JPS6054681A - キチナ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なキチナーゼ及びその製造法に関する。

本発明者らは天然の土壌よ少数多くの微生物を単離し、
その生産物について種々研究を行った結果、今回不発明
者によって分離された細菌がキチン分解酵素を多量に産
生ずることを見出し、不発明を完成した。

すなわち、本発明は新規なキチナーゼ及びその製造法を
提供するものである。

不発明のキチナーゼを産生ずる細菌は次のような菌学的
性質を有する。

（１）形態 直状、球形末端を有する桿形、大きさ１．０〜２．４μ
ｍ、運動性ら）、極単毛性で鞭毛を有する、グラム陰性 （２）　生育状態 ００．２％コロイドキチン、０，１％ペプトン、０．１
％肉汁エキス、０．３％塩化ナトリウム及び２．０％寒
天含有（ｐＨ７，０）キチン−寒天平板培地中、３０℃
で７２時間インキュベーションすると、明確ナコロニー
ヲ形成する。

■肉汁液体培地中、３７℃で生育する。

■７．５％塩化す）　ＩＪウム含有肉汁液体培地中で生
育しない。

■単一窒素源としてアンモニアを、単一炭素源トシテク
ルコース、Ｌ−アルギニン％　Ｌ−７スパラギン、Ｌ−
ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸％　Ｌ−セリン又はＬ−
アラニンを含有する無機培地中で生育する。

■トリプチケースダイズ寒天培地上で褐色の水溶性色素
を生成しない。

■アルギニン、アスパラギン、ロイシン及ヒメチオニン
を含有する混合培地中で生育する。

（３）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性 ■Ｖ−Ｐテスト：陰性 ■インドールの生成：陽性（０，１％トリプトファン含
有トリプトンブロス中） ■硫化水素の生成：陽性（２，５％ペプトン水中） ■デンプンの加水分解：陽性 ■ウレアーゼ：陰性 ■オキシダーゼ：陽性 ■カタラーゼ：陽性 ■チトクローム　オキシダーゼ：陽性 ［相］生育の温度範囲：１３〜４２℃で生育し、２７〜
３０℃において最もよく生育 ■生育ノルＨ範囲：５．５〜９．０ ◎酸素に対する態度二連性嫌気性 ［相］糖類に対する資化性、酸およびガスの生成（資化
性、酸およびガスの生成がおるもの、ないものを、それ
ぞれ＋、−で示す）：（４）　その他の性質 ■グルコン酸の酸化：陰性（グルコン酸オキシダーゼ試
験 ■リジンの脱炭酸反応：陰性〔モラー（’Ｍｏｌ’１−
ｅｒ　）法〕 ■塩化ナトリウムの耐性：陽性（１，０％′Ｎａ０１含
有プロスにおいて生育最大） ■シアン化カリウムの耐性：陽性（モラー法）■フォス
ファターゼ：陽性 ■カゼインの加水分解：陽性 ■ゼラチン溶解性：陽性 ■デオキシリボヌクレアーゼ：陽性 ■リボヌクレアーゼ：陽性 ［相］アルギニン脱水素酵素：陽性 ■グルタミン酸の脱炭酸反応：陰性 ０ビブリオスタテイツク試薬、２，４−ジアミノ−６，
７−ジイツグロビル　／テリジン（０／１１９）に対す
る反応性：陰性 ９２．３−ブタンジオールからアセトインが生産される
が、グルコースからはＩＥされない。

ブキャナン（Ｂｕｃｂａｎａｎ、Ｐ、）等（１９７４年
）、コワン（ｃＯＷａｎ、ｓ、’ｌ’、　）　（１９７
４年）、及びゲルハルト（Ｇｅｒｂａｒｄｔ、Ｐ、　）
等（１９８１年）の系統的方法にょシ調べられた上記性
状と不発明に係るキチン溶解性に基づき、本細菌の種属
を検索すると、キチン分解性を有する生物としては、ご
ワン（１９７４年）のビブリオ（ベネンケア）・バラへ
モリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ（Ｂｅｎｅｃｋｅａ）　ｐ
ａｒａｂｅｍｏｌｙｔｉ−ｃｕｅ　）及びバウマン（ｉ
３ａｕｍａｎ　、　Ｐ、　Ｌ、　）等のビブリオ（りｐ
モバクテリウム）・アルギノリティカス（ｙ、　（Ｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ａｌｇ−ｉｎｏｌｙｔｔ
ｃｕｓ　］が認められる〔ブキャナン等（１９７４）に
よれば、この２種の生物はビブリオ・パラへモリティカ
スに分類されている〕。

キチン溶解性の細菌は既に報吉がめ夛、それらはセラテ
ィア（５ｓｒｒａｔｉａ）稍〔′モラリアル（Ｍｏｎｒ
ｅａｌ、Ｊ、）等（１９６９年）、レイド（Ｒθｉｃｌ
、Ｊ、Ｄ）等（１９８１年）〕、ビブリオ属〔白日等（
１９７９年）〕、ベネンヶア属〔高校等（１９８２年）
〕及びストレプトミセス磯〔レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌ
ｄｓ、Ｄ、Ｍ、）　（１９５４年）〕であると記載され
ている〔プキャナン等（１９７４年）に依ればベネンヶ
アはビブリオ檎に属すると考えられている〕。これらを
参考にすると、不細菌はビプリオナセ工科に鴇するもの
と考えられる。因みに、不細菌はペプトンから硫化水素
を生成する能力がｉｂ、またビブリオスタティック（Ｖ
ｉｂｒｉｏａｔａｔｉｃ）試桑０／１２９に感作しない
点でビブリオ属とは全く相違する。

叙上の証拠よシ、不細菌は菌株アエロモナス・ヒドロフ
イン・亜アネロゲネスＡＴＯＯ１５４６７（工ＦＯ１３
２８２）に類似する。なぜなら、不細菌はｙ−ｐ反応、
グルコン酸オキシダーゼ試験が陰性でろシ、グリセリン
及びグルコースからガスを生成しない〔ブキャナン等（
１９７４年）〕。然し、本細菌が強いキチン溶解活性を
有するのに対し、上記菌株はキチン溶解性を全く示さな
い点で全く相違する。

そこで不発明者は、本細菌を公知の菌株と区別するため
に、アエロモナス・ヒドロフィラ・亜アネ目ゲネス　Ａ
　５２　（Ａｓ　ｒｏｍｏｎａｓ　ｂｙｄ−ｒｏｐｈｉ
ｌａ　５ｕｂｓｐ、　ａｎａａｒｏｇｏｎｅｓ　Ａ５２
：以下において細菌５２と略称することがろる）と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研
菌寄第７２０６号（Ｆｉｌ！ＲＭ　Ｐ−７２０６）とし
て寄託した。

不細菌は次の如くして分離、純化される。

分離は％　０．２％コロイドキチン１．０．１　％ペプ
トン、０．１％肉汁エキス、０．３％塩化ナトリウム及
び２．０％寒天含有キチン−寒天平板培地（１）Ｈ７，
０）上で、試料の懸濁液を１白金耳量画線する（画線平
板法）ことによｐ行った。３０℃で７２時間インキュベ
ーション後、コロニーを採取し、上記と同組成の斜面キ
チン−寒天培地に保存する。コロニーの周囲にはコロイ
ドキチンが溶解している明確な領域が形成される。分離
したコロニーからの当該細菌の純化はキチン−寒天培地
及び普通プロス−寒天培地上で交互に６回平板培養する
ことによシ行う。最後に４７個の分離物のうち、キチン
−寒天培地上で生育が早く、大きく明確なコロニーを形
成するものを細菌Ａ５２として選択した。

斯くして得られた細菌は、１．０％肉汁エキス、ｉ、ｏ
＊ヘフトン％　０．５％塩化ナトリウム、２、０％寒天
含有普通プロスー傾斜培地（ＩＮ−Ｎａ　ＯＨでｐ　Ｈ
＝　７．０に調整）中、２８℃で３日間培養した後室温
で保存し、１箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存する
。

不発明のキチナーゼは、上記細菌を栄養源培地に接種し
培養せしめることによりｓ造される。培養に用いられる
培地としては、酵素誘導基質でるるキチンと当該菌が利
用する栄養源を含むものであれば何れでもよいが、例え
ば１．０％エビ殻キチン、０．２％ブドウ糖、０．５％
ペプトン、１．０％酵母エキス、０．７φリン酸二水素
カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含有（ｌ　ｕ　１
ｌａＯＨでｐＨ＝７．０に調整）するものが挙げられる
。

培養法としては、振盪培養が好適である。

培養に適当な温度は２５〜３０℃であるが多くの場合２
８℃付近で培養する。２〜３日間培養後、培養液は次の
操作に付される。

キチナーゼの単離は、後記実施例に示す如く、キチナー
ゼの理化学的性状を考慮して種々の方法を適、当に組合
せることによって行う。

すなわち、キチナーゼは通常、培養ろ液中に存在するの
で、遠心分離又は濾過等の手段によって培養物から細菌
を分離した後、培養ｐ液に硫酸アンモニウムを添加して
塩析を行う。次いで塩析によシ析出したタンパクの沈澱
’Ｑ０．１Ｍ　）　ＩＪ、’、−ｔｍ酸緩衝１（ｐｕ７
．ｏ）に溶かし、これを遠心分離してその上澄液を粗酵
素液とする。粗酵素液はキチナーゼ及びキトビアーゼを
含有する。

粗酵素液からキチナーゼの単離は、キチナーゼ及びキト
ビアーゼのコロイドキチンへの吸着性の相違を利用して
行う。すなわち、粗酵素液及びコロイドキチンをトリス
−塩酸緩衝液と混ぜ、キチナーゼをコロイドキチンに吸
着させた後遠心分離し沈澱を得る。この沈澱を後記実施
例に示す如く、フェニルメチルスルホニルフルオリド（
ＰＭ８Ｆ）　含有）　ｙスー塩酸緩衝液によシ処理して
コロイドキチンを溶解し、キチナーゼ画分を得る。

キチナーゼ画分から、キチナーゼの分離精製は、Ｂｉｏ
−Ｇｏｍ　Ｆ−２００によるゲル枦遇及びＤｍＡＩ−セ
ファデフクス　ム−５０ＩＣよるカラムクロマトグラフ
ィーによシ行う。

以上の如くして得られたキチナーゼは次のような理化学
的性質を有する。

■作用：キチンに作用して、これを分解する。

■至適ｐＨ：ｐＨ７，０ ■恥　、コロイドキチン−量にして１．３５μ内。

■ｐＨ安定性：３７℃で３０分処理した場合、ｐＨ５，
２〜ｐＨ８，２において８０％以上の残存活性を示す。

■至適温度：Ｉ）Ｈ７，６において、コロイドキチンを
基質とした場合４５℃付近にある。

■温度安定性：コロイドキチン基質でｐＨ７，０におい
て、０〜５０℃、３０分処理で９５−以上の残存活性を
示す。

■等電点”：ｐＨ７，４付近 ■分子量”：１５３，０００ 牽〔ｂ値の測定〕 １、３％コロイドキチンを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，２）　０．４ｍｌ　、　５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，２）１．６ｍｇ、及び酵素液２．０　ｍｌ　７％
らなる反応液を３７℃で４５分間インキュベートし、こ
のときの濁度の減少から活性を測定した。

濁度の減少は６１０Ｕｍの吸光度の減少からめ、１分間
に１％の濁度を減少させる酵素量を１単位とした。結果
はラインライ−バー−パーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−
Ｂｕｒｋ　）ブｏ７トによ６ｉｂ値をめた。ｈ値はコロ
イドキチンの乾物重量で示した。なお、酵素液は精製キ
チナーゼ杼品を用い、１反応液中の酵素量は０．０７５
Ｕで行った。

事牽〔等電点電気泳動〕 ポリアクリルアミドゲルディスク等電点電気泳動はディ
ビス、ビー、ジｘ　−、Ａｎｎ−Ｂｌ。

Ｙ、Ａｃａｄ−［（ｃｌ、＋　１２１．４０４（１９６
４）に基き、７．５％ゲル、トリス−グリシン緩衝液（
ｐＨ８，４）中で行った。チューブ一本らたシ２〜４ｍ
Ａの電流を流し、５℃で泳動した。

…〔分子量〕 ５ｎｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。

斯くして得られる不発明のキチナーゼは細胞壁溶解酵素
としてプロトプラストの形成等に利用できるものでろる
。

次に実施例を挙げて説明する。

参考例１ （１）　エビ殻キチンの調製 冷凍エビ殻を解凍し、１０分間ワーリングプレンダー処
理を行ない、水道水で３回以上水洗する。得られたエビ
殻フレークを、１１１水酸化ナトリウムに１晩浸漬して
除タンパクを行ない、水道水で３回以上水洗する。次い
で得られた除タンパクエビ殻フレークヲ１１１１地酸に
１晩浸漬してカルシウム分を除く。以上の操作によシ得
られた精製エビ殻フレークを水道水で水洗後、ＩＮ水酸
化ナトリウムでｐＨ７，０に調整後、１０分間ワーリン
グブレンダー処理し、乾物量を２％に調整して、オート
クレーブで１２０℃にて２０分間滅菌する。

（２１コロイドキチンの調製 （１）で得たエビ殻キチンをボールミルで約２４時間粉
砕しボールミルキチンとした。このボールミルキチンを
以下の操作に付しコロイドキチンを得た。

８１．冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボールミルキ
チンと湿塩酸をよく混合する。

ｂ、大量の冷水中によく攪拌しながら滴下分散させる。

ｃ、１ｓｏｏｏｒで１０分間遠心分離することにより水
洗する。

ｄ、ワーＩＪ７グプレンダーで１０分間処理する。

８、　１８００（ｌで１０分間遠心分離してコロイドキ
チンを集め、更に０．０２５Ｍ　）リス−塩酸塩緩衝＊
　（ｐＨ７，２）で洗う。

斯くして得られたコロイドキチンは、適宜緩衝液に分散
させ使用に供される。

実施例１ （１）酵素生食のための培養 水道水１１にペプトン５？、酵母エキス５ｆ。

リン酸二水素カリウム０．６８ｆを加え、ＩＮ−水酸化
ナトリウムでｐＨ７，Ｑに調整した前培養培地を、綿栓
試験管に５　ｍｌずつ入れ、常法に従い滅菌する。次い
でこれに保存培地から細菌Ａ５２を一白金耳接種し、２
８℃で２４時間振盪培養を行なう。本培養は、水道水１
！に、エビ殻キチン１０ｆ１グルコース２ｔ％ペプトン
５ｔ％酵母エキス１０ｆ１　リン酸二水素カリウム０．
６８ｆ、塩化ナトリウム３ｆを加え、ＩＭ−水酸化ナト
リウムでｐＨ７，０に調整した不培養培地を、５００−
容フラスコに７０ｍ１ずつ分注し、常法に従い滅菌する
。

次いでこれに培養終了後の前培養培地１　ｍｌを接種し
、２８℃で７２時間振盪培養（２４Ｏｒｐｍ）した。

（２）粗酵素液の調整 培養終了後、不培養培地から１８０００９で２０分間遠
心分離することにより菌体を除いた後、細菌による汚染
を防ぐために最終濃度０、０２　％となるようにアジ化
ナトリウムを加え培養ろ液とした。次いで０℃冷却下、
スターラーで静かに攪拌し々から、培養Ｐ液に８０チ飽
和にガるように固形硫安を除々に加え塩析を行った。こ
のとき、培養ν液のｐＨが酸性側に傾かないように、Ｉ
Ｎ−水酸化ナトリウムでｐＨ７，０付近に保持しながら
行った。

塩析は０〜４℃に冷却しながら１時間以上行った。塩析
によシ析出したタンノζりの沈澱は。

１８０００Ｆで２０分間遠心分離して集めた。

この沈澱を培養Ｐ液の１０分の１容の０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（１）Ｈ７，０）に溶かし、０〜４℃に冷却
して１時間静置後、不溶物を１８０００９で２０分間遠
心分離で除き、上清全粗酵素液とし、−２０℃で凍結保
存した。

（３１キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼの分
離 コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違いによシ次
の如くして分離したつ 粗酵素液７５−（キチナーゼ約８８７Ｕ）と、コロイド
キチン２．５ｆＣ乾物重量）を含む２５ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，２）３００１を混ぜ、時々攪拌しな
がら水冷下で１時間、キチナーゼをコロイドキチンに吸
着させた。次いで１８０００ｔで２０分間遠心分離を行
ない沈澱を採取した。この沈澱に０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む２５　＋ｎＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
２）　４００　ｍ’ｌ：加え、水冷下でよく分散させ、
１時間かけて十分洗浄し、１８００（ｌで２０分間遠心
分離してキチナーゼ以外の不純タンパクを除いた。得ら
れた沈澱に１ｍＭＰＭＥＩＦを含む２５　ｍＭ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）　３００祷を加えよく分散
させ、３２℃で１２時間インキュベートしたところ、コ
ロイドキチンがほぼ完全に溶解してキチナーゼが遊離し
た。ここで再び１８０００ｆで２０分間遠心分離して不
消化物を除き上清をキチナーゼ画分とした。

（４）　キチナーゼの精製 実施例１の（３）で得られたキチナーゼ両分をエバポレ
ーター濃縮後％　２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，２）で平衡化したＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｆ−２００のカラ
ム（２，６Ｘ１００ｃｍ）でゲル濾過を行った。流速は
２８ｗ１／時とした。次いでゲル濾過で得たキチナーゼ
画分を、透析チューブ中でショ糖によシ濃縮を行った後
％　２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ７，２）で平
衡化した。　ａ　ａ　ＢニーセファデックスＡ−５０の
カラムクロマトグラフに付しくカラムサイズ：　２．６
　Ｘ−４５ｔ１ｎ）精製キチナーゼを得た。なお、溶出
は塩化すｌ−ＩＪウム濃度勾配Ｏ→０．３Ｍで、流　１
速は４２ｍＪ／時とした。

以上の各操作段階におけるキチナーゼの精製度及び回収
率を第１表に、ま７’ｊＤｉ！ＸＡｌ−セファデツクス
Ａ−５０によるカラムクロマトグラフを第１図に示す。

第１表よシ明らかな如く、上記操作によシ粗酵素液中の
キチナーゼは１７１倍に精製された。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図はＢｉｏ−Ｇｅｍ　Ｆ−２００（Ｄ’ｊＪラムＶ
ＣヨＦ）ゲル濾過して得られたキチナーゼ画分のＤｍｈ
ｍ−セファデンクスＡ−５０にょるカラムクロマトグラ
ムを示す図面でるる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　下記の理化学的性質を有するキチナーゼ。 ■作用：キチンに作用して、これを分解する。 ■至適ｐＨ：ｐＨ７，０ ■ｈ：コロイドキチン量にして１．３５μｆ／Ｍ０■ｐ
   Ｈ安定性：３７℃で３０分処理した場合、ｐＨ５，２〜
   ｐＨ８，２において８０％以上の残存活性を示す。 ■至適温度：ｐＨ７，０ＩＦ−おいて、フルイドキチン
   を基質とした場合４５℃付近にある。 ■温度安定性ニコルイドキチン基質で７３Ｈ７，０にお
   いて、０〜５０℃、３０分処理で９５％以上の残存活性
   を示す。 ■等電点：ｐＨ７，４付近 ■分子量：１５３，０００ ２、アエロモナス属に楓するキチナーゼ生産菌を培地に
   培養し、その培養物からキチナーゼを採取することを特
   徴とするキチナーゼの製造法。 ３、　キチナーゼ生産菌がアエロモナス・ヒドロフイラ
   ・亜アネロゲネスＡ５２である特許請求の範囲第２項記
   載のキチナーゼの製造法。