JP2004121069A - 新規ｄｎａヘリカーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡ組換えの中間体であるホリデイ構造のＤＮＡに作用し、２組のＹ字２本鎖ＤＮＡまたは４本の１本鎖ＤＮＡに解離させる耐熱性のＤＮＡヘリカーゼを提供する。
【解決手段】超好熱性古細菌ピロコッカスフリオサス由来の耐熱性ＤＮＡヘリカーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子配列の発現ベクターで形質転換した宿主を培養し、その培養物から該蛋白質を単離する。本酵素は９８℃で９０分間加熱してもほとんど活性の低下が見られない。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子操作用試薬として有用な、二本鎖ＤＮＡ　解離活性を有するＤＮＡヘリカーゼ及び、遺伝子工学的手法を用いた該酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子であるＤＮＡは通常、塩基間に水素結合を形成して二本鎖で存在している。また、同一鎖内でも塩基間に水素結合を形成することができ、ＤＮＡ鎖がステム＆ループ構造をとる場合もある。このようなＤＮＡ塩基間の水素結合を解離させて一本鎖に戻す機能を有する酵素を一般にＤＮＡヘリカーゼという。生物のゲノムＤＮＡが複製される時には、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖を鋳型にしてそのコピーが合成される。その際ＤＮＡヘリカーゼは中心的な役割を果たさなければならない。ＤＮＡ複製は二本鎖ＤＮＡを解きながら進行し、各々の鎖の塩基配列に相補的な配列を有する新生鎖が合成される。
また、相同的ＤＮＡ組換え過程において、組換え中間体である四分岐構造（ホリディジャンクション）が解消されて二組の二本鎖ＤＮＡに戻る際に、分岐点が適当な位置に移動することが知られており、その際には四分岐構造を特異的に認識して、そのヘリカーゼ活性で分岐点移動を起こす酵素が存在する。この他にもヘリカーゼ活性は、細胞内での様々な生命現象にとって重要な働きをしている。これまでの研究により多くのヘリカーゼが発見されている。その中で、相同組換え過程で分岐点移動に働くことがしられているものとしては、大腸菌ＲｕｖＢ，　ＲｅｃＧ蛋白質がある。真正細菌にはＲｕｖＢ，　ＲｅｃＧ　に類似した配列を有する蛋白質が存在する。
【０００３】
現在までに、ホリディ構造などの特異的な立体構造を認識してＤＮＡ　鎖間の水素結合を解離させながら二本鎖を解く酵素は、上記のようにいくつか知られてはいるが、殆どが常温真正細菌生物由来のもので、熱安定性は低く、試験管内での解離効率も良くない。高度好熱性の真正細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＲｕｖＢ蛋白質（ＴｔｈＲｕｖＢ，　ＴｍａＲｕｖＢ）が　単離されているが（非特許文献１参照）、そのうちＴｔｈＲｕｖＢ　が唯一耐熱性の酵素として、当該活性を有することが実験的に証明されている（非特許文献２参照）。しかしながらこの酵素は７０　度で１５分置くと変性して不溶化し、耐熱性と言えども安定なものではない。
【０００４】
【非特許文献１】「ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、１７８巻、ｐ２６９５−２７００（１９９６）
【非特許文献２】「モレキュラー　アンド　ジェネラルジェネティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２６１巻、ｐ１００１−１０１１（１９９９）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡ　組換え中間体であるホリディ構造ＤＮＡを効率よく二組の二本鎖ＤＮＡに解離するために適した分岐点移動活性を有する酵素を見出し、優れた遺伝子組換え技術を開発することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、超好熱性古細菌ピロコッカス　フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）　から新規ＤＮＡヘリカーゼ活性を発見し、該酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。さらに、この遺伝子を導入した形質転換体を作製し、該ＤＮＡヘリカーゼを大量生産することに成功した。
本発明者らは古細菌より、ＤＮＡ組換え過程における中間体であるホリディ構造ＤＮＡを特異的に認識して、分岐点近傍から、ＤＮＡ鎖間の水素結合を解離するヘリカーゼを見出すために、図１、図２のような人工的に合成したホリディ構造ＤＮＡを特異的に認識し、二組のＹ字型二本鎖ＤＮＡに解離する活性を有する蛋白質の同定を目指した。超好熱性古細菌の一種である、ピロコッカス　フリオサスの細胞抽出液から、目的とする活性を探索したところ、その活性を検出することに成功した。部分精製した画分を用いて、反応至適条件を検討した後、適する条件を用いてピロコッカス　フリオサスのプロテインライブラリーをスクリーニングした。その結果活性を示すクローンを見出し、その元になるコスミドＤＮＡを解析することによって、目的の活性を有する蛋白質に対応する遺伝子領域をクローニングすることに成功した。得られた遺伝子の塩基配列を調べたところ、７２０個のアミノ酸（配列番号１）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号２）が見つかった。そこで、該ＯＲＦのみをサブクローニングして、該蛋白質を大腸菌で産生させた。得られた蛋白質を、電気泳動的に単一バンドにまで精製した後、詳細に基質特異性を調べたところ、該酵素は四分岐のホリディ構造を認識し、二組のＹ字型二本鎖ＤＮＡに解離した。また、Ｙ字型二本鎖がさらにほどけて一本鎖になることもあった。以上の結果より、該蛋白質を、新規　ＤＮＡヘリカーゼと結論し、Ｈｊｍ　（Ｈｏｌｌｉｄａｙ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）　と命名した。アミノ酸配列について、データベース検索をした結果、高い相同配列を有するＯＲＦが、これまでに全ゲノム配列が解読されている全ての古細菌から発見された。またヒトを含む真核生物のゲノム中にも類似性を示す配列部分を有する蛋白質が存在する。
【０００７】
即ち本発明は、古細菌由来の耐熱性ＤＮＡヘリカーゼに関する。特にＤＮＡ組換えの中間体であるホリデイ構造のＤＮＡを特異的に認識して、水素結合を解離することによる分岐点移動をおこし、２組のＹ字２本鎖ＤＮＡまたは４本の１本鎖ＤＮＡに解離させるＤＮＡヘリカーゼに関する。本発明のＤＮＡヘリカーゼは、例えば、図１、図２に示されるような構造のＤＮＡを認識して、二組のＹ字型二本鎖ＤＮＡが分離、生成されるように働く酵素である。また、Ｙ字型構造の二本鎖は場合によっては、本酵素によって一本鎖にまで解離する。
本発明のＤＮＡヘリカーゼは耐熱性である。本明細書で「耐熱性」とは７０℃で１５分放置してもその活性を失わないことを言う。一態様によれば本発明のＤＮＡヘリカーゼは９８℃で９０分間置いても、殆ど活性低下が見られない。
【０００８】
本発明は以下の（ａ）（ｂ）または（ｃ）の組換え蛋白質に関する
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡヘリカーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の断片からなり、かつＤＮＡヘリカーゼ活性を有する蛋白質
【０００９】
本発明は、上に記載の蛋白質をコードする遺伝子にも関する。１態様によれば遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列を有する。遺伝コードの縮重により多数の他の塩基配列が存在し得る。
【００１０】
本発明は、上に記載の組換え蛋白質の製造方法であって、
（１）上に記載の蛋白質をコードする遺伝子にコントロール配列を作動可能に連結した配列を有する発現ベクターを調製し、
（２）該ベクターで宿主を形質転換し、
（３）形質転換した宿主を培養し、
（４）培養物から該蛋白質を単離する、
ことを含む方法にも関する。
【００１１】
本発明の蛋白質の製造に原核生物を用い得る。本発明の蛋白質の製造に適した原核生物としては、大腸菌Ｋ１２株２９４等の大腸菌、枯草菌等のバチルス属、Ｓａｌｍｏｎｅｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　及び　Ｓｅｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ等の腸内細菌、種々のシュードモナス属、及びストレプトマイセス属等を挙げることができる。
【００１２】
原核生物での遺伝子の発現を制御するのに適当なプロモーター配列としては、βラクタマーゼ、ラクトース系、アルカリホスファターゼ、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系等がある。ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターもまた適する。一般的にその塩基配列が公知の他の細菌性プロモーターも必要ないずれかの制限部位を提供するリンカー又はアダプターを用いて本発明の蛋白質をコードするＤＮＡに連結し得る。
【００１３】
本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、核酸配列を有し、上に記載した配列を有するいずれかの分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを言う。
【００１４】
本発明は、本発明による核酸分子を有するベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作で従来用いられる他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて様々なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）　Ｎ．Ｙ．　及び　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎ．Ｙ．　（１９８９），　（１９９４）　に記載の技術を参照。本発明に従い好ましく用いられるプラスミド及びベクターには当業者に周知のものが含まれる。或いは、本発明の遺伝子及びベクターを標的細胞に運搬するリポソーム中へ再構築することができる。
【００１５】
好ましい態様では、ベクター中に存在する核酸分子を原核又は真核細胞中で遺伝子を発現させることができるコントロール配列に結合する。
「コントロール配列」という用語は、それらが結合するコード配列を発現させるに必要な制御ＤＮＡ配列を言う。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物により異なる。原核生物では、コントロール配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物ではコントロール配列は一般にプロモーター、ターミネーター及びある場合にはトランスアクチベーター又は転写因子を含む。「コントロール配列」という用語は最小でもその存在が発現に必要であるすべての成分を含むことを意図し、更なる有用な成分をも含んでもよい。
「作動可能に結合した」という用語は、該成分がそれらの意図された方法で作用することを可能にする関係にある位置を言う。コード配列に「作動可能に結合した」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法で結合される。コントロール配列がプロモーターである場合には、２本鎖核酸が好ましく用いられることは当業者に自明である。
従って本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択した宿主細胞を形質転換し、選択した宿主細胞中でコード配列を発現させるため用いることができる構築物である。発現ベクターは例えばクローニング、バイナリーベクター又はインテグレイティングベクターであり得る。発現は好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核及び／又は真核細胞中での発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常転写の開始を確実にするプロモーター、及び場合により転写の終了及び転写物の安定化を保証するポリＡシグナルを通常含む。一般的に用いられるプロモーターは、ポリユビキチンプロモーター、及び発現の場合にはアクチンプロモーターである。更なる調節要素は転写エンハンサーを含みうる。原核宿主細胞での発現を可能にする可能な調節要素は、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるＰ_Ｌ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターであり、真核宿主細胞での発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−，ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー又はグロビンイントロンであるＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）等の適当な発現ベクターが当業者に知られている。該蛋白質を発現させるのに用い得る別の発現システムは昆虫システムである。そのようなシステムの１つにおいて、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　細胞又は　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅ中で外来遺伝子を発現させる。本発明の遺伝子のコード配列をポリヘドリン遺伝子等のウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置いてもよい。該コード配列を首尾よく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が非活性になり、コート蛋白質を欠いた組換えウイルスが得られるであろう。その組換えウイルスを用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　細胞又は　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａに感染させ、その中で本発明の蛋白質を発現させる（Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　４６　（１９８３），　５８４；　Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９１　（１９９４），　３２２４−３２２７）。有利には本発明の上記ベクターは選択可能なマーカーを含む。
【００１６】
本発明はさらに核酸配列が宿主細胞にとって外来である、上記のベクター又は本発明の遺伝子を含む宿主細胞に関する。
「外来」とは核酸分子が宿主細胞に関して異種であるか（これは異なった遺伝的背景を有する細胞又は生物に由来することを意味する）、或いは宿主細胞に関しては同種であるが、該核酸分子の天然に存在する対応物と異なる遺伝的環境にあることを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞に関して同種であるなら、それは該宿主細胞のゲノムの天然の位置にはないこと、特に異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子はそれ自身のプロモーターの支配下にあるか、又は異種のプロモーターの支配下にあってもよい。宿主細胞中に存在する本発明によるベクター又は遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、染色体外にある形で保持されていてもよい。これに関し、本発明の遺伝子はホモロガスな組換えにより変異体遺伝子を回復し、又は創出するのに用いてもよい（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ編，　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｓｌｌｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ，　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　（１９９４））。本発明は本発明のベクター又は遺伝子を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は（古）細菌、昆虫、菌類、植物、又は動物細胞等のいずれの原核又は真核細胞でありうる。好ましい菌類細胞は、例えば　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　属の細胞、特に　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　の細胞である。
「原核」と言う用語は、本発明の蛋白質の発現のためにＤＮＡ又はＲＮＡで形質転換又はトランスフェクトされ得るすべての細菌、例えば古細菌を含むことを意図する。原核宿主は、例えばＥ．　ｃｏｌｉ、　Ｓ．　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　等のグラム陽性及びグラム陰性細菌を含み得る。「真核」と言う用語は、酵母、高等植物、昆虫、そして好ましくは哺乳動物細胞を含むことを意味する。組換え製造方法に用いる宿主によって、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はグリコシル化されるかもしれないし、グリコシル化されないかもしれない。本発明の蛋白質は、最初のメチオニンアミノ酸残基を有していても、有していなくてもよい。当業者に一般的に知られたいずれかの技術を用いて本発明の遺伝子を用いて宿主を形質転換又はトランスフェクトすることができる。更に、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製方法及びそれらを例えば哺乳動物及び細菌中で発現させる方法は当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ，　１９８９）。
【００１７】
本発明の酵素をコードする遺伝子を大腸菌での発現ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｎ社）に組み込んだプラスミドｐＨＪＭ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ　に導入して得られた組換え体は　ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ／ｐＨＪＭ１と命名、表示され、　独立行政法人産業技術総合研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１９００６として寄託されている。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１） Ｐ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓ 細胞からの分岐点移動活性の精製
Ｐ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓ　ＤＳＭ３６３８は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨより入手し、文献（ヌクレイック　アシッド　リサーチ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　第２１巻、２５９ー２６５ページ）の方法に従って培養した。５２ｇ　のＰ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓ細胞を０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ　５００　ｍｌ中で超音波破砕し、超遠心（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＸＬ−９０、１００，０００×ｇ、６０　分）して沈殿を除き、細胞粗抽出液を得た。その細胞粗抽出液に終濃度０．１５　％になるようにポリエチレンイミンを加え、氷中で６０分間撹拌し、遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を１　Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａ中で溶解した後、８０　％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて氷中で６０分間撹拌して塩析した。遠心分離を行って回収した蛋白質沈殿を再び１　Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ中で再懸濁し、０．５　Ｍ　、次いで０．２　Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで段階的に透析を行い、０．２　Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化した１０　ｍｌのＨｉＴｒａｐ　ｈｅｐａｒｉｎ　カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、０．２　Ｍから２　Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で展開して蛋白質を溶出した。以下に示す方法により、各画分のホリディ構造分岐点移動活性を調べ、活性が見られた０．４６から０．７０　Ｍで溶出した画分を緩衝液Ｄ（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．０、０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　Ｍ　ＮａＣｌ）中で透析して、緩衝液Ｄで平衡化した５　ｍｌのＨｉＴｒａｐ　ＳＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、０．１　Ｍから０．６　Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で展開し、分画した。ホリディ構造分岐点移動活性は０．１８から０．３８　Ｍで溶出し、この画分を緩衝液Ａ中で透析した。つぎにこの画分を緩衝液Ａで平衡化した５　ｍｌのＨｉＴｒａｐ　Ｑカラムに添加し、０から１　Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配で展開して分画し、活性画分（０．３０から０．５５　Ｍで溶出した）を回収した。ついで、活性が見られた画分を緩衝液Ｅ（１０　ｍＭ　リン酸カリウム　ｐＨ　６．８、７　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１０　％　グリセロール）で透析し、透析後、緩衝液Ｅで平衡化した５　ｍｌのハイドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ　ＣＨＴ−ＩＩ）に添加して０．０１から１　Ｍのリン酸カリウム直線濃度勾配で展開して分画した。ホリディ構造分岐点移動活性が見られた０．１０から０．３０　Ｍで溶出した画分を緩衝液Ｆ（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．０、０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で透析し、同緩衝液で平衡化した１　ｍｌのホスホセルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐ−１１）に添加した。０から１．５　Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で展開して分画し、ホリディ構造分岐点移動活性が見られた０．２５から０．４３　Ｍで溶出した画分を緩衝液Ｆで透析した後、Ｍｏｎｏ　Ｓ　５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加して０から０．６　Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配により展開して分画し、各画分のホリディ構造分岐点移動活性が見られた０．４０から０．４５　Ｍで溶出した画分を回収した。得られた活性画分は４　℃で保存した。各活性画分のタンパク量はＡｄｖａｎｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ　Ｉｎｃ．）を用いて定量した。
【００１９】
（２）ホリディ構造 　ＤＮＡ　 の形成反応
配列表の配列番号４に示す　ＤＮＡ　を　１００　ｐ　ｍｏｌ　用いてポリヌクレオチドキナーゼと　［γ−３２Ｐ］　ＡＴＰ　で　５’　末端リン酸化した後　３０　ｐ　ｍｏｌ　を同量の配列番号３、５、６に示す　ＤＮＡ　と混合し６５℃、３０分間の熱処理に続いて１５時間かけて自然冷却で徐々に室温になるまで温度を下げて図１に示す、分岐点に３０　ｂｐの相同配列を持って中心部が移動する四分岐構造（ＨＳＬ）を形成させた。　末端標識した配列番号７に示す　ＤＮＡ　を同量の配列番号８、９　、１０に示す　ＤＮＡ　と混合し、同様の方法で中心部分に相同配列が２塩基分しかない四分岐構造　（ＪＹ）を形成させた（図２）。ＨＳＬが解離された状態であるＹ構造ＤＮＡ（Ｙ１、Ｙ２）は配列番号３＋配列番号４、配列番号３＋配列番号６の組み合わせでアニールして調製した。Ｍ１３一本鎖ＤＮＡに５’（Ｌ２）または３’（Ｌ３）フラップを持つもの、またはフラップを持たない（Ｌ１）オリゴヌクレオチドをアニールした基質は配列番号１３、１２、１１それぞれをＭ１３一本鎖ＤＮＡ（宝酒造）とアニールして調製した。また２本鎖部分が６３塩基になるより安定な基質ＤＮＡを得るために、配列番号１６，　１５，　１４　　をそれぞれＭ１３一本鎖ＤＮＡとアニールした。
【００２０】
（３） Ｐ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓ 細胞粗抽出液画分からのホリディ構造分岐点移動活性の検出
カラムより溶出した画分２　μｌと^３２Ｐ標識された合成ホリディ構造ＤＮＡ（ＨＳＬ）　５ｎＭを反応溶液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．８、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２　ｍＭ　ＡＴＰ、１　ｍＭ　ＤＴＴ、５０　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）２０　μｌ中で５５　℃で１時間反応させ、フェノールを用いて反応を止めた。その後反応溶液をＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ中で１２　％　ＰＡＧＥにより分離し、分離したＤＮＡはオートラジオグラムにより可視化した。
【００２１】
（４）ホリディ構造分岐点移動活性の反応条件検討
実施例１の（１）で記載したＭｏｎｏＳカラムクロマトグラフィー精製画分（２　μｌ）を５　ｎＭの合成ホリディ構造ＤＮＡ（ＨＳＬ）と反応させた。反応は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．０、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０　ｍＭ　ＡＴＰ、５０　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含む反応溶液中で、５５　℃、１時間の反応を基本としてＡＴＰ、ＭｇＣｌ_２の濃度、ｐＨ、反応温度を変えて行い、１２　％
ＰＡＧＥで反応産物を分離しオートラジオグラムを取って解析した。
ＡＴＰ濃度の検討にはＡＴＰを０、０．５、１、１．５、２、３、５、１０、２０　ｍＭ加えて行った。その結果１０　ｍＭの時最も高い活性を示した。ＭｇＣｌ_２濃度の検討にはＭｇＣｌ_２を０、１、３、５、１０、３０、５０、１００　ｍＭ加えて行い、至適ｐＨの検討はｐＨ　６．０、７．０、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０の反応溶液を用いて行った。反応温度の検討は３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０　℃で２０分反応した。塩濃度の影響については、ＮａＣｌ　濃度を　０，　４０，　５０，　１００，　１５０，　２００，　２５０，　３００，　４００　５００　ｍＭ　と変えて活性を比べた。活性はＭｇＣｌ_２非存在下では検出されず、５ｍＭ　の時最適であった。またＭｇ　以外にＣａ，　Ｚｎ，　Ｍｎ　なども調べたが、Ｍｇ　のときよりも活性が低かった。反応液中のｐＨが活性に与える影響については、分岐点移動活性はアルカリ側のｐＨ　７．０〜ｐＨ　１１．０の範囲で広く観察され、中性以下のｐＨは適さない。反応温度は、５５〜６０　℃で活性が最も強くなり、７５　℃においても活性が観察された。一方、４０　℃以下の中低温では活性は低かった。反応温度が６５　℃以上になると基質である合成ホリディ構造ＤＮＡが熱により不安定化し、解離したバンドが見られるようになる。反応温度が７０　℃以上になると部分精製した蛋白質の有する活性に基づく解離産物のバンドが減少するのは、熱により基質ＤＮＡが不安定になり、適切な基質としての構造を維持できなくなることが考えられる。６０　℃においては活性が最も強く見られ、基質ＤＮＡはほとんど解離されるが、解離したバンドに加えて、７０　ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡの位置にバンドが観察されるようになった。この産物がＰ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓの分岐点移動活性によって、まずホリディ構造ＤＮＡが解離し、その結果生じるＹ構造ＤＮＡが、さらに解離して一本鎖になったものであると考えられる。塩化ナトリウムを用いて反応溶液中の塩濃度がこの活性に与える影響を調べた結果、反応溶液中の塩濃度が４０　ｍＭと低い場合に活性が最も強く観察され、反応溶液中の最終塩濃度が１００　ｍＭになると活性がほとんど見られなくなった。基質特異性検討の反応はＭｏｎｏＳ画分（２　μｌ）を用い、様々な基質ＤＮＡ（ＨＳＬ、ＪＹ、４Ｊ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１０、Ｄ）５　ｎＭと１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．０、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０　ｍＭ　ＡＴＰ、５０　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含む反応溶液中で、５５　℃、１時間反応させた。
その結果、分岐点移動活性は分岐点付近に移動可能な相同配列領域を持つホリディ構造ＤＮＡを解離することができたが（ＨＳＬ，ＪＹ）、分岐点が固定され、移動できないホリディ構造ＤＮＡは解くことができなかった（４Ｊ）。また、Ｍ１３一本鎖ＤＮＡに５’末端側あるいは３’末端側にフラップ領域が存在する、あるいはフラップを伴わない合成オリゴヌクレオチドをアニーリングした基質を用いた反応では、分岐点移動活性はいずれの基質もアニーリングしたオリゴヌクレオチドを解離することができた（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。そして、ＨＳＬが分岐点移動活性により解離した形のＹ構造ＤＮＡでは効率は異なるもののどちらの基質も一本鎖に解離した（Ｙ１、Ｙ２）。一方、ループアウト構造ＤＮＡ（Ｌ１０）、通常の二本鎖ＤＮＡ（Ｄ）については一本鎖への解離は検出できなかった。
【００２２】
（５）ホリディ構造分岐点移動活性のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる解析
ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる解析はＳＭＡＲＴ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。ＭｏｎｏＳ画分（１００　μｌ）を緩衝液（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．０、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、１０　％　グリセロール、０．３　Ｍ　ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　３．２／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、４０　μｌずつ分画して溶液を回収した。各画分のホリディ構造分岐点移動活性は上記の方法で調べた。蛋白質マーカー（ＢｉｏＲａｄ、ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　（６７０　ｋＤａ）、γ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ（１５８　ｋＤａ）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４４　ｋＤａ）　ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（１７　ｋＤａ））を同じ条件でクロマトグラフィーを行い、Ａ_２８０のピーク時の液量と蛋白質マーカーの分子量より検量線を作成した。ホリディ構造分岐点移動活性の分子量は最も活性の強かった画分の液量を検量線に当てはめて推測した。この実験による結果では分子量４０〜５０ｋＤａに相当するところに活性が溶出された。
【００２３】
実施例２
（１）ピロコッカス　フリオサス　ゲノム ＤＮＡ の調製
実施例１の（１）に記載した方法によりＰ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓを培養し、５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液　Ｌ（１０　ｍＭ　トリスー塩酸（ｐＨ８．０），１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１００　ｍＭ　ＮａＣｌ）　１０　ｍｌに懸濁し、１０％　ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０　ｍｇ／ｍｌ）を５０　ｍｌ　加えて、５５℃で６０　分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１　ｍｌのＴＥ液（１０　ｍＭ　トリスー塩酸，　　（ｐＨ８．０），　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）　に溶解し、０．７５　ｍｇのＲＮａｓｅ　Ａを加えて３７℃で６０　分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５　ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００２４】
（２）コスミドライブラリーの作製
ストラタジーン社製　ＳｕｐｅｒＣｏｓ１　Ｃｏｓｍｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｋｉｔを用いて、使用説明書に従ってライブラリーを作製した。実施例（１）で得られたＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した時に、３０−４２キロ塩基対の断片が生じるように反応条件を決めた。切断後のＤＮＡ断片をコスミドベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入して、組換えコスミドのライブラリーとした。大腸菌を形質転換して得られたコロニーから適当に１０数個を選んで、コスミドを回収し、予想される大きさのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００２５】
（３）ライブラリーより粗抽出液の調製
（２）で作製した、組換えコスミドによる形質転換体から、約５００個を選んで、それぞれを２ｍｌのＬＢ培地で培養し、集菌後バッファーＡ（１０　ｍＭ　トリスー　塩酸（ｐＨ　８．０），　２　ｍＭ　２−メルカプトエタノール，　１０　％　グリセロール）５００　ｍｌに懸濁後、超音波処理により破砕した。得られた粗抽出液を８５℃１０　分間熱処理して、大部分の大腸菌由来の蛋白質を変性させ、遠心分離により上清を集め、耐熱性プロテインライブラリーとした。
（４）耐熱性プロティンライブラリーからの目的の切断活性のスクリーニング
上記反応溶液　３６　μｌ　に対して耐熱性プロテインライブラリーの各抽出液より０．８　μｌ　を　５　クローンずつ、即ち　４　μｌ　を１反応分として加え、５６℃で　３０　分間反応させた後にフェノール／クロロホルムで反応を停止させた。その上清を上記と同様に電気泳動し、オートラジオグラフィーを行い切断バンドの有無を検出した。この結果、クローンＮｏ　１２８，３６２　の　２クローンで四分岐構造　ＤＮＡ　の分岐点移動活性が発見された。
【００２６】
実施例３
（１）目的遺伝子の同定と大量発現系の構築
実施例２の（４）で得られたクローン中、Ｎｏ．　３６２からコスミドを単離し、コスミド中に存在する　ＢａｍＨＩで分解した後、ＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８　ベクターにサブクローニングした。得られたクローンからプラスミドを調製し、ｐＵＣ１１８配列中に設計されたプライマーを用いてインサートＤＮＡの部分配列を決定した。この部分配列から　クローンＮｏ　３６２のコスミドに挿入されていると予想されるピロコッカス　フリオサスゲノムＤＮＡ配列中に含まれるＡＴＰ結合モチーフを持つ６つのＯＲＦをデータベースより推測した。それぞれのＯＲＦの両端の塩基配列をもとにこれらの遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計し、単離したコスミドを鋳型として用いて、それぞれの遺伝子をＰＣＲ法で増幅した。プライマーは、それぞれフォワードプライマー、リバースプライマー配列の中に　ＮｃｏＩ　（ＣＣＡＴＧＧ），　ＳａｌＩ　（ＧＴＣＧＡＣ）　配列を組み入れ、ＮｃｏＩ　配列中の　ＡＴＧ　を翻訳の開始コドンとして利用できるように調節した。これらのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した遺伝子をｐＥＴ２１ｄベクターに組み込み、蛋白質を発現させ、実施例２（４）と同様に四分岐構造　ＤＮＡの分岐点移動活性を調べたところ、配列表の配列番号１７、１８に示すプライマーで増幅された遺伝子の産物が分岐点移動活性を有することが判明した。この四分岐構造　ＤＮＡの分岐点移動活性を有する酵素を産生するプラスミド中のＰＣＲで増幅された部分の塩基配列に変化がないことを確認した後ｐＨＪＭ１と命名した。また、該プラスミドで形質転換された大腸菌　ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ　を　Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ／ｐＨＪＭ１　と命名した。
【００２７】
（ ２ ）目的酵素蛋白質の精製
実施例３の（１）で得られた　Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ／ｐＨＪＭ１をアンピシリンが　１００　μｇ／ｍｌ　の濃度で存在する　ＬＢ　培地　［トリプトン１０　ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ　５ｇ／リットル、ｐＨ　７．２］　６５０　ｍｌ　で培養した。培養液の濁度が　０．４４７　Ａ_６００　に達した時、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド　（ＩＰＴＧ）　を添加し、さらに４時間培養を行った。集菌後、菌体を　１００　ｍｌ　のバッファーＡ　に　１　ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド　（ＰＭＳＦ）　を加えたものに懸濁し、超音波破砕機にかけた。１６，　０００　ｒｐｍ　、２０分間の遠心分離により粗抽出液を上清として回収し、この上清を８０　℃で２０　分間インキュベートして１６，　０００　ｒｐｍ　、２０分間の遠心分離により耐熱性画分を上清として回収した。終濃度が０．１５　％になるようにポリエチレンイミンを加え、１６，　０００　ｒｐｍ　、２０分間の遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を２　Ｍの硫酸アンモニウムが入ったバッファーＡ　１００　ｍｌに懸濁し、８０　％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた。１６，　０００　ｒｐｍ　、２０分間の遠心分離により得られた沈殿を　２０　ｍｌ　の２Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファーＡに溶解し、２リットルの０．２　Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファーＡにて透析した。透析後の溶液をバッファーＡ　で平衡化した　ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　カラム（ファルマシア社製）に供し、ＦＰＬＣ　システム（ファルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを行った。展開は　０　Ｍ　→　０．６　Ｍ　の　ＮａＣｌ　直線濃度勾配により行った。目的の蛋白質は　０．２８−０．３２　Ｍ　ＮａＣｌ　のところで溶出された。目的蛋白質を含む画分　１０　ｍｌ　を集め、２リットルの０．１５　Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファーＡで透析し、同バッファーで平衡化したＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎカラム（ファルマシア社製）に供した。ＦＰＬＣシステムを用いて０．１５　Ｍ　→　０．６　ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により展開した。目的の蛋白質は０．２５　Ｍ→０．５０　Ｍ　ＮａＣｌで溶出された。目的蛋白質を含む画分９　ｍｌを集め、０．２　Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファーＢ　［１０　ｍＭ　リン酸カリウム　（ｐＨ６．８）、７　ｍＭ　２ーメルカプトエタノール、０．０５　ｍＭ　塩化カルシウム、１０　％　グリセロール］　で透析し、バッファーＢ　で平衡化した　ハイドロキシアパタイトカラム（バイオ−ラッドＣＨＴ−ＩＩ）に供した。ＦＰＬＣシステムを用いて　０．０１　Ｍ　→　１　Ｍ　のリン酸カリウム直線濃度勾配により展開した結果、目的の活性は　０．３５−０．４　Ｍ　リン酸のところに溶出された。この画分を精製標品とし、Ｈｊｍヘリカーゼと命名した。６５０　ｍｌの培養液から、約５　ｍｇの酵素が得られた。
【００２８】
（３） Ｈｊｍ 蛋白質の性質
精製されたＨｊｍ　蛋白質を用いて四分岐構造ＤＮＡ　の分岐点移動活性を測定した。精製されたＨｊｍの性質は実施例１の（４）で示したＰ．　ｆｕｒｉｏｓｕｓの細胞中の酵素活性と変わらなかった。図３に示すように　２種類の四分岐構造ＤＮＡに対して、精製した　Ｈｊｍ蛋白質を加えると、タンパク量に依存して、分岐点移動により生じるＹ字型構造ＤＮＡ　のバンドが検出された。図には示していないが、Ｈｊｍは通常の二本鎖ＤＮＡ　は解かないことも確認された。しかし、図４に示すように、一本鎖の部分を含む基質であると、二本鎖部分の結合を解離できることが示された。Ｈｊｍによる四分岐構造ＤＮＡの解離反応の至適温度を調べるために、３０〜９０℃の範囲で反応させてみると、図５に示したように８０℃でも反応が進んでいることが分かった。９０℃では基質ＤＮＡ　の四分岐構造が保てなくなり、正確な検出が不可能となった。そこで、次にＨｊｍの熱安定性を調べるために、Ｈｊｍを予め種々の温度で置き、その残存活性を７５℃で測定した。図６に示すように９８℃で９０分間置いた後にもＨｊｍの分岐点移動活性はそのまま保たれていた。
【００２９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】分岐点移動活性のスクリーニングに用いた人工四分岐構造ＤＮＡを示す。枠内は分岐点の移動可能な配列を示す。
【図２】分岐点移動活性のスクリーニングに用いた人工四分岐構造ＤＮＡを示す。枠内は分岐点の移動可能な配列を示す。
【図３】Ｈｊｍヘリカーゼの分岐点移動活性の検出を示す。図１及び２の四分岐構造ＤＮＡを放射性標識し、０．１　ｐｍｏｌ　をＨｊｍ反応に用いた。反応液中にＨｊｍ　蛋白質１６．５　ｎｇ　〜０．５０　μｇ加えて５５℃で３０分反応させた。反応物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＨＢ８　由来ＲｕｖＡＢ蛋白質を対照実験に用いた。
【図４】図に示したような一部に二本鎖部分を含む一本鎖ＤＮＡを基質として、Ｈｊｍ　反応に用いた。反応液中にＨｊｍ　蛋白質０．　２５　μｇ加えて５５℃で３０分反応させた。反応物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。
【図５】Ｈｊｍの分岐点移動活性の温度依存性を示す。図１の四分岐構造ＤＮＡを放射性標識し、０．１　ｐｍｏｌ　をＨｊｍ反応に用いた。反応液中にＨｊｍ　蛋白質０．２５　μｇ加えて３５　〜　９０　℃で３０分反応させた。反応物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。
【図６】Ｈｊｍ蛋白質の熱安定性を示す。Ｈｊｍ　蛋白質０．２５　μｇを９８　℃で０　〜１２０分間インキュベートし、放射性標識した図１の四分岐構造ＤＮＡ、０．１ｐｍｏｌ　と混ぜ、５５　℃で３０分間反応させた。反応物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。

Claims (7)

1. 耐熱性ＤＮＡヘリカーゼ。
2. ＤＮＡ組換えの中間体であるホリデイ構造のＤＮＡを特異的に認識し、２組のＹ字２本鎖ＤＮＡまたは４本の１本鎖ＤＮＡに解離させる請求項１に記載のＤＮＡヘリカーゼ。
3. 古細菌由来である請求項１または２に記載のＤＮＡヘリカーゼ。
4. 以下の（ａ）（ｂ）または（ｃ）の組換え蛋白質。
   （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質
   （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡヘリカーゼ活性を有する蛋白質
   （ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の断片からなり、かつＤＮＡヘリカーゼ活性を有する蛋白質
5. 請求項４に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
6. 配列番号２で示される塩基配列を有する請求項５に記載の遺伝子。
7. 請求項４に記載の組換え蛋白質の製造方法であって、
   （１）請求項５に記載の蛋白質をコードする遺伝子にコントロール配列を作動可能に連結した配列を有する発現ベクターを調製し、
   （２）該発現ベクターで宿主を形質転換し、
   （３）形質転換した宿主を培養し、
   （４）培養物から該蛋白質を単離する、
   ことを含む方法。

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