CN105861582A - 一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法 - Google Patents

一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，(1)维生素K3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至pH4.0后，用乙酸乙酯萃取产物，浓缩后冷冻结晶，过滤除清液得到维生素K3氢醌；(2)将维生素K3氢醌和DMAPP加入酶促反应体系中，反应在密闭和N2保护条件下进行，反应完成后，加入Fe3+，去除N2保护，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到产物。本发明核心环节为生物酶催化工程技术，利用廉价的维生素K3催化合成高值的维生素K2。本发明生产工艺简单，生产成本低廉，生产过程绿色环保。

Description

一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法
技术领域
本发明属于芳香族异戊烯基转移酶催化合成精细化学品领域，具体涉及一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法。
背景技术
维生素K2是维生素K家族中的一员，其分子结构特征为2位被多聚异戊二烯侧链取代的3-甲基-1,4-萘醌。根据其多聚异戊二烯侧链聚合单元数目，可以分为MK1、MK2、MK4等14种。在自然界中，维生素K2主要存在于原核生物中，为细胞膜上电子传递链组成成分，同时也是各种维生素K在人体内被利用的最终活性形式。
维生素K最早被人们所认知是因为其凝血活性，它是凝血因子γ－羧化酶的辅酶，同时也是凝血因子7、9、10合成的必需条件。缺乏维生素K会导致凝血时间延长，严重者甚至无法凝血。在防止新生儿出血疾病，预防内出血及痔疮，减少女性生理期大量出血，促进血液正常凝固方面具有重要作用。随后人们发现维生素K2对治疗和预防骨质疏松有明显效果，可以促进成骨细胞钙化，增加骨密度，防止骨折。近些年来，维生素K2在抗肝癌方面的作用逐渐显现出来，研究证实了其对人肝癌细胞的生长增殖抑制作用和诱导凋亡作用。最近神经科学方面的研究表明，维生素K2能恢复受损神经细胞线粒体功能，可能在帕金森症治疗方面具有重要意义。
维生素K2目前可以通过化学合成法和微生物发酵法来合成，现阶段国内以化学法为主。化学法合成的维生素K2产品存在异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且受化学前体原料来源限制。利用微生物发酵法制备维生素K2，发酵原料易得、条件温和、环境压力低，同时因为本身来源于生物，制备的维生素K2具有高生物活性和高生物相容性，易于人体吸收与利用。然而微生物发酵制备维生素K2代谢过程非常冗长，且分支节点多，受多种代谢物抑制，整体合成效率低下，后续纯化工艺复杂，目前难以满足大规模生产需要。目前国内外利用单酶体外催化法合成维生素K2还未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下方案：一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，包括以下步骤：
(1)维生素K3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至pH4.0后，用乙酸乙酯萃取产物，浓缩后冷冻结晶，过滤除清液得到维生素K3氢醌；
(2)将维生素K3氢醌和DMAPP加入酶促反应体系中，反应体系包含NovQ芳香族异戊烯基转移酶，pH缓冲液，Mg2+，抗氧化剂；反应在密闭和N2保护条件下进行，反应完成后，加入Fe3+，去除N2保护，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到产物；
所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶为重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶或天然NovQ芳香族异戊烯基转移酶(来源自雪白色链霉菌Streptomycesniveus)，浓度为0.1～4g/L。
优选地，步骤(1)所述乙醇水溶液乙醇与水的体积比为1～3:1。
优选地，步骤(1)加入NaBH4浓度为600～1500mmol/L，维生素K3浓度为750～800mmol/L，NaBH4与维生素K3摩尔比为2:1～3:4，反应时间为6～18h。
优选地，步骤(1)所述浓缩倍数为4.5～5.5倍，冷冻结晶温度为-20～-80℃。
优选地，步骤(2)所述维生素K3氢醌加入浓度为5～20mmol/L，DMAPP加入浓度为5～10mmol/L。
优选地，pH缓冲液为Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种，pH范围6.5～7.5，浓度50～200mmol/L；所述Mg2+由MgCl2或MgSO4提供，Mg2+浓度为5～20mmol/L；抗氧化剂为还原型谷胱甘肽、抗坏血酸、α-生育酚中的一种，浓度为5～20mmol/L；
优选地，步骤(2)反应条件为25～40℃，反应时长24～48h。
优选地，步骤(2)加入的Fe3+由FeCl3或Fe2(SO4)3提供，Fe3+加入浓度为7～20mmol/L。
优选地，NovQ芳香族异戊烯基转移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6或SEQID NO:7所示。
本发明相比于现有技术具有如下的优点：
本发明核心环节为生物酶催化工程技术，利用廉价的维生素K3催化合成高值的维生素K2。本发明生产工艺简单，生产成本低廉，生产过程绿色环保。在维生素K3氢醌和DMAPP底物浓度均为10mmol/L情况下，30℃反应24h，反应液中维生素K2含量可达0.989g/L，转化率为41.2％。本发明对维生素K2工业生产具有重要意义。
附图说明
图1为HPLC维生素K3谱图
图2 HPLC反应液谱图
图3为novQ基因片段电泳图
图4为novQ基因改造修饰电泳图
图5为Ppic9酶切线性化电泳图
图6为Ppic9-novQ重组质粒电泳图
图7为NovQ蛋白western-blot检测图谱
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将5.17g(30mmol)维生素K3溶解于40mL乙醇水溶液(1:1，v/v)中，分次加入1.13g(30mmol)NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃搅拌反应12h至体系呈淡绿色透明液体。用100mmol/L稀盐酸中和至pH4.0后，用120mL乙酸乙酯分三次萃取产物，萃取液在氮气保护下浓缩至约8mL，-80℃冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至1.6mL，-80℃冷冻结晶，过滤，合并两次过滤的晶体得到4.73g维生素K3氢醌，产率89.5％。空气中氧化后，经HPLC检测，其出峰特征如图1所示(出峰时间3.19min，检测器A248nm)。
实施例2.
将107.44g(780mmol)维生素K3溶解于800mL乙醇水溶液(3:1，v/v)中，分次加入45.40g(1200mmol)NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应6h至体系呈淡绿色透明液体。用100mmol/L稀盐酸中和至pH4.0后，用2.4L乙酸乙酯分三次萃取产物，萃取液在N2保护下浓缩至约0.177L，-20℃冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至约0.039L，-20℃冷冻结晶，过滤，合并两次过滤的晶体得到96.07g维生素K3氢醌，产率90.9％。
实施例3.
将68.87g(400mmol)维生素K3溶解于500mL乙醇水溶液(2:1，v/v)中，分次加入11.35g(300mmol)NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应18h至体系呈淡绿色透明液体。用100mmol/L稀盐酸中和至pH4.0后，用1500mL乙酸乙酯分三次萃取产物，萃取液在N2保护下浓缩至约91mL，-50℃冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至约16.5mL，-50℃冷冻结晶，过滤，合并两次过滤的晶体得到57.85g维生素K3氢醌，产率82.1％。
实施例4
将0.2g的重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶(来源自专利菌种CCTCC M2016105，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山八一路299号，中国典型培养物保藏中心)，溶解于100mL的Tris-HCl缓冲液中(50mmol/L，pH 7.5)，加入0.20g(1mmol)的MgCl2.6H2O，0.25g(1mmol)的DMAPP铵盐，充分溶解后，在N2保护下加入0.18g(1mmol)实施例1中获取的维生素K3氢醌，0.15g(0.5mmol)还原型谷胱甘肽。N2保护下密闭反应24h，反应温度40℃。酶促反应结束后，撤去N2保护，加入0.19g(0.7mmol)FeCl3.6H2O，30℃下震荡反应4h。使用200mL乙酸乙酯，分三次萃取，合并有机相，得到维生素K2与维生素K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1(v/v)的甲醇/二氯甲烷，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长248nm。HPLC检测出峰特征如图2所示(维生素K3出峰时间3.19min，维生素K2出峰时间3.49min，检测器A248nm)。检测结果萃取液中维生素K2(MK1)浓度为0.495g/L，换算为反应液中维生素K2(MK1)浓度为0.989g/L。维生素K3氢醌和DMAPP转化率为41.2％，全过程维生素K3转化率为36.9％。
实施例5
将8g的天然NovQ芳香族异戊烯基转移酶(来源自雪白色链霉菌Streptomycesniveus)溶解于2L的磷酸钠盐缓冲液中(100mmol/L，pH 7.0)，加入9.86g(40mmol)的MgSO4.7H2O，394g(16mmol)的DMAPP铵盐，充分溶解后，在N2保护下加入7.04g(40mmol)实施例2中获取的维生素K3氢醌，3.52g(20mmol)抗坏血酸。N2保护下密闭反应48h，反应温度25℃，酶促反应结束后，撤去N2保护，加入加入10.81g(40mmol)FeCl3.6H2O，25℃下震荡反应4h。使用5L乙酸乙酯，分四次萃取，合并有机相，得到维生素K2与维生素K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1(v/v)的甲醇/二氯甲烷，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长248nm。检测结果萃取液中维生素K2(MK1)浓度为0.582g/L，换算为反应液中维生素K2(MK1)含量为1.46g/L。维生素K3氢醌转化率为30.3％，DMAPP转化率为60.6％，全过程维生素K3转化率为27.5％。
实施例6
将0.1g的天然NovQ芳香族异戊烯基转移酶(来源自雪白色链霉菌Streptomycesniveus)溶解于1L的柠檬酸钠盐缓冲液中(200mmol/L，pH 6.5)，加入1.02g(5mmol)的MgCl2.6H2O，1.23g(5mmol)的DMAPP铵盐，充分溶解后，在N2保护下加入0.86g(5mmol)实施例3中获取的维生素K3氢醌，8.61g(20mmol)生育酚。N2保护下密闭反应36h，反应温度37℃，酶促反应结束后，撤去N2保护，加入3.04g(11.25mmol)FeCl3.6H2O，37℃下震荡反应4h。使用3L乙酸乙酯，分四次萃取，合并有机相，得到维生素K2与维生素K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1(v/v)的甲醇/二氯甲烷，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长248nm。检测结果萃取液中维生素K2(MK1)浓度为0.129g/L，换算为反应液中维生素K2(MK1)含量为0.387g/L。维生素K3氢醌转化率为21.5％，DMAPP转化率为32.25％，全过程维生素K3转化率为17.7％。
实施例7
将4g的重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶(来源自专利菌种CCTCC M2016105，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山八一路299号，中国典型培养物保藏中心)溶解于2L的磷酸钠盐缓冲液中(100mmol/L，pH 7.0)，加入4.06g(20mmol)的MgCl2.6H2O，4.92g(20mmol)的DMAPP铵盐，充分溶解后，在N2保护下加入3.52g(20mmol)实施例2中获取的维生素K3氢醌，3.52g(20mmol)抗坏血酸。N2保护下密闭反应48h，反应温度40℃，酶促反应结束后，撤去N2保护，加入8.00g(20mmol)Fe2(SO4)3，40℃下震荡反应4h。使用5L乙酸乙酯，分四次萃取，合并有机相，得到维生素K2与维生素K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1(v/v)的甲醇/二氯甲烷，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长248nm。检测结果萃取液中维生素K2(MK1)浓度为0.348g/L，换算为反应液中维生素K2(MK1)含量为0.870g/L。维生素K3氢醌转化率为36.2％，DMAPP转化率为36.2％，全过程维生素K3转化率为32.9％。
本发明的重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶是通过重组的毕赤酵母菌的生产的。重组的毕赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山八一路299号，中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC M 2016105。
由以下步骤构建得到：
步骤一：构建重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ：
(1)异戊烯基转移酶novQ基因获取
使用高氏一号培养基，50mL/250mL装液量，28℃，180rpm摇瓶培养雪白链霉菌(购买于中国药学微生物菌种保藏管理中心)72h，过滤得到菌丝体，使用CTAB法提取菌丝体总DNA。以总DNA为模板，使用NovQ基因正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2进行PCR扩增，扩增参数为95℃变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延长90s，72℃延长10min，32循环。获取含novQ基因完整开放阅读框的片段。该片段电泳结果如图3所示，DNA测序结果为SEQ ID No.3。
(2)novQ基因片段改造修饰
以含novQ基因完整开放阅读框的片段为模板，使用正向修饰引物SEQ ID No.4和反向修饰引物SEQ ID No.5进行PCR，在novQ开放阅读框5’端接上ppic9质粒分泌信号肽α因子C端基因同源片段，在3’端切除终止密码子，接上六聚组氨酸标签和ppic9质粒插入位点下游同源序列片段。PCR参数为95℃变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延长90s，3循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延长90s，72℃延长10min，29循环。得到改造修饰后的novQ基因片段。该片段电泳结果如图4所示。
(3)目的基因片段与载体连接
使用限制性内切酶Xho I和Not I将ppic9质粒切割线性化后，琼脂糖凝胶电泳割胶回收大片段，该片段电泳结果如图5所示。使用ezfusion同源重组酶将改造修饰后的novQ基因片段连入ppic9质粒，连接反应参数为25℃,40min。得到重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ。
步骤二：构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ：
(1)重组载体ppic9-novQ扩增
将毕赤酵母表达载体ppic9-novQ转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基筛选培养后，挑取阳性克隆。获得含ppic9-novQ的重组大肠杆菌DH5α。挑取重组大肠杆菌DH5α单菌落接种到含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃震荡培养18h，10000g离心10min，得到重组大肠杆菌DH5α菌体。使用Axygen质粒中量抽提试剂盒，中量抽提质粒，获取足量ppic9-novQ载体。该载体电泳结果如图6所示。
(2)ppic9-novQ转化毕赤酵母菌
ppic9-novQ载体经限制性内切酶Stu I线性化后，电转化转入毕赤酵母菌GS115感受态细胞，转入参数为1.5kv，25μF，放电时间4.5ms。使用MGY组氨酸营养缺陷培养基平板筛选，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ。
重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有25mL的MGY培养基的250mL三角瓶中，28℃，250rpm震荡培养36h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比10％的接种量接入盛有25mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，28℃，250rpm震荡培养36h。将发酵液以4000g，15min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，25mL/250mL装液量，25℃，250rpm震荡培养96h，培养期间每隔24小时加入0.25mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，4000g，15min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。该蛋白western-blot检测结果如图7所示。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)维生素K3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至pH4.0后，用乙酸乙酯萃取产物，浓缩后冷冻结晶，过滤除清液得到维生素K3氢醌；
(2)将维生素K3氢醌和DMAPP加入酶促反应体系中，反应体系包含NovQ芳香族异戊烯基转移酶，pH缓冲液，Mg2+，抗氧化剂；反应在密闭和N2保护条件下进行，反应完成后，加入Fe3+，去除N2保护，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到产物；
所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶为重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶或天然NovQ芳香族异戊烯基转移酶，浓度为0.1～4g/L。
2.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(1)所述乙醇水溶液乙醇与水的体积比为1～3:1。
3.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(1)加入NaBH4浓度为600～1500mmol/L，维生素K3浓度为750～800mmol/L，NaBH4与维生素K3摩尔比为2:1～3:4，反应时间为6～18h。
4.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(1)所述浓缩倍数为4.5～5.5倍，冷冻结晶温度为-20～-80℃。
5.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(2)所述维生素K3氢醌加入浓度为5～20mmol/L， DMAPP加入浓度为5～10mmol/L。
6.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，pH缓冲液为Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种，pH范围6.5～7.5，浓度50～200mmol/L；所述Mg2+由MgCl2或MgSO4提供，Mg2+浓度为5～20mmol/L；抗氧化剂为还原型谷胱甘肽、抗坏血酸、α-生育酚中的一种，浓度为5～20mmol/L。
7.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(2)反应条件为25～40℃，反应时长24～48h。
8.根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，步骤(2)加入的Fe3+由FeCl3或Fe2(SO4)3提供，Fe3+加入浓度为7～20mmol/L。
9.根据权利要求6所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，其特征在于，NovQ芳香族异戊烯基转移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
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