CN108841759A - 一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及用于制备防止黄瓜灰霉病的微生物菌剂和生物有机肥 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及用于制备防止黄瓜灰霉病的微生物菌剂和生物有机肥 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及用于制备防止黄瓜灰霉病的微生物菌剂和生物有机肥。在碎蛋壳以及碎报纸屑衬托下，硫酸锰能缓慢释放在培养基中，分布均匀，效果显著，配合相关工艺可明显提高转孢速度，缩短培养时间，节省成本；甜瓜蒂浸出液有毒性，配合相关工艺既可以消除毒性，保证无杂菌，又能将甜瓜蒂含有的葡萄糖、半乳糖、氨基酸等营养成分释放出来，制得的生物有机肥与微生物菌剂含有的地衣芽孢杆菌是生防细菌，能够有效防止黄瓜灰霉病。生物有机肥能够有效促进根系发达，使黄瓜植株健壮，增强抗灰霉病能力；叶面喷施微生物菌剂，能在叶片形成保护层，阻止灰葡萄孢菌的侵染，对黄瓜叶片起到保护作用。

Description

一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及用于制备防止黄瓜灰霉病的微 生物菌剂和生物有机肥
技术领域
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵工艺及其防止黄瓜灰霉病的方法，该菌种的保藏号为CGMCC1.813。该菌种是生防细菌，对灰葡萄孢菌有明显的抑制效果。本发明以一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌，制得生物有机肥及微生物菌剂，对黄瓜灰霉病有防止效果。
背景技术
灰霉病是黄瓜保护地栽培常年发生的一种病害，近年来发生呈逐年趋重。由于果实常常受到侵扰而引起腐烂，常常称之烂果病，霉烂病。此病由真菌半知菌亚门灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.侵染引起。以菌核在土壤中或以菌丝及分生孢子在病残体上越冬或越夏。翌春条件适宜，菌核萌发，产生菌丝体、孢子梗、分生孢子，分生孢子成熟后随气流、雨水、露水等传播。光照不足、低温和高湿条件下易流行。灰霉病主要危害黄瓜叶片、茎蔓、花及幼果，并且伴有霉味。在湿度大时，该病容易传播，灰霉所到之处即染病。此病治疗传统方法是农药喷淋染病部位，导致农药残留，环境污染，危及到人类健康。并且传统使用大化肥使土壤日益贫瘠，导致黄瓜根部不发达，长势弱，抗病弱。灰霉病重点在于预防，染病必将导致黄瓜产量以及品质下降，影响菜农收入。本发明涉及一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌制得的生物有机肥以及微生物菌剂。本发明生物有机肥可以促进黄瓜根部发达，增强抗病力；灰霉病主要危害地上部分，本发明微生物菌剂能够有效防止茎叶蔓灰霉病的发生。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及其防止黄瓜灰霉病的方法。
本发明采取的技术方案为：
一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化，将保存在超低温冰箱里的地衣芽孢杆菌菌管取出，在无菌条件下用接种环接入到斜面，将斜面放在生化培养箱，25℃培养24h；
(2)种子液的制备，无菌条件下，用接种环将活化后的菌种接入到装有专用培养基的三角摇瓶里；将三角摇瓶放在空气浴摇床里，控制转速165r/min，34℃培养24h；
(3)工业发酵，按照发酵罐体积60％配料，所选原料以及配比如下：将用报纸包有的纯度98％，浓度0.02ppm的硫酸锰塞进完整的鸡蛋壳中，按照原料质量百分比取高温豆饼粉3.2％，玉米粉4.3％，鱼粉0.3％，碳酸钙0.95％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.02％；通入蒸汽，物料灭菌处理，冷却至35℃接种；按罐压0.06Mpa，35℃，1:1.2通风量，转速180r/min进行发酵；在转孢率达30％时，将培养温度降至30℃；转孢率达到85％-90％停止；发酵结束制得发酵菌液。
进一步的，所述步骤(1)中菌种活化的斜面制备方法：用三角摇瓶存放蒸馏水，称取营养琼脂完全溶于蒸馏水；将三角摇瓶放在灭菌锅，灭菌；待三角摇瓶冷却至45℃，每只无菌试管加入10ml液体制成斜面。
进一步的，所述步骤(2)中种子液专用培养基组分按照质量百分比组成及制备方法如下：葡萄糖1％，淀粉1.5％，酵母粉1.8％，蛋白胨0.2％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.03％，清水补足，用氢氧化钠调PH至7，将培养基放在高压蒸汽灭菌锅，在121℃，0.1mpa条件下，灭菌30min，灭菌结束后，培养基冷却至室温，备用。
进一步的，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的微生物菌剂，所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
进一步的，所述微生物菌剂中的甜瓜蒂浸出液的制备方法为：将甜瓜蒂粉碎至80目，按照甜瓜蒂粉与水的质量比为1:50配料至灭菌罐，通入蒸汽，121℃灭菌30min，冷却至室温，通入无菌空气保压备用，取液体即得甜瓜蒂浸出液。
进一步的，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的生物有机肥，其特征在于，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉55-60份、草木灰10-15份、牡蛎钙粉8-12份、鱼粉4-6份、金银花3-5份、月季花2-4份、仙人掌5-8份、腐植酸5-10份；发酵菌液的添加量为有机肥总质量的3-5％。
进一步的，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的生物有机肥的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)先将金银花、月季花、仙人掌粉碎至40目，后与花生壳粉、草木灰、牡蛎钙粉、鱼粉搅匀；
(2)采用水泥地面堆积发酵，发酵温度控制在65-70℃，发酵时间：春秋15天，夏季10天，冬季20天；发酵期间进行补水，翻堆，以及补氧；
(3)发酵结束，向物料中加以质量百分比为3-5％发酵菌液，混合均匀。
进一步的，所述微生物菌剂含有有效活菌数≥10亿/g，霉菌杂菌数≤3×10^6/g，杂菌率≤10％，PH值为5.0-8.0，其施用方法为：亩用量50g，稀释500倍，地上部分喷施，其用于防止黄瓜灰霉病。
进一步的，所述生物有机肥含有有效活菌数≥2亿/g，有机质≥50％，水分≤30％，PH值为6.5-7.5，其用于防止黄瓜灰霉病。
本发明的有益效果为：
1、一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵工艺发酵培养基中加有的硫酸锰(浓度0.02ppm)极少，直接加入容易沉底，导致不均匀分布。本发明中硫酸锰被鸡蛋壳报纸包裹，鸡蛋壳、报纸被搅拌叶搅碎，在碎蛋壳以及碎报纸屑衬托下，硫酸锰能缓慢释放在培养基中，起到催化作用，避免因量少导致分布不均匀。
2、在本发明中的发酵工艺条件下，转孢率达到30％时，配合以下工艺：将培养温度降至30℃，可明显提高转孢速度，缩短培养时间，节省成本。
3、甜瓜蒂含有葡萄糖，半乳糖，氨基酸等成分，利于功能菌存活，并且对黄瓜根系、茎叶有很好的滋养保护作用。甜瓜蒂有微毒性，采用上述甜瓜蒂浸出液提取方案，既可以消除毒性，保证无杂菌，又能将甜瓜蒂含有的葡萄糖、半乳糖、氨基酸等营养成分释放出来。
4、本发明制得的生物有机肥与微生物菌剂含有的地衣芽孢杆菌是生防细菌，对灰葡萄孢菌有明显的抑制效果，能够有效防止黄瓜灰霉病。生物有机肥能够有效促进根系发达，使黄瓜植株健壮，增强抗灰霉病能力；叶面喷施微生物菌剂，能在叶片形成保护层，阻止灰葡萄孢菌的侵染，对黄瓜叶片起到保护作用。
附图说明
图1为采用本发明中地衣芽孢杆菌发酵工艺，在17小时时候，转孢率达到90％以上；
图2为未采用本发明中地衣芽孢杆菌发酵工艺，在17小时时候，转孢率为30％左右。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案以及优点更加明白，以下结合实施案例、数据进行进一步阐释。实施案例仅用于解释本发明，不限定本发明。
本发明实例中所用材料要求如下：
花生壳粉：有机质≥80％，水分≤20％，目数≤40目。
草木灰：水分≤15％，目数≤50目。
牡蛎钙粉：水分≤10％，PH 8-9。
鱼粉：水分≤10％，蛋白质≥45％。
腐植酸：有机质≥90％，水分≤20％。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)：为冷干菌种，系市购产品，保藏并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC1.813。
一种地衣芽孢杆菌的具体发酵工艺包括如下步骤：
(1)菌种活化，将保存在超低温冰箱里的地衣芽孢杆菌菌管取出，在无菌条件下用接种环接入到斜面，将斜面放在生化培养箱，25℃培养24h；
(2)种子液的制备，无菌条件下，用接种环将活化后的菌种接入到装有150ml专用培养基的250ml三角摇瓶里；为了操作避免失误，应制备5-6瓶备用；将三角摇瓶放在空气浴摇床里，控制转速165r/min，34℃培养24h；
(3)工业发酵，按照发酵罐体积60％配料，所选原料以及配比如下：将用报纸包有的硫酸锰(纯度98％，浓度0.02ppm)塞进完整的鸡蛋壳中，按照质量百分比取高温豆饼粉3.2％，玉米粉4.3％，鱼粉0.3％，碳酸钙0.95％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.02％；通入蒸汽，物料在121℃灭菌30min，冷却至35℃接种；按罐压0.06Mpa，35℃，1:1.2通风量，转速180r/min进行发酵；在转孢率达30％时，将培养温度降至30℃，可明显提高转孢速度；转孢率达到85％-90％停止；发酵结束后，菌液有效活菌数可达150亿/ml，制得发酵菌液。
所述步骤(1)中菌种活化的斜面制备方法：用三角摇瓶存放1000ml蒸馏水，称取40g营养琼脂完全溶于蒸馏水；将三角摇瓶放在灭菌锅，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20-30min；待三角摇瓶冷却至45℃，每只无菌试管加入10ml液体制成斜面。
所述步骤(1)中种子液专用培养基组分按照质量百分比组成及制备方法如下：葡萄糖1％，淀粉1.5％，酵母粉1.8％，蛋白胨0.2％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.03％，清水补足，用氢氧化钠调PH至7，将培养基放在高压蒸汽灭菌锅，在121℃，0.1mpa条件下，灭菌30min，灭菌结束后，培养基冷却至室温，备用。
微生物菌剂中的甜瓜蒂浸出液的制备方法为：将甜瓜蒂粉碎至80目，按照甜瓜蒂粉与水的质量比为1:50配料至灭菌罐，通入蒸汽，121℃灭菌30min，冷却至室温，通入无菌空气保压备用，取液体即得甜瓜蒂浸出液。
以地衣芽孢杆菌为功能性菌的生物有机肥的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)先将金银花、月季花、仙人掌粉碎至40目，后与花生壳粉、草木灰、牡蛎钙粉、鱼粉搅匀；
(2)采用水泥地面堆积发酵，发酵温度控制在65-70℃，发酵时间：春秋15天，夏季10天，冬季20天；发酵期间进行补水，翻堆，以及补氧；
(3)发酵结束，向物料中加以3％发酵菌液，混合均匀。
微生物菌剂含有有效活菌数≥10亿/g，霉菌杂菌数≤3×10^6/g，杂菌率≤10％，PH值为5.0-8.0，其施用方法为：亩用量50g，稀释500倍，地上部分喷施。
生物有机肥含有有效活菌数≥2亿/g，有机质≥50％，水分≤30％，PH值为6.5-7.5，其施用方法，作为作物基肥，亩用量300kg，沟施、撒施。
实施例1
一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉55份、草木灰12份、牡蛎钙粉9份、鱼粉5份、金银花4份，月季花3份，仙人掌6份，腐植酸5份。
所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
实施例2
一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉58份、草木灰15份、牡蛎钙粉8份、鱼粉4份、金银花3份，月季花4份，仙人掌5份，腐植酸7份。
所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
实施例3
一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉59份、草木灰10份、牡蛎钙粉12份、鱼粉5份、金银花5份，月季花2份，仙人掌8份，腐植酸10份。
所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
实施例4
一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉60份、草木灰10份、牡蛎钙粉9份、鱼粉6份、金银花3份，月季花2份，仙人掌5份，腐植酸6份。
所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
前期实验：使用本发明制得的一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥以及一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的微生物菌剂，在山东省莱西市，平度市进行了生产试验，试验田亩数6亩。
将试验田化为六个区域，每个区域1亩地，分别使用实施例1-4的实施方式，同时设置两组对照区域，对照一组使用普通17-17-17复合肥，对照二组不施肥，试验区域间设有隔离带，相互之间不受影响。
施肥方式：
1、一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的生物有机肥，播种前将各区域按照计划一次性施足肥料。
2、一种以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为功能性菌的微生物菌剂，在黄瓜定植后15天进行地上部分喷施。
黄瓜出苗定植后45天时，试验结果为：实施例1-4的实施方式黄瓜苗健壮，叶片浓绿，根部发达，同时没有灰霉病，试验过程中不需要喷施杀虫剂、杀菌剂。对照一组，黄瓜苗势弱，叶片浅绿，根部较发达，有灰霉病发生。对照二组，黄瓜出苗不齐，长势很弱，根部不发达，有灰霉病发生。
后续实验：从定植到黄瓜结果，各个区域不再施肥，均是维持黄瓜生长所需的同等阳光及水分。收获后，对黄瓜农艺性状、灰霉病发病情况、产量进行总结。实验结果如下：
1、对黄瓜农艺性状的影响
由表1可以看出实施例1-4中黄瓜植株根系、叶色、坐果率均优于对照组，畸形果率低于对照组。
表1各区域黄瓜农艺性状对比
2、对黄瓜亩产量影响
实施例1-4在山东省莱西市、平度市进行田间试验，结果发现，试施例1-4对黄瓜亩产量均有明显的提高，对照一组也有促产作用。
表2不同施肥对黄瓜亩产量对比分析表
3、对黄瓜灰霉病防止效果
实施例1-4，以及对照组在山东省莱西市、平度市进行田间试验，结果如下：实施例1-4对黄瓜灰霉病均有明显防止效果，对照组发病率高。见表3。
表3各施肥区域灰霉病发病率对比表
由实验结果可以看出，本发明所述的一种以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为功能性菌制得的生物有机肥以及微生物菌剂肥力持久，能够促进黄瓜根系发达，叶片浓绿，提高坐果率，降低畸形果率，提高产量，并能明显的降低灰霉病发病率。
综上，本发明所述的一种地衣芽孢杆菌发酵工艺及其防止黄瓜灰霉病方法，能够提高转孢速率，缩短发酵周期，降低成本。本发明所述的一种以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为功能性菌制得的生物有机肥以及微生物菌剂养分均衡，肥效持久，利于黄瓜根系发育，提高产量，防止灰霉病发病。
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化，将保存在超低温冰箱里的地衣芽孢杆菌菌管取出，在无菌条件下用接种环接入到斜面，将斜面放在生化培养箱，25℃培养24h；
(2)种子液的制备，无菌条件下，用接种环将活化后的菌种接入到装有专用培养基的三角摇瓶里；将三角摇瓶放在空气浴摇床里，控制转速165r/min，34℃培养24h；
(3)工业发酵，按照发酵罐体积60％配料，所选原料以及配比如下：将用报纸包有的纯度98％，浓度0.02ppm的硫酸锰塞进完整的鸡蛋壳中，按照原料质量百分比取高温豆饼粉3.2％，玉米粉4.3％，鱼粉0.3％，碳酸钙0.95％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.02％；通入蒸汽，物料灭菌处理，冷却至35℃接种；按罐压0.06Mpa，35℃，1:1.2通风量，转速180r/min进行发酵；在转孢率达30％时，将培养温度降至30℃；转孢率达到85％-90％停止；发酵结束制得发酵菌液。
2.根据权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述步骤(1)中菌种活化的斜面制备方法：用三角摇瓶存放蒸馏水，称取营养琼脂完全溶于蒸馏水；将三角摇瓶放在灭菌锅，灭菌；待三角摇瓶冷却至45℃，每只无菌试管加入10ml液体制成斜面。
3.根据权利要求1所述，一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述步骤(2)中种子液专用培养基组分按照质量百分比组成及制备方法如下：葡萄糖1％，淀粉1.5％，酵母粉1.8％，蛋白胨0.2％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.03％，清水补足，用氢氧化钠调PH至7，将培养基放在高压蒸汽灭菌锅，在121℃，0.1mpa条件下，灭菌30min，灭菌结束后，培养基冷却至室温，备用。
4.根据权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的微生物菌剂，所述微生物菌剂为质量百分比为10％的发酵菌液和质量百分比为90％的甜瓜蒂浸出液混合均匀而成。
5.根据权利要求4所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述微生物菌剂中的甜瓜蒂浸出液的制备方法为：将甜瓜蒂粉碎至80目，按照甜瓜蒂粉与水的质量比为1:50配料至灭菌罐，通入蒸汽，121℃灭菌30min，冷却至室温，通入无菌空气保压备用，取液体即得甜瓜蒂浸出液。
6.根据权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的生物有机肥，其特征在于，原料各组分按照重量份组成如下：花生壳粉55-60份、草木灰10-15份、牡蛎钙粉8-12份、鱼粉4-6份、金银花3-5份、月季花2-4份、仙人掌5-8份、腐植酸5-10份；发酵菌液的添加量为有机肥总质量的3-5％。
7.根据权利要求6所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述发酵菌液用于制备防止黄瓜灰霉病的生物有机肥的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)先将金银花、月季花、仙人掌粉碎至40目，后与花生壳粉、草木灰、牡蛎钙粉、鱼粉搅匀；
(2)采用水泥地面堆积发酵，发酵温度控制在65-70℃，发酵时间：春秋15天，夏季10天，冬季20天；发酵期间进行补水，翻堆，以及补氧；
(3)发酵结束，向物料中加以质量百分比为3-5％发酵菌液，混合均匀。
8.根据权利要求4所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述微生物菌剂含有有效活菌数≥10亿/g，霉菌杂菌数≤3×10^6/g，杂菌率≤10％，PH值为5.0-8.0，其施用方法为：亩用量50g，稀释500倍，地上部分喷施，其用于防止黄瓜灰霉病。
9.根据权利要求6所述一种地衣芽孢杆菌发酵工艺，其特征在于，所述生物有机肥含有有效活菌数≥2亿/g，有机质≥50％，水分≤30％，PH值为6.5-7.5，其用于防止黄瓜灰霉病。
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