JP4430981B2 - マルトース−1−リン酸生成酵素の製造法 - Google Patents
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FEBS Letters 1976, 61(2):192-3 Enzyme Microb. Technol. 1995,17,140-146 Atherroscleosis 1998、136(2):297-303 Acta Histochem. 1997、99(4):401-410 J. Immunol. 1989、143(11):3666-3672 Arch Microbiol. 2003、180(4):233-239 Planta. 1982、154:87-93
ここで、培地に添加される糖(炭素源)としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖が挙げられ、これらの二種以上を混合して用いても良い。このうち、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖を用いるのが好ましく、例えばデンプン、アミロース、デキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、アミロペクチン、グリコーゲン、デンプン分解物等が挙げられる。
尚、酵素活性の測定は、基質に2%デキストリンマックス1000及び1Mリン酸緩衝液(pH7)を用い、適宜希釈した酵素を加え、37℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸をHPLCにて定量することにより行った(実施例1参照)。
1)作用
グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖及びリン酸類又はその塩からマルトース−1−リン酸を生成する。
すなわち、本発明酵素は、リン酸類又はその塩の存在下において、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性を有する。ホスホリラーゼは、これまでグルコース等、単糖を認識してグルコース−1―リン酸等を生成する酵素しか報告されておらず、このように二糖を認識して二糖リン酸を生成するタイプものはこれまでに全く知られていない。
一方、本発明酵素は、リン酸類の非存在下においては、マルトオリゴ糖に作用して、マルトース単位で転移をする。すなわち、マルトヘキサオース(DP=6)に作用させることにより、マルトオリゴ糖(DP=4、DP=6、DP=8、DP=10等)が、また、マルトヘプタオース(DP=7)に作用させることにより、マルトオリゴ糖(DP=5、DP=7、DP=9、DP=11等)が生成するように、マルトペンタオース以上のオリゴ糖に作用してマルトース単位で転移する活性を有する。従来、マルトシルトランスフェラーゼは、Eur. J. Biochem. (1998) 250, 1050-1058に報告があるが、当該酵素に、マルトース−1−リン酸を生成するという報告は無い。また、従来のマルトシルトランスフェラーゼは、マルトトリオース(DP=3)等の低分子に作用し、DP=3以上のオリゴ糖に作用させたとき、低分子のDP=1〜3の低重合度オリゴ糖を生成するが、本発明の酵素は、マルトオリゴ糖DP=3,4にはほとんど作用せず、マルトオリゴ糖DP=5には作用しにくい。また、DP=5以上のマルトオリゴ糖に作用させてもDP=1〜3の低重合度のオリゴ糖をほとんど生成しない。従って、本発明酵素は従来のマルトシルトランスフェラーゼとは異なる酵素である。
かように、本発明の酵素は、グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性とマルトース単位で伸長していくマルトース転移活性を有するこれまでに知られていない全く新しいタイプの酵素である。以上より、本発明酵素は、マルトデキストリン・マルトシルホスホリラーゼ、マルトデキストリン:オルトリン酸−α−1−マルトシルトランスフェラーゼ、又はマルトシルトランスフェラーゼのように命名できる。
上記基質の濃度は特に規定しないが、リン酸類及びリン酸塩は50mM〜2Mが好ましく、さらに100mM〜1200mM、特に400〜1000mMが好ましい。グルコース重合度5以上のα−1,4グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖は、1〜70質量%が好ましい。
リン酸類又はその塩との存在下で、グルコース重合度6以上のα−1,4グルコシド結合を含むオリゴ糖、多糖又はそれらの分解物によく作用してマルトース−1−リン酸を生成する。グルコース重合度5のオリゴ糖に若干作用し、重合度2〜4のオリゴ糖には殆ど作用しない。ここで、多糖としては、例えばアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、澱粉等が挙げられる。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)による分子量は約75kDa(但し、SDS−PAGE法では測定条件により5kDa程度上下することがある)である。
基質としてpH5.5〜8.5の各pHの700mMリン酸緩衝液及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素を0.28U/mLとなるように加え、37℃、1時間反応させ、酵素活性を測定した場合、至適pHは6.5〜8.0付近であり、pH5.5〜8.5範囲で、pH7.5(最大活性)との相対活性50%を示す。
基質として1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7)及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素0.168U/mLとなるように加え、30℃〜70℃の各温度にて1時間反応させ、95℃で10分間処理し酵素を失活させ、反応液を101倍希釈して酵素活性を測定した場合、至適温度は35〜50℃であり、30℃〜55℃の広い範囲で活性を有する。
そして、本発明によれば、培養液中に、特別な操作なく、マルトース−1−リン酸を生産させることが可能である。さらに、アグリコンとなる化合物及びマルトース−1−リン酸を培養液と直接作用させることによって、特別な操作なく配糖体を得ることも可能である。
マルトース−1−リン酸生成酵素の活性測定を検討し、次の反応条件を設定した。
基質には2%デキストリンマックス1000及び1Mリン酸緩衝液(pH7)の条件下、適宜希釈した酵素を加え、37℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸を実施例1で示したHPLCにて定量した。すなわち、マルトース−1−リン酸は、DIONEX社のDX500クロマトグラフィシステムにて定量した。カラム:CarboPac PA1(4×250 mm)、検出器:ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液:A液;100 mM水酸化ナトリウム溶液B液;1M酢酸ナトリウムを含む100 mM水酸化ナトリウムを用いた。注入から初期濃度A液90%:B液10%、0〜17分A液18.5%:B液81.5%のリニアグラジエントにより分析した。標準として100 mM、50 mMのSIGMA社マルトース−1−リン酸を用いた。約15.5分にピークが現れた。1分間で1μMのマルトース−1―リン酸を生成する量を1U(ユニット)とした。
使用菌株はCorynebacterium glutamicum JCM1321を使用した。菌をSCD寒天培地(日本製薬)に塗末し、30℃にて一晩生育させた。種培養としては、0.5% 酵母エキス、4% アミノ酸調味液K(味の素)、3% 液糖マルトリッチ(昭和産業)、100 mM リン酸緩衝液(pH7)の培地をヒダ付き三角フラスコに50 mL仕込み、生育した菌株を1白金耳接種し、30℃、210 rpmで一晩振とう培養を行った。主培養としては、0.5% 酵母エキス、1% アミノ酸調味液K(味の素)、0.5% 硫酸アンモニウム、10% デキストリンマックス1000(松谷化学)、10%塩化カルシウム2水和物、200ppm 硫酸マグネシウム、25ppm塩化第二鉄、400 mMリン酸緩衝液(pH7)の培地を160本のヒダ付き三角フラスコに50 mL仕込み、種菌を1%植菌し、30℃、210rpmで一晩振とう培養を行った。
培養上精中にマルトース−1−リン酸生成酵素が240U/L生産された。
実施例2で得られた本培養液6Lを遠心分離後、上精を限外濾過モジュールACP-13000(旭化成)により濃縮し、10 mMリン酸緩衝液(pH8)にて透析を行った。濃縮透析液をDEAE−Toyopearl 650Mカラム(東ソー;5×15cm)に吸着させ、同緩衝液2Lで洗浄した後、1M塩化ナトリウム1.5Lにて溶出させ、粗酵素液を得た。
粗酵素液は、BIO-CAD60システム(パーセプティブ)により精製を進めた。まず、粗酵素液1580mLに1M硫酸アンモニウムを加え、1M硫酸アンモニウムと50mMリン酸緩衝液にて平衡化した疎水クロマトカラムPOROS PE/M(φ10×100mm)に添着させ、50mMリン酸緩衝液(pH8)中で1000 mMから360mMの硫安の濃度勾配で150mLを、次いで360 mM〜0 mMまでの硫安濃度勾配で375mLを流速12mL/分にて流した。その結果、約360mM硫安で溶出されたフラクションにマルトース−1−リン酸生成酵素のピークが認められた。活性フラクションは10mMリン酸緩衝液(pH8)中で透析し、酵素液74mLを得た。
透析酵素溶液はさらに、20mMリン酸緩衝液(pH8)で平衡化された陰イオン交換カラムPOROS HQ/M(φ10x100mm)添着させ20mMリン酸緩衝液(pH8)中で0から50mMまでの塩化ナトリウムの濃度勾配で450mLを流速12mL/分で流した。その結果、非吸着画分から濃度勾配が始まった直後に活性画分が現れ、その画分を10mMリン酸緩衝液(pH8)中で透析を行い、9.3mLの酵素液を得た。
再度本酵素液を同様な条件で陰イオン交換カラムPOROS HQ/M(φ10x100mm)処理を行った結果、塩化ナトリウムの濃度勾配が始まった直後にマルトース−1−リン酸生成酵素と思われるピークを検出した。
ピークトップのフラクションをCentriprep YM-3(MILLIPORE)により0.6mLまで10倍濃縮し、SDS-PAGEを行った結果、ほぼ単一のバンドを検出し、分子量約75kDaと推定された。さらに、本サンプルのアミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、Gly-Arg-Leu-Gly-Ile-Asp-Asp-Val-Arg-Pro-Arg-Ile-Leu-Asp-Gly-Asn-Pro-Ala-Lys-Ala-Val-Val-Gly-Glu-Ile-Val-Pro-Val-Ser-Ala-Ile-Val-Trp-Arg-Glu(配列番号1)であった。
菌株としては、Corynebacteriumglutamicum JCM1318、Corynebacterium hoagii JCM1319、Corynebacteriumglutamicum JCM1321、Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、Corynebacteriumcallunae IFO15359を用いた。菌株をSCD寒天プレート(日本製薬)に塗末し、30℃にて一晩培養した。種培養には大試験管10mL仕込みの0.67%Yeast Nitrogen Base(Difco)に菌株を一白金耳植菌し、30℃で一晩、250rpmで振とう培養を行った。
主培養は0.67%Yeast Nitrogen Base(Difco)、10%デキストリンマックス1000(松谷化学)を含む培地に、400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を添加した培地あるいは添加しない培地にて35℃で6日間、250rpm振とう培養を行った。
1mlの培養液を遠心分離し、菌体と培養上清に分離した。菌体外のM1P生成酵素活性は培養上清をそのまま用いた。一方、菌体内の酵素活性は集められた菌体を培養液と等量の50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁させ、遠心分離にて菌体を分離し洗浄した。さらに、培養液と等量の50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁させ、50μlのトルエンを加え強く攪拌することで、菌体を破壊し、活性測定用酵素液とした。活性測定は実施例1に示した方法で行った。活性測定の結果を表1に示す。
(1)至適pH
基質としてpH5.5〜8.5の各pHの700 mMリン酸緩衝液及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素を0.28U/mLとなるように加え、37℃、1時間反応させた。95℃で10分間処理することにより反応を停止させ、反応液を101倍希釈して実施例1のHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。
その結果、図1に示すように、至適pHは6.5〜8.0付近であり、pH5.5〜8.5の範囲でpH7.5との相対活性50%を示し、広く反応することが判った。
基質として1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7)及び2%マルトヘプタオース(G7:生化学工業)を用い、精製酵素0.168U/mLとなるように加え、30℃〜70℃の各温度にて1時間反応させ、95℃で10分間処理し酵素を失活させ、反応液を101倍希釈して実施例1のHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。その結果、図2に示すように、至適温度は35℃〜50℃付近であり、30℃〜55℃の広い範囲で活性を有していた。
(i)デキストリンとリン酸からマルトース−1−リン酸を生成する反応
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.5%デキストリンマックス1000(松谷化学)及び250mMのリン酸緩衝液(pH7)を37℃にて15時間反応させ、実施例1に示す手法にてマルトース−1−リン酸を定量した。その結果、145μMのマルトース−1−リン酸を生成した。
(ii)各種マルトオリゴ糖とリン酸からのマルトース−1−リン酸を生成する反応
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.5%の各鎖長の異なった基質(グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース(生化学工業))及び250mMのリン酸緩衝液(pH7)を37℃にて15時間反応させ、実施例1に示す手法にてマルトース−1−リン酸を定量した。その結果を表2に示す。
0.16U/mLのマルトース−1−リン酸生成酵素と2.0%の各鎖長の異なった基質(グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース(生化学工業))を37℃にて1時間反応させ、実施例1に示す手法にてHPLC分析を行った(結果はピーク面積で示す)。マルトオリゴ糖(DP=1〜11)の保持時間はデキストリン(松谷化学)分析から推定した。その結果を表3に示す。
Claims (1)
- 100〜1200mMのリン酸類又はその塩を含有する培地中でマルトース−1−リン酸生成酵素生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を培養し、培地中に生成されたマルトース−1−リン酸生成酵素を採取することを特徴とするマルトース−1−リン酸生成酵素の製造法。
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