CN117265046A - 一种鼠李糖基转移酶在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用 - Google Patents
一种鼠李糖基转移酶在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种鼠李糖基转移酶在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用，属于糖工程技术领域。本发明首次克隆并重组表达了来源于丁香糖丝菌的鼠李糖基转移酶Ss‑RhaT，该酶能以dTDP‑Rha为鼠李糖供体，以新木脂素类(厚朴酚、和厚朴酚)、二苯乙烯类(白藜芦醇、紫檀芪)、黄酮类(白杨素、木犀草素)、黄酮醇类(山奈酚、槲皮素)、黄烷酮类(橙皮素、柚皮素)、异黄酮类(染料木素、鹰嘴豆芽素A)、二氢查耳酮类(根皮素)、三萜类(齐墩果酸、桦木酸)和蒽醌类(大黄素)等天然产物为糖基受体，合成相应的鼠李糖基化天然产物，是目前所知受体底物谱最广泛的鼠李糖基转移酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种鼠李糖基转移酶在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用，属于糖工程技术领域。
背景技术
鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferases,EC 2.4.1-)是自然界中专门催化鼠李糖苷键形成的一类糖基转移酶，广泛分布于植物和细菌中。据CAZy数据库(http://www.cazy.org/)统计，已知的鼠李糖基转移酶分属于糖基转移酶的GT1、GT2、GT4、GT102、GT104和GT106家族，其功能涉及植物和细菌次级代谢产物的糖基化修饰、细菌细胞表面多糖的合成以及少数细菌翻译延伸因子的N-糖基化修饰。目前已知具有广泛受体底物谱的鼠李糖基转移酶相对较少，且主要为植物来源。SCI论文(DOI:10.1039/c6ra16251g、DOI:org/10.1016/j.carres.2015.09.010、DOI:10.1039/c7ob02763j和DOI:org/10.1128/AEM.01652-13)分别报道了来自植物和细菌受体底物谱广泛的鼠李糖基转移酶，能够以多种不同结构的天然产物为糖基受体进行鼠李糖基化修饰。然而，这些鼠李糖基转移酶所糖基化修饰的受体多以黄酮类化合物为主，形成的鼠李糖苷产物结构类型有限。中国专利文献CN111500601A和CN111647574A公开的鼠李糖基转移酶的受体也以黄酮类化合物为主。因此，挖掘新的具有广泛受体底物谱的鼠李糖基转移酶对合成结构多元的鼠李糖苷化合物具有重要的应用价值。
研究表明许多鼠李糖苷类天然产物具有显著的药用活性，在药物研发中具有重要的应用前景。相比化学合成和依赖逆水解机制的鼠李糖苷酶法合成，鼠李糖基转移酶所催化的鼠李糖基化反应具有操作简便、环境友好、立体选择易控制、催化效率高和受体选择灵活等优点，是鼠李糖苷类化合物合成的重要工具。然而目前已知的鼠李糖基转移酶大多为植物来源且主要以黄酮类化合物为受体，而对其他类型的天然产物糖基化活性较差。因此发掘具有广泛受体底物谱，能够修饰多种天然产物的鼠李糖基转移酶对合成多元化的鼠李糖苷化合物具有重要的应用意义。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是缺乏具有广泛的受体底物谱的鼠李糖基转移酶，不能对多种天然产物实现鼠李糖基化修饰这一局限，本发明提供了一种鼠李糖基转移酶在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用，本发明可进行糖基化修饰的天然产物包括9类共16个天然产物，为目前所报道的受体底物谱最广泛的鼠李糖基转移酶。
本发明的技术方案如下：
一种鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用，所述天然产物包括新木脂素类、二苯乙烯类、黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类、异黄酮类、二氢查耳酮类、三萜类和蒽醌类天然产物。
根据本发明优选的，所述新木脂素类天然产物包括厚朴酚、和厚朴酚，所述二苯乙烯类天然产物包括白藜芦醇、紫檀芪，所述黄酮类天然产物包括白杨素、木犀草素，所述黄酮醇类天然产物包括山奈酚、槲皮素，所述黄烷酮类天然产物包括橙皮素、柚皮素，所述异黄酮类天然产物包括染料木素、鹰嘴豆芽素A，所述二氢查耳酮类天然产物包括根皮素，所述三萜类天然产物包括齐墩果酸、桦木酸，所述蒽醌类天然产物包括大黄素。
根据本发明优选的，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT来源于丁香糖丝菌(Saccharothrix syringae)。
根据本发明优选的，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述应用是以脱氧胸苷二磷酸鼠李糖(dTDP-Rha)为鼠李糖供体。
根据本发明优选的，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT按照以下方法获得：以丁香糖丝菌基因组DNA为模板，经PCR扩增获得鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的编码基因序列，将PCR扩增的编码基因序列和质粒载体pET-22b(+)分别进行双酶切，纯化、连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌，在LB培养基中培养至对数生长期，然后经IPTG诱导表达，收集菌体，菌体破壁纯化后得鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。
进一步优选的，所述PCR扩增所使用的引物序列如下：
F：5’-GGAATTCCATATGAAGATCCTGTTTTCGAGCCTCG-3’,下划线表示Nde I酶切位点，
R：5’-CCGCTCGAGGGCGTACTGCGGCAGGG-3’,下划线表示Xho I酶切位点。
进一步优选的，所述双酶切采用限制性内切酶Nde I和Xho I。
进一步优选的，所述诱导表达时IPTG的终浓度为0.1-0.5mM，诱导表达的温度为16℃；诱导表达的时间为10-30h。
在本发明一种优选的技术方案中，鼠李糖基转移酶Ss-RhaT对天然产物的鼠李糖基化修饰的方法，包括如下步骤：
以dTDP-Rha为鼠李糖供体，分别以天然产物厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇、紫檀芪、白杨素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、橙皮素、柚皮素、染料木素、鹰嘴豆芽素A、根皮素、齐墩果酸、桦木酸、大黄素为糖基受体，加入鼠李糖基转移酶Ss-RhaT，于温度25-52℃、pH 7.0-9.0和MgCl2浓度0.5-10mM条件下反应5-25小时，获得相应的鼠李糖基化天然产物。
根据本发明优选的，所述鼠李糖供体的浓度为1-5mM。
根据本发明优选的，所述天然产物的浓度为1-5mM。
根据本发明优选的，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的浓度为200-600μg/mL。
根据本发明优选的，所述温度为37-52℃。
根据本发明优选的，所述pH为8.0-8.5。
根据本发明优选的，所述MgCl2浓度为2-5mM。
根据本发明优选的，鼠李糖基化修饰的反应体系中还可添加0-15％的DMSO。
根据本发明优选的，在鼠李糖基转移酶Ss-RhaT用量为500μg/mL，pH 8.0、37℃、MgCl2浓度5mM条件下催化反应6h，厚朴酚、白藜芦醇、木犀草素和山奈酚四种天然产物的转化率分别为97.0％、90.0％、90％和99.0％。
有益效果：
1、本发明首次克隆并重组表达了来源于丁香糖丝菌的鼠李糖基转移酶Ss-RhaT，该酶能以dTDP-Rha为鼠李糖供体，以新木脂素类(厚朴酚、和厚朴酚)、二苯乙烯类(白藜芦醇、紫檀芪)、黄酮类(白杨素、木犀草素)、黄酮醇类(山奈酚、槲皮素)、黄烷酮类(橙皮素、柚皮素)、异黄酮类(染料木素、鹰嘴豆芽素A)、二氢查耳酮类(根皮素)、三萜类(齐墩果酸、桦木酸)和蒽醌类(大黄素)等天然产物为糖基受体，合成相应的鼠李糖基化天然产物，并且对其中的厚朴酚、白藜芦醇、木犀草素和山奈酚四种天然产物分别表现出97.0％、90.0％、90％和99.0％的鼠李糖基化转化率，是目前所知受体底物谱最广泛的鼠李糖基转移酶。
2、本发明采用鼠李糖基转移酶Ss-RhaT对天然产物进行鼠李糖基化修饰，该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景，为多元化鼠李糖苷化合物的合成提供了重要的工具酶。
附图说明
图1为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的SDS-PAGE电泳图；图中M泳道为蛋白质分子量Marker；1泳道为空载体pET-22b(+)表达菌株的细胞裂解液；2泳道为重组质粒pET22b-Ss-rhaT表达菌株的细胞裂解液；3泳道为重组质粒pET22b-Ss-rhaT表达菌株的细胞裂解液离心后的上清；4泳道为重组质粒pET22b-Ss-rhaT表达菌株的细胞裂解液离心后的沉淀；5泳道为纯化后的重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。
图2为不同天然产物反应后的HPLC分析图谱。
图3为厚朴酚鼠李糖基化产物质谱图。
图4为和厚朴酚鼠李糖基化产物质谱图。
图5为白藜芦醇鼠李糖基化产物质谱图。
图6为紫檀芪鼠李糖基化产物质谱图。
图7为白杨素鼠李糖基化产物质谱图。
图8为木犀草素鼠李糖基化产物质谱图。
图9为山奈酚鼠李糖基化产物质谱图。
图10为槲皮素鼠李糖基化产物质谱图。
图11为橙皮素鼠李糖基化产物质谱图。
图12为柚皮素鼠李糖基化产物质谱图。
图13为染料木素鼠李糖基化产物质谱图。
图14为鹰嘴豆芽素A鼠李糖基化产物质谱图。
图15为根皮素鼠李糖基化产物质谱图。
图16为齐墩果酸鼠李糖基化产物质谱图。
图17为桦木酸鼠李糖基化产物质谱图。
图18为大黄素鼠李糖基化产物质谱图。
图19为不同供体底物反应后的HPLC分析图谱。
图20为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同温度下的相对活性曲线。
图21为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同pH下的相对活性曲线。
图22为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同二价金属离子下的相对活性柱状图。
图23为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同浓度MgCl2下的相对活性曲线。
图24为重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同有机溶剂下的相对活性曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护的范围并不仅限于此。下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均为市售生物和化学实验用材料。
实施例中涉及的菌株：
丁香糖丝菌为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(http://www.cgmcc.net/)的丁香糖丝菌(Saccharothrix syringae)CGMCC 4.1716。
实施例1：鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的克隆、表达和纯化
以丁香糖丝菌基因组DNA为模板，根据NCBI数据库中丁香糖丝菌基因组中预测的鼠李糖基转移酶(GenBank accession No.WP_033433114)的基因序列设计上、下游引物F和R，进行PCR扩增，PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测、纯化，并通过PCR回收试剂盒进行回收，得到丁香糖丝菌鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的基因片段；
其中，上、下游引物F和R的序列如下：
F：5'-GGAATTCCATATGAAGATCCTGTTTTCGAGCCTCG-3',下划线表示Nde I酶切位点，R：5’-CCGCTCGAGGGCGTACTGCGGCAGGG-3’,下划线表示Xho I酶切位点；
PCR扩增的体系如下(总体积100μL)：
5×PCR buffer 20μL、2.5mM dNTP 8μL、10μM引物各2μL、100ng/μL模板2μL、5×TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶(2.5U/μL)2μL，超纯水64μL。
PCR扩增的条件如下：
95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
Nde I和Xho I限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET-22b(+)分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段，用T4连接酶于16℃下连接4h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含50mg/L氨苄的LB平板，37℃恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养8-10h，提取质粒进行序列测定，测得鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的编码基因大小为1146bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，得重组质粒pET22b-Ss-rhaT。
取重组质粒pET22b-Ss-rhaT 0.5μL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布于含50mg/L氨苄的LB平板，37℃恒温培养过夜，筛选阳性克隆。将阳性克隆接种于20mL含50mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃培养10h。将菌液按照1％的接种量接种于1L含50mg/L氨苄的LB液体培养基中，37℃培养3h，当OD600达到0.6-0.8时(对数生长期)，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，100rpm摇床培养，16℃诱导20h。
将诱导后的培养液8,000×g离心15min后收集菌体，用40mL Binding buffer重悬，用超声破壁仪破壁后，12,000×g离心取上清。以5mL Ni-NTA凝胶装柱，40mL BindingBuffer平衡柱子后，将处理好的上清经过0.22μm的滤膜过滤后上样。用40mL BindingBuffer洗柱，再取60mL Washing Buffer洗柱，最后用20mL Elution buffer洗脱并分步收集洗脱液，以Nanodrop 2000(Thermo)测定蛋白浓度并经SDS-PAGE检测，如图1，SDS-PAGE显示纯化出的蛋白质分子量在40kDa左右，与预测分子量39.4kDa一致。收集的蛋白洗脱液用pH 8.0的50mM的Binding Buffer超滤除盐，得重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。
纯化中所用缓冲液组成如下：
Binding Buffer：pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl；
Washing Buffer：pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl，50mM咪唑；
Elution Buffer：pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl，250mM咪唑。
实施例2：鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的受体底物特异性测定
以dTDP-鼠李糖(dTDP-Rha)为糖基供体底物，不同的天然产物为受体底物，检测重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的糖基化活性。
糖基化反应在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行，反应体系为100μL，反应体系还包括以下终浓度的组分：2mM dTDP-Rha，2mM受体底物，5mM MgCl2，500μg/mL纯化的鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。同时，以煮沸处理10min的鼠李糖基转移酶Ss-RhaT催化组作为对照组；
其中，所述受体底物包括9类共16个天然产物，具体信息如表1所示。将以上16个天然产物分别溶解于DMSO中，配制成100mM DMSO贮存液备用。
表1.受体底物的类别及结构式
将实验组与对照组配制好的反应体系置于37℃催化反应6h，随后加入100μL乙酸乙酯并充分涡旋振荡，进行萃取，10,000×g离心1min后吸取上层乙酸乙酯相，蒸馏干燥后重新溶解于100μL甲醇中进行HPLC分析和质谱分析。
HPLC分析使用搭配UV检测器的Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentTC-C18(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈，HPLC条件如下：0-25min：0-85％乙腈；25-30min：100％乙腈；30-35min：25％乙腈，柱温30℃，流速1mL/min。各天然产物的鼠李糖基化反应检测波长设置如下：厚朴酚(295nm)、和厚朴酚(295nm)、白藜芦醇(308nm)、紫檀芪(308nm)、白杨素(262nm)、木犀草素(350nm)、山奈酚(260nm)、槲皮素(330nm)、橙皮素(270nm)、柚皮素(282nm)、染料木素(300nm)、鹰嘴豆芽素A(254nm)、根皮素(288nm)、齐墩果酸(210nm)、桦木酸(210nm)和大黄素(300nm)。
不同天然产物反应后的HPLC结果如图2所示，与对照组相比，16个天然产物经鼠李糖基转移酶Ss-RhaT催化后均产生了新的特征峰，表明重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT以dTDP-Rha为供体可对上述16个(9类)天然产物实现鼠李糖基化修饰，为目前所报道的受体底物谱最广泛的鼠李糖基转移酶。
图3～图18依次为厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇、紫檀芪、白杨素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、橙皮素、柚皮素、染料木素、鹰嘴豆芽素A、根皮素、齐墩果酸、桦木酸和大黄素经鼠李糖基化修饰后所得产物的质谱图，进一步表明天然产物糖基化修饰成功。
以上天然产物鼠李糖基化的转化率如下表：
表2.不同天然产物鼠李糖基化的转化率
| 天然产物 | 厚朴酚 | 和厚朴酚 | 白藜芦醇 | 紫檀芪 | 白杨素 | 木犀草素 | 山奈酚 | 槲皮素 |
| 转化率(％) | 97.0 | 70.3 | 90.0 | 66.2 | 86 | 90 | 99.0 | 74.7 |
| 天然产物 | 橙皮素 | 柚皮素 | 染料木素 | 鹰嘴豆芽素A | 根皮素 | 齐墩果酸 | 桦木酸 | 大黄素 |
| 转化率(％) | 26 | 39.1 | 62.3 | 56 | 89.3 | 8.3 | 6.2 | 24.3 |
其中，厚朴酚、白藜芦醇、木犀草素和山奈酚四种天然产物的鼠李糖基化转化率分别高达97.0％、90.0％、90.0％和99.0％。
实施例3：鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的供体底物特异性测定
鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的糖基供体特异性研究以厚朴酚作为糖基受体底物进行测定。
与实施例2的反应体系相同，糖基化反应在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行，反应体系为100μL，反应体系还包括以下终浓度的组分：2mM供体底物，2mM厚朴酚，5mMMgCl2，500μg/mL纯化的鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。其中，供体底物包括：dTDP-Rha、dUDP-Rha、UDP-Glc。
将配制好的反应体系置于42℃下反应6h，随后加入100μL乙酸乙酯并充分涡旋振荡，进行萃取，10,000×g离心1min后吸取上层乙酸乙酯相，蒸馏干燥后重新溶解于100μL甲醇中进行HPLC分析，HPLC分析方法与实施例2相同。
不同供体底物反应后的HPLC结果如图19所示，可知鼠李糖基转移酶Ss-RhaT除了dTDP-Rha，还可以利用dUDP-Rha和UDP-Glc为供体底物对厚朴酚进行糖基化修饰，但是dUDP-Rha和UDP-Glc的糖基化修饰效果较差，利用三种供体底物对厚朴酚进行糖基化反应6h的转化率分别为95.3％、11.7％和21.6％。
实施例4：鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶学性质
1、温度对酶活性和酶稳定性的影响
最适温度的测定方法：以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，在不同温度(25、30、37、42、47、52、60℃)下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以所测得最大酶活为100％、其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制相对活性-温度曲线。
温度稳定性的测定方法：在不同温度(25、30、37、42、47、52、60℃)下将重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT酶液保温30min，然后以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以所测得最大酶活为100％、其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制相对活性-温度曲线。
酶活力单位定义：每分钟生成1μmol产物所对应的酶量为1U。
重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同温度下的相对活性曲线如图20所示，重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在37-52℃内具有较高酶活，最适反应温度为42℃；重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在低于37℃时比较稳定，超过37℃后较快失活，超过47℃后基本失活。
2、pH对酶活和酶稳定性的影响
最适pH的测定方法：糖基化反应在50mM的NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0-7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-8.5)和Glycine-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)中进行，以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％、其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制相对活性-pH曲线。
pH稳定性的测定方法：将重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT分别放在上述不同pH的缓冲液中，4℃过夜后，以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以各组反应中的最大酶活为100％、其他组相对于最大酶活的相对活性为纵坐标，绘制相对活性-pH曲线。
重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在不同pH下的相对活性曲线如图21所示，鼠李糖基转移酶Ss-RhaT最适反应pH为8.5，在pH 7.0-9.0范围内相对稳定。
3、二价金属离子对酶活性的影响
二价金属离子种类测定方法：以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，其中，添加的二价金属离子分别为5.0mM的MgCl2、MnCl2、CaCl2、BaCl2、CoCl2、CuCl2、ZnCl2、NiSO4和FeCl2，对照组添加5.0mM的EDTA·2Na。在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以各对照组酶活为100％、其他组相对于对照组的相对活性为纵坐标，绘制柱状图。
结果如图22所示，MgCl2、MnCl2和CaCl2能够明显的促进酶活，以MgCl2效果最为明显，MnCl2次之，CaCl2再次之。BaCl2、CoCl2、CuCl2、ZnCl2、NiSO4和FeCl2不同程度地抑制酶活，其中CuCl2、CoCl2和BaCl2的酶活抑制作用较为明显，ZnCl2、NiSO4和FeCl2的抑制作用相对较弱。
MgCl2的最佳浓度测定方法：以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系，其中，添加的MgCl2浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、3.5、5、7.5、10mM。在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以未添加MgCl2组的酶活为100％、其他组相对于未添加MgCl2组的相对活性为纵坐标，绘制相对活性曲图。
结果如图23所示，随着MgCl2浓度由0增加至2mM时，酶活达到最大，并在此后保持稳定。
4、有机溶剂对酶活性的影响
糖基化反应在含有有机溶剂的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行，其中，有机溶剂分别为甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，有机溶剂的浓度分别为0、5、10、15、20、30、40％(v/v)，然后以dTDP-Rha为糖基供体底物，以厚朴酚为糖基受体底物，按照实施例2配制反应体系。在37℃下测定重组鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的酶活。以未添加有机溶剂组的酶活为100％、其他组相对于未添加有机溶剂组的相对活性为纵坐标，绘制相对活性曲图。
结果如图24所示，低于15％的DMSO对Ss-RhaT的酶活有促进作用，其余三种有机溶剂均对酶活有抑制作用。
Claims (10)
1.一种鼠李糖基转移酶Ss-RhaT在天然产物的鼠李糖基化修饰中的应用，所述天然产物包括新木脂素类、二苯乙烯类、黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类、异黄酮类、二氢查耳酮类、三萜类和蒽醌类天然产物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新木脂素类天然产物包括厚朴酚、和厚朴酚，所述二苯乙烯类天然产物包括白藜芦醇、紫檀芪，所述黄酮类天然产物包括白杨素、木犀草素，所述黄酮醇类天然产物包括山奈酚、槲皮素，所述黄烷酮类天然产物包括橙皮素、柚皮素，所述异黄酮类天然产物包括染料木素、鹰嘴豆芽素A，所述二氢查耳酮类天然产物包括根皮素，所述三萜类天然产物包括齐墩果酸、桦木酸，所述蒽醌类天然产物包括大黄素。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT来源于丁香糖丝菌(Saccharothrix syringae)。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是以脱氧胸苷二磷酸鼠李糖(dTDP-Rha)为鼠李糖供体。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT按照以下方法获得：以丁香糖丝菌基因组DNA为模板，经PCR扩增获得鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的编码基因序列，将PCR扩增的编码基因序列和质粒载体pET-22b(+)分别进行双酶切，纯化、连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌，在LB培养基中培养至对数生长期，然后经IPTG诱导表达，收集菌体，菌体破壁纯化后得鼠李糖基转移酶Ss-RhaT。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增所使用的引物序列如下：
F：5’-GGAATTCCATATGAAGATCCTGTTTTCGAGCCTCG-3’,下划线表示Nde I酶切位点，
R：5’-CCGCTCGAGGGCGTACTGCGGCAGGG-3’,下划线表示Xho I酶切位点。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述双酶切采用限制性内切酶Nde I和XhoI；
优选的，所述诱导表达时IPTG的终浓度为0.1-0.5mM，诱导表达的温度为16℃；诱导表达的时间为10-30h。
9.一种鼠李糖基转移酶Ss-RhaT对天然产物的鼠李糖基化修饰的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以dTDP-Rha为鼠李糖供体，分别以天然产物厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇、紫檀芪、白杨素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、橙皮素、柚皮素、染料木素、鹰嘴豆芽素A、根皮素、齐墩果酸、桦木酸、大黄素为糖基受体，加入鼠李糖基转移酶Ss-RhaT，于温度25-52℃、pH7.0-9.0和MgCl2浓度0.5-10mM条件下反应5-25小时，获得相应的鼠李糖基化天然产物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.所述鼠李糖供体的浓度为1-5mM；
ii.所述天然产物的浓度为1-5mM；
iii.所述鼠李糖基转移酶Ss-RhaT的浓度为200-600μg/mL；
iv.所述温度为37-52℃；
v.所述pH为8.0-8.5；
vi.所述MgCl2浓度为2-5mM；
vii.鼠李糖基化修饰的反应体系中还可添加0-15％的DMSO；
viii.在鼠李糖基转移酶Ss-RhaT用量为500μg/mL，pH 8.0、37℃、MgCl2浓度5mM条件下催化反应6h，厚朴酚、白藜芦醇、木犀草素和山奈酚四种天然产物的转化率分别为97.0％、90.0％、90％和99.0％。
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2023
- 2023-09-25 CN CN202311247504.9A patent/CN117265046A/zh active Pending
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