JPS58216692A - 含硫アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−含硫アミノ酸、即ちＬ−システィンおよび
Ｌ−シスチンの製造法に関する。

従来、Ｌ−システィン（以下、ジスティント略す）およ
びＬ−シスチン（以下、シスチンと略す）は毛髪等のシ
スティンやシスチ／の含−の高い天然物を鉱酸で加水分
解し、生じたアミノ酸混液よりシスチンとして単離取得
し、システィンはこのようにして得られたし一シスチン
を還元して製造されていた。

これに対し、本出願人ｔこおいては既に、２−アミノ−
チアシリノー４−カルボン酸（以下、ＡＴＣと記す。）
を原料とし、微生物の作用を利用してシスティン又はシ
スチンを製造する方法（特開昭５１−１３６６１９号公
報参照）を開発した。

この方法？こ於ては、ＡＴＣを含硫アミノ酸に変換する
能力を有する微生物が酵素源として使用され、この酵素
は誘導酵素であるため、酵素誘導剤として原料のＡＴＣ
が必委とされている。しかしながらＡＴＣは高価であり
、原料の１部を酵素誘導剤として使用することは経済的
でなく、この方法を工業的に実施し、含硫アミノ酸を安
価１こ製造するためｔこは、酵素誘導剤として使用する
ＡＴＣの駿を削減し、かつ菌体の酵素活性を高くするこ
とが必要とされていた。そこで本発明者等は培養液の酵
素活性を高める方法を開発することを目的として種々研
究を重ねた結果、ＡＴＣの培地への添加時期を微生物の
対数増殖期、特ｒこ対数増殖期の後半？こすることｔこ
よってＡＴＣが大巾ｔこ削減できること、更に、培養し
て得られた培養液を３０〜４５ＵＦこ少くとも１時間以
上保持して熟成することｔこよりＡＴＣ水解活性が２０
〜４０％増大することを発見した゛。本発明はこの発見
ツこ基づいて完成されたものである。

てなる含硫アミノ酸の製造法１こ関する。

囚　アクロモバクタ−属、アルカリ土類金属、バチルス
属、ブレビバクテリウム属、エンテロバクタ−属、エル
ビニア属、エッゾエリヒア属、フラボバクテリウム属、
ミクロコツカス属、ミコプラナ属、シュードモナス属、
サルシナ属又はセラチア属？こ属し、２−７ミノーチア
ゾリノー４−カルボン酸を水解してシスティン又はシス
チンを生成する能力を有する微生物を栄養培地で培養し
、対数増殖期ｔこＡＴＣを添加して培養する工程 （Ｂ）　　培養液を３０〜４５ｔ、’に少くとも１時間
以上保持して熟成する。［稈 （Ｃ）　　熟成した培養液ｔこ含まれる微生物をＡＴＣ
ｔこ作用せしめてンスティ／又はシスチンを生成せしめ
る工程　　゛ υ）　生成したシスティン又はシスチンを採取する工程 上記（Ａ）工程に於て使用する微生物は、アクロモバク
タ−、アルカリゲネス、バチルス、ブレビバクテリウム
、エンテロバクタ−、エルビニア、エノ７エリヒア、フ
ラボバクテリウム、ミクロコツカス、ミコプラナ、シュ
ードモナス、サルシナあるいはセラデアの各属ｔこ属し
、ＡＴＣを水解してシスティン又はシスチンを生成する
能力を有する微生物であり、その他自然界に存在する野
生株、公的な微生物保存機関ｔこ保存されている菌株或
いはそれらより人工的に変異誘導した微生物群より、Δ
゛ｒＣからのシスチ／又は（及び）７フーテイン生産能
のイｉ無を調べることによって分離採取されるものも使
用できる。

より具体的ｔこ例示するならば次の如き菌株があげられ
る：サルチナ・ルテアＡＪ−１２１７（５ａｒｃｉｎａ
　Ｉｕｔｅａ　）　ＡＴＣＣ２７２、アクーモパクター
会デルマルバアＡ　Ｊ　−１９８３（Ａｃｈｒｅｍｅｂ
ａｅｔｅｒ＋ｌｅ１ｍｑｒｖａｅ　）　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　
−Ｐ　３４８３、アルカリゲネス・デニトリフィカンス
ＡＪ−２５５３（ΔＩｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｄｅｎｉｔ
ｒｉｆｉｃａｎｓ　）　ＡＴＣＣ＋５１７３、バチルス
・プレビスＡＪ−１２８２（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖ
ｉｓ　）ΔＴＣＣ８１８５、ブレビバクゾリウム・フラ
バムＡ　Ｊ　−１５１６（Ｂｒｅｖｉｌ＞ａｅｔｅｒｉ
ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ΔＴＣ；Ｃｌ３８２６、エンテロ
バクター・アエロゲネスへＪ　−２６４３（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓＩＡＭ１０１９）
ＦＥＲＭ−Ｐ２７６４、エルピニア・カロトボラＡ　Ｊ
　−２７５３（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ
ＣＣＭ８７３）ＦＥＲＭ−Ｐ２７６６、シュードモナス
・チアゾリノフイラムＡＪ−３８５４（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｐｈｉｌｕｍ　）　Ｆ
　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ２８１０、シュードモナス・デスモリ
チ力ＡＪ２３６８　（Ｐ、　ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ　
）　ＦＥＲＭ−Ｐ２Ｂ＋６、エノシエリヒアａｊすＡ　
Ｊ　−２５９２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　
　ＩＡＭｌ１３２）ＦＥＲＭ−Ｐ２７６３　　、　　　
ミ　クロコツカス・ソド千ソンヌＡＪ−１７５３（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　５ｏｄｏｎｅｎｓｉｓ　）　Ａ　
ＴＣＣ１１８８０、ミコプラナ・ジモルファＡ　Ｊ　−
２８０９（Ｍｙｃｏｐｌａｎａｄｉｍｏｒｐｈａ　）　
ＡＴＣＣ４２４９、セラチア・マルセンセ／スＡ　Ｊ　
−２６９８（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
ＩＡＭ１２０６）ＦＥＲＭ−Ｐ２７６６、　フラボバク
テリウム・アイドフィクムＡＪ−２４９４（ｌ’ｌ　ａ
ｖｏｈａｃｌｅｒｉｕｍ　　ａｃｉｄｏｆｉｃｕｍ　　
）　　Ａ　　Ｔ　　ＣＣ８３６６、ソ゛ソドモプースー
メバリスへＪ−２２３６、（Ｐｓｅｕｄｏｍｅｎａｓ　
ｏｖａ　Ｉ　ｉ　ｓ　　１八Ｍ＋４５４）ＦＥＲＭ−Ｉ
）　２７６２等が挙げられる。

微生物を培養するための培地は炭素源、窒素源、無機イ
オノ、史しこ侠すれば有機微歇栄養素を適宜含イｊする
１１′９地であり、例えば、炭素源としてグルコース、
／ユクロース、キシロース、糖ｉ等の糖類、　酢酸等の
有機酸、エタノール、グリセロール、メタノール等のア
ルコール類など、壁素源として硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムなト、有機栄養源として、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーン・ステイープリカーなど、無
機イオンとして、マグネシウム、鉄、マンガン、カリウ
ム、ナトリウム、す７　ｖ、ｆＫどのイオンが適宜用い
られる。

微生物の培養法は常法ｔこ従って行えば良く、上記培地
のｐ　Ｈを６〜９とし、２０〜４０Ｃで好気的ｒこ培養
し、対数増殖期、特に対数増殖期の後半、更ｔこ其体的
には後記第１表ｒこ示す組成の培地を用いて３０Ｕで４
〜８時間培養した時点、菌体濃度で示せば培■液を１／
　２６　ｒこ希釈した液の５６２ｎｍ　ｔこ於る吸光度
が０４〜０．７１こ達した時点で、培養液Ｅ　Ａ　Ｔ　
Ｃを０．０５−０．６％、【ノ；−マシ＜　ハ０．０５
〜０．１％添加し、更に培養して酵素活性の高い培養液
を摺る。このようｔこ対数増殖期を選訳することｔこよ
って酵素誘導体のＡＴＣの量、を１１５〜＋／ｘｏｒこ
削減することができる。

（１３）工程會こ於ては、」二記培養液を３０〜４５ｒ
の温度ｔこ少くとも１．０時間以上、望ましくは１．０
〜３．０時間保持して培養液の熟成を行う。この熟成期
間中は培養液をゆるやかＶこ＊、ｑすることが望ましく
、この熟成工程を２１人することｔこより培養液の酵素
活性は２０〜４０％増大し、かつ、安定した酵素活性が
得られる。

（Ｃ）−１−程は−に記熟成しｔこ培養液ｔこ含まれる
微生物なＡＴＣｒこ作用せしめてシスティンはシスチン
を生成せしめる二［程であり、この工程ｔこ於ては、熟
成した培Ｎ液Ｖこ含まれる微生物を酵素源として使用す
る。即ち、熟成した培養液、培養液から分離した分離菌
体、洗滌生菌体、凍結乾燥体、アセトン乾燥菌体、物理
的、化学的もしくけ生化学的ｔこ破壊された菌体、抽出
液、粗精製物、精製物、精製蛋白標品、または菌体もし
くは精製処理物の固定化物などを酵素源として使用する
。

原ｔ・１であるＡＴＣは合成法にて供給されるもので、
Ｉ）一体、Ｉ５一体、ラセミ体のいずれもが使用さする
１１ ．１１．、　質？Ｍ度は、バッチ式、連続式Ｖこよって
も異なるが、バッチ式では一般ｔこ水性媒質中０．１〜
３゜係、好ましくは０．５〜１０％稈度で連続式では、
これよりやや濃度を低下させた方が好ましい。

反応は、首通、水性媒質中で１５〜６０　ｃ、好ましく
は３０ｒ−５０ｃ附近で、ｐＨ＝６−１０゜好ましくは
７．０〜９．５附近で行なわれる。反応時間は、静置、
攪性、流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力ｌｌｌ
１ｌｔこよって異なってくるので一様ではないが、バッ
チ法では通常１ｏ分〜７２時間稈度である。

反応が進行すると、反応液中ｔこシスティンとシスチン
が共存するのであるが、通常／スティンは空気中の酸素
により酸化されてシスチンに変化し易く、時間がたっ１
こっれてシスチンの昂が増大する。しかしながら、反応
条件等の変更１こよってシステ、インとシスチンの濃度
比を変えることも可能である。なお、反応液にヒドロキ
シルアミンやセミカルバジドを添加することによってシ
スティン及び／またはシスチンの収率を向上することが
できる。

α））工法ｔこ於るシスティン及びンスチ／の採取法は
常法１こ従って行えば良く、例えば、通気酸化１こより
大部分をシスチンとし、その難溶性を利用して晶析する
方法ｔこ上りＬ−シスチンを得ることができる。また、
システィンにする場合は電気還元ｔこよる通常の方法で
処理して、／スティンとして採取することができる。

シスチンとシスティンの定量は、液体クロマトグラフィ
ーと微生物定量法ｔこまって行われる。後者は乳酸菌ｐ
イつノストノク・チトロボラムＡＴＣＣ８０８１を用い
る方法であるが、この菌はシスチンとンスティ／の双方
によって何等の生育な手えもれるので両アミノ酸の和を
定量すること１こ／ｌす、通常シスチンとして表示され
る。なお、この菌をより体のシスチン、システィンでは
生育できない。

以ド、実施例ｔこて説明する。

実施例１ 第１表に示す組成の培地１．Ｏｔを２．Ｏｔ容のジャー
ファーメンタ−に張り込み、１２０Ｃで１５分間加熱・
滅菌した。

第１表培地組成 グルコース　　　　　　　　　　２０　１Ｋｌｌ、　Ｐ
Ｏ４２，０／／ ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０１，０／ｌ Ｆｅ５Ｏ４ｅ７Ｈ，ＯＯ，０２〃 ＭｎＳＯ４会７ＨＱ　ＯＯ，６２＃ （ＮＨ４）、５０４　　　　　　　　　　　　　３．０
　１１大豆蛋白分解液　　　　　　　　１０．０　笥ｌ
ｐＨ６，５ こし１こシュードモナス・デスモリチカ　ＦＥＲＭ’−
Ｐ２８１６　　の種３名養液５０−を接種し、ａｏｒに
て通気ｍ１．ｌ′ｌ培養（’／２ＶＶＭ、　　６００　
ｒｐｍ　）を開始した。培養期間中培養液のｐ　Ｈは６
５にコントロールし、培ｉ〔開始時、及び一定時間培養
後、培養液ｔこＤＬ−ＡＴＣ，を０．１　％添加して培
養を続け、培養開始後＋　２１＋、！ｆ間で培狙を終了
した。得られた培養液ｔこＤＬ、−Ａｉ’Ｃ５，０チ、
ＫＨ，ＰＯ４０，１チ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０３
％を添加し、ｐＨを８．０ｔこ調節後、３０Ｃ１こ２４
時間保持して反応を行った。反応終了後裔反応液を通気
下で激しく損性しシスティンを酸化させてシスチンに変
換せしめた。

この反応液に６Ｎ−ＮａＯＨ溶を加えてシスチンを溶解
し、ＣＰＫ−０８（強酸性カチオン交換樹脂）カラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー１こてシスチンを定
植した。その結果を第２表１こ示す。

第２表　ＡＴＣ添加時期とシスチン生成量０（時間）　
　　　　　　０．０３　　　　　　　０．０２２　　　
　　　　　　０：Ｏｓ　　　　　　　ｏ、ａ　ｓ４　　
　　　　　　　　　　　　　０．２　１　　　　　　　
　　　２．３　０６　　　　　　　　　　　　　　　０
．３５　　　　　　　　　　３．０　６８　　　　　　
　　　　　　　　　０．６　０　　　　　　　　　　３
．１　８１０　　　　　　　　　　　　　　　０．７　
５　　　　　　　　　　１．６　６１２　　　　　　　
　　　　　　　　０．８　８　　　　　　　　　　０．
５　２第２表ｔこ示すようｔこ、菌体濃度が０．３５〜
０．６０の時期、即ち、対数増殖期間中ｔこ添加する場
合ｔこ最も活性が高いことが確認された。同様の方法で
、培養６時間後にＡＴＣを添加し再に４時間通気損性し
て１．０１の培養液を得た。この培養液を５ｄ宛に分け
て、夫々＋０２１？から６０ｒの温度ｔこ１時間保持し
て熟成を行った。この熟成培養液ｔこ下記第３表ｔこ示
す基質溶液５．０ｍｌを加えて混合し、３０ｔｌｌ’に
３時間保持して酵素反応を行った。

第３表　基′肖溶液の組成 １）］、−ＡＴＣ＠３Ｈ，０２，Ｏｆ／ｄｅＫＨ，１Ｐ
Ｏ４１，０〆Ｉ 塩酸ヒドロキシルアミン　　　　０．３　　〆Ｉ、　Ｈ
ｓ、。

反応終了後、６　Ｎ　−ＮａＯＨ溶液を５．０ｍ／添加
して良く攪拌し、高速液体クロマトグラフィーｔこてシ
スティン及びシスチンの生成量を定量した。その結果を
第４表ｔこ示す。

第４表　熟成温度と含硫アミノ酸の生成量２０　　　　
　　　　　０．２　　　　　　　　０．２　　　　　　
　　０．４０２６　　　　　　　　　０．２　　　　　
　　　０．２　　　　　　　　０．４０３０　　　　　
　　　　　０．２　　　　　　　　　０．２５　　　　
　　　０．４５３５　　　　　　　　　０．３５　　　
　　　　０．２０　　　　　　　０．５５４０　　　　
　　　　　０．３５　　　　　　　０．３０　　　　　
　　０．６５４５　　　　　　　　　　０．２５　　　
　　　　０．３０　　　　　　　０．５５５０　　　　
　　　　　　０．２０　　　　　　　０，１０　　　　
　　　０．３０５５　　　　　　　　　　０．１０　　
　　　　　０．１　０　　　　　　　０．２０６０　　
　　　　　　　　０、ｊＯＯ，００，１第４表に示すよ
うｒこ、熟成温度は３０〜４５Ｕの間が良いことが確認
された。

同様にして上記培養液を４０Ｕに一定時間保持し、保持
時間と熟成効果との関係な調べた。その結果を第５表に
示す。

第５表　保持時間と熟成効果 ０　　　　　　　　　　０．３　５　　　　　　０．１
　５　　　　　　０．５　０１　　　　　　　　　　０
．４　５　　　　　　　０．＋　　５　　　　　　　０
．６　０２　　　　　　　　　　０．４　５　　　　　
　０．２　０　　　　　　０．６　５３　　　　　　　
　　０．４　８　　　　　　０．２　０　　　　　　０
．６　８４　　　　　　　　　０．４　３　　　　　　
０．１　５　　　　　　０．５　　Ｂ６　　　　　　　
　　０．３　０　　　　　　０．０　５　　　　　　０
．３　５第５表ｔこ示す結果から保持時間は１〜４時間
で充分の熟成効果が得られることがわかる。

実施例２ 実施例１と同様の方法でシュードモナス・デスモリチカ
ＦＥＲＭ−Ｐ２８１６を培養し、培養６時間培養後、Ｄ
Ｌ−ＡＴＣを０．１　％添加して、再に４時間通気攪拌
培養を行った５、得られた培養液を４０、Ｃｔこ３時間
保持して熟成を行い、次いで遠心分離して菌体を集めた
。菌体を０．１Ｍ！Ｊン酸緩衝液で洗浄しこれな第３表
ｔこ示す基を着溶液１．Ｏ４に懸西液を３６℃に２４時
間保持して反応を行った。

反し色、液を通気下で激しく攪４してンステイノを酸化
してシスチン変換せしめ、結晶として析出せしめた。析
出した結晶をｒ１憚別し、ＩＮ−ＭＣＩｔこ溶解し、６
　Ｎ　−ＮａＯＨを加えて中和し、シスチンを再結せし
め、８．５ｆのシスチンの結晶を採取した。

この結晶はＮＭＲスペクトル、Ｘ線回折像、比旋光度の
データからＬ−シスチンと同定された。尚、旋光度純度
は９４．５　％であった。

実施例３ 第１表に示す組成の培地を調製し、５０〇−容振盪フラ
スコに５０−充分注し、１２０’ＣＦごて１０分間加熱
した。この培地ｔこ下記第６表ｒこ示す試験菌株を１白
金ｒ１２接種し３０ｒで２４時間振盪培養を＜ｊつだ。

培養開始時及び対数増殖期（培養開始後８．０時間）　
ｔ：　Ｄ　Ｌ−八ＴＣを０．１％添加し史？こ６．０時
間１９　養を行った。対数増殖期ｔこＤＬ−ＡＴＣを添
加して得られた培九液を２分し、−力ｔこついては４０
Ｕｒこ３時間保持して熟成をｆ］つだ。

夫々の１Ｍ！ｉ液５．Ｏｍｌ！’ｒこ第３表の基質溶液
５．０ｍｌを混合し、３０ｒｒこ４０時間保持して反応
を行った。

各反応液中のソステイン及びシスチンを高速液体クロマ
トグラフィーで定敞した。その結束を第６表に示す。

第６表　含硫アミノ酸の生成Ｅｔ　　（ｒ／Ｍｅ）Ｓ、
　　１ｕｔｅａ　　八ＴＣＣ２７２１１２３２８Ａ、ｄ
ｅｌｍｌＩｒｖａｅ　ＦＥＲＭ−Ｐ３４８３　　　　　
１８　　　　　１７２　　　　２１６Ａ、ｄｅｎｉｔｒ
目’１ｃａｎｓ　Ａ１℃Ｃ：１５１７３　　　８　　　
　　３２　　　　　４３Ｂ、ｂｒｅｖｉｓ　ＡＴＣＣ８
１８５８２８３５１３ｒｃｖｉ　、ｆｌａｖｕｍ　ＡＴ
ＣＣ８３６６３９１５Ｅｎｔ、　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　
ＦＥＲｔｖ）−Ｐ２７６４　　２８　　　１８０　　２
０５Ｅ、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　ＦＥＲＭ−Ｐ２７６６
　　　　３　　　　　１９　　　　　２５Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　３　　　　　６Ｍ、５ｏｄｏｎｅｎｓｉｓ　ＡＴ
ＣＣ１１８８０３２１４５１６７Ｍｙｃｏ、　ｄｉｍｏ
ｒｐｈａ　ＡＴＣＣ４２７９２５１２３１３６３、ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＦＥＲＭ−Ｐ２７６５　　　　４　
　　　　１８　　　　２５Ｆ、ａｃｉｄｏｆｉｃｕｍ　
ＡＴＣＣ８３６６１３５Ｐｓｅｕ、ｏｖａｌｉｓ　ＦＥ
ＲＭ−Ｐ２８１３　　　　３５　　　　２１５　　　　
２４５Ｐｓｅｕ　−ｔ　ｈ　ｌ　ａｚｏ　Ｉ　Ｉ　＝ｗ
ｌ　、ｊ、ＭＢ、ｏ４５３２３３６Ｂ特許出願人　味の
素株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 次の（ト）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の各工程を含有
   してなる含硫アミノ酸の製造方法。 （Ａ）　　アクロモバクタ−属、アルカリ土類金属、バ
   チルス属、ブレビバクテリウム属、エンテロバクタ−属
   、エルビニア属、エノゾエリヒア属、フラボバクテリウ
   ム属、ミクロコンカス属、ミコプラナ属、シュードモナ
   ス属、サルシナ属又はセラチア属ｔこ属し、２−７ミノ
   ーチアゾリンー４−カルボン酸を水解してＬ−／スティ
   ン又はＬ−シスチンを生成する能力を有する微生物を栄
   養培地で培養し、対数増殖期に２−７ミノーチアゾリン
   ー４−カルボン酸を添加して培養する工程。 （Ｂ）　　ＧＡ）工程で得られた培養液を３０〜４６　
   Ｕｔこ少くとも１．０時間以上保持して熟成する］二程
   。 （Ｃ）　　熟成培養液に含まれる微生物を２−アミン−
   チアゾリン−４−カルボン酸ｔこ作用させてＬ−システ
   ィン又はＬ−シスチンを生成せしめる工程。 （ｒ））　　Ｌ−システィン又は１７−ジスチンヲｎ　
   Ｑ　−する工程。