CN107674877A

CN107674877A - 糖基化合物的甲基化转移酶基因

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Publication number: CN107674877A
Application number: CN201710684237.XA
Authority: CN
Inventors: 张礼文; 徐玉泉; 谢李楠; 王辰; 王晓婧
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2018-02-09
Also published as: CN108624572B; CN108624572A

Abstract

本发明涉及一个糖苷类化合物的甲基转移酶基因，可在体外将糖苷类化合物中糖基的4位羟基进行甲基化修饰，同时可以同萄糖基转移酶协同作用，通过组合生物合成转化包括聚酮类，黄酮类，蒽醌类等在内的不同活性物质，从而获得有别于这些天然产物结构的新型活性化合物，实现化合物的定向生物转化，增强化合物的稳定性。

Description

糖基化合物的甲基化转移酶基因

技术领域：

本发明涉及一个可将糖基化物质中的葡萄糖4位羟基甲基化的基因，所述糖基化物质具体包括聚酮类，黄酮类，-的糖基化衍生物。

背景技术：

各种天然及非天然的糖基化物质容易受到来自生物体及外界的多种因素的影响，导致自身降解，活性降低。如果将这些物质中糖基的4位羟基烷基化，有利于增强其稳定性。

真菌生物转化是利用细胞内特定的酶对外源化合物进行结构修饰与改造，从而获得更有价值的代谢反应。

发明内容:

本发明的目的是获得可参与糖基化合物中糖基的4位羟基甲基化的O-甲基转移酶基基因，实现糖基化化合物的体外甲基化修饰，获得新型结构及活性的天然产物，增强其稳定性。

本发明筛选了球孢白僵菌，从中获得了一个特殊的O-甲基转移酶，命名为BbFkbM。

通过人工合成葡糖O-甲基转移酶基因BbFkbM，构建了可在酵母菌中表达的重组质粒，同实验室已有的葡糖基转移酶异源表达载体共转入酵母，并在酵母中进行异源表达转化。

通过外源添加不同糖基化衍生物，或与葡糖基转移酶进行组合生物合成，从发酵产物中提取得到了与原化合物结构不同的糖甲基化产物。

经实验证实，本发明的O-甲基转移酶基基因通过异源表达，可对多种黄酮类，聚酮类糖基化衍生物进行甲基化修饰，所得到的产物较未修饰前稳定性增强，可抵消酵母中糖苷水解酶的降解作用，增强了在生物体内的稳定性。

而且，本发明还发现所述O-甲基转移酶BbFkbM的同源基因存在于不同的虫生真菌中，具有相同的功能。可与不同的糖基转移酶进行组合生物合成，修饰不同的天然活性产物，为先导化合物的发现及药物的定向转化提供了新的研究方法与途径。

具体如下：

1、获得BbFkbM基因

通过基因组测序和相关预测软件对糖基转移酶的结构分析，设计引物，由cDNA扩增获得球孢白僵O-甲基转移酶基因BbFkbM。其中，BbFkbM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、葡糖基转移酶BbFkbM酵母表达载体构建与酵母转化

将含有完整的BbUGT86的DNA片段连接到PXW06F载体上，构建了组成型表达质粒PXW06F-BbFkbM，同时和葡糖基转移酶异源表达载体PRS425m-BbUGT86转入营养缺陷型酵母受体BJ5464进行异源表达中。

3、重组子的筛选共同

将表达载体转入不能合成亮氨酸、色氨酸的缺失酵母菌中，利用亮氨酸、色氨酸营养缺陷型标记筛选重组子。

4、聚酮类化合物饲喂转化试验及转化产物HPLC液相分析

重组菌株培养过程中分别添加聚酮类化合物Desmethyl-Lasiodiplodin(以下称为化合物1)，发酵转化产物用有机溶剂提取，并进行HPLC液相分析，核磁共振分析产物结构。

发现化合物1几乎全部转化。液相结果显示除了化合物1的峰外还得到了另外一个峰。分离产物进行进一步的结构分析证明得到了与天然产物化合物1不同结构的聚酮类化合物2，经质谱分析发现化合物2是在原产物化合物1的5位碳原子的羟基上加上了一个葡萄糖，同时葡萄糖4位上的羟基甲基化。证明了O-甲基转移酶基因可用于对苯二酚内酯及其类似物的聚酮糖基化衍生物的结构进行修饰，很适合对各种活性化合物进行分子结构修饰，增加聚酮化合物库的多样性。重组菌株发酵产物色谱图及产物结构见图3。

5、黄酮类化合物的饲喂转化试验及转化产物HPLC液相分析

重组菌株培养过程中分别添加不同黄酮类化合物，发酵转化产物用有机溶剂提取，并进行HPLC液相分析，核磁共振分析产物结构。

6.糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物在稳定性比较

将纯化后的糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物分别添加到野生型的酵母发酵液中，培养相同的时间，通过提取粗提物进行HPLC液相分析，检测两种物质在酵母体内自身酶系作用下的稳定性。

7.酵母糖苷水解酶EXG1对糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物稳定性的影响

将纯化后的糖基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物分别添加到野生型和敲除糖苷水解酶EXG1的酵母发酵液中，培养相同的时间，通过提取粗提物进行HPLC液相分析，检测两种物质在酵母自身糖苷水解酶作用下的稳定性。

8.虫生真菌中同源基因的功能验证

通过获得的球孢白僵菌的糖基转移酶和O-甲基转移酶的氨基酸序列利用相关生物信息学软件进行比对从不同的虫生真菌中获得了DNA相似度大于30％、覆盖率大于90％的98个同源基因序列见表1。从DNA序列一致度50％、相似度70％、覆盖率99％以上的序列中挑选了玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea，罗伯特绿僵菌Metarhizium robertsii和紫色麦角菌Claviceps purpurea中的3个O-甲基转移酶基因进行异源表达，NCBI中的序列号分别为XP_007822447.1、XP_018701797.1和CCE31609.1。这四个蛋白的活性中心的氨基酸序列一致性很高，极性相符(图31)。通过底物饲喂试验，均成功转化了聚酮类化合物1的糖基化衍生物，验证了真菌中同源的糖基转移酶和O-甲基转移酶的相似功能。

表1 O-甲基转移酶基因BbFkbM的同源基因列表

序列表说明

SEQ ID NO.1BbFkbM的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2由SEQ ID NO.1推导出的BbFkbM编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO.3IfOMT的核苷酸序列；

SEQ ID NO.4由SEQ ID NO.3推导出的IfOMT编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO.5MrOMT的核苷酸序列；

SEQ ID NO.6由SEQ ID NO.5推导出的MrOMT编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO.7CpOMT的核苷酸序列；

SEQ ID NO.8由SEQ ID NO.7推导出的CpOMT编码的氨基酸序列。

附图说明

图 1为BbFkbM基因片段的扩增结果；

图2为重组载体PXW06F-BbFkbM的物理图谱；

图3为化合物1修饰前的液相色谱图；

图4是化合物1修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物2的HPLC液相色谱图。

图5-图19为所实验的底物黄酮样品转化后的糖甲基化产物的色谱图及质谱结果，其中：

图5的F-3化合物转化前的色谱图及质谱结果；

图6的F-4化合物转化前的色谱图及质谱结果；

图7的F-5化合物转化前的色谱图及质谱结果；

图8的F-6化合物转化前的色谱图及质谱结果；

图9是F-7化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图10是F-8化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图11是F-11化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图12是F-12化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图13是F-15化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图14是F-16化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图15是F-20化合物转化后的色谱图及质谱结果；

图16和图17分别为化合物3在培养24h和48h后的水解产物的液相色谱图；

图18和图19分别为化合物2在培养24h和48h后的水解产物的液相色谱图；

图20为EXG1敲除突变株PCR验证的电泳结果；

图21和图22分别为化合物3在野生型及突变型酵母培养过程中的水解产物的液相色谱图；

图23和图24分别为化合物2在野生型及突变型酵母培养过程中的水解产物的液相色谱图；

图25到图27分别为重组载体PXW06F-IfOMT、PXW06F-MrOMT和PXW06F-CpOMT物理图谱。

图28为化合物3经紫色麦角菌CpOMT修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物2的HPLC液相色谱图；

图29为化合物3经罗伯特绿僵菌MrOMT修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物2的HPLC液相色谱图；

图30为化合物3经玫烟色棒束孢菌IfOMT修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物2的HPLC液相色谱图。

图31为BbFkbM与CpOMT、MrOMT、IfOMT的蛋白序列比对结果，红线标出区域为该蛋白活性中心，条形图表示序列一致度，字母颜色表示氨基酸极性。

具体实施方式

以下实验中所用的实验材料说明及来源如下：

以下菌株和载体：球孢白僵菌Beauveria bassiana ATCC7159、玫烟色棒束孢菌Isaria fumosorosea ACCC37775，罗伯特绿僵菌Metarhizium robertsii ARSEF 23和紫色麦角菌Claviceps purpurea ACCC337002酵母菌S.cerevisiae BJ5464-NpgA、酵母表达载体PRS425m-BbUGT86和PXW06F，均来源于中国农业科学院生物技术所，由本发明人实验室自行保存

酶与试剂盒：

限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；

RNA反转录试剂盒购自TAKARA公司；

Quick-Fusion Cloning Kit购自Biotool公司；

热启动高保真DNA扩增试剂盒购自Biotool公司；

DNA聚合酶和DNA marker购自北京全式金生物公司；

质粒小提试剂盒、通用型DNA纯化胶回收试剂盒购自天根公司；

冷冻酵母转化试剂盒购自YMO RESEARCH生物公司；

大肠杆菌DH5α感受态购自康维世纪公司；其它试剂均为国产分析纯产品。

培养基：

大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。SC-^-Leu缺陷培养基(1％葡萄糖、6.7％Difco^TM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids、-Leu/-Trp DO Supplement)。YPD培养基(1％酵母膏，2％Peptone蛋白胨，2％葡萄糖)。YPD低糖培养基(1％酵母膏，2％Peptone蛋白胨，1％葡萄糖.)若制固体培养基，加入2％琼脂粉。

实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，分子克隆按(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

化合物1：Desmethyl-Lasiodiplodin

化合物2：化合物1糖基4位羟基的甲基化产物

化合物3：化合物1糖基化产物

实施例1 合成O-甲基转移酶基因BbFkbM，并构建酵母表达载体获得酵母转化子

对获得的一株球孢白僵菌进行基因组测序获得了该菌株的基因组序列，通过相关生物信息学软件分析糖基转移酶的过程中，通过比对发现了一个O-甲基转移酶基因，我们命名为BbFkbM。将BbFkbM的核苷酸序列通过多种软件预测分析去除掉内含子拼接得到BbFkbM的编码区序列。提取球孢白僵菌的RNA通过反转录获得cDNA，利用设计的引物扩增BbFkbM的编码基因，回收目的片段交给测序公司测序比对，获得SEQ ID NO.1所示的糖基转移酶基因BbFkbM。

合成时引入酶切位点。在启动子前加入NdeI酶切位点，在终止子后加入PmeI酶切位点，片段长度为0.75Kb。BbFkbM扩增片段见图1。

用NdeI和PmeⅠ双酶切穿梭载体PXW06F并回收6114bp大小的片段。利用无缝连接克隆试剂盒将两片段连接。

热激法转化入大肠杆菌感受态DH5α。Amp^r抗性筛选，提取质粒，ScaI和NdeⅠ酶切鉴定。重组质粒PXW06F-BbFkbM图谱见图2

将酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464-NpgA接种至YPD培养基中，30℃、200r/min-1培养至O.D.值0.8-1.0，按照ZYMO公司提供的说明书制备酿酒酵母感受态细胞并进行重组质粒的转化。将含有糖基化转移酶基因的PRS425m-BbUGT86同含有O-甲基转移酶的PXW06F-BbFkbM重组质粒共转化入酿酒酵母中，涂布于亮氨酸、色氨酸缺失的SC固体缺陷培养基，30℃培养3天左右。获得的酵母转化子，划线培养至新的SC—^-Leu/^-Trp缺陷培养基上，于30℃培养箱中培养2天左右；

实施例2 应用葡O-甲基转移酶重组载体PXW06F-BbFkbM实现对聚酮类化合物Desmethyl-Lasiodiplodin糖基化衍生物的修饰

1.实验目的

通过HPLC高效液相分离得到修饰O-甲基转移酶和葡糖基转移酶后的代谢产物并分析其分子结构。

2.实验方法：

1)发酵培养

采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至相应的25ml^-Leu/^-Trp液体缺陷培养基中，30℃、200r·min-1培养16h左右，再加入YPD低糖培养基25ml，同时分别加入5mg Desmethyl-Lasiodiplodin纯品继续培养48h；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇复溶萃取物。

2)高效液相(HPLC)色谱检测：

将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。

HPLC检测条件如下：色谱柱Kromasil 100-5-C18，采用乙腈-H2O为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件:梯度洗脱条件:0～5min,乙腈10％；5～15min,乙腈从10％→95％；15～25min,乙腈为95％；25～28min,乙腈从95％→10％；28～31min,乙腈为10％。流速0.8mL·min-1，检测波长为300nm。

3.实验结果及分析：

通过HPLC分析发现，天然聚酮类化合物1(Desmethyl-Lasiodiplodin)的峰几乎消失，得到了另外一个峰，说明天然产物化合物1几乎全部被转化。

分离产物进行质谱及核磁共振分析证明，大部分化合物1通过葡糖基转移酶和O-甲基转移酶的修饰作用转化为了化合物2。

经质谱分析及核磁共振的C谱及H谱结果分别得到了化合物1、2的大致结构式，通过比较两种化合物的相对分子质量发现化合物2比化合物1的相对分子质量大，结合分子结构可确定化合物2分子上多出了一个甲基化的葡萄糖分子。

通过软件进一步分析C谱及H谱，发现化合物2是在原产物化合物1的5位碳原子的羟基上加上了一个4位羟基甲基化的葡萄糖。

以上结果证明，本发明得到的O-甲基转移酶基因可用于聚酮糖基化衍生物进行甲基化修饰，增加聚酮化合物库的多样性。

重组菌株发酵产物色谱图及产物结构见图3和图4。

化合物1和化合物2NMR的C谱及H谱见表2。

表2 化合物1和化合物2NMR的C谱及H谱

实施例3 应用葡O-甲基转移酶重组载体PXW06F-BbFkbM实现对黄酮类化合物的修饰

1.实验目的

2.实验方法：

1)发酵培养

采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至相应的25ml^-Leu/^-Trp液体缺陷培养基中，30℃、200r·min-1培养16h左右，再加入YPD低糖培养基25ml，同时分别加入5mg纯品继续培养48h，所用黄酮类样品共20种；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇复溶萃取物。

2)高效液相(HPLC)色谱检测：

将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。

2.实验结果及分析：

通过HPLC分析发现，添加的20中底物中共有10种样品发生了转化，分别为编号F-3,F-4,F-5,F-6,F-7,F-8，F-11,F-12,F-15,F-16,F-20。在发酵产物的色谱图中除了添加的起始底物的峰及糖基化产物的峰，还得到了另一个的化合物的峰，确定添加的起始的黄酮样品均发生了转化。

经质谱结果分析，分别得到了转化后产物的相对分子量，通过比较两种化合物的相对分子质量发现转化后产物均比起始底物的相对分子质量大176，结合分子结构可确定转化后化合分子上多出了一个甲基化的葡萄糖分子。

通过软件进一步分析发现甲基化发生在在起始底物的糖基化产物葡萄糖的4位羟基上。证明了O-甲基转移酶基因可用于对黄酮类糖基化衍生物的结构修饰，很适合对各种活性化合物进行分子结构修饰，增加黄酮苷类化合物库的多样性。

重组菌株发酵产物色谱图见图5到图15，

转化前后化合物的化学式，结构及分子量见表3。

表3 各类黄酮类化合物修饰前后对照

实施例4 糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物的稳定性比较

1.实验目的

在酵母自身酶系的作用下，比较糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物化合物3在相同条件下的体外稳定性。

2.实验方法：

在用YPD培养的50mL酵母BJ5464中分别添加2mg糖甲基化修饰产物化合物2，与修饰前化合物糖基化衍生物化合物3，样品溶解在100μL色谱甲醇中，空白对照为等体积色谱甲醇。30℃、200r·min-1分别培养24h和48h后，用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇复溶萃取物。

将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。

3.实验结果及分析：

分析化合物3和化合物2在同样培养时间下的萃取产物色谱图。化合物3在培养24h和48h后的萃取产物色谱图分别如图16和图17所示：化合物2在培养24h和48h后的的萃取产物色谱图分别如图18和图19所示。

通过色谱图可以看出修饰后糖基化衍生物在24h后开始水解，随着培养时间的增长，水解化程度越高；但糖甲基化产物2在酵母培养过程中较为稳定，未发生明显水解现象，说明葡萄糖上发生的甲基化能增加糖基化产物的稳定性，防止化合物被酶降解。

实施例5 酵母中糖苷水解酶EXG1对糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物在培养过程中的影响

1.实验目的

在酵母糖苷水解酶EXG1的作用下，比较糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物化合物3在相同培养条件下的稳定性，确定甲基化作用对糖基化产物稳定性的影响。

2.实验方法：

1)构建糖苷水解酶EXG1缺失的酵母突变株

在酿酒酵母S.cerevisiae的糖苷水解酶EXG1基因中选取两段500bp左右的序列作为上下游同源臂，以尿嘧啶合成基因Ura为抗性标记，设计引物，通过融合PCR构建基因敲除所用的同源交换片段，引物列表见。

表4 合成引物及序列

扩增EXG1基因的上下游同源臂时，以S.cerevisiae BJ5464-NpgA基因组为模板，扩增尿嘧啶合成基因Ura基因时，以PXK-30F质粒为模板。通过Biotool热启动高保真DNA扩增试剂盒进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，天根DNA纯化试剂盒回收目的条带，以回收片段为模板，EXG1-UP-F，EXG1-Down-R为引物进行第二轮的融合PCR扩增，同样PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，融合片段全长为bp。天根DNA纯化试剂盒回收融合片段，用于酵母的基因敲除。

将酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464-NpgA接种至YPD培养基中，30℃、200r/min-1培养至O.D.值0.8-1.0，按照ZYMO公司提供的说明书制备酿酒酵母感受态细胞并进行重组片段的转化。将融合片段转化入酿酒酵母中，涂布于尿嘧啶缺失的SC固体缺陷培养基，30℃培养3天左右。获得的酵母转化子，划线培养至新的SC-^-Ura缺陷培养基上，于30℃培养箱中培养2天左右；同挑取了8个酵母转化子进行菌落PCR，验证敲除结果的正确性，验证引物为CTGTGTTTACAGTGCGGTGCACACG；CGTTTGGATGAGGACCCACTTGAAACAAT；PCR产物野生型条带应为2.4k，突变株为1.9k。PCR产物电泳结果见图20，在8个酵母转化子中有7株酵母成功实现的基因敲除，转化效率高达87.5％。

用YPD培养的50mLΔEXG1酵母BJ5464中分别添加2mg糖甲基化修饰产物化合物2，与修饰前化合物糖基化衍生物化合物3，样品溶解在100μL色谱甲醇中，对照为除菌株为野生型BJ5464外，其他条件均不变。30℃、200r·min-1分别培养48h后，用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇复溶萃取物。

将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。

3.实验结果及分析：

化合物3在野生型及突变型酵母相同培养条件下的萃取产物色谱图如图21和22所示；化合物2在野生型及突变型酵母相同培养条件下的萃取产物色谱图如图23和24所示。

通过野生型和ΔEXG1突变型的色谱图可以看出修饰前糖基化衍生物在酵母糖苷水解酶的水解作用下发生明显的葡萄糖掉落现象，重新转化为糖基化前的起始底物，再敲除掉 EXG1基因后这种水解作用程度降低，说明酵母中的糖苷水解酶EXG1可作用于糖基化的化合物，发生水解现象，而且这种水解作用比较明显；而糖甲基化产物2在无论是在野生型还是突变型的酵母培养过程中都较为稳定，未发生明显水解现象，说明葡萄糖上发生的甲基化能增加糖基化产物的稳定性，防止化合物被水解酶降解。

实施例6虫生真菌中O-甲基转移酶同源基因的功能验证

1.实验目的

利用相关生物信息学软件分析发现了球孢白僵菌中的糖基转移酶和O-甲基转移酶在其他虫生真菌中存在大量的同源基因，通过酵母的异源表达系统，进行聚酮化合物的底物饲喂试验，确定这些同源基因的功能。

2.实验方法：

1)构建酵母表达载体，获得酵母转化子

利用相关生物信息学软件进行比对从不同的虫生真菌中获得球孢白僵菌糖基转移酶和O-甲基转移酶的同源基因序列。从这些相似度高达80％以上的基因序列中挑选了玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea，罗伯特绿僵菌Metarhizium robertsii和紫色麦角菌Claviceps purpurea的3株菌的O-甲基转移酶基因进行序列分析。通过多种软件预测分析去除掉内含子拼接得到O-甲基转移酶基因的编码区序列。设计的引物扩增目的基因，回收目的片段交给测序公司测序比对，获得了IfOMT、MrOMT和CpOMT的编码基因序列。基因序列依次分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示。合成时分别引入酶切位点。在启动子前加入NdeI酶切位点，在终止子后加入PmeI酶切位点。用NdeI和PmeⅠ双酶切穿梭载体PXW06F并回收6114bp大小的片段。利用无缝连接克隆试剂盒分别将基因片段与载体连接。

热激法转化入大肠杆菌感受态DH5α。Amp^r抗性筛选，提取质粒，酶切鉴定。获得的重组质粒PXW06F-IfOMT、PXW06F-MrOMT和PXW06F-CpOMT质粒图谱依次见图25，图26和图27。将酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464-NpgA接种至YPD培养基中，30℃、200r/min-1培养至O.D.值0.8-1.0，按照ZYMO公司提供的说明书制备酿酒酵母感受态细胞并进行重组质粒的转化。将重组质粒转化入酿酒酵母中，涂布于色氨酸缺失的SC固体缺陷培养基，30℃培养3天左右。获得的酵母转化子，划线培养至新的SC—^-Trp缺陷培养基上，于30℃培养箱中培养2天左右；

2)发酵培养

采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至相应的25ml^-Trp液体缺陷培养基中，30℃、200r·min-1培养16h左右，再加入YPD低糖培养基25ml，同时分别加入5mg化合物1的糖基化衍生物化合物3继续培养48h，用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇复溶萃取物。

3)高效液相(HPLC)色谱检测：

将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。

3.实验结果及分析：

通过HPLC分析发现，不同来源的O-甲基转移酶通过异源表达均能将糖基化化合物3转化，得到了另外一个糖甲基化产物的峰。这说明不同虫生真菌中的O-甲基转移酶同源基因具有相同的修饰功能，均能成功实现对聚酮化合物等糖基化衍生物葡萄糖4位羟基上的甲基化以达到提高糖基化化合物稳定性的目的。CpOMT、MrOMT和IfOMT的重组菌株底物饲喂发酵产物的色谱图及见图28、图29和图30。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 糖苷类化合物的甲基化转移酶基因

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 1

ATGGCTCTCG TCGAAAAAAT TCAGTTGACA GACGATTTTT CTGTCTATGC AAATCCAGCC 60

GCTAAGCTTG AAGTGGAATT TATTCACAAA GAAATCTTCA TCGACAAGTG CTATGATGTC 120

GCGCCATTTC CCGACGATAG CTTCATAGTC GATGCTGGTG GCAACATTGG CATGTTCACC 180

CTGTACATGA AGAGAAAATA TCCACAATCA ACCATTCTCG CTTTTGAGCC TGCTCCGGCT 240

ACGTTTTCTA CTTTTCAGCG CAATATGGAA TTACACAACG TTTCCGGTGT ACAAGCCCAT 300

CAATGTGGGC TCGGCAGGGA AGATGCAAGT CTGGCCTTGA CGTTCTACCC GCAGATGCCA 360

GGCAACTCGA CGCTGTATGC CGAGGACAAA ACGAACCAAA TGAAGTCTGT GGACCAAAAT 420

CACCCTATCG CCAAGCTTAT GCAAGAGACG CATGAGGTGC AAGTTGATGT GAAACGGCTG 480

TCGGATTTCC TTGGCGAGGT CCCCAATCTG AAACGCGTCA ACCTGCTCAA GGTAGACGTG 540

GAGGGCGCCG AGATGGATGT GTTACGAGGT TTAGATGACG AGCATTGGGA TCTGATTGAC 600

AATGTTGTAG TCGAGCTTTG CGACAGCAAA GGAGACTTTG CCACGGCCAA GACTCTGCTG 660

GAATCCAAGG GATTTGCGGT TGCTGTAGAG AGGCCCGACT GGGCACCACC AGATCTAAAG 720

ATGTACATGT TGATCGCAAA AAGAAACTGA 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 2

Met Ala Leu Val Glu Lys Ile Gln Leu Thr Asp Asp Phe Ser Val Tyr

1 5 10 15

Ala Asn Pro Ala Ala Lys Leu Glu Val Glu Phe Ile His Lys Glu Ile

20 25 30

Phe Ile Asp Lys Cys Tyr Asp Val Ala Pro Phe Pro Asp Asp Ser Phe

35 40 45

Ile Val Asp Ala Gly Gly Asn Ile Gly Met Phe Thr Leu Tyr Met Lys

50 55 60

Arg Lys Tyr Pro Gln Ser Thr Ile Leu Ala Phe Glu Pro Ala Pro Ala

65 70 75 80

Thr Phe Ser Thr Phe Gln Arg Asn Met Glu Leu His Asn Val Ser Gly

85 90 95

Val Gln Ala His Gln Cys Gly Leu Gly Arg Glu Asp Ala Ser Leu Ala

100 105 110

Leu Thr Phe Tyr Pro Gln Met Pro Gly Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Glu

115 120 125

Asp Lys Thr Asn Gln Met Lys Ser Val Asp Gln Asn His Pro Ile Ala

130 135 140

Lys Leu Met Gln Glu Thr His Glu Val Gln Val Asp Val Lys Arg Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Leu Gly Glu Val Pro Asn Leu Lys Arg Val Asn Leu Leu

165 170 175

Lys Val Asp Val Glu Gly Ala Glu Met Asp Val Leu Arg Gly Leu Asp

180 185 190

Asp Glu His Trp Asp Leu Ile Asp Asn Val Val Val Glu Leu Cys Asp

195 200 205

Ser Lys Gly Asp Phe Ala Thr Ala Lys Thr Leu Leu Glu Ser Lys Gly

210 215 220

Phe Ala Val Ala Val Glu Arg Pro Asp Trp Ala Pro Pro Asp Leu Lys

225 230 235 240

Met Tyr Met Leu Ile Ala Lys Arg Asn

245

<210> 3

<211> 750

<212> DNA

<213> 玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）

<400> 3

ATGGCTGCCG TGCAAAAAAT CCAACTTGCA GATGACTTTT CCGTCTACGC AAACCCCGCA 60

GCAAAGCTCG AGGTCGAGTT CATCTACAAG GAAATCTTCG TCGATGGGTG CTACAACAAC 120

GCGTCGATCC CCGACGACGC CTTCATCGTC GACGCCGGAG GCAACATTGG CATGTTCAGC 180

CTTTTCATGA AGAAGAAATA TCCGCAATCG ACTATCCTCG CTTTTGAGCC TGCGCCGGCT 240

ACCTTTTCCA CCTTTCAGCG CAACATGGAG CTGCACGGTG TTTCTGGGGT GCAGGCCCAT 300

CAATGCGGGC TCGGCAAGGA GAACGCCAGC ATGGCCCTGA CCTTTTACCC GCAGATGCCT 360

GGCAACTCGA CGCTATACCT AGAGGACAAG AAGAACCAGA TGAAGTCTAT CGACAAGGAG 420

CACCCCATCG CCAAGCTCAT GCAGGAGACG GAAGAGGTGC AGGTGGACGT GAAGCGGCTG 480

TCCGAATTCC TCGACCGCGT GCCGGACCTG AAACGCGTTG ACCTGCTCAA GATAGACGTC 540

GAGGGTGCTG AGCTGGACGT GCTGAAGGGT CTGGACGACA AGCACTGGAA CCTGATTAAC 600

AATATTGTGA TCGAACTTTG CGACAGCAAG AGCGAGTTCG CCATCACCAA GGCACTGCTG 660

GAATCGAAAG GGTTCACGGT TGCGATAGAA CGGCCTGACT GGGCACCCGA AGACCTCAAG 720

ATGTACATGT TGATCGCGAA CAGACGCTAA 750

<210> 4

<211> 249

<212> PRT

<213> 玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）

<400> 4

Met Ala Ala Val Gln Lys Ile Gln Leu Ala Asp Asp Phe Ser Val Tyr

1 5 10 15

Ala Asn Pro Ala Ala Lys Leu Glu Val Glu Phe Ile Tyr Lys Glu Ile

20 25 30

Phe Val Asp Gly Cys Tyr Asn Asn Ala Ser Ile Pro Asp Asp Ala Phe

35 40 45

Ile Val Asp Ala Gly Gly Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Met Lys

50 55 60

Lys Lys Tyr Pro Gln Ser Thr Ile Leu Ala Phe Glu Pro Ala Pro Ala

65 70 75 80

Thr Phe Ser Thr Phe Gln Arg Asn Met Glu Leu His Gly Val Ser Gly

85 90 95

Val Gln Ala His Gln Cys Gly Leu Gly Lys Glu Asn Ala Ser Met Ala

100 105 110

Leu Thr Phe Tyr Pro Gln Met Pro Gly Asn Ser Thr Leu Tyr Leu Glu

115 120 125

Asp Lys Lys Asn Gln Met Lys Ser Ile Asp Lys Glu His Pro Ile Ala

130 135 140

Lys Leu Met Gln Glu Thr Glu Glu Val Gln Val Asp Val Lys Arg Leu

145 150 155 160

Ser Glu Phe Leu Asp Arg Val Pro Asp Leu Lys Arg Val Asp Leu Leu

165 170 175

Lys Ile Asp Val Glu Gly Ala Glu Leu Asp Val Leu Lys Gly Leu Asp

180 185 190

Asp Lys His Trp Asn Leu Ile Asn Asn Ile Val Ile Glu Leu Cys Asp

195 200 205

Ser Lys Ser Glu Phe Ala Ile Thr Lys Ala Leu Leu Glu Ser Lys Gly

210 215 220

Phe Thr Val Ala Ile Glu Arg Pro Asp Trp Ala Pro Glu Asp Leu Lys

225 230 235 240

Met Tyr Met Leu Ile Ala Asn Arg Arg

245

<210> 5

<211> 759

<212> DNA

<213> 罗伯特绿僵菌（Metarhizium robertsii）

<400> 5

ATGGCGGCCG AAATACAGAA ACTAGAAATG TCGGACGGTT TTCTCGTCTA CGCCAACCCC 60

AAGGCAGCCA TGGAGACGCA ATTCATCCAC AAGGAAATCT TTCAAGACAA ATGTTATGAT 120

GTCGCACCCT TCCCCGAGGA CGCCTTCATG ATTGATGCGG GAGGCAACAT TGGCATGTTC 180

AGCCTGTACA TGAAGAAGAA ATACCCGGCT GCCACAATCC TAGCATTCGA ACCCGCACCG 240

ACGACTTTCA ACACATTCAA GAAGAACATG GAACTGCACA ACATTTCAGG CGTGCAGGTC 300

TACCAGTGCG GGCTGGGTCG TGAGAATTCC AACGAGACGT TGACTTTTTA TCCCAACATG 360

CCCGGCAATT CGACCTTGCA TGGTGGCGAA AAAGAAGAGT TTATCAAGAC GGCAGATTCT 420

GAACACCCTG TTATTAAGTT GCTAAGCGAG GTCGAGCAGG TTCAGGTCGA CGTCAAGCGA 480

CTATCGGGGT TTCTAAACGA TCTTCCCGAC CTGAAGCGGA TTGACTTGCT CAAGATTGAT 540

GTGGAAGGTG CGGAGCTGGA CATCTTCCGC GGACTGGACA ATGTACACTG GGACTTGATT 600

GAAAACATTG TCTTGGAGAT TTGTGACCAC AATGGAGCAT TGGAAGAAGC TGAAGCGCTT 660

TTGCGAGAGA AGGGATTTGA GACTTCCAAG GAGTTGGCGG ACTGGGCGCC GAAAGAGATG 720

CCGATGTACA TGATGGTAGC TAAACGGGCT CATCACTAG 759

<210> 6

<211> 252

<212> PRT

<213> 罗伯特绿僵菌（Metarhizium robertsii）

<400> 6

Met Ala Ala Glu Ile Gln Lys Leu Glu Met Ser Asp Gly Phe Leu Val

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Pro Lys Ala Ala Met Glu Thr Gln Phe Ile His Lys Glu

20 25 30

Ile Phe Gln Asp Lys Cys Tyr Asp Val Ala Pro Phe Pro Glu Asp Ala

35 40 45

Phe Met Ile Asp Ala Gly Gly Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Tyr Met

50 55 60

Lys Lys Lys Tyr Pro Ala Ala Thr Ile Leu Ala Phe Glu Pro Ala Pro

65 70 75 80

Thr Thr Phe Asn Thr Phe Lys Lys Asn Met Glu Leu His Asn Ile Ser

85 90 95

Gly Val Gln Val Tyr Gln Cys Gly Leu Gly Arg Glu Asn Ser Asn Glu

100 105 110

Thr Leu Thr Phe Tyr Pro Asn Met Pro Gly Asn Ser Thr Leu His Gly

115 120 125

Gly Glu Lys Glu Glu Phe Ile Lys Thr Ala Asp Ser Glu His Pro Val

130 135 140

Ile Lys Leu Leu Ser Glu Val Glu Gln Val Gln Val Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Leu Ser Gly Phe Leu Asn Asp Leu Pro Asp Leu Lys Arg Ile Asp Leu

165 170 175

Leu Lys Ile Asp Val Glu Gly Ala Glu Leu Asp Ile Phe Arg Gly Leu

180 185 190

Asp Asn Val His Trp Asp Leu Ile Glu Asn Ile Val Leu Glu Ile Cys

195 200 205

Asp His Asn Gly Ala Leu Glu Glu Ala Glu Ala Leu Leu Arg Glu Lys

210 215 220

Gly Phe Glu Thr Ser Lys Glu Leu Ala Asp Trp Ala Pro Lys Glu Met

225 230 235 240

Pro Met Tyr Met Met Val Ala Lys Arg Ala His His

245 250

<210> 7

<211> 756

<212> DNA

<213> 紫色麦角菌（Claviceps purpurea）

<400> 7

ATGGCCACCG CAAATTTACA AAAAGTGCAA CTCGCTGATG ATTTAGCCGT CTACGCAAAC 60

TCAGGCGCCG AATTCGAGAC CCAGTTCCTC TACAGGGAAA TCTTCGGAGA CAAGTGCTAC 120

GACACAGGCC CTCTGCCCGA AGACGCAGTC ATCATCGACG CAGGCGCCAA CATCGGCATG 180

TTCAGCCTAT ACATCAAGCG GCAGTGTCCC GGGGCGCGCA TCACGGCCTT TGAGCCCGCG 240

CCCGATACGG CGGCGGCGCT GAGGCTCAAT CTGGCGCTGC ATAAGGTGCA TGGGGTCGAG 300

GTGCACGAGT GCGCGCTGGG AAGCCAGGAC TGTGAGATGA AGTTGACGTA CTTTCCCAAT 360

ATGCCGGGAA ACTCGACATT GCATGGCGAT GATGAACCGG CCATCTTTGC GGGAGAGGTC 420

GGGCGCGCGC ATCCGGTGGC GCGGCTGCGG GAGGAGCGGC GGGAGGTGCC GGTGCCGGTG 480

CGGCGGCTAT CGGATGTTTT GCGGCAGATG CCGGGACTAG AGCGCGTGGA TCTGCTCAAA 540

ATCGACGTCG AAGGCGCCGA ACTAGACGTC CTGCGGGGAC TAGACGATGA TCATTGGGAG 600

CTAGTGCGCC GTATCGTCAT GGAGGTGGGC GACGAACACG GCGATCTGGC GGCCGCCGAG 660

ACTCTGCTGC GGGGGCGCGG CTTCGAGGTC GTGAGCGAGC GCGCGGCGTG GGCGCCAGAG 720

ACGTTGCCCA TGTATACCTT GATGGCGCGA AGGTGA 759

<210> 8

<211> 251

<212> PRT

<213> 紫色麦角菌（Claviceps purpurea）

<400> 8

Met Ala Thr Ala Asn Leu Gln Lys Val Gln Leu Ala Asp Asp Leu Ala

1 5 10 15

Val Tyr Ala Asn Ser Gly Ala Glu Phe Glu Thr Gln Phe Leu Tyr Arg

20 25 30

Glu Ile Phe Gly Asp Lys Cys Tyr Asp Thr Gly Pro Leu Pro Glu Asp

35 40 45

Ala Val Ile Ile Asp Ala Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Tyr

50 55 60

Ile Lys Arg Gln Cys Pro Gly Ala Arg Ile Thr Ala Phe Glu Pro Ala

65 70 75 80

Pro Asp Thr Ala Ala Ala Leu Arg Leu Asn Leu Ala Leu His Lys Val

85 90 95

His Gly Val Glu Val His Glu Cys Ala Leu Gly Ser Gln Asp Cys Glu

100 105 110

Met Lys Leu Thr Tyr Phe Pro Asn Met Pro Gly Asn Ser Thr Leu His

115 120 125

Gly Asp Asp Glu Pro Ala Ile Phe Ala Gly Glu Val Gly Arg Ala His

130 135 140

Pro Val Ala Arg Leu Arg Glu Glu Arg Arg Glu Val Pro Val Pro Val

145 150 155 160

Arg Arg Leu Ser Asp Val Leu Arg Gln Met Pro Gly Leu Glu Arg Val

165 170 175

Asp Leu Leu Lys Ile Asp Val Glu Gly Ala Glu Leu Asp Val Leu Arg

180 185 190

Gly Leu Asp Asp Asp His Trp Glu Leu Val Arg Arg Ile Val Met Glu

195 200 205

Val Gly Asp Glu His Gly Asp Leu Ala Ala Ala Glu Thr Leu Leu Arg

210 215 220

Gly Arg Gly Phe Glu Val Val Ser Glu Arg Ala Ala Trp Ala Pro Glu

225 230 235 240

Thr Leu Pro Met Tyr Thr Leu Met Ala Arg Arg

245 250

Claims

1.一种糖苷类化合物甲基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因在化合物体外的糖基化修饰中的应用。

3.权利要求2所述的应用，是糖苷类化合物中糖基的4位羟基甲基化体外修饰。

4.权利要求3所述的应用，所述糖苷类化合物是黄酮类和聚酮类的糖苷化合物。

5.含权利要求1所述基因的重组质粒。

6.权利要求5所述的重组质粒在糖苷类化合物中糖基的4位羟基甲基化体外修饰中的应用。

7.用权利要求5所述的重组质粒转化的真核或原核宿主细胞。

8.含权利要求5所述的重组质粒的重组工程菌株。

9.一种糖苷类化合物的甲基化转移酶，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

10.权利要求9所述的转移酶在化合物体外的糖基化修饰中的应用。