JPH0223866A - シュークロースホスホリラーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シェークロースホスホリラーゼの安定化法に
関し、その目的とするところは該酵素製剤を得るに際し
酵素活性の低下を招くことなく、しかも貯蔵安定性の優
れた酵素製剤を得ることにある。

シェークロースホスホリラーゼは、無機！＋７１１の存
在下でシュークロースに作用してグルコース１リン酸と
フラクトースを生成させる酵素であり、該酵素を例えば
ホスホグルコムターゼ及ヒグルコース６リン酸デヒドロ
ゲナーゼ等と組み合わせて、無機リン酸又はシェークロ
ースの定量分析に適応することが出来、診断用酵素剤等
として今後その開発が期待されている。

〔従来の技術〕

従来、シェークロースホスホリラーゼを安定化させる具
体的手段は、知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

シェークロースホスホリラーゼは、該酵素製剤の製造工
程ないし保存中に著しく酵素活性が低下する為、安定な
酵素製剤を得るのが極めて困難である。

そこで当業界に於いては、該酵素を安定化することが実
用面で重要な課題となっている。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者等は、上記課題を解決する為、鋭意検討
を重ねた結果、シー−クロースホスホリラーゼ含有液に
糖類、有機酸塩、アルカリ金属の塩化物、アルカリ土類
金属の塩化物、アミノ酸及びキレート剤からなる群より
選ばれた少なくとも１種のものを添加するか、又は更に
これを例えば凍結乾燥法等により乾燥すれば、該酵素活
性の低下がほぼ完全に防止されて安定な酵素製剤が得ら
れ、しかも長期貯蔵にも安定であること等の知見を得、
本発明を完成した。

即ち、本発明はシェークロースホスホリラーゼ含有液に
糖類、有機酸塩、アルカリ金属の塩化物、アルカリ土類
金属の塩化物、アミノ酸及びキレート剤からなる群より
選ばれた少なくとも１種のものを添加するか、又は更に
これを乾燥することよりなるシェークロースホスホリラ
ーゼの安定化法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるシェークロースホスホリラーゼは如
何なる起源のものでも良いが、例えばロイコノストック
属、シュードモナス属等の微生物より生産されるシェー
クロースホスホリラーゼヲ使用スる場合は、これらのシ
ェークロースホスホリラーゼ生産菌を培養し、該培養物
を常法により抽出して得た粗酵素あるいは該粗酵素を常
法により精製して得られる精製酵素等が好適に用いられ
る。

シェークロースホスホリラーゼ生産菌の具体例としては
、例えばロイコノストック属にｉするメツセンチロイデ
ス（ＡＴＣＣ１２２９１）　、シュードモナス属に属す
るサツカロフイラ（ＡＴＣＣ１５９４６）等が挙げられ
る。

上記シェークロースホスホリラーゼ生産菌を培養し、該
培養物よりシェークロースホスホリラーセヲ採取スるに
は、例えばシェークロースホスホリラーゼ生産菌を培養
して得た培養菌体を常法により破砕抽出して該酵素の抽
出液を得、これをポリエチレンイミン、硫酸マンガンあ
るいはプロタミン硫酸等により除核酸を行ない、陰イオ
ン交換樹脂による吸着溶出法、ゲル濾過法、・・イドロ
キンアバタイトを用いた吸着溶出法、疎水クロマトグラ
フィー等を適宜選択し組み合わせて行なうことにより精
製し、これを必要により濃縮することにより精製酵素液
を得ることができる。そして本発明はこのようなシュー
クロースホスホリラーゼの粗酵素液もしくは精製酵素液
にリン酸緩衝液等のシェーク。−スボスホリラーゼを失
活させない溶液を加えたシェークロースホスホリラーゼ
含有液に糖類、有機酸塩類、アミノ酸類、アルカリ金属
の塩化物、アルカリ土類金属の塩化物、及びキレート剤
からなる群より選ばれた少なくとも１種のものを夫々単
独に、もしくは同時に添加、溶解する。

糖類とし一〇は、グルコース、フラクトース、イノジッ
ト、ソルビット、ラクトース、ンユークロース、マルト
ース等が挙げろとる。また有機酸塩としてはリンゴ酸ソ
ーダ、クエン酸ソーダ等、アルカリ金属の塩化物として
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム等、アルカリ土類金
属の塩化物としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム、塩化バリウム等、アミノ酸としては、グリシン、グ
ルタミン酸ソーダ、アルギニン塩酸塩等、更にキレート
剤としては、エチレンジアミン４酢酸、エチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム、エチレンジアミン４酢酸カリウ
ム等が挙げられる。

そして／ニークロースホスホリラーゼ含有液に対する糖
類、有機酸塩類、アミノ酸類、アルカリ金属の塩化物、
アルカリ土類金属の塩化物、及びキレート剤等の添加量
としては、糖類及び有機酸の場合１％（Ｗ／Ｖ　）程度
以上添加するのが好ましく、またアルカリ金属の塩化物
、アルカリ土類金属の塩化物、及びキレート剤の場合５
　ｍＭ程度以上、アミノ酸の場合１０　ｍＭ程度以上添
加するのが望ましい。

なお上記添加物を添加する際のシュークロースホスホリ
ラーゼ含有液のｐＨ値は、はぼ６〜７の範囲にあれば良
く、また前記含有液のｐＨ調製が必要である場合には適
宜な手段によりｐＨ調製を行なえば良い。

上述のように、シェークロースホスホリラーゼ含有液に
糖類、有機酸塩類、アミノ酸類、アルカリ金属の塩化物
、アルカリ土類金属の塩化物、及びキレート剤からなる
群より選ばれた少なくとも１種のものを添加するか、ま
たは更にこれを凍結乾燥、真空乾燥等の乾燥手段により
乾燥すれば安定化されたンユークロースホスホリラーゼ
標品が得られる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、比較的簡易な操作によりシュークロー
スホスホリラーゼの酵素失活をほぼ完全に防止すること
が出来、例えば無機リンを定量するのに極めて有用な酵
素剤を得ることが出来るので、本発明は産業上極めて有
意義である。

以下、実施例により本発明を具体的に示す。

〔実施例〕

実施例１ トリプトン１％、酵母エキス１％、）Ｇ（２ＰＯ４１，
５％、シェークロース２％からなる培地（ｐＨ６）　２
０１を３０７！容ジャーファーメンタ−に入れ、これを
１２０°Ｃで殺菌冷却し、無菌濾過したビタミン−金属
塩溶液１％（チアミン塩酸塩０．１％、Ｍｇ５Ｏ４・７
Ｈ２０４％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，１％、Ｍｎ５Ｏ
４・４Ｈ２０２％、アスコルビン酸０．５％を夫々含有
）を添加したのち、この培地に、別に前記と同一組成の
培地２００　ｍｌを３００　ａｔ容三角フラスコに取す
殺菌したものに、ロイコノストック・メツセンチロイデ
ス（ＡＴＣＣ１２２９１）の寒天斜面培養物より採取し
た１白金耳を接種し、これを３０°Ｃで２４時間静置培
養して得た前培養液０．１％（Ｖ／Ｖ）接種し３０°Ｃ
、２００ｒ、ｐ、ｍ、　　の撹拌速度でｐＨを６に調製
しつつ２０時間培養した。培養終了後遠心機で集菌し、
リゾチーム（生化学工業社製）０．１％（Ｗ／Ｖ　）　
、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０００，１％、１０　ｍＭエチ
レンジアミン４酢酸２ナトリウムを含有する０、０５　
Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７，０）　ｌ　
ｌに懸濁した。そして３７°Ｃで１時間加温して溶菌し
、更にエチレンイミン・ポリマー（東京化学社製）を終
濃度が０．００５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加して除
核酸を行なったのち、遠心分離して上澄みを採取した。

次にその上澄みを０．０１　Ｍ　Ｍδ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ６＞　　で平衡化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｃｅ
ｌ　　（スウェーデン、ファルマシア社製）に酵素を吸
着させ、０．１　Ｍ　ＫＣＩを含有する前記緩衝液で洗
浄したのち、これを０．５　Ｍ　ＫＣＩを含有する前記
緩衝液で酵素を溶出した。

得られた酵素液に、３５％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを水冷、撹拌しながら徐々に添加し生成した沈殿
をセライト（和光純薬社製）で濾過し、該濾液に更に７
５％飽和となるように硫酸アンモニウムを水冷、撹拌し
ながら徐々に添加し、生じた沈殿を遠心分離で採取した
。

そしてその沈殿をＯ，Ｏｆ　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、同緩衝液（ｐＨ７）で透
析）脱塩したのち、酵素蛋白質濃度が１％（Ｗ／Ｖ　）
になるように希釈した。

上記の如くにして得られたンユークロースホスホリラー
ゼ含有酵素液Ｌｏｗ／に第１表に示す添加物を第１表の
濃度で添加、溶解したのち、常法により凍結乾燥してシ
ェークロースホスホリラーゼ酵素粉末を得た。

得られた酵素粉末を、デンケーター内で３０”Ｃ，３０
日間保持した結果、残存酵素活性は第１表の通りであっ
た。また比較のために、対照（無添加）の場合の酵素液
の残存活性も第１表に示した。

なお、酵素活性の測定は下記の通りである。

基質／ニークロースを０．０５　Ｍ　　ＫＨ２ＰＯ４Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，８）中に溶かして基質濃度１６
０　ｍＭに調製する。この基質液３．０ｍｅに、前記緩
衝液に溶解した濃度０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ　−２ナト
リウム溶液０．０３　ｍｌ、１％（Ｗ／Ｖ　）　ＮＡＤ
Ｐ　　（オリエンタル酵母社製）溶液０．Ｌｍｅ、０．
０１％（Ｗ／Ｖ　）グルコース　１．６２リン酸（ベー
リンガーマンハイム社製）溶液０．１　ｍｌ、Ｉ　Ｍ塩
化マク＊　’／　ウＡ　溶液０．０５　ｍｌ　、ホスホ
グルコムターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）　０．
０１　ｍｅ　、　クルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
（オリエンタル酵母社製）　０．０１　ｔｗｌを加え、
２５°Ｃで約５分間予備加温する。酵素液０．０２　ｍ
ｌを加え、波長３４０　ｎｍでの１分間当たりの吸光度
変化を測定する。

なお対照は、本酵素液０．０２＋＋＋／の代わりに０．
０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）を０
．０２ｍ／ｆｆｉ加したものである。

３４０　ｎｍ　　での酵素反応液及び対照の１分間当た
りの吸光度の変化の差より、生成したグルコース１リン
酸を定量した。

そして力価の表示は２５°Ｃ，１分間当たり１μモルの
グルコース１リン酸を生成する酵素量を１単位とした。

第 表 第１表の結果から明らかな如く、本発明に於ける添加物
を加えた場合のシュークロースホスホリラーゼの安定化
効果は、対照に比し何れも著しく優れていることが認め
られた。なお本発明に係る酵素粉末は、何れも４°Ｃで
６ケ月以上保存しても全く安定であった。

実施例２ 実施例１に記載したと同様に調製したンユークロースホ
スホリラーゼ含有酵素液１０　ｍｌ！に、夫々塩化マグ
ネシウムを５　ｍＭ添加、溶解し、更にこれらに夫々イ
ノンット、ソルビット、ンユークロース、またはリンゴ
酸ソーダを１％（Ｗ／Ｖ　）づつ添加、溶解し、均一化
させたのち、常法により凍結乾燥して酵素粉末を得た。

このようにして得られた酵素粉末を、デシケータ−内で
３０″Ｃに於いて１ケ月間保持した結果、残存酵素活性
は第２表の如くであった。

なお比較のために、対照として前記の操作のうち塩化マ
グネシウム及び糖類、あるいは塩化マグネシウム及び有
機酸塩の両者を添加しない他は前記と全く同様に実施し
て得た酵素粉末の残存活性、そしてまた塩化バリウムだ
けを添加する以外は前記と全く同様に実施して得た酵素
粉末の残存活性も第２表に示した。

第２表の結果から、ンユークロースホスホリラーゼ含有
液に塩化物、または塩化物と糖類、あるいは塩化物と有
機酸塩の両者を添加した場合は、これらを添加しないで
凍結乾燥した場合に比較して極めてよくシュークーース
ホスホリラ〜ゼは安定化し、長期間の保存にも極めて安
定であること、そして塩化物と糖類、あるいは塩化物と
有機酸塩の両者を添加して凍結乾燥した場合は塩化物だ
けを添加して凍結乾燥した場合に比較してその安定効果
が一層大であることが認められた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュークロースホスホリラーゼ含有液に糖類、有機酸塩
   、アルカリ金属の塩化物、アルカリ土類金属の塩化物、
   アミノ酸及びキレート剤からなる群より選ばれた少なく
   とも１種のものを添加するか、又は更にこれを乾燥する
   ことよりなるシュークロースホスホリラーゼの安定化法
   。