JPH034785A - シュークロースホスホリラーゼの製造法 - Google Patents
シュークロースホスホリラーゼの製造法Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、シュークロースホスホリラーゼの製造法に関
し、その目的とするところは高酵素活性のシュークロー
スホスホリラーゼを効率良く得ることにある。
し、その目的とするところは高酵素活性のシュークロー
スホスホリラーゼを効率良く得ることにある。
シュークロースホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下
でシェークロースに作用してグルコース−1−リン酸と
フラクトースを生成させる酵素でアリ、ホスホグルコム
ターゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等
と組み合わせて、無機リン酸を定量する方法(例えば特
開昭63−146800号、特開昭63−49100号
公報参照)及びシュークロースの定量分析〔アナライテ
ィカル・バイオケミストリー142.556〜561
(1984)3等に適応することができ、診断用酵素剤
等として今後その開発が期待される。
でシェークロースに作用してグルコース−1−リン酸と
フラクトースを生成させる酵素でアリ、ホスホグルコム
ターゼ及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等
と組み合わせて、無機リン酸を定量する方法(例えば特
開昭63−146800号、特開昭63−49100号
公報参照)及びシュークロースの定量分析〔アナライテ
ィカル・バイオケミストリー142.556〜561
(1984)3等に適応することができ、診断用酵素剤
等として今後その開発が期待される。
従来、pイコノストック属、ンユードモナス属、アセト
バクター属等に属し、ンユークロースホスホリラーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地tlH1、該培養物より
シュークロースホスホリラーゼを採取する方法が知られ
ている。
バクター属等に属し、ンユークロースホスホリラーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地tlH1、該培養物より
シュークロースホスホリラーゼを採取する方法が知られ
ている。
しかしながら、従来の製造法に於いては目的とするシュ
ークロースホスホリラーゼの活性及び収率が低し・欠点
を有し、その改善が強く望まれて(・る。
ークロースホスホリラーゼの活性及び収率が低し・欠点
を有し、その改善が強く望まれて(・る。
本発明者等は、従来のシュークロースホスホリラーゼの
製造法の上記欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、
非常に数多くのアミノ酸類のうち)−f−−にニン、ア
スパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、ヒ
スチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を0.1%
(W/V)以上含有する培地に、シュークロースホスホ
リラーゼ生産能を有する微生物を培養したところ、高酵
素活性のシュークロースホスホリラーゼを得ることがで
きること、また該培地に更に炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及
び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W
/V)以上含有させると、著しく高酵素活性のシューク
ロースホスホリラーゼを得ることができることを知り、
これらの知見に基づし・て本発明を完成した。
製造法の上記欠点を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、
非常に数多くのアミノ酸類のうち)−f−−にニン、ア
スパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、ヒ
スチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を0.1%
(W/V)以上含有する培地に、シュークロースホスホ
リラーゼ生産能を有する微生物を培養したところ、高酵
素活性のシュークロースホスホリラーゼを得ることがで
きること、また該培地に更に炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及
び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W
/V)以上含有させると、著しく高酵素活性のシューク
ロースホスホリラーゼを得ることができることを知り、
これらの知見に基づし・て本発明を完成した。
即ち本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を有
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よ
りンーークジースホスホリラーゼを採取することを特徴
とするシュークロースホスホリラーゼの製造法であり、
また本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を有
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及ヒソレラノ塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有し、また炭酸塩、酢酸塩、塩酸
塩及び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%
(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシ
ュークロースホスホリラーゼを採取することを特徴とス
ルンユークロースホスホリラーゼの製造法である。
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よ
りンーークジースホスホリラーゼを採取することを特徴
とするシュークロースホスホリラーゼの製造法であり、
また本発明はシュークロースホスホリラーゼ生産能を有
する微生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン
、オルニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラ
ニン及ヒソレラノ塩より選ばれる少なくとも1種を0.
1%(W/V)以上含有し、また炭酸塩、酢酸塩、塩酸
塩及び硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%
(W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシ
ュークロースホスホリラーゼを採取することを特徴とス
ルンユークロースホスホリラーゼの製造法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明に使用されるシュークロースホスホリラーゼ生産
能を有する微生物としては、上記性質を有する微生物で
あれば如何なるものでも良く、例えばロイコノストック
属、シュードモナス属、アセトバクター属に属する微生
物が挙げられる。
能を有する微生物としては、上記性質を有する微生物で
あれば如何なるものでも良く、例えばロイコノストック
属、シュードモナス属、アセトバクター属に属する微生
物が挙げられる。
上記微生物の具体例としては、例えばロイコノストック
・メツセンチロイデス(ATCC12291)、シュー
ドモナス・サツ力ロフイラ(ATCC15946)、ア
セトバクター・キシリナム(J、 Nate、 Sci
。
・メツセンチロイデス(ATCC12291)、シュー
ドモナス・サツ力ロフイラ(ATCC15946)、ア
セトバクター・キシリナム(J、 Nate、 Sci
。
Cov−c、 Sri Lanka 10(2)、 8
0〜169(1982)E等が挙げられる。
0〜169(1982)E等が挙げられる。
次に上記シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する
微生物の培養手段を述べる。
微生物の培養手段を述べる。
先ず本発明に用いられる培養培地としては、通常の液体
栄養培地に、以下に述べる特定のアミノ酸を添加含有せ
しめた培地が用いられる。
栄養培地に、以下に述べる特定のアミノ酸を添加含有せ
しめた培地が用いられる。
上記液体栄養培地としては、ンユークロース、糖蜜等の
炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、硫酸ア
ンモニウム、コーンステーブリカー等の窒素源、リン酸
1カリウム、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸鉄等の無機塩、チアミン、アスコルビン酸等のビタミ
ンを含有し、p H6,O〜8.0に調節したものが好
ましい。
炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、硫酸ア
ンモニウム、コーンステーブリカー等の窒素源、リン酸
1カリウム、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸鉄等の無機塩、チアミン、アスコルビン酸等のビタミ
ンを含有し、p H6,O〜8.0に調節したものが好
ましい。
また、本発明の液体栄養培地に添加されるアミノ酸とし
ては、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グ
ルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オルニ
チン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及び
それらの塩より選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
ては、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グ
ルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オルニ
チン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及び
それらの塩より選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
また、その添加量は培地に対して0.1%(W/V)以
上、特に0.3〜2.0%(W/V)となるように添加
することが好ましく、又添加時期は培養途中でも良いが
、培地の調整時に添加するのが望ましし・。
上、特に0.3〜2.0%(W/V)となるように添加
することが好ましく、又添加時期は培養途中でも良いが
、培地の調整時に添加するのが望ましし・。
このように、上記のアミノ酸を所定量添加含有せしめた
培地を用いると、高酵素活性のシュークロースホスホリ
ラーゼを効率良く得ることが可能となる。
培地を用いると、高酵素活性のシュークロースホスホリ
ラーゼを効率良く得ることが可能となる。
そして、上記培地に対し、炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び
硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W/
V)以上、特ニ0.1〜5%(W/V)添加し、培養中
培地のpHを5.5〜8. Oの範囲に維持するト、更
に高酵素活性のンユークロースホスホリラ〜ゼを効率良
く得ることができるので好ましυ1゜ 上記した炭酸塩としては、炭酸カルシウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等、酢酸塩とし
ては、酢酸すl−’Jウム、酢酸アンモニウム、酢酸カ
リウム、酢酸カルシウム等、塩酸塩としては塩化ナトリ
ウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化カリウ
ム等、硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム
、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム等が好適に用いら
れる。
硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W/
V)以上、特ニ0.1〜5%(W/V)添加し、培養中
培地のpHを5.5〜8. Oの範囲に維持するト、更
に高酵素活性のンユークロースホスホリラ〜ゼを効率良
く得ることができるので好ましυ1゜ 上記した炭酸塩としては、炭酸カルシウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム等、酢酸塩とし
ては、酢酸すl−’Jウム、酢酸アンモニウム、酢酸カ
リウム、酢酸カルシウム等、塩酸塩としては塩化ナトリ
ウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化カリウ
ム等、硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム
、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム等が好適に用いら
れる。
本発明によれば、定量用酵素剤及び診断用酵素剤として
有用な、高酵素活性のシュークロースホスホリラーゼを
、簡易な操作で、効率良く得ることが出来、産業上極め
て有意義である。
有用な、高酵素活性のシュークロースホスホリラーゼを
、簡易な操作で、効率良く得ることが出来、産業上極め
て有意義である。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
[実 施 例]
実 施 例 1
0液体栄養培地組成] %は(W/V)による。
シェークロース
酵母エキス
ポリペプトン
2.0%
1.0%
1.0%
リン酸2カリウム
チアミン塩酸塩
アスコルビン酸
硫酸マグネシウム
硫酸第1鉄
WL酎ラマンガ
ン
pH
1,5%
0.001%
0.005%
0.04%
0.001%
0.02%
7.0
(全量Loom/)
上記液体栄養培地に、第1表記載の如きアミノ酸を所定
量添加含有した培地100 ratを、200m1容量
の三角フラスコに入れて、120°C115分間滅菌し
たものに、肉汁寒天斜面培地にて純粋培養シたロイコノ
ストック・メツセンテロイテス(ATCC12291)
の菌体な3白金耳接種し、これを恒温器で30℃で14
時間静置培養した。
量添加含有した培地100 ratを、200m1容量
の三角フラスコに入れて、120°C115分間滅菌し
たものに、肉汁寒天斜面培地にて純粋培養シたロイコノ
ストック・メツセンテロイテス(ATCC12291)
の菌体な3白金耳接種し、これを恒温器で30℃で14
時間静置培養した。
このようにして得た培養液4 mlを遠心分離して菌体
を集菌し、得られた菌体を0.05 M KH2PO4
−NaOH緩衝液(pH6,5)4mgに懸濁し、遠心
分離して洗浄菌体を調製した。
を集菌し、得られた菌体を0.05 M KH2PO4
−NaOH緩衝液(pH6,5)4mgに懸濁し、遠心
分離して洗浄菌体を調製した。
次にこの洗浄菌体をリゾチーム(生化学工業社製)0.
5%(W/V)、Triton X−1000,1%(
V/V)10mMエチレンジアミン4酢酸2ナトリウム
を含有する0、05M KH2PO4NaOH緩衝液
(pH6,5)4mgに懸濁した。そして37°Cで3
0分間加温して溶菌し、更にエチレンイミン・ポリマー
(東京化成工業社製)を終濃度が0.005%(V/V
)になるように添加して除核酸を行なったのち、遠心分
離して上清(粗酵素液)を採取した。
5%(W/V)、Triton X−1000,1%(
V/V)10mMエチレンジアミン4酢酸2ナトリウム
を含有する0、05M KH2PO4NaOH緩衝液
(pH6,5)4mgに懸濁した。そして37°Cで3
0分間加温して溶菌し、更にエチレンイミン・ポリマー
(東京化成工業社製)を終濃度が0.005%(V/V
)になるように添加して除核酸を行なったのち、遠心分
離して上清(粗酵素液)を採取した。
上清の酵素活性を測定した結果、培養液1 ml当タリ
のン二−クロースホスホリラーゼ活性は第1表記載の如
くであった。
のン二−クロースホスホリラーゼ活性は第1表記載の如
くであった。
なお、酵素活性の測定は下記の通りである。
基質シュークロースを0.05 M KH2PO4Na
OH緩衝液(p H6,8)中に溶かして基質濃度を1
60mMに調製する。この基質液3.0コに、前記緩衝
液に溶解した濃度0. OI M EDTA−2ナトリ
ウム溶液0.03mA、1%(W/V) NADP (
オリエンp tI、酵母社製)溶液0.1 ml、 0
.01%(W/V)グルコース−1,6−2リン酸(ヘ
ーリンガーマン・・イム社製)溶液0.1+y/、1M
塩化マグネシウムi 液0.05 me 、ホスホグル
コムターゼ(ベーリンガーマンハイム社製) 0.01
ml 、グルツース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(
オリエンタル酵母社製)0.01mgを加え、25゛C
で約5分間予備加温する。酵素液0.02 meを加え
、波長340 nmでの1分間当たりの吸光度変化を測
定する。
OH緩衝液(p H6,8)中に溶かして基質濃度を1
60mMに調製する。この基質液3.0コに、前記緩衝
液に溶解した濃度0. OI M EDTA−2ナトリ
ウム溶液0.03mA、1%(W/V) NADP (
オリエンp tI、酵母社製)溶液0.1 ml、 0
.01%(W/V)グルコース−1,6−2リン酸(ヘ
ーリンガーマン・・イム社製)溶液0.1+y/、1M
塩化マグネシウムi 液0.05 me 、ホスホグル
コムターゼ(ベーリンガーマンハイム社製) 0.01
ml 、グルツース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(
オリエンタル酵母社製)0.01mgを加え、25゛C
で約5分間予備加温する。酵素液0.02 meを加え
、波長340 nmでの1分間当たりの吸光度変化を測
定する。
なおブランク値は、本酵素液0.02 tnlの代わり
に0.01 M HEPES −NaOH緩衝液(pH
7)を0、02 ml添加したものである。
に0.01 M HEPES −NaOH緩衝液(pH
7)を0、02 ml添加したものである。
334−0nでの酵素反応液及びブランク値の1分間当
たりの吸光度の変化の差より、生成したグルコース−1
−リンMを定tl、た。
たりの吸光度の変化の差より、生成したグルコース−1
−リンMを定tl、た。
そして力価の表示は25°C,1分間当たり1マイクル
モルのグルコース1リン酸を生成する酵素量を1単位と
した。
モルのグルコース1リン酸を生成する酵素量を1単位と
した。
第1表の結果から、数多くのアミノ酸のうち、メチオニ
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グル
タミン酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリ
ン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を単
独又は併用で0.1%(W/v)以上含有スる培地に、
シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を
培養すると、高酵素活性のシュークロースホスホリラー
ゼが得られることが判る。
ン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グル
タミン酸、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリ
ン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びそれらの塩を単
独又は併用で0.1%(W/v)以上含有スる培地に、
シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を
培養すると、高酵素活性のシュークロースホスホリラー
ゼが得られることが判る。
実 施 例 2
実施例1のシュークロースホスホリラーゼの製造法にお
いて、培地として実施例1の液体栄養培地にリシン塩酸
塩0.5%(W/V)及び炭酸カルシウム0.5%(W
/V)を添加含有した培地(p H7,O)を用いる以
外は全く同様に操作して、3.35 uymeのンユー
クロースホスホリラーゼ粗酵素液を得た。
いて、培地として実施例1の液体栄養培地にリシン塩酸
塩0.5%(W/V)及び炭酸カルシウム0.5%(W
/V)を添加含有した培地(p H7,O)を用いる以
外は全く同様に操作して、3.35 uymeのンユー
クロースホスホリラーゼ粗酵素液を得た。
第1表及び本実施例の結果から、L−リジン塩酸塩を0
.5%(W/V)添加使用した場合は、1.48U/m
lのシュークロースホスホリラーゼが得られるが、L−
リジン塩酸塩0.5%(W/V)と炭酸塩0.5%(W
/V)を併用添加すると、著しく高酵素活性即ち3.3
5 U/atのそれが得られることが判る。
.5%(W/V)添加使用した場合は、1.48U/m
lのシュークロースホスホリラーゼが得られるが、L−
リジン塩酸塩0.5%(W/V)と炭酸塩0.5%(W
/V)を併用添加すると、著しく高酵素活性即ち3.3
5 U/atのそれが得られることが判る。
Claims (2)
- (1)シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微
生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オル
ニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及
びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.1%(
W/V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシュ
ークロースホスホリラーゼを採取することを特徴とする
シュークロースホスホリラーゼの製造法。 - (2)シュークロースホスホリラーゼ生産能を有する微
生物を、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、オル
ニチン、シトルリン、ヒスチジン、フェニルアラニン及
びそれらの塩より選ばれる少なくとも1種を0.1(W
/V)%以上含有し、また炭酸塩、酢酸塩、塩酸塩及び
硝酸塩より選ばれる少なくとも1種を0.05%(W/
V)以上含有する培地に培養し、該培養物よりシューク
ロースホスホリラーゼを採取することを特徴とするシュ
ークロースホスホリラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13477189A JPH034785A (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13477189A JPH034785A (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH034785A true JPH034785A (ja) | 1991-01-10 |
Family
ID=15136180
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13477189A Pending JPH034785A (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | シュークロースホスホリラーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH034785A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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1989
- 1989-05-30 JP JP13477189A patent/JPH034785A/ja active Pending
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