杆菌Ec(met)；37℃培养24～48h，进行体内甲基化；用Qiangen公司的纯化试剂盒纯化大肠杆菌Ec(met)中的甲基化质粒；用此质粒转化地衣芽孢杆菌。

表达质粒pKK-met是通过将地衣芽孢杆菌中的甲基转移酶基因克隆入pKK223-3的tac启动子下游获得的。

地衣芽孢杆菌工业生产菌株指的是，能够合成重要工业产品：工业酶制剂，生物多聚体或抗生素，并且其合成水平已具有商业开发价值的地衣芽孢杆菌菌种。

地衣芽孢杆菌电穿孔转化：

接种地衣芽孢杆菌工业菌株CICIM B2004(王正祥等。应用与环境生物学报，2007；)或CICIM B0204(牛丹丹等。微生物学报，2006)于2.5mL LB培养基中，过夜培养后，转接入50mL生长培养基(含0.5mol/L山梨醇的LB培养基)中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.85-0.95。将菌体在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min离心5分钟收集菌体。用预冷的EP缓冲液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇和10％甘油)反复洗涤细胞4次。将细胞悬浮于约1mL的预冷EP缓冲液中。取60μL菌体分装于1.5mL Eppendorf管中。取1μL质粒DNA(50ng/L)，与细胞混匀，移入预冷的电转化池，电击(2000v，5ms)后，加入1mL复苏培养基(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB培养基)，37℃、80r/min培养3h，然后涂布含卡那霉素(5μg/mL)或四环素(50μg/mL)的LB平板，于37℃培养2～3天。

本发明的有益效果：

1、本发明的DNA遗传转化新技术，对地衣芽孢杆菌有效。经重组大肠杆菌Ec(met)甲基化的DNA分子具有消除地衣芽孢杆菌R-M系统的限制作用，用此甲基化的DNA可以稳定和高效地对地衣芽孢杆菌工业菌株进行遗传转化，转化率达到25～1250个/μgDNA。

2、本发明的DNA甲基化技术，对地衣芽孢杆菌具有特异性。

3、本发明的特异性甲基化DNA制备技术为体内完成，具有方便、快捷、高效和廉价等特点。

4、本发明的应用于地衣芽孢杆菌遗传转化的特异性甲基化DNA的制备为在大肠杆菌细胞内完成，便于DNA分子重组的实施；同时，没有对地衣芽孢杆菌R-M系统进行任何改变，从而保证地衣芽孢杆菌工业生产菌株在经此方法获得特定遗传改良或修饰后，仍保持对外源DNA分子入侵的免疫力，即保证地衣芽孢杆菌的遗传稳定性。

附图说明

图1.pKK-met物理图谱

具体实施方式

实施例1：地衣芽孢杆菌甲基转移酶编码基因的鉴定与克隆表达

分析B.licheniformis ATCC 14580基因组序列(GenBank登录号为：AE017333，Veith B et al，J Mol Biotechnol，2004)，确定其基因组4169271至4170800区域存在一个开放读框，其编码基因产物可能为一个B.licheniformis特异性I型DNA甲基转移酶。用染色体DNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取染色体DNA，以此DNA为模板，以化学合成的寡核苷酸

metP1 5′-TCAGAATTCTGAGGAACACAACCATGGCTGAATT-3′，下划线部分为EcoRI位点，和

metP2 5′-TACGAATTCTCCTAACTTACGCTCTTCCCA-3′，下划线部分为EcoRI位点，为基因扩增引物，在PfuDNA多聚酶的作用下，通过多聚酶链反应(PCR)扩增出1.6kb大小的B.licheniformis甲基转移酶的编码基因(Bli-met)。将此PCR产物EcoRI酶切，与经同样酶切的pBluescriptII SK(-)(Alting-MeesMA&Short JM，Nucl Acids Res，1989)载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板(酵母膏1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％)上筛选出转化子。酶切验证得到了重组质粒，定名为pSK-met。对重组质粒pSK-met中的met基因用双脱氧核苷酸链终止法进行序列测定，确认其序列的正确性。

进一步构建含B.licheniformis甲基转移酶的重组表达质粒pKK-met。

其构建过程为：EcoRI酶切pSK-met，用胶回收试剂盒(Qiagen公司)胶回收1.6kb Bli-met基因片段，回收纯化的Bli-met基因片段与经EcoRI酶切的pKK223-3连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，酶切验证得到重组表达质粒pKK-met，相应的重组菌命名为Ec(met)。

实施例2：外源DNA分子甲基化

重组菌Ec(met)用Sambrook介绍的方法(Sambrook et al，Molecular Cloning：ALab Manual，1989)制备感受态细胞并于-70℃保存。用质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)制备大肠杆菌-地衣芽孢杆菌的穿梭质粒pHY 300PLK、pDG148-Stu，pHY-WZX。用感受态法，将上述质粒转化入重组菌Ec(met)中，在终浓度100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL四环素或5μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。阳性转化子经分离纯化后，在LB培养基中于37℃下培养24～48h，运用met基因的表达对转化入其中的质粒DNA进行甲基化。运用质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)对上述转化子中的质粒DNA分子进行分离纯化。即制备获得用于后续地衣芽孢杆菌遗传转化的质粒甲基化DNA分子。

实施例3：特异性甲基化DNA分子用于地衣芽孢杆菌的遗传转化

接种工业生产地衣芽孢杆菌菌株B2004或B0204于2.5mL含0.5mol/L山梨醇的LB培养基中，过夜培养后，转接入50mL含0.5mol/L山梨醇的LB培养基中，于37℃培养至A₆₀₀为0.85-0.95。将菌体在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min离心5分钟收集菌体。用预冷的EP缓冲液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇和10％甘油)反复洗涤细胞4次。将细胞悬浮于约1mL的预冷EP缓冲液中。取60μL菌体分装于1.5mL Eppendorf管中。取1μL上述方法制备的甲基化或未甲基化质粒DNA(50ng/L)，与细胞混匀，移入预冷的电转化池，电击(2000v，5ms)后，加入1mL复苏培养基(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB培养基)，37℃、80r/min培养3h，然后涂布含卡那霉素(5μg/mL)或四环素(50μg/mL)的LB平板。转化率见表1。运用特异性甲基化的DNA转化地衣芽孢杆菌的转化率较未甲基化的DNA提高了5～10倍，达到25～1250个/μg DNA。特别是，用未甲基化的DNA不能实现转化的几种地衣芽孢杆菌菌种，用特异性甲基化DNA分子对地衣芽孢杆菌工业生产菌种实现了遗传转化。

表1

工业菌株	质粒	转化率(个/μg DNA)
			B.licheniformis B0204B.licheniformis B2004	pHY300PLKpDG148-StupHY-WZX甲基化pHY300PLK甲基化pDG148-Stu甲基化pHY-WZXpHY300PLKpDG148-StupHY-WZX甲基化pHY300PLK甲基化pDG148-Stu甲基化pHY-WZX	510778012509160012514036

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法，其特征是：

(1)在转化地衣芽孢杆菌工业生产菌株前，先在特异性甲基转移酶催化下，对待遗传转化的DNA分子中腺嘌呤(A)碱基进行甲基化，由此制备获得不被地衣芽孢杆菌I型核酸限制性酶分解的甲基化DNA分子；

(2)用电穿孔法，将此甲基化的DNA分子遗传转化地衣芽孢杆菌工业生产菌株，运用此方法，地衣芽孢杆菌工业生产菌株的遗传转化率达到25～1250个/μg DNA。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征是：DNA分子的甲基化所用的特异性甲基转移酶是运用基因克隆技术获得的、在大肠杆菌表达的、地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶；其甲基化方式是，在大肠杆菌细胞内，地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶对外源DNA分子进行甲基化，即体内甲基化。

3.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征是：DNA分子体内甲基化，是经过表达质粒pKK-met，在大肠杆菌细胞内高表达地衣芽孢杆菌特异性甲基转移酶实现的。

4.根据权利要求3所述的遗传转化方法，其特征是：表达质粒pKK-met是通过将地衣芽孢杆菌中的甲基转移酶基因克隆入pKK223-3的tac启动子下游获得的。

5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征是：地衣芽孢杆菌工业生产菌株指的是，能够合成重要工业产品：工业酶制剂，生物多聚体或抗生素，并且其合成水平已具有商业开发价值的地衣芽孢杆菌菌种。

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