KR20010040349A - 재조합 미생물에 의한 알라닌 생성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사용된 미생물이, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상을, 특히 피루베이트를 거쳐 알라닌으로 전환시키는 방식으로 고유 당 대사 반응을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 글루코스로부터 알라닌을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양하여 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다. 미생물은 동종발효형 미생물, 특히 젖산균, 더욱 구체적으로 L.락티스(균주)가 바람직하고, 식품 등급 미생물이 바람직하다. 본 발명은 동일계 및 입체 특이적 알라닌 제조에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 사용할 수 있는 미생물 및 재조합 DNA 분자와 본 발명에 따라 얻은 알라닌 및 알라닌 함유 (식품) 제품에 관한 것이다.

Description

재조합 미생물에 의한 알라닌 생성 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ALANINE BY RECOMBINANT MICROORGANISMS}

〈110〉 NEDERLANDS INSTITUUT VOOR ZUIVELONDERZOEK(NIZ0)

〈120〉 PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ALANINE BY RECOMBINANT MICROORGANIS

MS

〈130〉 1

〈150〉 PCT/NL 1999/00021

〈151〉 1999-01-15

〈160〉 2

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Synthetic-primer 1

〈400〉 1

cgaggatccg gccggttgag gtttctaaag cgg 33

〈210〉 2

〈211〉 36

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Synthetic-primer 2

〈400〉 2

cgcgagctca cttgtttcat aagttgcacc gtaacc 36

이러한 유형의 방법은 이미 Uhlenbusch 등의 문헌[Appl. Environ. Microbiol. 57:1360-1366(1991)]을 통해 알려져 있다. 이 방법에서, L-알라닌은 알라닌 디히드로게나아제 유전자를 발현하는 방식으로 유전자 변형된 미생물(짐모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis))을 배양함으로써 생성된다. 발현된 알라닌 디히드로게나아제는 피루베이트로의 전환반응을 통해 배지내 글루코스를 알라닌과 에탄올 혼합물로 전환시킨다. 이 경우, 전환된 글루코스의 양을 기준으로 계산된 최대 알라닌 수율은 16%이다.

그러나, 짐모모나스 모빌리스는 식품 등급 유기체가 아니다. 짐모모나스 모빌리스는, 탄소 양을 기준하여 계산했을 때 에탄올 66% 및 CO₂33%를 형성하도록 생성된 에탄올 각 분자당 한 분자의 CO₂를 생성하기 때문에 동종발효형 미생물은 아니다.

L-알라닌은 약학 용도 및 수의학적 용도로 사용된다. 예를 들면, 임상 수술 전 식품과 수술후 식품으로서, 그리고 사료 보충물로서 다른 아미노산과 함께 비경구 투여용 제제에 첨가된다. 또한, 알라닌은 그것의 단맛으로 인해 식품 첨가제로서 사용된다.

L-알라닌은 슈도모나스 다쿤하에(Pseudomonas dacunhae)의 고정 세포 또는 세포 현탁액에 의한 L-아스파르트산염의 탈카르복실반응을 통해 공업적으로 생산된다. 이 L-알라닌의 수율은 아스파르트산을 출발물질로 하는 경우 90%를 초과할 수 있으나 아스파르트산은 비싼 기질이다.

또한, D/L-알라닌은 당의 화학적 합성법 또는 직접 발효법으로 제조할 수 있다. 이 발효에 관여된 미생물, 예컨대 코리네박테리아 겔라티노슘(Corynebacterium gelatinosium), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 브레비박테리아 락토페르멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 클로스트리디움 속균(Clostridium sp.) 및 피로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)는 아마도 내인성 알라닌 디히드로게나아제에 의한 촉매반응을 거쳐 50 내지 60%의 최대 전환율로 D/L-알라닌을 생성한다.

EP 0 603 865에는 이종 L-알라닌 디히드로게나아제 활성(예, 아트로박터 유래)을 지닌 에스케리치아(Escherichia), 코리네박테리아(Corynebacterium) 또는 브레비박테리아(Brevibacterium) 미생물을 사용하여 알라닌을 생성하는 방법이 기재되어 있다.

이들 미생물 중 어느 것도 젖산균에 속하지 않는다. 그러나, 많은 전술한 브레비박테리아 균주, 예컨대 B. 락토페르멘텀(B. lactofermentum) 및 B. 플라붐(B. flavum)은 "식품 등급" 미생물로 분류된다. 그러나, 이들 '식품 등급'으로 분류하는 것은 이들이 식품으로부터 분리되기 때문이며, 이들을 식료품의 (발효) 제조시에 이용하지는 않는다.

마지막으로, EP 0 603 865의 실시예 7에 제시된 데이타로 파악할 수 있는 한도내에서 최대 전환율은 배지 내 글루코스 양을 기준으로 계산했을 때 단 30%였다.

EP 0 567 644에는 아트로박터 균주를 사용한 발효로 L-알라닌을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법을 수행하는 경우, 이 실시예 5에 제시된 데이타로 파악할 수 있는 한도내에서 최대 전환율은 배지내 글루코스의 양을 기준으로 계산했을 때 30%였다.

그러나, 사용된 아트로박터 균주는 동종발효형이 아니며 식품 등급 박테리아 또는 젖산균에도 속하지 않는다. 또한, EP 0 603 865의 제5면, 1 내지 4행에 따르면, 아트로박터의 사용은 "냄새 형성 물질"에 의한 오염을 초래한다고 개시되어 있다.

J. Oerlgysson 등의 문헌[Anthonie van Leeuwenhoek, 68 no. 4, p. 273-280(1995)]에는 클로스트리디움(Clostridium) 균주를 사용하여 알라닌을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 제시된 데이타로부터 파악할 수 있는 한도내에서, 이 경우, 도달된 최대 전환율은 배지내 글루코스 양을 기준으로 계산했을 때 항상 50% 미만이다. 또한, 클로스트리디움은 동종발효형이나 식품 등급 박테리아 또는 젖산균에 속하지 않는다. 또한, 제279면에는 "클로스트리디움 P2는 피루베이트로부터 알라닌을 거의 생성하지 않으므로 사실상 피루베이트 상에서 증식할 수 없다"고 언급하고 있다.

알라닌 제조에 이. 콜리(E. coli) 균주를 사용하는 방법이 A. Galkin 등의 문헌[Appl. Environ. Microbiology, 1997, p. 4651-4656] 및 JP-A-62936196에 대응하는 일본 특허 초록, vol. 11, no. 222(C-435)에 기재되어 있다. 그러나, 이. 콜리는 이종발효형 유기체(특히, 최소 O₂조건하에서 배양되는 경우)이며 식품 등급 박테리아 또는 젖산균도 아니다.

T. Ferain 등의 문헌[J. of Bacteriology 1996, p. 5431-5437]에는 천연 젖산염 디히드로게나아제를 암호화하는 두개의 유전자가 파괴된 L. 플란타룸(L. plantarum) 균주(LDH)가 기재되어 있다.

그러나, 이와 같은 참고문헌에는 이 유기체 내 탄소/피루베이트 물질대사를 알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것에 대해서는 기재되어 있지 않다. 그러므로, LDH-돌연변이체는 알라닌의 제조에 이용될 수 없다.

본 발명은 탄소원으로부터 알라닌을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양함으로써 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pNZalaD에 대한 챠트이다.

도 2는 SDS-PAGE(10%)에서 전기 영동으로 얻은 겔(샘플 당 10 ig의 총 단백질)을 나타내며, 배지 중 다양한 니신 농도(가로축의 숫자)에서 NZ3900/LDH[pNZalaD] 중 AlaDH의 (과)생성을 예시한다.

도 3A∼3E는 소규모 세포 현탁액 중에서 글루코스 10mM 이 전환되는 경우에, 니신 A 농도(도 3A 및 도 3B), 아세트산암모늄 농도(도 3C), 사용된 암모늄원(도 3D) 및 출발 혼합물 pH(도 3E)의 알라닌 생성에 대한 효과를 나타낸다.

도 4는 pNZ3900(pNZalaD)(도 4A) 및 NZ3900/LDH^-(pNZalaD)(도 4B)의 경우에 글루코스 100mM 및 황산암모늄 100mM(NaOH를 이용하여 pH 7.5로 유지됨)로 보충된 세포 현탁액 중의 시간에 대한 글루코스 소비, 및 알라닌 및 젖산염 생성의 변화량을 나타낸다.

도 5는 글루코스 100 mM 및 황산암모늄 150mM로 보충된 NZ3900/LDH^_(pNZalaD)의 세포 현탁액(pH 7.5)으로부터 17 시간 후 얻어진 최종 생성물의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 6A∼6B는 두개의 별도 실험(도 6A 및 도 6B)에서 형성된 알라닌의 양에 대한 배지 중의 니신 A 농도의 영향을 나타낸다.

도 6C는 도 6A의 실험에서 형성된 D-알라닌 이성체 및 L-알라닌 이성체의 양의 비율을 나타낸다(도 6 C).

도 6D는 배지중의 글루코스, 락토스 및 알라닌의 농도에 대한 배지 중 니신 농도의 영향을 나타낸다.

본 발명의 목적은 알라닌, 특히 L-알라닌의 개선된 생성 방법을 제공하는 것이다.

이러한 유형의 방법은 적당한 미생물에서 당이 그 유도체(예, 젖산염)로 되는 고유 대사의 전환 반응(들)을 알라닌, 특히 L-알라닌의 형성 반응으로 대체함으로써 제공될 수 있음이 밝혀졌다.

그러므로, 본 발명은 배지내 적당한 탄소원으로부터 알라닌을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양함으로써 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 사용된 미생물은 배지로부터 소비된 탄소 중 필수적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되도록 고유의 당 물질대사를 알라닌 형성 반응, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 미생물인 것에 특징이 있다.

본 발명에서는, 식품 등급 박테리아 및/또는 젖산균을 이용하는 것이 바람직하며, 젖산균의 식품 등급 균주를 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나, 이것으로 본 발명을 한정하는 것은 아니다:

- 본 발명의 방법에서 젖산균(예컨대, 바람직하게는 식품 등급 젖산균)을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 배지로부터 소비된 탄소 중 필수적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되고,

- 젖산균에 속하지 않는 식품 등급 미생물을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 배지로부터 소비된 탄소 중 필수적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되며,

- 식품 등급 미생물도 아니고 젖산균도 아닌 미생물을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 배지로부터 소비된 탄소 중 필수적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환된다.

또한, 사용되는 미생물은 거의 동종발효형이 바람직하다.

특히, 본 발명에 따르면, 피루베이트(배지 내 글루코스 또는 당의 또 다른 적당한 당원의 전환반응으로부터 유도됨)의 고유 대사 전환반응(들)은, 형성된 피루베이트 내 탄소를 기준으로 하여 계산했을 때, 형성된 피루베이트 중 필수적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되도록 알라닌 형성 반응으로 전환되는데,

- 본 발명의 방법에서, 젖산균(예컨대, 이용된 식품 등급 젖산균이 바람직함)을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 형성된 피루베이트 중 필수적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되고,

젖산균에 속하지 않는 식품 등급 미생물을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 형성된 피루베이트 중 필수적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되며,

식품 등급 미생물도 아니고 젖산균도 아닌 미생물을 사용하는 경우, 본 발명에 따르면 형성된 피루베이트 중 필수적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환된다.

상기 방법은 공지된 방법과 비교하여 고순도의 알라닌을 고수율로 제공하며, 탄소 이용 효율이 상당히 높다. 이 방법에서는 당원으로서 도입되는 탄소의 80% 이상, 90% 이상이 알라닌으로 전환되고, 또는 심지어 거의 완전한 전환율(＞99%)을 얻을 수 있다.

또한 본 발명은, 바람직한 양태에 있어서, 최종 생성물 중 L-알라닌에 대한 향상된 입체 특이성을 제공하여, 입체 특이성이 95% 이상 또는 심지어 99% 이상일 수 있다.

또한, 특정 양태에 있어서, 본 발명은 발효된 식료품 또는 식품 제제의 제조 시 알라닌의 동일계 제조에 적합한 기법을 제공한다.

사용된 탄소원은 본 명세서에 설명된 바와 같이 고유 대사 반응이 알라닌 형성 반응으로 전환될 수 있는 임의의 대사성 또는 발효성 탄소원일 수 있다. 일반적으로, 탄소원은 미생물이 해당 과정계 반응을 통하여, 피루베이트로 고유하게 전환되는 탄소원일 수 있다. 일반적으로, 탄소원은 글루코스, 락토스(젖산균의 경우, 데 보스 및 시몬스의 문헌[Genetics and Biotechnology of Lactic acid Bacteria, 가슨 및 데 보스 편저, pp.52∼106, 챔프 앤드 홀, 1994] 참조), 수크로스(젖산균의 경우, 라우쉬 및 데 보스의 문헌[1992a, J. Bacteriol., 174, pp.1280∼1287]과 문헌[1992b, Gene, 121, pp.55∼61] 참조), 말토스 또는 전분(젖산균의 경우, 아셀던크 등의 문헌[1993, Mol. Gen. Genet., 240, pp.428∼434] 참조)과 같은 통상의 대사성 및 발효성 당원이 있다. 일반적으로는 글루코스, 락토스 및 수크로스가 바람직하다.

당 대사 반응의 알라닌 형성 반응으로의 전환 정도는, 해당 기술 분야에 통상적으로 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따라 탄소(탄소비)를 기준으로 하여, [형성된 알라닌의 탄소(원자)량]/[소비된 당원 내의 탄소(원자)량] ×100%로서 표시된다.

소비된 당의 양(g 또는 몰)에 대한 형성된 알라닌의 양(g 또는 몰)은 당원 (내의 탄소 원자의 수)에 따라 좌우된다. 따라서, 100% 전환율을 기준으로 할 경우, 글루코스 1 몰은 알라닌 2 몰을 생성하는 반면, 수크로스 또는 락토스 1 몰은 알라닌 4 몰을 생성한다.

미생물에 (증가된) 알라닌 생성 활성을 부여하고, 바람직하게는 동시에 피루베이트의 고유 전환 반응(들)을 분열시키거나 또는 억제함으로써 고유 당 대사 반응을 알라닌 형성 반응으로 전환시킬 수 있다.

이러한 (증가된) 알라닌 생성 활성은, 미생물 내 알라닌 형성 활성을 암호화 하는 하나 이상의 동종 또는 이종 유전자를 발현(증가)시켜 부여할 수 있다.

특히, 이들 유전자는 알라닌, 구체적으로 L-알라닌의 형성을 촉매화하는 자체 공지된 효소, 특히 전술한 바와 같이 배지내 발효가능한 당원 또는 이것의 대사 물질로부터 알라닌을 생성할 수 있는 효소를 암호화하는 (하나 이상)의 구조 유전자이다.

사용된 효소는 피루베이트를 알라닌으로 전환시키므로써 알라닌을 생성시킬 수 있는 것, 특히 알라닌 디히드로게나제가 바람직하다. 이를 암호화하는 구조 유전자는 임의의 적당한 미생물로부터 유도할 수 있지만, 젖산균 또는 바실러스(Bacillus) 속, 특히 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus spaericus)의 박테리아 유래의 알라닌 디히드로게나제인 것이 바람직하다. 특히, 식품 등급 미생물 유래의 알라닌 디히드로게나제를 사용한다. 또한, 미생물에 내인성이고, 필요에 따라 적당한 동종 또는 이종 프로모터의 제어하에 및/또는 유도 전에 상기 목적을 위해 과발현시킨 알라닌 디히드로게나제를 사용할 수도 있다.

식품 등급의 미생물 또는 젖산균에 속하지 않은 미생물 유래의 알라닌 디히드로게나제(유전자)의 예로는 아트로박터 유래의 L-알라닌 디히드로게나제를 들 수 있는데, 이의 클로닝은 EP 0 603 865호에 개시되어 있다.

피루베이트 대사의 고유 전환 반응(들)은, 예를 들면 해당 대사 경로에 관련된 효소에 대한 가역적 또는 비가역적 억제 인자를 배지내 포함시켜 해당 대사 경로를 억제 또는 차단하므로써, 또는 이들 효소의 고유 발현을 분열 및/또는 억제함으로써 억제시킬 수 있다.

그러나, 피루베이트의 고유 전환반응(들)시 미생물이 결핍되도록 하는 방식으로 유전자 조작된 미생물을 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 예컨대 이러한 당업계에 공지된 돌연변이체는 상당히 감소되거나 결핍되는 방식으로 해당 효소를 발현하거나 또는 전혀 발현하지 않기 때문이다.

한 예로서 Platteeuw 등의 문헌[1995, App. Environ. Microbiol., 61, pp. 3967∼3971]에 기재된 엘. 락티스(L. lactis)의 젖산염 디히드로게나제 결핍 균주가 있다. 상기 문헌에서, 이 균주의 피루베이트 대사 반응은 알파 아세토젖산염 합성 효소의 과생성에 의해 디아세틸 생성 반응으로(성장 조건에 따라 대략 80% 정도) 전환된다. 그러나, 이 경우 다른 생성물이 디아세틸 이외에도 추가 형성되므로, 소비된 탄소원 중 소량만이 필요한 생성물(디아세틸)로 전환되는 반면, 전환 반응은 미생물의 산화-환원 반응의 균형을 깨뜨려 상당히 불리해진다.

또한, 사용된 미생물은 임의의 공지된 미생물 또는 이것의 공지된 돌연변이체일 수 있고, 동종발효형 및 이종발효형 미생물도 사용할 수 있다.

동종발효형 미생물이란 필수적으로 당을 피루베이트를 거쳐 단일 대사 생성물로 전환시키는(즉, 탄소비를 기준으로 계산할 때 80% 이상) 미생물을 의미한다. 이러한 미생물의 예로는 L. 락티스 및 S. 크레모리스(S. cremoris)와 같은 젖산균이 있으며, 이들은 피루베이트를 젖산/젖산염으로 거의 완전히 전환시킨다. H.G Schlegel의 문헌[General Microbiology, 5판, 티에메 벨라그 1981, 구체적으로 pp.255∼295] 참조.

기타 예로는 C. 아시디-우리시(C. acidi-urici) 및 C. 실린드로스포럼(C. Cylindrosporum)과 같은 클로스트리디아(Clostridia) 종, 및 C. 포미코아세티컴(C. formicoaceticum) 및 C. 써모아세티컴(C. thermoaceticum)과 같은 동종발효형 아종이 있는데, 이들은 본 발명의 반응식 1에 따라 수소 당량(기질 산화에서 유래함) 및 이산화 탄소로부터 동종발효 방식으로 아세테이트를 형성한다.

8[H-당량] + 2 CO₂→ CH₃COOH + 2 H₂O

그러나, 이들 클로스티리디아(Clostridia) 속균은 일반적으로 식품 등급의 미생물은 아니다.

헤테로 발효성 미생물은 피루베이트를 다수의 주요 전환 생성물로 변형시키는 미생물을 의미한다. 넓은 의미에서, 이들은 상기 정의에 따라 동종발효형 미생물로 분류되지 않는 모든 미생물을 포함한다.

본 발명에 따르면, 일반적으로 동종발효형 미생물을 사용하는 것이 훨씬 더 바람직한 데, 그 이유는 피루베이트로부터 주요 생성물로의 전환 반응을 알라닌으로의 전환 반응으로 대체한 경우 매우 양호한 수율로 알라닌 생성을 유도하기 때문이다. 이를 위해서는, 피루베이트 대사의 유일한 한 고유 경로를 전환, 억제 및/또는 분열시켜야 한다. 그러나, 1종 이상의 피루베이트의 고유 전환 반응(들)이 알라닌 생성 반응으로 바뀌는 경우, 이종발효형 미생물을 사용하는 것도 본 발명에 속한다.

또한, 공지되어 있고 단일 주생성물(유기 분자) 이외에도 CO₂를 생성하는 일부 "세미-동종발효형" 미생물도 있다. 이들 미생물은 엄격하게는 상기 정의(총 탄소를 기준으로 하여 측정하였을 때, 단일 대사 생성물의 80% 이상 형성)에 따라 동종발효형 유기체로 분류할 수 없지만, 이들 미생물은 탄소비를 기준으로 하여 측정했을 때 단일 대사 생성물의 80% 이상을 생성시킬 때마다 본 발명의 순수한 동종발효형 미생물의 등가물로서 간주할 수 있으며, 여기서 CO₂는 무시한다. 이에 대한 또 다른 이유는, 그러한 유기체의 대사를 본 발명에 따라 전환시킬 때 최종 배양 배지는 주요 생성물으로서 거의 알라닌만을 함유하는데, 그 이유는 배지로부터 형성된 CO₂가 주위 공기 중으로 방출되기 때문이다. 그러나, 역시 순수한 동종발효형 유기체를 사용하는 것이 바람직하다.

사용되는 미생물은 L.락티스(L.lactis), L.불가리커스(L.bulgaricus), L.에시도필러스(L.acidophilus), L.헬베티커스(L.helveticus), S.크레모리스 (S.cremoris) 또는 S.써모필러스(S.thermophilus)와 같은 젖산균, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 기질로서 락토스, 수크로스, 글루코스 및/또는 피루베이트를 사용할 수 있는 기타 동종발효형 미생물이 바람직하다. 일부 용도에서는, 식품 등급 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

사용되는 미생물은 이용가능한 기질에 대해 알라닌 생성 효소와 경쟁하는 효소 및/또는 활성(들)이 결핍된 것이 바람직하다. 예를 들어, 알라닌 생성 효소가 L-알라닌 디히드로게나제 유전자인 경우, 사용되는 미생물은 L-알라닌 디히드로게나제의 기질인 피루베이트를 젖산염으로 전환시킬 수 있는 젖산염 디히드로게나제가 결핍되어 있는 것이 바람직하다.

L-알라닌의 입체선택성 생성에 있어서, 사용되는 미생물은 감지할 수 있을 정도의 어떠한 알라닌 라세마제 활성도 포함하지 않는 것이 바람직하다. 이를 위해서, 예컨대 가역적 또는 비가역적 억제 인자들을 배지내 포함하거나, 라세마제 활성의 자연적인 발현을 분열 및/또는 억제하거나, 또는 임의의 고유 라세마제 활성을 상당히 감소시키거나 결핍시키는 방식으로 발현하거나 또는 전혀 발현하지 않는 방식으로 유전자 조작된 미생물을 사용함으로써, 임의의 천연 라세마제 활성을 공지의 방법으로 억제할 수 있다. 또한 그러한 돌연 변이체는 당업자에게 공지되어 있다.

알라닌 형성 활성을 암호화하는 하나 이상의 동종 또는 이종 유전자는 공지된 방식, 예컨대 사용되는 미생물 내에서 활성인 통상의 동종 또는 이종 프로모터의 제어하에, 사용된 미생물 내에서 (과)발현시킬 수 있다.

이 목적을 위하여, 하나 이상의 구조 유전자는, 예컨대 해당 프로모터를 이미 포함하는 플라스미드 또는 기타 적절한 벡터내로 암호 유전자를 우향으로 및 우측 리딩 프레임에 도입함으로써 프로모터와 활성가능하게 결합된다. 이후, 미생물은 생성 재조합 DNA 분자로 통상의 방식으로 형질전환시키는데, 재조합 DNA를 박테리아 게놈에 포함시키거나 세포내의 별도의 플라스미드로서 사용할 수 있다. 이를 위해서, Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Vols 1-3, Cold spring Habor(1989)]에 기재된 바와 같은 공지된 재조합 기술을 사용할 수 있다.

원칙적으로, 사용되는 미생물 내에서 활성인 임의의 적절한 구성성 프로모터 또는 유도성 프로머터를 이 목적으로 사용할 수 있다. 적절한 구성성 프로모터의 예로는 usp45 프로모터(van Asseldonk등, 1990, Gene, 95: 155-160), nisR 프로모터(de Ruyter등, 1997, J.Bacteriol.,178: 3434-3439), pepN 프로모터(Tan 등, 1992, FEBS Lett.,306: 9-16) 및 문헌[de Vos and Simons in "Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria, Gasson and de Vos, eds., pp 52-106, Chapman and Hall, 1994]에서 언급한 프로모터 등이 있다. 적합한 조절형 프로모터의 예로는 O31 중간 프로모터 및 ori-계 발현계(O'Sullivan 등, 1996, Biotechnology, 14: 82-87), xylA 프로모터(Lokman등, 1994, Mol.Gen.Genet., 245: 117-125) 및 억제/작동 O rlt계(Nauta등, 1996, Mol. Microbiol., 19: 1331-1341) 등이 있다.

사용되는 프로모터는 알라닌 생성 활성이 발현을 증가시키는 것이 바람직하고, 과발현을 조절하는 것이 더욱 바람직하다.

프로모터의 매우 적합한 부류종, 예컨대 Kuipers 등의 문헌[TIBTECH, 15: 135-140]에 개시된 자가 유도성 프로모터는 하기에 개시되어 있다.

알라닌 디히드로게나제를 암호화하고, 독자적으로 복제하는 재조합 구조 단위체(플라스미드)를 사용하는 방법의 대안적인 또 다른 중요한 방법은 알라닌 디히드로게나제 유전자를 사용되는 미생물의 염색체 DNA로 삽입하는 것이다. 이 방법은 공지된 방법, 예를 들어 적절한 파아지 벡터, F-인자 플라스미드 또는 트랜스포존(transposon)을 사용함으로써, 또는 적절한 공여체 균주와 접합시킴으로써 수행할 수 있다. 예로서 니신 수크로스 접합성 트랜스포존 Tn5276(Rauch and de Vos, J.Bacteriol., 174: 1280-1287), 트랜스포존 Tn919(Hill 등., 1985, FEMS Microbiol. Lett., 30: 115-119) 및 pGHOST 통합 벡터(Magiun 등, 1992, J.Bacteriol., 174: 5633-5638) 등이 있다.

적절한 동종 또는 이종 프로모터(예, 상기 언급한 프로모터)와 조합된 알라닌 디히드로게나제 유전자의 염색체내 삽입이 가능하지만, 본 발명과 관련된 알라닌 디히드로게나제 유전자는 일반적으로 박테리아 DNA내의 내인성 프로모터의 제어하에 발현된다.

본 발명의 특정 양태에서, 젖산균 내의 젖산염 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 같이, 기질(피루베이트)에 대해 알라닌 디히드로게나제 유전자와 경쟁할 수 있는 천연 효소를 암호화하는 구조 유전자는 염색체 DNA 내에서 알라닌 디히드로게나제 유전자로 치환되며, 필요에 따라 치환된 유전자의 천연 프로모터의 제어하에 둘 수 있다.

본 방법으로 형질전환시킨 미생물은, 고유/천연 미생물과 비교하여 알라닌 생성 활성으로 발현을 증가시킬 수 있고, 동시에 임의의 경쟁성 고유 대사반응, 특히 고유 피루베이트 대사반응이 결핍된 것이 바람직한데, 이 형질전환된 미생물은 본 발명의 일양태를 제공한다.

프로모터의 유도를 유지하는 조건하에서 미생물을 배양하여, 암호 유전자를 발현한 후, 발현된 효소가 배지의 성분 또는 그 대사산물, 특히 글루코스 또는 다른 적합한 발효성 탄소/당원으로부터 알라닌을 생성한다. 또한 배양 배지는 미량 원소 등을 포함하는 적절한 질소원과 같이 배지의 통상적인 구성성분을 모두 포함한다.

알라닌 생성 효소가 L-알라닌 디히드로게나제인 경우, 배양 배지는 대사가능한 탄소원 또는 다른 피루베이트원과 함께 암모늄 이온의 공급원을 포함한다. 암모늄 이온은 소비된 탄소를 기준으로 계산했을 때, 탄소원 대 암모늄 이온의 비율이 1:3 이상으로 배지내 존재하는 것이 바람직하다. 탄소원으로서 글루코스를 이용하는 경우, 예를 들어 글루코스 대 암모늄의 비는 1:2 이상인 반면, 탄소원으로서 수크로스 또는 락토스를 이용하는 경우, 이 비율은 1:4 이상이다.

알라닌 생성 효소의 발현 및 L-알라닌 형성은 각각 프로모터의 유도 인자 및 알라닌 생성 효소의 기질을 첨가하여 별도로 조절할 수 있다. 이 경우, 발현 및 L-알라닌 생성은 하기 상세하게 기재된 바와 같이 동시에 또는 연속적으로 유도하거나 얻을 수 있다.

알라닌 디히드로게나제의 발현량은 충분한 알라닌이 생성된다면, 그 자체가 매우 중요한 것은 아니다. 이는 일반적으로 사용되는 미생물에 좌우된다. 예를 들어 고유 경쟁 경로의 억제/분열 후, 사용되는 미생물내 존재하는 내인성 알라닌 형성 활성이 이미 충분하여 만족할 만한 알라닌을 생성할 수 있다. 동종 또는 이종 알라닌 디히드로게나제 발현을 강화시키는 경우, 이 효소는 세포 단백질의 최대 30∼40% 이상을 구성할 수 있다.

더욱이 L-알라닌의 형성은 통상의 미생물학적 기술과 사용되는 미생물을 배양/처리하는 반응기를 사용하여 공지된 방법으로 수행하거나, 또는 이들과 유사한 방법들로 수행할 수 있다. 예컨대 회분식 또는 연속식 공정을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 적절한 담체상에서, 예를 들어 적절한 세포 반응기 또는 컬럼에서 고정 형태로 미생물을 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명에 있어서 미생물의 손상되지 않은 세포를 사용하는 것이 무세포 추출물과 같은 세포 추출물을 사용하는 것 보다 일반적으로 바람직하다.

이 후, 형성된 알라닌은 발효기 배지에서 분리하고, 가능하다면 종래 방법으로 추가 정제할 수 있다.

본 발명의 공정은 고순도(〉90%, 바람직하게는 〉99%)의 알라닌을 제공하며, 글루코스의 소비 효율도 높다(〉75%). 특히 존재하는 임의의 천연 라세마제 활성이 전술한 바와 같이 억제되는 경우, 이 공정은 고도의 입체 특이성을 제공하는데, L-이성체를 80% 이상, 특히 95% 이상, 심지어 100%(알라닌 총량을 기준으로 계산) 포함하는 최종 생성물(전체 입체특이적 생성물)이 얻어진다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법으로 얻은 알라닌과, 본 발명의 방법에 의해 생성된 알라닌을 함유하는 제제, 특히 식료품 및/또는 건강 증진 제제 뿐 아니라, 첨가제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 알라닌 생성 효소의 대량 생산에 사용할 수도 있다.

마지막으로, 추가의 측면으로, 특히 본 발명에 의한 방법을 젖산균으로 수행한 경우, 본 발명은 알라닌 생성 활성의 발현을 제어하기 위한 매우 간편한 시스템에 관한 것이다.

이러한 측면은 "자가 유도성" 프로모터의 사용을 포함하는 것으로, 이는 임의의 해독후 변형된 발현 생성물을 비롯하여, 프로모터에 의해 자연적으로 제어되는 암호 유전자의 발현 생성물 뿐 아니라, 이러한 발현 생성물의 유사체 및 유도체에 의해 유도될 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

그러므로, 본 발명의 상기 측면은 알라닌 생성 유전자 변형 미생물을 배양하여 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 사용된 미생물은 미생물내 활성이 있는 자가 유도성 프로모터의 제어하에 알라닌 생성 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 것이며, 이러한 프로모터는 항미생물성 펩티드 또는 유사 시그날 단백질을 암호화하는 유전자 클러스터로부터 유도한 것이다.

본 발명의 상기 측면에 의하면, 항미생물성 펩티드를 암호화하는 유전자 클러스터의 발현을 자연적으로 조절하는 자가 유도성 프로모터를 사용한다. 이러한 프로모터는 일반적으로 2 성분 신호 형질 도입 시스템을 통해 항미생물 단백질 자체 뿐 아니라 이의 유사체 및 유도체에 의해 유도될 수 있다.

프로모터의 비제한적인 예로는 카르노박테리움 피스시콜라(Carnobacterium piscicola)의 박테리오신 유전자 클러스터, 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake) 유래의 사카리신 유전자 클러스터와, (추측컨대) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 서브틸린 유전자 클러스터로부터의 프로모터 등이 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 프로모터로는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 박테리오신 유전자 클러스터 유래의 플란타리신 A에 대한 프로모터와 같은 미생물내 일정 감지 과정과 관련된 유사한 비살균성 신호 단백질에 대한 프로모터 등이 있다. 참조 문헌[Kleerebezem et al., Molecular Microbiology (1997) 24 (5), 895-904 및 인용된 참조 문헌].

사용된 프로모터는 본 출원인의 유럽 특허 출원 제0,712,935호(nis A) 및 참조 문헌[De Ruyter et al., Appl. Environ. Microbiol. 62: 3662-3667 (1996); Kuiper et al., Tibtech, 1997년 4월 (Vol. 15): 135-140 및 이에 인용된 참조 문헌](nisA 및 nisF)에 기재된 바와 같이 L. 락티스(L. lactis), 특히 nisA 및 nisF 프로모터의 니신 유전자 클러스터 유래의 자가 유도성 프로모터인 것이 바람직하다. 이러한 프로모터는 젖산균내 동종 단백질 및 이종 단백질의 제어형 (과)발현용(예, E. coli 유래의 gus A 리포터 유전자 pepN 및 용해성 유전자 lytH 및 lytA) 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)와 같은 이종 숙주내의 니신 유도성 발현용으로 이미 사용되어 왔다. 본 발명에 의하면, 이러한 자가 유도성 프로모터 시스템은 알라닌 생성 활성, 즉 알라닌 생성 효소의 제어형 (과)발현에 사용하는 것이 유용하다.

알라닌 디히드로게나제를 암호화하는 유전자는 이러한 프로모터와 조합되어 활성을 나타내는 전술한 방식으로 니신 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 예를 들면, 암호화 유전자는 특히 EP-A-0,712,935호 및 De Ruyter 등의 논문에 기재된 방법과 유사하게, 정확한 리딩 프레임내에, 자가 유도성 프로모터를 이미 함유하는 플라스미드 또는 벡터내로 도입할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 추가의 측면으로는 알라닌 생성 효소, 특히 자가 유도성 프로모터, 보다 상세하게는 전술한 니신 유전자 클러스터 유래의 프로모터의 제어하에 있는 L-알라닌 디히드로게나제와 같은 알라닌 생성 효소를 암호화하는 1 종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 서열에 관한 것이다.

재조합 DNA 분자는 플라스미드와 같은 벡터의 형태인 것이 바람직한데, 이는 선택가능한 마커 및 기타 공지된 벡터 성분을 동시에 함유할 수 있다. 사용된 바람직한 플라스미드는 이하에 보다 상세하게 기재할 것이다.

예를 들면 전술한 EP-A-0,712,935 및 De Ruyter 등의 논문에 기재된 주지의 방법으로 본 발명에 의한 벡터를 사용하여 미생물을 형질전환시킬 수 있다.

자가 유도성 프로모터에 대한 1 이상의 유도 인자를 유도 농도로 함유하는 배지내에서 배양시킴으로써, 본 발명의 추가의 측면이 되는 전술한 방식으로 형질전환된 미생물을 L-알라닌의 생성에 사용할 수 있다. 이로써, 알라닌 생성 활성을 발현시킬 수 있으며, 따라서 배지내에 포함될 수 있는 적절한 기재로부터 L-알라닌을 형성하는데 사용할 수 있다.

적절한 유도 인자로는 사용된 프로모터가 자연적으로 조절하는 유전자(들)의 발현 생성물 뿐 아니라, 이의 유사체 및 유도체가 있음이 명백하다(그러나 필수적은 아님). 이들은 일반적으로 예컨대 nis 프로모터-니신 A, 니신 Z 및 이의 유사체/유도체와 같은 항미생물 단백질 또는 유사 "펩티드 페로몬" 뿐 아니라, 돌연변이체, 변형체 및/또는 이의 단편이 있다.

또한, 전술한 EP-A-0,712,935 및 De Ruyter 등의 논문에 기재된 바와 같이 또는 이와 유사한 방법으로 유도할 수 있다. 이는 천연 미생물과 비교하여 소정의 L-알라닌 생성 활성의 발현 또는 과발현을 증가시키는 것이 바람직하다.

자가 유도성 프로모터를 사용하는 경우, 사용된 미생물의 세포는 신호 형질도입 시스템(을 위한 유전자)을 포함하는 것이 바람직하며, 이 시스템은 세포의 외부에 존재하는 유도 인자에 대해 반응하는 프로모터를 유도한다. 이러한 시스템은 종종 니신 유전자 클러스터 유래의 주지의 nisK 및 nisR 유전자/단백질에서와 같은 2 성분(즉, 센서 단백질 및 반응 조절자)으로 구성된다. 이러한 시그날 형질도입 시스템은 사용된 미생물내 자연적으로 존재할 수 있거나 또는 이종 유전자의 적절한 발현에 의해 미생물에 부여될 수도 있다. 사용된 바람직한 시그날 도입 시스템은 사용된 프로모터의 제어에 고유적으로 관련된 것이다. 전술한 Kleerebezem 등의 논문 및 이에 인용된 참고 문헌을 참고한다.

본 발명에 따른 자가 유도성 프로모터 시스템을 사용하면 EP-A-0,712,935에 기술된 바와 같이, 이 시스템의 모든 주지된 이점을 제공한다. 예를 들어, 발효중의 임의의 원하는 순간에 알라닌 생성 활성의 발현을 유도할 수 있고, 이러한 발현은 배지중의 유도 인자의 농도에 따라 거의 직선 관계로 변화한다(양성 유도).

또한, 사용된 바람직한 유도 인자들(니신 A, 니신 Z 및 그들의 유사체/유도체)은 젖산균이 낙농 제품의 발효시 천연적으로 형성하기 때문에 식료품에 사용할 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 바람직하게 발효된 식료품을 제조하기 위하여, 예를 들어 낙농 제품, 특히 치즈, 또는 요구르트와 같은 발효형 낙농 제품중의 감미료로서 알라닌의 제어형 동일계 제조를 위하여 그대로 유리하게 사용할 수 있다. 알라닌 생성이 영양물(배지)의 실질적인 변화없이 유도될 수 있다는 추가의 이점이 있다.

이 경우에 있어서, 미생물은 통상의 산성화 미생물과 배합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물은 또한 통상의 산성화제로부터 유도할 수 있다.

이제, 본 발명을 하기의 비제한적 실시예 및 도면과 관련하여 설명할 것이다.

실험 부분

젖산균은 발효에 의한 식품 제조시 이용되는 각종 공정과 관련이 있다. 예를 들어, L. 락티스(L. lactis)는 고다(Gouda) 치즈 또는 버터밀크와 같은 낙농 제품의 제조에 직접 사용된다. L. 락티스는 호모형 젖산 발효를 일으키는데, 여기에서 젖산염은 글루코스로부터의 주요 최종 생성물로서 형성된다.

본 발명에 따라, (피루베이트에서 젖산염으로의) 고유의 대사 경로가 피루베이트에서 알라닌 형성 반응으로 전환되는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위하여, L-알라닌 디히드로게나제 유전자는 (바람직하게) 야생형 젖산균 또는 락타아제 히드로게나제가 결핍된 그의 변종 중에서 발현된다.

피루베이트의 알라닌으로의 효소적 전환 반응은 하기 반응 도식에 따라 진행된다:

피루베이트 + NH₄ ⁺+ NADH ‥‥‥→L-알라닌 + H₂O + NAD⁺.

젖산염 디히드로게나제가 결핍된 L. 락티스 균주를 사용하면, 후술한 바와 같은 적절한 pH 조절을 통하여 글루코스로부터 주로, 바람직하게는 거의 배타적으로 알라닌이 생성될 것이다. pH 조절을 하지 않는 경우, 아세토인 및 알라닌의 혼합물이 형성될 것이다. 양자의 경우에 있어서, 고유 글루코스 대사는 50 내지 60% 정도로 전환될 것이다. L. 락티스 야생 균주를 사용할 때, 젖산염 및 알라닌의 혼합물이 글루코스로부터 얻어질 것이고, 대사는 30 내지 40% 정도로 전환될 것이다.

이들 미생물에 의한 알라닌의 제조는 연속 공정 또는 회분식 공정으로 수행할 수 있다. 회분식 공정에 있어서, 적당한 완충액 중의 L. 락티스의 세포 현탁액을 사용하면 글루코스를 거의 완전하게 알라닌으로 전환(18 g/ℓ)(호모형 알라닌 발효)시켜 약 99.5% 순도의 알라닌을 얻을 수 있다.

실시예 I:

L. 락티스의 야생 균주 및 LDH-결핍 균주 중 바실러스 스파에리커스(Bacillus sphaericus: alaD) 유래의 L-알라닌 디히드로게나제 유전자의 과발현.

De Ruyter 등에 의하여 기술된 니신 유도성 과발현 시스템을 alaD 유전자의 발현을 위하여 사용하였다.

이러한 목적을 위하여, 플라스미드 pNZ8020 중 alaD 유전자를 nisA 프로모터와 활성가능하게 조합하여 플라스미드 pNZalaD를 얻었다(도 1). 이 플라스미드를 NZ3900 균주(이는 필수적으로, pepN 위치로 삽입되는 조절 요소 nisRK를 함유함)로 옮겼다. 두개의 플라스미드 pNZ8020 및 NZ3900 균주는 de Ruyter 등의 문헌에 기술되어 있다.

동시에, 동원 LDH-결핍 균주는 플라스미드 pNZ2007를 단순 교차시켜 작제하였다[Platteeuw 등, Appl. Environ. Microbiol 61: 3967∼3971(1995)에 기술됨]. 그 후, 이 LDH-결핍 균주는 플라스미드 pNZalaD의 도움으로 형질전환시켰다. 두개의 동원 균주는 알라닌 디히드로게나제를 과발현하였으며, 배지중 알라닌 디히드로게나제 생성물과 니신의 농도 사이의 선형 용량/반응 관계를 얻었다. 생성된 총 단백질의 약 40%에 상응하는 LDH의 최대 과발현은 배지 1㎖ 당 니신 A 0.75 ng의 농도에서 얻어졌다.

실시예 II:

LDH-양성 NZ3900[pNZalaD] 균주 중의 알라닌 생성.

2 단계 과정을 글루코스 발효의 최종 생성물 연구를 위하여 개발하였다.

첫 번째 단계에서, 니신 A를 사용한 유도에 의하여 L-알라닌 디히드로게나제로 세포를 충전시켰다. 두 번째 단계에서, 세포를 수거하고, 농축(A₆₀₀값 10으로)시킨 후, 글루코스(100 mM) 및 암모늄 이온원(100 mM)으로 보충된 포스페이트 완충액 (100 mM, pH 7.0)중에서 재현탁시켰다. 이 현탁액을 pH 조절없이 30℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 글루코스로부터의 최종 생성물의 형성을 HPLC 분석을 사용하여 모니터하였다.

이 방법에서 니신 A 농도, 암모늄 농도, 사용된 암모늄원 및 사용된 pH의 영향을 조사하였다. 결과는 알라닌 생성이 알라닌 디히드로게나제로 세포를 충전시키는 동안에 도입된 니신 A의 양에 직접 관계되었음을 나타내었다(도 3A). 최대 유도시, 글루코스로부터의 최종 생성물은 고유 글루코스 대사의 30%가 전환된 젖산염 및 알라닌의 혼합물이다(표 1).

일정한 니신 농도에서, 생성된 알라닌의 양은 세포 외부의 암모늄 농도(도 3C 참조; 0 내지 200mM의 아세트산암모늄으로부터 진행)와 관계된다. 또한, 사용된 암모늄원(아세트산암모늄, 황산암모늄 또는 염화암모늄은 최종 알라닌 농도에 큰 영향을 끼쳤다(도 3D 참조). 따라서, 아세트산암모늄이 바람직하게 사용된다.

마지막으로, 알라닌 생성은 매질의 pH, 특히 초기 혼합물의 pH (도 3E 참조; pH 5 내지 8 범위)에 의하여 영향을 받는다. 최대 생성물은 8의 초기 pH(약 8.5의 내부 pH에 상응함)를 사용하여 얻는다. 상기 pH는 사용된 효소를 위한 최적의 pH 범위(8.5 내지 9)에 있다.

pH를 7.5로 조정하고, NaOH를 첨가하여 일정하게 유지시켜 상기 과정을 반복하였다. 초기 글루코스 및 황산암모늄 농도를 100mM로 조정하였다. 도 4A는 가장 중요한 출발 물질 및 생성물(글루코스, 알라닌 및 젖산염)의 시간에 대한 생성량을 나타낸다. pNZ3900[pNZalaD]를 사용한 발효는 11 시간 후 종결되었고, 젖산염(88.6mM), 알라닌(60mM) 및 아세트산염(8mM)을 얻었으며, 고유 대사의 알라닌으로의 전환 정도는 36%였다.

실시예 III

LDH-결핍 균주 NZ3900/LDH^_[pNZalaD]에서 알라닌 생성

실시예 II의 2 단계 과정은 LDH-결핍 균주에서 알라닌 생성을 연구하는데 사용하였다.

LDH-양성 균주에 대한 니신 A 농도, 암모늄 농도, 사용된 암모늄원 및 출발 혼합물의 pH의 효과를 실시예II에 설명된 바와 거의 유사하게 조사하였다.

알라닌 생성은 알라닌 디히드로게나아제로 세포를 충전하는 동안 배지 중의 니신 A의 양과 직접 관련이 있다(도 3B). 최대로 유도된 경우, 글루코스로부터 획득된 최종 생성물은 주로 아세토인과 알라닌의 혼합물로서, 대사의 50% 전환에 해당한다.

일정한 니신 농도에서, 생성된 알라닌의 양은 또한 세포외 암모늄 농도와 관련이 있으나(아세트산암모늄의 0 내지 200mM 범위, 도 3C), 알라닌 생성을 위한 LDH-양성 균주의 경우에서보다 낮은 암모늄 이온 농도가 요구된다. 또한, 사용된 암모늄원(아세트산암모늄, 황산암모늄 또는 염화암모늄) 및 출발 혼합물의 pH는 야생 균주의 경우보다 최종 알라닌 농도에 미치는 영향이 덜하다(도 3D 및 3E). 또한 알라닌 생성은 출발 혼합물에 대해 pH8에서 최고치에 달한다.

pH 조절은 본원에서 설명된 미생물에 의한 알라닌 생성에 매우 중요한 것 같다. 실시예 II에 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여, pH를 7.5로 유지하였다. 초기 글루코스와 황산암모늄 농도는 모두 100mM로 유지하였다. 도 4B는 시간에 따른 주요 출발 물질 및 생성물(글루코스, 알라닌 및 젖산염)의 변화를 보여준다. NZ3900/LDH^-[pNZalaD]를 이용한 발효는 17시간 후에 종결되고, 주로 알라닌을 생성하는데, 이는 대사의 80% 전환에 해당한다. 100mM 황산암모늄이 제한 인자일 수 있기 때문에, 더 높은 황산암모늄 농도에서 추가로 발효시켰다. 예를 들면, 글루코스 100mM이 알라닌 200mM로 완전히 전환하는데 200mM 암모늄 이온이 필요하다.

따라서 150mM 황산암모늄(300mM 암모늄 이온에 상응)으로 발효시키면, 글루코스(100mM)에서 알라닌(200mM, 18g/l)으로의 전환이 거의 100% 얻어진다. 17 시간의 발효 후에 취한 샘플을¹³C-NMR로 분석하여(도5), 알라닌이 유일한 생성물임을 확인하였으며, 이의 순도는 거의 99.5%였다.

(LDH-)NZ9300 균주, pNZalaD를 1998년 1월 16일자로 Baarn의 CBS(Centraal Bureau voor de Schimmelcultures)에 기탁하였다.

실시예 IV

균주 NZ3900/ALR^-[pNZalaD] 및 NZ3900/LDH^-/ALR^-[pNZalaD]의 L-알라닌 이성체의 생성

알라닌의 L-이성체는 실용적 목적으로 매우 주목받고 있다. 그러나, L.락티스는 알라닌 라세마제 활성을 갖는다. 각 이성체에 특이적인 효소 분석의 도움으로 실시예 II 및 III에서 얻은 샘플의 경우에 최종 생성물에서 L- 및 D- 이성체 모두의 생성을 관찰하였다. D-이성체가 최종 생성물의 약 10∼15%인 2개 이성체의 혼합물을 얻는다. 이 라세미화는, 알라닌 생성 과정에서 알라닌 라세마제 활성의 특정 저해제, 예를 들면 D-클로로알라닌의 존재가 얻어진 D-이성체의 양을 상당히 감소시키기(3% 이하) 때문에 효소적 전환의 결과이다. 이 라세미화를 방지하기 위해, 알라닌 라세마제 유전자(alr)를 동종 재조합에 의해 분열시켰다. 이러한 목적을 위해, "자살 분열 벡터(suicide disruption vector)"는 다음과 같이 제조하였다. alr 유전자의 내부 단편에 대응하는 약 660 염기쌍인 PCR 단편을 다음과 같은 2개의 프라이머를 사용하여 얻었다;

프라이머 1: 5'-CGAGGATCCGGCCGGTTGAGGTTTCTAAAGCGG-3'

프라이머 2: 5'-CGCGAGCTCACTTGTTTCATAAGTTGCACCGTAACC-3'

또한, 이 프라이머는 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 제시되어 있다. 이 PCR 단편은 BamH1 및 SstI으로 절단하여, 자살 플라스미드 pJDC9의 해당 제한 위치에 삽입하였다(Chen and Morrison, Gene, 64:155-165(1988)). 알라닌 라세마제-음성 균주, NZ3900[pNZalaD] 및 NZ3900/LDH^-[pNZalaD]를 얻어, L-알라닌만을 생성하는지에 대해 실시예 II 및 III의 방법과 거의 동일하게 조사하였다. 실시예 II 및 III에 사용된 효소적 분석에 따르면 양 결핍 균주는 실질적으로 알라닌의 L-이성체만을 생산하였다.

실시예V

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NC8 유래의 알라닌의 생성

니신-유도가능한 시스템을 다음과 같이 L. 플란타룸 NC8(플라스미드 없는 균주)내로 이동시켰다[Aukrust, T. 등 (1992) Food Res.Int. 25:253-261]. 파지 MV4(pMCl 유도체)의 통합 시스템을 사용하여 위치-특이적 재조합에 의해 tRNA_ser위치에서 염색체에 필요한 조절 유전자 nisRK를 통합시켰다[Dupont, L. 등 J.Bacteriol. 177: 586-595]. 재조합 균주를 추가로 플라스미드 pNZalaD로 형질전환시켰다.

락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)용으로 개량된 유사한 2-단계 방법은 알라닌 생성을 평가하기 위해 사용되었다. 다양한 니신 A 농도(0, 5, 10, 25, 50 ng ml^-1)를 사용하여 세포에 디히드로게나아제를 미리 적재하고, A_600nm=10으로 농축하였다. 글루코스(50 mM) 및 황산암모늄(100 mM)을 보충한 KNaPO₄완충액(100mM, pH 7.5)을 사용하여 소규모 세포 현탁액(4 ml)을 만들었다. 현탁액을 pH 조절없이 90분간 항온처리하였다.

알라닌의 생성은, 알라닌 디히드로게나아제를 세포에 미리 적재하는 동안 첨가된 니신 A의 양과 직접 관련된다(도 6A 및 6B). 최대로 유도된 경우(50ng 니신A ml^-1), 글루코스로부터의 최종 생성물은 25%(도 6A)내지 33%(도 6B)가 전환된 알라닌과 젖산염의 혼합물이다(표 2). 이러한 전환 결과는 pNZalaD를 보유한 L.락티스(Nz3900)의 LDH-양성 균주에 대하여 획득된 데이터와 유사하다.

알라닌의 두 종류의 이성체는 효소 분석에 의해 정량되고, 이 경우에 D-알라닌 이성체는 총 알라닌의 40%에 이른다(도 6C)(표2).

(NH4 +)2SO4(100mM)로 보충된 KNaPO4완충액(100mM, pH7.5) + 50ng ml-1니신A에서의 엘.플란타룸 NC8(nisRK)[pNZalaD]의 세포 현탁액을 이용한 글루코스(10mM)로부터의 생성물 형성(mM)
균주	글루코스	L-알라닌	D-알라닌	L+D-알라닌	L-젖산염	D-젖산염	L+D-젖산염
NC8(nisRK)[pNZalaD]6A	10	3.1	2.3	5.4	7.5	8.2	15.7
NC8(nisRK)[pNZalaD]6B	20	4.2	2.6	6.8	7.2	6.5	13.7

실시예 VI

락토바실러스 플란타룸에서의 알라닌 생성

전술한 것과 유사한 방식으로 nisRK 유전자를 ldhD 및 ldhL 결핍 락토바실러스 플란타룸 균주 TF103(Ferain T., 등, (1996), J. Bacteriol. 178:5431-5437))의 tRNA_ser부위내로 삽입하였다. 산출된 균주는 pNZalaD 플라스미드로 형질전환 되었다.

LDH-양성 락토바실러스 플란타룸 균주에 대해 기재되었던 것과 동일한 절차를 사용하여 알라닌 생성에 관한 실험을 수행하였다. 실험 2단계에서의 알라닌의 생성은 제1 단계 또는 사전 적재 단계시 첨가된 니신 A의 양과 직결되어 있었다. 최대 유도시, 글루코스에서 얻은 최종 산물은 이 균주에 존재하는 알라닌이 주로 차지하였는 데, 그 양은 탄소 흐름의 80% 전환에 달했다.

알라닌의 두가지 이성체를 규명한 결과, D-알라닌 이성체는 전체 알라닌의 약 40%에 달했다. D-알라닌 경우, 입체특이성 알라닌 생성은 이 균주에서 락토바실러스 플란타룸의 알라닌 라세마제 암호화 유전자가 불활성화 되었기 때문에 일어 날 수 있는 것으로 추정된다. 이것은 성장 배지가 D-알라닌으로 보충되었을 경우 LDH-양성 균주 NC8에서 가능할 것으로 보였던 것이다[Hols, P등(1997), J. Bacteriol. 179;3804-3807).

실시예 VII

고정화 세포에서 L-알라닌의 생성

락토바실러스 락티스 NZ3900/LDH⁺[pNZalaD](실시예 II)를 최대 유도 조건하에서 배양하였다. 이렇게하여 얻은 "적재형 세포"는(이 세포는 비교적 다량의 알라닌 탈수소화제를 함유하고 있다) Ca-알기네이트 또는 κ-카라긴중에서 고정화시켰다. 고정화에 의해 미생물과 발효액간의 확실한 분리가 행해졌다. 이는 생물학적 반응기의 개념의 분석을 실제적인 조건하에서 가능하게 하였다. 고정화된 세포를 생물학적 반응기 완충액(100mM 인산염 완충액, pH 7.5)에 넣어 항온 배양하였다. 이 반응기는 또한 100mM 글루코스와 150mM 황산암모늄을 함유하였다. 처음 24 시간동안 반응기의 유체를 분석한 결과 주 생성물로서 〈95% 이상이 알라닌으로 나타났다. κ-카라긴에 고정된 세포는 이들 조건하에서 좀 더 안정한 것으로 밝혀졌는 데, 이는 알기네이트에서의 고정화가 좀 더 불안정함으로 인한 결과 비교적 높은 pH가 나타났기 때문이다. 처음 24시간동안 글루코스 소비량과 이과 관련한 알라닌 생성이 안정했으며, 이는 "유리 세포"에서 발견된 대응하는 전환량과 거의 다르지 않았음을 보여주었다. 글루코스 소비량은 시간당 약 20mM 로 계산되었다.

실시예 VIII

알라닌의 동일계 생성

구조 유전자가 니신 프로모터(nis A 또는 nis F)의 제어하에 있도록 바실러스 서브틸리스 alaD 유전자를 lacF 니신 프로모터 플라스미드에 삽입하였다.

이 플라스미드를 2 단계의 동종 재조합 과정에 의해 nisRK 신호 형질도입 시스템을 함유하는 L. 락티스의 식품 등급 LDH 결손 균주를 형질전환하는 데 사용한다. 이는 식품 등급의 L. 락티스 균주(LDH⁺또는 LDH^-)를 제공하며, 사용 결과 자가 유도성 nis 프로포터의 제어하에 B. 서브틸러스 alaD 유전자를 발현시킨다.

대안적으로, L. 락티스 균주의 염색체 DNA상의 젖산염 탈수소화효소를 암호하는 고유 부위를, 예컨대 공지된 유전자 치환 기술 및 lacF 변이주 중의 lacF 선택 마커를 사용하여 B. 서브틸러스 alaD를 암호화하는 서열로 치환하는데, 이것은 식품 등급의 B. 서브틸러스 alaD를 형질발현하는 L. 락티스 균주 생성을 또한 가능하게 한다.

시험관내에서 특성을 규명한 후, 생성된 알라닌 생성 L. 락티스 균주를 사용하여 버터밀크 같은 발효성 낙농 생성물을 제조한다. 알라닌-생성 균주는 일반적으로 본 명세서에서는 보조 스타터로서 사용된다. 물론 이 균주는 낙농 제품을 발효시키는 데 종 배양물에 존재하는 통상의 산성화제로서도 사용된다.

본 발명에 따라 알라닌-생성 균주가 보조 스타터로서 사용될 때, 일반적으로 사용된 균주의 탄소 대사는 주로 알라닌 형성 반응으로 그 방향이 전환되어 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상 알라닌을 형성하며, 이외에 나머지 주성분으로 젖산/젖산염을 산출한다.

본 발명에 따른 알라닌 생성 균주를 주요 스타터로서 사용하는 경우. 이 균주는 알라닌 외에도 상당량의 젖산/젖산염을 생성한다. 주 스타터로서 사용되는 이러한 젖산균중에서, 탄소 대사를 알라닌 생성 반응으로 그 방향을 전환하여 30% 정도의 소량, 심지어는 20% 알라닌을 형성하고, 나머지 성분으로 젖산/젖산염을 산출할 수도 있다.

공지된 방법으로 이후에 실시되는 발효 공정시, 니신을 배지에 억제량 이하로 첨가하여 알라닌 생성을 유도한다.

그 결과 다량의 알라닌 성분을 갖는 버터밀크가 생성되는 데 이는 종래의 것보다 감미도가 더 높다.

알라닌-생성 L. 락티스 균주를 고다 치즈 모델 시스템(CH-EASY 모델)에서 사용/연구하였다. 이때 발효된 생성물 중에 형성된 알라닌의 양과 치즈의 맛 및 기타 다른 특성은 발효 조건 및 배지중의 니신 농도같은 인자의 함수에 의해 결정되었다.

Claims (31)

1. 사용된 미생물이 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상을 알라닌으로 전환시키는 방식으로 고유 당 대사 반응을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 배지내 적절한 당원으로부터 알라닌을 생성할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 배양하여 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 사용된 미생물은 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 고유 당 대사 반응을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 젖산균인 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
3. 제1항에 있어서, 사용된 미생물은 젖산균에 속하지 않는 식품 등급 미생물이고, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 고유 당 대사반응을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
4. 제1항에 있어서, 사용된 미생물은 젖산균에도 식품 등급 미생물에도 속하지 않는 미생물이며, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상의 고유 당 대사 반응을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
5. 제1항에 있어서, 탄소를 기준으로 형성된 피루베이트의 실질적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이 알라닌으로 전환되는 방식으로 미생물내 피루베이트의 천연 대사 전환반응(들)을 알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 사용된 미생물이 젖산균이고, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 피루베이트의 천연 대사 전환반응(들)을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
7. 제5항에 있어서, 사용된 미생물은 젖산균에 속하지 않는 식품 등급 미생물이고, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 피루베이트 고유 대사 전환반응(들)을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
8. 제5항에 있어서, 사용된 미생물은 젖산균에도 식품 등급 미생물에도 속하지 않는 미생물이며, 배지로부터 소비된 탄소의 실질적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상의 고유 대사 전환반응(들)을 알라닌, 특히 L-알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물에 (강화된) 알라닌 생성 활성을 부여하고, 바람직하게는 동시에 피루베이트의 고유 전환반응(들)을 분열 또는 억제하여 고유 당 또는 피루베이트 대사 반응을 알라닌 형성 반응으로 전환시키는 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물은 피루베이트의 고유 전환반응(들)이 유전적으로 결핍되어 있고, 알라닌 형성 효소를 암호화하는 1종 이상의 동종 또는 이종 유전자가 (강화) 발현되는 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물이 동종발효형 미생물인 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
12. 제2항 또는 제6항에 있어서, 미생물은 식품 등급 젖산균, 더욱 구체적으로는 식품 등급의 L.락티스(L. lactis) 균주인 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알라닌 형성 효소가 알라닌 디히드로게나제, 바람직하게는 젖산균 또는 바실러스 속균, 특히 바실러스 스파에리커스(Bacillus sphaericus) 유래의 알라닌 디히드로게나제인 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물내에 존재하는 천연 알라닌 라세마제 활성이 억제되는 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
15. 천연 미생물과 비교하여 알라닌 생성 활성을 증가 발현시킬 수 있고, 임의의 경쟁성 고유 대사 반응이 유전적으로 결핍된, 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 미생물.
16. 제15항에 있어서, L-알라닌 디히드로게나제를 증가 발현시키고 젖산염 디히드로게나제 효소내 고유 피루베이트 대사 반응이 결핍된 것이 특징인 미생물.
17. 사용된 미생물이 미생물내에서 활성인 자가 유도성 프로모터의 제어하에 알라닌 생성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하고, 이 프로모터는 항미생물성 펩티드 또는 유사한 신호 단백질을 암호화하는 유전자 클러스터로부터 유래되는 것이 특징인, 알라닌 생성 유전자 변형된 미생물을 배양하여 알라닌, 특히 L-알라닌을 제조하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 프로모터는 L. 락티스의 니신 유전자 클러스터에서 유래한 프로모터, 특히 nisA 또는 nisF 프로모터인 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 미생물이 동종발효형 미생물, 특히 젖산균, 더욱 구체적으로 L.락티스(균주)인 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 식료품의 제조시 그 위치에 알라닌을 생성하는 것이 특징인 알라닌, 특히 L-알라닌 제조 방법.
21. 자가 유도성 프로모터와 활성적으로 결합된 알라닌 생성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하고, 프로모터가 항미생물성 펩티드 또는 유사한 신호 단백질을 암호화하는 유전자 클러스터로부터 유래된 것이 특징인 재조합 DNA 분자 또는 서열.
22. 제21항에 있어서, 플라스미드와 같은 벡터인 것이 특징인 재조합 DNA 분자 또는 서열.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 자가 유도성 프로모터가 L.락티스내 니신 유전자 클러스터 유래의 프로모터, 구체적으로 nisA 또는 nisF 프로모터인 것이 특징인 재조합 DNA 분자 또는 서열.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알라닌 생성 효소를 암호화하는 유전자가 L-알라닌 디히드로게나제를 암호화하는 유전자인 것이 특징인 재조합 DNA 분자 또는 서열.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 재조합 DNA 분자 또는 서열을 포함하는 미생물, 특히 젖산균 또는 기타 동종발효형 미생물.
26. 제25항에 있어서, 식품 등급 미생물인 것이 특징인 미생물, 특히 젖산균 또는 기타 동종발효형 미생물.
27. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 제25항 또는 제26항에 기재된 미생물의 용도.
28. 제15항, 제16항, 제25항 및/또는 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 1종 이상의 미생물과 계획된 발효용 산성화제로서 공지된 임의의 추가 미생물을 포함하는 발효 제품, 특히 발효 식료품 제조용 종배양물(starter culture).
29. 제28항에 있어서, 제15항, 제16항, 제25항 및/또는 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 미생물이 기존의 산성화제와 함께 보조 스타터(stater)로서 존재하는 것이 특징인 발효 제품, 특히 발효 식료품 제조용 종배양물.
30. 알라닌, 특히 L-알라닌 및/또는 알라닌 함유 식료품, 건강 촉진 제제 및/또는 그 첨가제 제조에 사용하는 제15항, 제16항, 제25항 및/또는 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 미생물, 및/또는 제27항 또는 제28항에 기재된 종배양물의 용도.
31. 알라닌을 함유하는 제제, 특히 식료품, 건강 촉진 제제 및/또는 그 첨가제와 함께 제1항 내지 제14항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법, 또는 제30항에 기재된 용도로 얻은 알라닌.