KR900003742B1

KR900003742B1 - 5'-이노신산(5'-Inosinic Acid)을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR900003742B1
Application number: KR1019880006749A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 이윤기; 정성오; 정연수
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1988-06-04
Filing date: 1988-06-04
Publication date: 1990-05-30
Also published as: KR900000472A

Abstract

내용 없음.

Description

5'-이노신산(5'-Inosinic Acid)을 생산하는 미생물

본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 미생물 차체에 관한 것으로 좀더 구체적으로는 브레비박테리움 암모니아 게네스(ATCC 6872)의 변이주로 아데닌(Adenine)요구성이며 우레아(Urea)를 자화할 수 있는 효소인 우레아제(Urease)가 결손된 변이주에 관한 것이다.

종래의 5'-이노신산 생산 균주는 아데닌과 구아닌(Guanine) 또는 크산틴을 동시에 요구하거나, 아데닌 노출형균주(Leaky Mutant) 또는 아데닌 누출형 구아닌 요구성 균주 Agr, Biol, Chem., Vol 47(5), P1035-1041, 1983., (KY13120, KY13171, KY13184등)로서 본 발명의 변이주는 이와는 전혀다른 아덱 요구성 및 구아닌 누출형 균주로 우레아제가 결손된 특수한 미생물이며 값싼 당질원료를 사용, 질소원 제한영양 배지에서 호기적으로 배양하여 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 신규한 미생물에 관한 것으로 1988.5.26. 사단법인 합국종균협회에 기탁하였다(KFCC-106l4).

또한 본 발명의 변이주는 5'-이노신산에서 아데닐로 썩시네이트(Adenylo succinate)를 거쳐 5'-아데노신산(5'-Adenosincacid)으로 가는 합성경로가 결손되어 5'-아데노신산에 의해서 5'-이노신산 생합성 경로의 주요한 호소인 5'-포스포리보실-1-피로포스페이트 아미도트란스페라제(5'-phosphoribosyl-l-phyrophosphate amido tansferase)가 역제어(feedback 제어)조절을 받지않아 다량의 5'-이노신산을 생성하도록 아데닌 영양요구성으로 변이된 것임은 물론, 종래의 균주가 갖지 않은 질소원대사 경로를 변이시킨 우레아(Urea) 분해 효소인 우레아제(Urease)가 결손된 변이주이다.

본 발명의 변이주를 이용하여 종래 사용해온 원료에 의한 발효 실험을 행한 결과, 종래의 균주보다 발효배지내에 축적하는 5'-이노신산의 수율 및 농도가 월등히 높은 것으로 확인 되었다.

본 발명 변이주의 분리 방법을 설명하면, 브레비 박테리움 암모니아 게네스(ATCC 6872)를 친주로하여 자외선조사 또는 화학변이 유기제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 디에틸설페이트 등을 처리하고 최소배지(주1)에서는 생육하지 않으나 아테닌 첨가 최소배지(주2)에서는 생육하고 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(주3)에서 생육이 촉진되는 아데닌 요구, 구아닌누출형 변이주를 분리하였다. 이때 변이주 획득율을 높이기 위해서 페니실린 농축법을 사용하였다.

상술한 방법에 따라 선별한 아데닌 요구주를 CS 69라고 명명하였으며, 이것을 다시 상술한 방법에 따라 변이 시킨후 우레아제 검사배지인 크리스텐센 우레아 고체배지(Christensen Urea Agar주 4배지)에 도달하여 황색으로 변하는 균주를 선별하여 CS 6984(KFCC-10614)로 명명하였다.

(주1) 최소배지 : 포도당 2%, 황산암모니움 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/L, 황산철 10mg/L, 황산아연 1mg/L, 황산망간 1mg/L, L-시스테인 20mg/L, 칼슘 판토테네이트 10mg/L, 티아민 염산염 5mg/L, 비오틴 30μg/L, 요소 0.2%, pH 7.3

(주2) 아데닌 첨가 최소배지 : 최소배지에 아데닌을 0mg/L-500mg/L까지 농도별로 첨가한 배지

(주3) 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지 : 최소배지에 아데닌, 구아닌(또는 크산틴) 각 0-500mg/L까지 농도별로 첨가한 배지

(주4) 크리스텐센 우레아 고체배지 : 펩톤 1.0g, 포도당 1.0g, 염화나트륨 5.0g, 인산 제1칼륨염 2.0g, 페놀페드 0.0l2g, 한천 20g, 요소 20g, 증류수 1L

본 발명의 변이주 CS 6984(KFCC-10614)의 생리적 특성을 종래 균주와 비교하여 표 1에 기재하였으며,상세한 연구는 되어있지 않지만 본 발명의 변이주는 질소원 대사경로상 어느 특정 경로에 변이가 일어나 고농도의 5'-아미노산을 축적하는 것으로 추정된다.

[표 1]

이와같이 본 발명은 5'-이노신산 생산 능력이 있는 아데닌 요구 및 구아닌 누출형 변이주에 질소원 대사관련 효소의 기능을 변화시킨 특수한 변이주 CS 6984(KFCC-10614)를 이용함으로서, 종래의 5'-이노신산 생산균주 보다 수율 및 농도가 월등히 높은 것으로 확인되었다.

본 발명에 사용한 발효배지로는 공업적으로 값이싼 당질원료(포도당, 과당 및 이를 구성 성분으로 하는 다당류의 가수 분해물)와 질소원(유기 및 무기질소원) 및 미생물의 생육에 필요한 무기염과 미량원소, 비타민이 적당히 첨가된 배지라면 모두 사용이 가능하다.

배양방법은 실시예의 기재와 같이 온도 25℃-35℃, pH-8로 유지하면서 호기적으로 5-6일간 배양하여 축척된 5'-이노신산을 정량분석 하였다.

본 발명을 다음의 실시예에서 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

사용균주 : 본 발명 변이주 CS 6984(KFCC-10614)

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%.

발효배지 : 인산제 1, 2칼륨 각 2%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 100mg/L, 황산철 100mg/L, 황산망간 10mg/L, 황산아연 10mg/L, 옥수수 침지여액 20%, 비오틴 30μg/L, 티아민염산염 5mg/L, 아데닌 200mg/L, 과당, 포도당 및 당밀 혼합하여 총 환원당으로 20% 되게 첨가후 pH 7.0으로 맞추어 사용하였다.

발효방법 : 상기 종배지 40ml를 500ml 진탕용 삼각 프라스크에 분주하고 상법에 따라 가압멸균후 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 하였다.

발효배지 1800m1를 5L시험 발효조에 사입하여 120℃에서 20분간 가압살균하여 상기 종배양액 160m1를 살균한 다음 5일간 배양하였다.

이때 발효조건은 회전수 분당 900회, 공기유량 1vvm, 온도 28℃-25℃, pH 7으로 조절하였다. 또 발효 2일, 4일후 l차 및 2차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 발효액량대비 농도 18%, 8% 되도록 첨가했다.

5'-이노신산의 배지내 축적량은 42.7g/L이었다(5'-이노신산 축적 농도는 5'-이노신산 나트륨·7.5H₂O로 표시하였다).

[실시예 2]

사용균주 : 본 발명 변이주 CS-6984(KFCC-10614)

종배지 : 실시예 1과 동일

발효배지 : 구아닌 50mg/L를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일.

발효방법 : 배양기간을 80-90시간으로 한것을 제외하고 실시예 1과 동일. 5'-이노신산 축적량은 48.3g/L이었다.

본 실시예의 기재와 같이 구아닌을 적당량 첨가함으로서 발효기간의 단축 및 생산 수율을 높일 수 있었다.

Claims

브레비박테리움속에 속하고 생육에 아데닌을 요구하며 구아닌 또는 크산틴 누출형 균주로서 질소원으로 요소를 자화할 수 있는 우레아제가 결손된 것을 특징으로 하는 5'-이노신산의 생산능이 있는 미생물(KFCC-10614) .