JP4464196B2 - マルトース−1−リン酸の製造法 - Google Patents
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FEBS Letters 1976、61(2):192-3 Enzyme Microb. Technol.、1995、17、140-146 Atherroscleosis 1998、136(2):297-303 Acta Histochem. 1997、99(4):401-410 J. Immunol. 1989、143(11):3666-3672 Arch Microbiol. 2003、180(4):233-239 Planta. 1982、154:87-93
培地中の糖類の濃度は、効果の点から1〜70質量%が好ましく、さらに好ましくは、10〜70質量%、特に20〜50質量%とするのが好ましい。
培地中のリン酸類又はその塩の濃度は、効果の点から1mM以上であることが必要であるが、好ましくは1mM〜2Mの範囲、特に50mM〜1Mの範囲が望ましい。
尚、酵素活性の測定は、基質に2%デキストリンマックス1000及び1Mリン酸緩衝液(pH7)を用い、適宜希釈した酵素を加え、37℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸をHPLCにて定量することにより行った(参考例1参照)。
1)作用
グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖及びリン酸類又はその塩からマルトース−1−リン酸を生成する。
すなわち、本酵素は、リン酸類又はその塩の存在下において、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性を有する。ホスホリラーゼは、これまでグルコース等、単糖を認識してグルコース−1―リン酸等を生成する酵素しか報告されておらず、このように二糖を認識して二糖リン酸を生成するタイプものはこれまでに全く知られていない。
一方、本酵素は、リン酸類の非存在下においては、マルトオリゴ糖に作用して、マルトース単位で転移をする。すなわち、マルトヘキサオース(DP=6)に作用させることにより、マルトオリゴ糖(DP=4、DP=6、DP=8、DP=10等)が、また、マルトヘプタオース(DP=7)に作用させることにより、マルトオリゴ糖(DP=5、DP=7、DP=9、DP=11等)が生成するように、マルトペンタオース以上のオリゴ糖に作用してマルトース単位で転移する活性を有する。従来、マルトシルトランスフェラーゼは、Eur. J. Biochem. (1998) 250, 1050-1058に報告があるが、当該酵素に、マルトース−1−リン酸を生成するという報告は無い。また、従来のマルトシルトランスフェラーゼは、マルトトリオース(DP=3)等の低分子に作用し、DP=3以上のオリゴ糖に作用させたとき、低分子のDP=1〜3の低重合度オリゴ糖を生成するが、本酵素は、マルトオリゴ糖DP=3,4にはほとんど作用せず、マルトオリゴ糖DP=5には作用しにくい。また、DP=5以上のマルトオリゴ糖に作用させてもDP=1〜3の低重合度のオリゴ糖をほとんど生成しない。従って、本酵素は従来のマルトシルトランスフェラーゼとは異なる酵素である。
かように、本酵素は、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性とマルトース単位で伸長していくマルトース転移活性を有するこれまでに知られていない全く新しいタイプの酵素である。以上より、本酵素は、マルトデキストリン・マルトシルホスホリラーゼ、マルトデキストリン:オルトリン酸−α−1−マルトシルトランスフェラーゼ、又はマルトシルトランスフェラーゼのように命名できる。
リン酸類又はその塩との存在下で、グルコース重合度6以上のα−1,4グルコシド結合を含むオリゴ糖、多糖又はそれらの分解物によく作用してマルトース−1−リン酸を生成する。グルコース重合度5のオリゴ糖に若干作用し、重合度2〜4のオリゴ糖には殆ど作用しない。ここで、多糖としては、例えばアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、澱粉等が挙げられる。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)による分子量は約75kDa(但し、SDS−PAGE法では測定条件により5kDa程度上下することがある)である。
基質としてpH5.5〜8.5の各pHの700mMリン酸緩衝液及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素を0.28U/mLとなるように加え、37℃、1時間反応させ、酵素活性を測定した場合、至適pHは6.5〜8.0付近であり、pH5.5〜8.5範囲で、pH7.5(最大活性)との相対活性50%を示す。
基質として1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7)及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素0.168U/mLとなるように加え、30℃〜70℃の各温度にて1時間反応させ、95℃で10分間処理し酵素を失活させ、反応液を101倍希釈して酵素活性を測定した場合、至適温度は35〜50℃であり、30℃〜55℃の広い範囲で活性を有する。
菌株としては、Corynebacterium sp. JCM1300、Corynebacterium flavescens JCM1317、Corynebacteriumglutamicum JCM1318、Corynebacterium hoagii JCM1319、Corynebacteriumglutamicum JCM1321、Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、Corynebacteriumpilosum JCM3714、Corynebacterium amycolatum JCM7447、Corynebacteriummatruchotii JCM9386、Corynebacterium minutissimum JCM9387、Corynebacteriumstriatum JCM9390、Corynebacterium callunae IFO15359を用いた。菌株をSCD寒天プレート(日本製薬)に塗末し、30℃にて一晩培養した。種培養には大試験管10mL仕込みの0.67%Yeast Nitrogen Base(Difco)に菌株を一白金耳植菌し、30℃で一晩、250rpmで振とう培養を行った。
主培養は0.67%Yeast Nitrogen Base(Difco)、10%デキストリンマックス1000(松谷化学)、400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含む培地にて35℃で6日間、250rpm振とう培養を行った。
カラム:CarboPac PA1(日本ダイオネックス社 4×250 mm)、検出器:ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液:A液;100 mM水酸化ナトリウム溶液 B液;1M酢酸ナトリウムを含む100mM水酸化ナトリウムを用いた。
注入から初期濃度A液90%:B液10%、0〜17分A液18.5%:B液81.5%のリニアグラジエントにより分析した。標準として100mM、50mMのSIGMA社マルトース−1−リン酸を用いた。約15.5分にピークが現れた。培養上精は200倍希釈し、20μLを注入した。分析の結果を表1に示す。
また、培養上清中には、マルトース−1−リン酸の他に、グルコース−1−リン酸等のリン酸化糖類も生産され得る。従って、菌体を分離除去した後、必要に応じて限外ろ過、逆浸透膜、電気透析、イオン交換膜、イオン交換樹脂、活性炭、合成吸着剤、晶析等を行い、イオン交換クロマトグラフィーすることによりマルトース−1−リン酸の分離を行った。
マルトース−1−リン酸生成酵素の活性測定を検討し、次の反応条件を設定した。
基質には2%デキストリンマックス1000及び1Mリン酸緩衝液(pH7)の条件下、適宜希釈した酵素を加え、37℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸を実施例1で示したHPLCにて定量した。すなわち、マルトース−1−リン酸は、DIONEX社のDX500クロマトグラフィシステムにて定量した。カラム:CarboPac PA1(4×250 mm)、検出器:ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液:A液;100 mM水酸化ナトリウム溶液B液;1M酢酸ナトリウムを含む100 mM水酸化ナトリウムを用いた。注入から初期濃度A液90%:B液10%、0〜17分A液18.5%:B液81.5%のリニアグラジエントにより分析した。標準として100 mM、50 mMのSIGMA社マルトース−1−リン酸を用いた。約15.5分にピークが現れた。1分間で1μMのマルトース−1―リン酸を生成する量を1U(ユニット)とした。
使用菌株はCorynebacterium glutamicum JCM1321を使用した。菌をSCD寒天培地(日本製薬)に塗末し、30℃にて一晩生育させた。種培養としては、0.5% 酵母エキス、4% アミノ酸調味液K(味の素)、3% 液糖マルトリッチ(昭和産業)、100 mM リン酸緩衝液(pH7)の培地をヒダ付き三角フラスコに50 mL仕込み、生育した菌株を1白金耳接種し、30℃、210 rpmで一晩振とう培養を行った。主培養としては、0.5% 酵母エキス、1% アミノ酸調味液K(味の素)、0.5% 硫酸アンモニウム、10% デキストリンマックス1000(松谷化学)、10%塩化カルシウム2水和物、200ppm 硫酸マグネシウム、25ppm塩化第二鉄、400 mMリン酸緩衝液(pH7)の培地を160本のヒダ付き三角フラスコに50 mL仕込み、種菌を1%植菌し、30℃、210rpmで一晩振とう培養を行った。
培養上精中にマルトース−1−リン酸生成酵素が240U/L生産された。
参考例2で得られた本培養液6Lを遠心分離後、上精を限外濾過モジュールACP-13000(旭化成)により濃縮し、10 mMリン酸緩衝液(pH8)にて透析を行った。濃縮透析液をDEAE−Toyopearl 650Mカラム(東ソー;5×15cm)に吸着させ、同緩衝液2Lで洗浄した後、1M塩化ナトリウム1.5Lにて溶出させ、粗酵素液を得た。
粗酵素液は、BIO-CAD60システム(パーセプティブ)により精製を進めた。まず、粗酵素液1580mLに1M硫酸アンモニウムを加え、1M硫酸アンモニウムと50mMリン酸緩衝液にて平衡化した疎水クロマトカラムPOROS PE/M(φ10×100mm)に添着させ、50mMリン酸緩衝液(pH8)中で1000 mMから360mMの硫安の濃度勾配で150mLを、次いで360 mM〜0 mMまでの硫安濃度勾配で375mLを流速12mL/分にて流した。その結果、約360mM硫安で溶出されたフラクションにマルトース−1−リン酸生成酵素のピークが認められた。活性フラクションは10mMリン酸緩衝液(pH8)中で透析し、酵素液74mLを得た。
透析酵素溶液はさらに、20mMリン酸緩衝液(pH8)で平衡化された陰イオン交換カラムPOROS HQ/M(φ10x100mm)添着させ20mMリン酸緩衝液(pH8)中で0から50mMまでの塩化ナトリウムの濃度勾配で450mLを流速12mL/分で流した。その結果、非吸着画分から濃度勾配が始まった直後に活性画分が現れ、その画分を10mMリン酸緩衝液(pH8)中で透析を行い、9.3mLの酵素液を得た。
再度本酵素液を同様な条件で陰イオン交換カラムPOROS HQ/M(φ10x100mm)処理を行った結果、塩化ナトリウムの濃度勾配が始まった直後にマルトース−1−リン酸生成酵素と思われるピークを検出した。
ピークトップのフラクションをCentriprep YM-3(MILLIPORE)により0.6mLまで10倍濃縮し、SDS-PAGEを行った結果、ほぼ単一のバンドを検出し、分子量約75kDaと推定された。さらに、本サンプルのアミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、Gly-Arg-Leu-Gly-Ile-Asp-Asp-Val-Arg-Pro-Arg-Ile-Leu-Asp-Gly-Asn-Pro-Ala-Lys-Ala-Val-Val-Gly-Glu-Ile-Val-Pro-Val-Ser-Ala-Ile-Val-Trp-Arg-Glu(配列番号1)であった。
(1)至適pH
基質としてpH5.5〜8.5の各pHの700 mMリン酸緩衝液及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素を0.28U/mLとなるように加え、37℃、1時間反応させた。95℃で10分間処理することにより反応を停止させ、反応液を101倍希釈して実施例1のHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。
その結果、図1に示すように、至適pHは6.5〜8.0付近であり、pH5.5〜8.5の範囲でpH7.5との相対活性50%を示し、広く反応することが判った。
基質として1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7)及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素0.168U/mLとなるように加え、30℃〜70℃の各温度にて1時間反応させ、95℃で10分間処理し酵素を失活させ、反応液を101倍希釈して実施例1に示したHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。その結果、図2に示すように、至適温度は35℃〜50℃付近であり、30℃〜55℃の広い範囲で活性を有していた。
(i)デキストリンとリン酸からマルトース−1−リン酸を生成する反応
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.5%デキストリンマックス1000(松谷化学)及び250mMのリン酸緩衝液(pH7)を37℃にて15時間反応させ、実施例1に示す手法にてマルトース−1−リン酸を定量した。その結果、145μMのマルトース−1−リン酸を生成した。
(ii)各種マルトオリゴ糖とリン酸からのマルトース−1−リン酸を生成する反応
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.5%の各鎖長の異なった基質(グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース(生化学工業))及び250mMのリン酸緩衝液(pH7)を37℃にて15時間反応させ、実施例1に示す手法にてマルトース−1−リン酸を定量した。その結果を表2に示す。
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.0%の各鎖長の異なった基質(グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース(生化学工業))を37℃にて1時間反応させ、実施例1に示す手法にてHPLC分析を行った(結果はピーク面積で示す)。マルトオリゴ糖(DP=1〜11)の保持時間はデキストリン(松谷化学)分析から推定した。その結果を表3に示す。
Corynebacterium vitaeruminis JCM1323及びCorynebacterium callunaeIFO15359を、SCD寒天培地(日本製薬株式会社)に塗末し30℃にて培養した。本菌の一白金耳を液体培地(0.67%のYeast Nitrogen Base(Difco社)、50, 100,200 mMのリン酸緩衝液(pH7)、15%のデキストリン(sigma社 potato由来))に接種し、30℃で6日間振とう培養を行った。培養液を遠心分離により菌体除去後の上清のマルトデキストリンホスホリラーゼ活性を測定した。
Claims (2)
- コリネバクテリウム属細菌を、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖からなる糖類及び1mM以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたマルトース−1−リン酸を採取するマルトース−1−リン酸の製造法。
- リン酸類又はその塩の濃度が50mM〜2000mMである請求項1記載の製造法。
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