JPH034785A - シュークロースホスホリラーゼの製造法 - Google Patents

シュークロースホスホリラーゼの製造法

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JPH034785A
JPH034785A JP13477189A JP13477189A JPH034785A JP H034785 A JPH034785 A JP H034785A JP 13477189 A JP13477189 A JP 13477189A JP 13477189 A JP13477189 A JP 13477189A JP H034785 A JPH034785 A JP H034785A
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JP
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sucrose phosphorylase
phosphorylase
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lysine
methionine
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JP13477189A
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Kazuo Nakamura
和雄 中村
Takuo Koga
拓郎 古賀
Takao Shirokane
白兼 孝雄
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Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シュークロースホスホリラーゼの製造法に関
し、その目的とするところは高酵素活性のシュークロー
スホスホリラーゼを効率良く得ることにある。
シュークロースホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下
でシェークロースに作用してグルコース−1−リン酸と
フラクトースを生成させる酵素でアリ、ホスホグルコム
ターゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等
と組み合わせて、無機リン酸を定量する方法(例えば特
開昭63−146800号、特開昭63−49100号
公報参照)及びシュークロースの定量分析〔アナライテ
ィカル・バイオケミストリー142.556〜561 
(1984)3等に適応することができ、診断用酵素剤
等として今後その開発が期待される。
〔従来の技術〕
従来、pイコノストック属、ンユードモナス属、アセト
バクター属等に属し、ンユークロースホスホリラーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地tlH1、該培養物より
シュークロースホスホリラーゼを採取する方法が知られ
ている。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、従来の製造法に於いては目的とするシュ
ークロースホスホリラーゼの活性及び収率が低し・欠点
を有し、その改善が強く望まれて(・る。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者等は、従来のシュークロースホスホリラーゼの
製造法の上記欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、
非常に数多くのアミノ酸類のうち)−f−−にニン、ア
スパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、ヒ
スチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を0.1%
(W/V)以上含有する培地に、シュークロースホスホ
リラーゼ生産能を有する微生物を培養したところ、高酵
素活性のシュークロースホスホリラーゼを得ることがで
きること、また該培地に更に炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及
び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W
/V)以上含有させると、著しく高酵素活性のシューク
ロースホスホリラーゼを得ることができることを知り、
これらの知見に基づし・て本発明を完成した。
即ち本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を有
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よ
りンーークジースホスホリラーゼを採取することを特徴
とするシュークロースホスホリラーゼの製造法であり、
また本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を有
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及ヒソレラノ塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有し、また炭酸塩、酢酸塩、塩酸
塩及び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%
(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシ
ュークロースホスホリラーゼを採取することを特徴とス
ルンユークロースホスホリラーゼの製造法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明に使用されるシュークロースホスホリラーゼ生産
能を有する微生物としては、上記性質を有する微生物で
あれば如何なるものでも良く、例えばロイコノストック
属、シュードモナス属、アセトバクター属に属する微生
物が挙げられる。
上記微生物の具体例としては、例えばロイコノストック
・メツセンチロイデス(ATCC12291)、シュー
ドモナス・サツ力ロフイラ(ATCC15946)、ア
セトバクター・キシリナム(J、 Nate、 Sci
Cov−c、 Sri Lanka 10(2)、 8
0〜169(1982)E等が挙げられる。
次に上記シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する
微生物の培養手段を述べる。
先ず本発明に用いられる培養培地としては、通常の液体
栄養培地に、以下に述べる特定のアミノ酸を添加含有せ
しめた培地が用いられる。
上記液体栄養培地としては、ンユークロース、糖蜜等の
炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、硫酸ア
ンモニウム、コーンステーブリカー等の窒素源、リン酸
1カリウム、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸鉄等の無機塩、チアミン、アスコルビン酸等のビタミ
ンを含有し、p H6,O〜8.0に調節したものが好
ましい。
また、本発明の液体栄養培地に添加されるアミノ酸とし
ては、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グ
ルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オルニ
チン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及び
それらの塩より選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
また、その添加量は培地に対して0.1%(W/V)以
上、特に0.3〜2.0%(W/V)となるように添加
することが好ましく、又添加時期は培養途中でも良いが
、培地の調整時に添加するのが望ましし・。
このように、上記のアミノ酸を所定量添加含有せしめた
培地を用いると、高酵素活性のシュークロースホスホリ
ラーゼを効率良く得ることが可能となる。
そして、上記培地に対し、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び
硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W/
V)以上、特ニ0.1〜5%(W/V)添加し、培養中
培地のpHを5.5〜8. Oの範囲に維持するト、更
に高酵素活性のンユークロースホスホリラ〜ゼを効率良
く得ることができるので好ましυ1゜ 上記した炭酸塩としては、炭酸カルシウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等、酢酸塩とし
ては、酢酸すl−’Jウム、酢酸アンモニウム、酢酸カ
リウム、酢酸カルシウム等、塩酸塩としては塩化ナトリ
ウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化カリウ
ム等、硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム
、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム等が好適に用いら
れる。
〔発明の効果〕
本発明によれば、定量用酵素剤及び診断用酵素剤として
有用な、高酵素活性のシュークロースホスホリラーゼを
、簡易な操作で、効率良く得ることが出来、産業上極め
て有意義である。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
[実 施 例] 実   施   例   1 0液体栄養培地組成]  %は(W/V)による。
シェークロース 酵母エキス ポリペプトン 2.0% 1.0% 1.0% リン酸2カリウム チアミン塩酸塩 アスコルビン酸 硫酸マグネシウム 硫酸第1鉄 WL酎ラマンガ ン pH 1,5% 0.001% 0.005% 0.04% 0.001% 0.02% 7.0 (全量Loom/) 上記液体栄養培地に、第1表記載の如きアミノ酸を所定
量添加含有した培地100 ratを、200m1容量
の三角フラスコに入れて、120°C115分間滅菌し
たものに、肉汁寒天斜面培地にて純粋培養シたロイコノ
ストック・メツセンテロイテス(ATCC12291)
の菌体な3白金耳接種し、これを恒温器で30℃で14
時間静置培養した。
このようにして得た培養液4 mlを遠心分離して菌体
を集菌し、得られた菌体を0.05 M KH2PO4
−NaOH緩衝液(pH6,5)4mgに懸濁し、遠心
分離して洗浄菌体を調製した。
次にこの洗浄菌体をリゾチーム(生化学工業社製)0.
5%(W/V)、Triton X−1000,1%(
V/V)10mMエチレンジアミン4酢酸2ナトリウム
を含有する0、05M KH2PO4NaOH緩衝液 
(pH6,5)4mgに懸濁した。そして37°Cで3
0分間加温して溶菌し、更にエチレンイミン・ポリマー
(東京化成工業社製)を終濃度が0.005%(V/V
)になるように添加して除核酸を行なったのち、遠心分
離して上清(粗酵素液)を採取した。
上清の酵素活性を測定した結果、培養液1 ml当タリ
のン二−クロースホスホリラーゼ活性は第1表記載の如
くであった。
なお、酵素活性の測定は下記の通りである。
基質シュークロースを0.05 M KH2PO4Na
OH緩衝液(p H6,8)中に溶かして基質濃度を1
60mMに調製する。この基質液3.0コに、前記緩衝
液に溶解した濃度0. OI M EDTA−2ナトリ
ウム溶液0.03mA、1%(W/V) NADP (
オリエンp tI、酵母社製)溶液0.1 ml、 0
.01%(W/V)グルコース−1,6−2リン酸(ヘ
ーリンガーマン・・イム社製)溶液0.1+y/、1M
塩化マグネシウムi 液0.05 me 、ホスホグル
コムターゼ(ベーリンガーマンハイム社製) 0.01
 ml 、グルツース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(
オリエンタル酵母社製)0.01mgを加え、25゛C
で約5分間予備加温する。酵素液0.02 meを加え
、波長340 nmでの1分間当たりの吸光度変化を測
定する。
なおブランク値は、本酵素液0.02 tnlの代わり
に0.01 M HEPES −NaOH緩衝液(pH
7)を0、02 ml添加したものである。
334−0nでの酵素反応液及びブランク値の1分間当
たりの吸光度の変化の差より、生成したグルコース−1
−リンMを定tl、た。
そして力価の表示は25°C,1分間当たり1マイクル
モルのグルコース1リン酸を生成する酵素量を1単位と
した。
第1表の結果から、数多くのアミノ酸のうち、メチオニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グル
タミン酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリ
ン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を単
独又は併用で0.1%(W/v)以上含有スる培地に、
シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を
培養すると、高酵素活性のシュークロースホスホリラー
ゼが得られることが判る。
実   施   例   2 実施例1のシュークロースホスホリラーゼの製造法にお
いて、培地として実施例1の液体栄養培地にリシン塩酸
塩0.5%(W/V)及び炭酸カルシウム0.5%(W
/V)を添加含有した培地(p H7,O)を用いる以
外は全く同様に操作して、3.35 uymeのンユー
クロースホスホリラーゼ粗酵素液を得た。
第1表及び本実施例の結果から、L−リジン塩酸塩を0
.5%(W/V)添加使用した場合は、1.48U/m
lのシュークロースホスホリラーゼが得られるが、L−
リジン塩酸塩0.5%(W/V)と炭酸塩0.5%(W
/V)を併用添加すると、著しく高酵素活性即ち3.3
5 U/atのそれが得られることが判る。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微
    生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
    グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オル
    ニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及
    びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.1%(
    W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシュ
    ークロースホスホリラーゼを採取することを特徴とする
    シュークロースホスホリラーゼの製造法。
  2. (2)シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微
    生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
    グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オル
    ニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及
    びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.1(W
    /V)%以上含有し、また炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び
    硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W/
    V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシューク
    ロースホスホリラーゼを採取することを特徴とするシュ
    ークロースホスホリラーゼの製造法。
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