CN115896202A

CN115896202A - 基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用

Info

Publication number: CN115896202A
Application number: CN202111158151.6A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 魏文苹; 吴世文; 严兴
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提供了一种基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用。本发明人通过挖掘植物基因组信息，提供了一系列分离的酶，包括4‑香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪‑6‑β‑羟化酶。进一步地，本发明人通过联合运用所述的酶，合成了山莨菪醇类似物或东莨菪醇类似物，以及它们的合成途径的中间体化合物。

Description

基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和微生物学领域；更具体地，本发明涉及基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用。

背景技术

托品生物碱是来自茄科植物，其代表性化合物莨菪碱和东莨菪碱被世卫组织批准为抗胆碱药物，已被广泛用于麻醉、镇痛、止咳以及控制帕金森病等。作为临床基本药物莨菪碱和东莨菪碱拥有巨大市场需求，而其来源十分有限。茄科植物颠茄的叶片中托品生物碱的含量很低，莨菪碱含量一般为0.2％，东莨菪碱含量一般为0.02％。由于立体化学的挑战性，托品生物碱的全部化学合成方法对于工业用途而言都没有足够的经济效益。植物育种者使用遗传，辐射，和多倍体育种方法以尝试开发新的植物品种以高含量的莨菪而闻名，但所有这些努力都失败了。由此可见，东莨菪碱虽然具有极其重要的价值，但其来源存在一定的局限性。

据已有文献报道：在石蒜碱的C2基团上进行了亲脂取代可显著增强乙酰胆碱酶抑制活性。由于含有托品烷骨架的肉桂酸和苯甲酸类酯具有广泛的生物活性，一些被应用于制药行业。如果可以快速获得丰富多样的托品骨架的类似物，将会大大提高托品生物碱的药用活性潜能。

2016年，Dominique Loqué等首次在酵母体内实现莨菪碱类似物的生物合成。他们在酵母体内通过喂养假托品醇和肉桂酸，利用拟南芥来源的At4CL和古柯来源的EcCS催化生成肉桂酰假托品醇。4香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)是木质素生物合成途径中的一个关键酶，4CL催化肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯，这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径。其中以四香豆酸、阿魏酸和芥子酸为底物生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA、芥子酰CoA，被进一步转化为肉桂醇衍生物，最终通过脱氢还原反应生成木质素单体。EcCS酰基转移酶，该酶以苯丙烷辅酶A酯为酰基供体，假托品醇为酰基受体生成酯。

2019年，Srinivasan和Smolke在文献中指出EcCS也可以利用托品醇作为酰基受体，这进一步扩展了EcCS的底物范围。Srinivasan和Smolke进一步将拟南芥的PAL1和4CL5以及来自于古柯的可卡因合酶基因(EcCS)转化进入工程酵母细胞中，在酵母中进行莨菪碱的类似物肉桂酰托品的合成。

东莨菪碱比莨菪碱具有更高的应用价值，但东莨菪碱的类似物的生物合成在本领域中尚需进一步探讨和优化。

发明内容

本发明的目的在于提供基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用，所述化合物包括新的化合物，包括非天然的化合物。

在本发明的第一方面，提供一种制备托品骨架化合物的方法，包括：以4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶联合，催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。

在一个或多个实施方案中，所述的苯丙烷酸包括具有式(I)结构的化合物；和/或，所述托品醇类酰基受体包括：假托品醇或托品醇，山莨菪；

其中，R1，R2，R3独立地选自：氢，羟基，-O-烷基(烷氧基)，烷基，羰基、醛基。

在一个或多个实施方案中，所述的山莨菪醇类化合物包括具有式(II)结构的化合物；和/或，所述的东莨菪醇类化合物包括具有式(III)结构的化合物；

在一个或多个实施方案中，所述的烷基为包括1～8个碳原子(如2、3、4、5、6或7个)的烷基；较佳地，所述的式(I)结构的化合物包括(但不限于)选自如下结构的化合物或其异构体：

在一个或多个实施方案中，所述的式(II)结构的化合物包括(但不限于)选自如下结构的化合物或其异构体：

在一个或多个实施方案中，所述的式(III)结构的化合物包括(但不限于)选自如下结构的化合物或其异构体：

在一个或多个实施方案中，所述的异构体为托品醇类酰基受体的酰基化位点(酰基转移酶参与的酰基化)上的另一构型的异构体(同分异构体)。

在一个或多个实施方案中，所述的方法为胞内(体内)的反应体系或体外的反应体系；较佳地，在体外的反应体系中，分两步反应：

(a)以4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶联合，催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成莨菪碱类似物；较佳地，催化反应的体系中，还包括辅酶A(CoA)，MgCl₂，ATP；

(b)以莨菪-6-β-羟化酶催化莨菪碱类似物形成山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物；较佳地，催化反应的体系中，还包括α-酮戊二酸、抗坏血酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢酶。

在一个或多个实施方案中，(a)中，催化反应在Tris-HCl缓冲液中进行，较佳地其为100±20mM Tris-HCl、更佳地100±10mM Tris-HCl；较佳地其为pH 8.0±0.5、更佳地pH8.0±0.3。

在一个或多个实施方案中，(a)中，苯丙烷酸为0.5～10mM(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、5、7、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，CoA为0.5～10mM(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、5、7、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，MgCl₂为0.5～10mM(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、5、7、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，ATP为0.5～10mM(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、5、7、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，假托品醇为0.5～10mM(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、5、7、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，Aa-4CL为5～100uM(如6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90uM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，EcCS为20uM为5～100uM(如6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90uM)。

在一个或多个实施方案中，(a)中，反应在30±5℃(如30±3℃，30±2℃，30±1℃)进行。

在一个或多个实施方案中，(a)中，反应进行0.2～5小时(如0.3、0.5、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、4小时)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，催化反应在Tris-HCl缓冲液中进行，较佳地其为50±10mM Tris-HCl、更佳地50±5mM Tris-HCl；较佳地其为pH 8.0±0.5、更佳地pH 8.0±0.3。

在一个或多个实施方案中，(b)中，α-酮戊二酸(α-KG)为2～50mM(如3、5、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45mM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，抗坏血酸钠为1～20mM(如2、3、5、6、8、10、12、15、16、18、19mM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，硫酸亚铁为0.1～2mM(如0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8mM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，过氧化氢酶0.4～10mg/mL(如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、3、4、5、6、8、9mM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，以Aa-4CL和EcCS的反应液生成的莨菪碱的结构类似物为底物；较佳地，其用量为整个反应体系的1～30％(v/v)(如2％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％(v/v))。

在一个或多个实施方案中，(b)中，H6H为12～240μM(如15、20、25、30、40、50、60、66、70、80、100、150、200μM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，反应总体积200μL(如15、20、25、30、40、50、60、66、70、80、100、150、200μM)。

在一个或多个实施方案中，(b)中，反应在30±5℃(如30±3℃，30±2℃，30±1℃)进行。

在一个或多个实施方案中，(b)中，反应进行1-20小时(如2、3、4、5、6、8、10、12、15、15、18小时)。

在一个或多个实施方案中，所述的4-香豆酸辅酶A来源于三分三(Anisodusacutangulus)；较佳地，所述4-香豆酸辅酶A是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的酶，或其保守性变异多肽。

在一个或多个实施方案中，所述的酰基转移酶来源于古柯(Erythroxylum coca)；较佳地，所述酰基转移酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的酶，或其保守性变异多肽。

在一个或多个实施方案中，所述的莨菪-6-β-羟化酶来源于天仙子(Hyoscyamusniger L.)或三分三(Anisodus acutangulus)；较佳地，所述莨菪-6-β-羟化酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的酶，或其保守性变异多肽。

在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:2、4或6的保守性变异多肽包括：(1)由SEQID NO:2、4或6所示序列的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能被用于制备托品骨架化合物的多肽；(2)氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4或6所示序列的多肽有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)相同性，且能被用于制备托品骨架化合物功能的多肽；或(3)在SEQ ID NO:2、4或6所示序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供酶组合的用途，用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体，合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物；所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶。

所述的山莨菪醇类化合物包括具有式(II)结构的化合物；和/或，所述的东莨菪醇类化合物包括具有式(III)结构的化合物；

在一个或多个实施方案中，所述烷基如但不限于：C1～C6烷基、C1～C4烷基、C1～C2烷基。

在本发明的另一方面，提供构建体或含有所述构建体的遗传工程化的细胞(宿主细胞)，其中包括(外源的)编码酶组合的多核苷酸；所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶，其用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。

在一个或多个实施方案中，所述的细胞包括：在一个优选例中，所述遗传工程化的细胞包括：真核细胞或原核细胞；较佳地，所述真核宿主细胞包括：酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等；所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。

在本发明的另一方面，提供制备所述的细胞的方法，包括：将编码酶组合的多核苷酸引入到构建体(如表达质粒)中，进一步转入宿主细胞中。

在本发明的另一方面，提供莨菪-6-β-羟化酶的应用，用于将山莨菪碱类化合物的C-6、C-7位环氧化，形成东莨菪碱类化合物。

在本发明的另一方面，提供一种制备东莨菪碱类化合物的方法，包括以莨菪-6-β-羟化酶催化山莨菪碱类化合物，从而在其C-6、C-7环氧化形成东莨菪碱类化合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备托品骨架化合物的反应体系或试剂盒，其中包括：

(i)酶组合(组合的酶)，所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶，其用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物；或

(ii)构建体，所述构建体中引入了编码(i)所述酶组合的多核苷酸；

(iii)遗传工程化的细胞，其中引入了编码(i)所述酶组合的多核苷酸，或(ii)的构建体。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括：Tris-HCl缓冲液，较佳地其为100±20mM Tris-HCl、更佳地100±10mM Tris-HCl；较佳地其为pH 8.0±0.5、更佳地pH 8.0±0.3。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括苯丙烷酸；较佳地其为0.5～10mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括CoA；较佳地其为0.5～10mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括MgCl₂；较佳地其为0.5～10mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括ATP；较佳地其为0.5～10mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括假托品醇；较佳地其为0.5～10mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括Aa-4CL；较佳地其为5～100uM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括EcCS；较佳地其为5～100uM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括Tris-HCl缓冲液，较佳地其为50±10mM Tris-HCl、更佳地50±5mM Tris-HCl；较佳地其为pH 8.0±0.5、更佳地pH 8.0±0.3。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括α-酮戊二酸(α-KG)；较佳地其为2～50mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括抗坏血酸钠；较佳地其为1～20mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括硫酸亚铁；较佳地其为0.1～2mM。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括过氧化氢酶；较佳地其为0.4～10mg/mL。

在一个或多个实施方案中，所述反应体系或试剂盒中还包括H6H；较佳地其为12～240μM。

在一个或多个实施方案中，所述的试剂盒中，(i)、(ii)或(iii)被分离地置于不同的容器/包装中。

在一个或多个实施方案中，所述的试剂盒中，还包括说明制备托品骨架化合物的方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供托品骨架类化合物，所述化合物为具有如下结构的化合物或其异构体：

在一个或多个实施方案中，所述的异构体为A位置(酰基化位点)上的另一构型的异构体(同分异构体)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1、托品骨架类似物的合成路线图。

图1A：分步合成过程，其中(1)从苯丙烷酸合成莨菪醇类似物，(2)从莨菪醇类似物合成山莨菪醇类似物，(3)从山莨菪醇类似物合成东莨菪醇类似物；

图1B：总合成过程，从苯丙烷酸合成东莨菪醇类似物。

图2、以cDNA为模板扩增Aa-4CL基因片段。M：核酸Marker(庄盟生物科技有限公司)；Aa-4CL代表其扩增得到的Aa-4CL片段。

图3、纯化得到Aa-4CL的可溶蛋白。CL：全细胞裂解液；M：蛋白Marker(庄盟生物科技有限公司)；CP：细胞裂解液的沉淀；CS：细胞裂解液的上清；FT：细胞流穿液；20、50、100、250、500分别代表20mM、50mM、100mM、250mM、500mM咪唑洗脱下来的液体。

图4、纯化得到EcCS的可溶蛋白。CL：全细胞裂解液；CS：细胞裂解液的上清；M：蛋白Marker(庄盟生物科技有限公司)；CP：细胞裂解液的沉淀；FT：细胞流穿液；20、50、100、250、500分别代表20mM、50mM、100mM、250mM、500mM咪唑洗脱下来的液体。

图5、纯化得到Aa-H6H/Hn-H6H的可溶蛋白。M：蛋白Marker(庄盟生物科技有限公司)；Aa-H6H、Hn-H6H分别代表其纯化得到的可溶蛋白。

图6、LC/MS分析Aa-4CL、EcCS催化假托品醇(假莨菪醇)和四香豆酸的反应，产物为四香豆酰假托品醇。

图7、LC/MS分析Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和四香豆酸的反应，产物为四香豆酰假托品醇的羟基化产物。

图8、LC/MS分析Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和阿魏酸的反应，产物为阿魏酰假托品醇的羟基化产物。

图9、LC/MS分析Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和苯丙酸的反应，产物为苯丙酰假托品醇的环氧化产物。

图10、四香豆酰假托品醇的核磁氢谱图。

具体实施方式

本发明人致力于托品骨架化合物的生物合成方面的研究，通过挖掘植物基因组信息，提供了一系列分离的酶，包括4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶。进一步地，本发明人通过联合运用所述的酶，合成了山莨菪醇类似物或东莨菪醇类似物，以及它们的合成途径的中间体化合物。

术语

如本文所用，所述的“托品骨架(类)化合物”包括山莨菪醇(类)化合物或东莨菪醇(类)化合物。所述的“托品骨架(类)化合物”也可以是在本发明披露的化合物基础上的变化形式，例如，化合物的母核结构保持不变，但在个别(如1-3个，1-2个)位置上发生基团(如含有1-8个碳原子(较佳地1-4个或1-2个碳原子)的脂族烃类基团)的取代。所述的“托品骨架(类)化合物”包括托品骨架衍生的新的非天然化合物。

如本文所用，所述的“莨菪醇(类)化合物”与“莨菪醇衍生物”或“莨菪醇类似物”可互换使用。

如本文所用，所述的“山莨菪醇(类)化合物”与“山莨菪醇衍生物”或“山莨菪醇类似物”可互换使用。

如本文所用，所述的“东莨菪醇(类)化合物”与“东莨菪醇衍生物”或“东莨菪醇类似物”可互换使用。

如本文所用，“分离的酶”、“活性酶”、“分离的多肽”或“活性多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

如本文所用，“活性酶”虽可被分离，但其也可被保留于混合体系中，例如其被分泌表达后的表达上清体系、或其胞内表达后的细胞裂解液体系中，在混合体系中发挥其催化活性。

如本文所用，所述的“构建物”、“构建体”、“表达构建物”或“表达构建体”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，术语“保守性变异多肽”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述的“保守性变异多肽”可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

酶、其编码基因、载体及宿主

本发明中，通过挖掘植物基因组以及转录组信息，结合大量的研究和实验工作，提供了能够合成托品骨架衍生新非天然化合物的酶，基于这些酶，本发明人获得了一系列新型的托品骨架化合物，包括非天然的化合物。

在本发明的优选方式中，所述的4-香豆酸辅酶A连接酶挖掘选自药用植物三分三(Anisodus acutangulus)，酰基转移酶选自古柯(Erythroxylum coca)，莨菪-6-β-羟化酶选自天仙子(Hyoscyamus niger L.)。

在本发明的优选方式中，所述的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶分别为氨基酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6所示的多肽，也包括其保守性变异多肽。

本发明人对所述酶进行异源表达发现，本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)可以高效地催化苯丙烷酸形成苯丙烷辅酶A酯；本发明的酰基转移酶(EcCS)可以高效地催化苯丙烷辅酶A酯与托品醇/假托品醇形成莨菪醇类化合物；本发明的莨菪-6-β-羟化酶(H6H)可以高效的催化莨菪醇类似物形成山莨菪醇类似物、进一步形成东莨菪醇类似物。

本发明也包括所述4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶或莨菪-6-β-羟化酶的保守性变异多肽。所述的“保守性变异多肽”可以包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较20个或10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶或莨菪-6-β-羟化酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。例如，所述的标签可以是但不限于：FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。

当出于生产本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶的目的时，为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在本发明的多肽的氨基端添加上信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

编码本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶或莨菪-6-β-羟化酶的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：(1).用编码所述多肽(含其保守性变异多肽)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码所述多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，当进行原核表达时，所述表达载体可以是原核表达载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶或莨菪-6-β-羟化酶的多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，枯草杆菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母，植物细胞，灵芝细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，较佳地为大肠杆菌，酵母，链霉菌；更佳地为大肠杆菌细胞。细胞宿主是一种生产工具，本领域技术人员可以通过一些技术手段对大肠杆菌以外的其他宿主细胞进行改造，从而也实现如本发明的生物合成，由此构成的宿主细胞以及生产方法也应包含在本发明中。

本发明也提供了用于生物合成托品骨架化合物或其中间体的宿主细胞(遗传工程化的细胞)，其中包括：编码本发明的4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶或莨菪-6-β-羟化酶的多核苷酸。在其它实施方式中，所述的宿主细胞中还可含有(转化有)有利于形成前体化合物的多肽(酶)，有利于形成辅酶A的多肽等，有利于形成酰基供体/酰基受体的多肽(酶)，例如通过对代谢流的影响而使得所需化合物得以加强。所述的宿主细胞中还可含有(转化有)有利于参与本发明的图1A或图1B所涉及的合成途径的化合物的形成的其它的多肽(酶)。

应用及生产工艺

莨菪碱具有良好的应用价值，东莨菪碱则比莨菪碱具有更高的应用价值，但东莨菪碱类似物的生物合成未见报道。

本发明中，首次基于生物酶法利用组合使用来源于植物4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶(可卡因合酶)、莨菪-6-β-羟化酶实现了东莨菪碱类似物的合成。

本发明的莨菪碱6β-羟基化酶(H6H)同时具有羟基化和环氧化的作用，将莨菪碱羟基化形成山莨菪碱，而后将山莨菪碱的C-6，C-7环氧化形成东莨菪碱。

莨菪-6-β-羟化酶H₆H的参与实现了山莨菪碱、东莨菪碱的类似物的生成。本发明中，H₆H第一次被用来生产山莨菪碱、东莨菪碱的类似物。4-香豆酸辅酶A连接酶、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶这三类酶的组合使用增加了托品骨架类似物的丰富度。这些丰富多样的托品骨架衍生新非天然化合物填补了当前莨菪碱药物分子结构的局限性，为进一步的药物分子活性筛选及先导化合物开放提供分子化合物产品基础，同时也可利用合成生物学大规模生产这类化合物提供基因元件的服务。

本发明的优选技术方案中，可以通过耦联组合使用来源于植物的4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、酰基转移酶(EcCS)、莨菪-6-β-羟化酶(H₆H)，利用托品醇(莨菪醇)或假托品醇分别和8种苯丙烷酸为底物，获得多种多样的托品骨架化合物(图1A-B)。较佳地，可以获得16种莨菪碱、16种山莨菪碱、16种东莨菪碱的类似物，共计48种化合物。例如表1中所列举的24种化合物(假托品醇作为中间体参与反应形成)，另24种化合物则分别为这一化合物的另一异构形式(托品醇作为中间体参与反应形成，较佳地为相应于表1中第一行化合物结构式中箭头所示位点的异构)。“Δ2”表示碳碳双键。

表1

本发明的酶催化的生物合成方法可以为胞内(体内)的反应体系或体外的反应体系。

作为一种实施方式，可以在体外的反应体系中进行所述的托品骨架化合物的生物合成；较佳地，分两步反应：(a)以4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶联合，催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成莨菪碱类似物；较佳地，催化反应的体系中，还包括辅酶A(CoA)，MgCl₂，ATP；(b)以莨菪-6-β-羟化酶催化莨菪碱类似物形成山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。较佳地，催化反应的体系中，还包括α-酮戊二酸、抗坏血酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢酶。

作为另一种实施方式，本发明也提供了生物合成托品骨架化合物的方法，包括：将合成4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶的编码基因共转入宿主细胞中；以及，培养所述的宿主细胞，从而生物合成托品骨架化合物。相对于传统的植物提取手段，微生物发酵具有速度快、受外界因素影响较小等优势。

本发明也提供了用于生物合成托品骨架化合物或其中间体的反应体系或试剂盒，其中包括：酶组合(组合的酶)，所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶，其用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。或者，其中包括：构建体，所述构建体中引入了编码所述酶组合的多核苷酸。或者，其中包括：遗传工程化的细胞，其中引入了编码(i)所述酶组合的多核苷酸，或(ii)的构建体。更佳地，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供所述的托品骨架衍生新非天然化合物的生产方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离纯化出所述的4-香豆酸辅酶A连接酶，酰基转移酶，莨菪-6-β-羟化酶；(c)耦联组合使用上述来源于植物三分三的4-香豆酸辅酶A连接酶、古柯的酰基转移酶、天仙子的莨菪-6-β-羟化酶，催化假托品醇和3种苯丙烷酸底物生成莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱的类似物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

序列信息

>Aa-4CL(SEQ ID NO:1)

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccatggtgccgatggagacctcaacaaagcaatcaggagatataattttccgatcaaaactccctgatatttacatccctaaacatctaccattacattcttattgcttcgaaaacatttcggagttcagttcccgcccttgtttgattgatggtgctaatgatcaaatatacacttatgctgaagttgaactcacttcgagaaaagttgctgctggtcttaacaaattggggatccaacagaaggacacaatcatgatcctcttgcctaattcccctgaatttgtgttcgcttttatgggcgcatcgtatctcggagccatttccaccatggccaatcctatgtttacatcagcagaggttgtaaagcaagccaaagcctcaagcgcgaagattattataacgctagcttgctatgtgggcaaagtgaaggactatgcaatcgaaaatgaagtcaaggtaatttgcattgattctgcaccagaaggttgtctccatttctccgaattgactcaatcggatgaacacgaccttcctgaggtgaaattccagccggacgacgttgtagcgctgccgtattcctcggggactacgggaatgcccaaaggggtgatgttgacacacaagggattagtcacgagtgttgcgcaacaagttgatggcgaaaatgccaacttgtatatgcacagcgaggatgtgttgatgtgtgtgttacctttattccatatttactctctcaactctattttgctctgtggattgagagtcggagcagcgattttgattatgcaaaaattcgacattgtttcgtttttggagttgatacagaagtataaggtgtcaattgggccatttgttcctcctattgttctggcccttgctaagagtccgttggttgataattatgatctttcatcagtaaggacagtcatgtctggtggtgcaccattaggaaaggaacttgaagacgctgtgcgaacaaaattccctaacactaaacttggtcagggttatggaatgacggaagccgggccggtgctggcaatgtgtttggcatttgcaaaagaaccttttgaaataaaatcaggcgcatgtggtaccgtcgtgagaaatgcagagatgaaaattgtggatccggatacaggtttctctctgccccggaaccaacccggtgagatttgcattagaggtgaccagatcatgaaaggttacttgaatgatcctgaagcaacgacgagaacaatagacaaagaaggatggttacacaccggtgacattgggttcatcgacgatgatgacgagcttttcattgtggaccgactgaaagaattgatcaaatacaaaggatttcaagtggcacctgccgagcttgaagctcttcttgtcaaccatcccaacatttctgatgctgctgttgtcccaatgaaagatgagcaagcgggagaagttccagtggcttttattgttaggtcaaatggatccacaattactgaagatgaagtcaaggatttcgtctcgaagcaggtgatattttataagagaataaagcgcgtatttttcgtggagactgtaccgaaagctccgtcaggaaaaattcttagaaaggatttgagagctagattggctgctggtattccaaat

>Aa-4CL(SEQ ID NO:2)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMVPMETSTKQSGDIIFRSKLPDIYIPKHLPLHSYCFENISEFSSRPCLIDGANDQIYTYAEVELTSRKVAAGLNKLGIQQKDTIMILLPNSPEFVFAFMGASYLGAISTMANPMFTSAEVVKQAKASSAKIIITLACYVGKVKDYAIENEVKVICIDSAPEGCLHFSELTQSDEHDLPEVKFQPDDVVALPYSSGTTGMPKGVMLTHKGLVTSVAQQVDGENANLYMHSEDVLMCVLPLFHIYSLNSILLCGLRVGAAILIMQKFDIVSFLELIQKYKVSIGPFVPPIVLALAKSPLVDNYDLSSVRTVMSGGAPLGKELEDAVRTKFPNTKLGQGYGMTEAGPVLAMCLAFAKEPFEIKSGACGTVVRNAEMKIVDPDTGFSLPRNQPGEICIRGDQIMKGYLNDPEATTRTIDKEGWLHTGDIGFIDDDDELFIVDRLKELIKYKGFQVAPAELEALLVNHPNISDAAVVPMKDEQAGEVPVAFIVRSNGSTITEDEVKDFVSKQVIFYKRIKRVFFVETVPKAPSGKILRKDLRARLAAGIPN

>EcCs(SEQ ID NO:3)

atggagatgagcaagaaaaagctggaaatcattctgcgtaaaaccatcaaaccgagcagcagcaccccgcagcacctgcaaaccttcgagctgagcttttgggatgaaccgctgccgccggactacggtaccatcattttcttttatcagaccaacggcagcaaaaacgacgatgacgaggcgctgagcatcttctttcagcgtagcagcagcctgcaaaacagcctgagcaaaaccctgattcactactatccgctggcgggtcgtctgaaggatgacggcaccgcggtggattgcaacgacgagggtgcgtacttcgttgaagcgcgtatcgattgccaactgagcaccctgctgaaccacccggatgcggacttcctgagccactatttttgcccggcgctggacagcaacaacctgccgagcggctgcatgctggcgatccagctgaccctgtttaactgcggtggcatcgcgattagcgtgagcccgagccacaaaattgcggatgcgagcagcgcgtgcaccttcgtgcaaagctgggcgagcatgaccaccatcggtgaggttgcgccgaagccgatttttctggagccgagcagcagcccgccgcgtagcctgcgtaacgcgccgatgctgaccgagatcccgggtgaattcgtgaaacgtcgtttcgtttttccggcgagcaaaattgcgcagctgcgtaccaagaccaccggtccgagcagcccgaccggcaagcaacacatgagcgatgcggacctggttatggcgctgttcatgaaatgcgcgatcctggcgagccgtagcctgagcaagagcagcagcggtccgtacgtgctgtttcaggtggttgacctgcgtaaacgtgttcgtccgccgctgccggcgaacaccattggtaacgtggttctgtactataccacccagatcgaggaaaaccaaattgagctgaacgaactggcgggcaaattccgtaagagcctgaacgagttttgcaacctggcggcgaacagcagcctgaacgaggaaccggaattcatcattcagggtagcccgtactgctgcaccaacctgtgcggcttcccgttttatgagatcgatttcggttggggcaaaccgagctgggtgaccaccgaactgctgtggtttcgtaacatcattgttctgcagaaaaccaaggatggtgacggcattgagctgtgggttagcatggacgagaaggaaatggcgctgtttgaacaagatcacgacatcattgcgtacgcgagcaacaacccgagcgttctggcggcgtatagccgtatgtaa

>EcCs(SEQ ID NO:4)

MEMSKKKLEIILRKTIKPSSSTPQHLQTFELSFWDEPLPPDYGTIIFFYQTNGSKNDDDEALSIFFQRSSSLQNSLSKTLIHYYPLAGRLKDDGTAVDCNDEGAYFVEARIDCQLSTLLNHPDADFLSHYFCPALDSNNLPSGCMLAIQLTLFNCGGIAISVSPSHKIADASSACTFVQSWASMTTIGEVAPKPIFLEPSSSPPRSLRNAPMLTEIPGEFVKRRFVFPASKIAQLRTKTTGPSSPTGKQHMSDADLVMALFMKCAILASRSLSKSSSGPYVLFQVVDLRKRVRPPLPANTIGNVVLYYTTQIEENQIELNELAGKFRKSLNEFCNLAANSSLNEEPEFIIQGSPYCCTNLCGFPFYEIDFGWGKPSWVTTELLWFRNIIVLQKTKDGDGIELWVSMDEKEMALFEQDHDIIAYASNNPSVLAAYSRM

>Hn-H₆H(SEQ ID NO:5)

atggctactttcgtctccaattggtccaccaagtccgtttccgaatccttcatcgctccattgcagaagagagccgaaaaggacgttccagttggtaacgacgtcccaatcatcgacttgcaacaacaccaccacttgttggtccagcaaatcaccaaggcttgccaagacttcggtttgttccaggtcatcaaccacggtttcccagaagagttgatgttggagaccatggaggtttgcaaggagttcttcgctttgccagcagaagagaaggagaagttcaagccaaaaggcgaagccgctaagttcgagttgccattggagcagaaggctaagttgtacgtcgaaggcgaacagttgtccaacgaggagttcttgtattggaaggacaccttggctcacggttgtcatccattggatcaggacttggtgaactcttggccagaaaagccagccaagtacagagaagtcgttgctaaatattctgtcgaagtcaggaagttgaccatgaggatgttggactacatttgcgagggcttgggtttgaagcttggctacttcgacaacgagttgtcccagatccagatgatgttgaccaactactacccaccttgtccagatccatcttccactttgggttcaggaggtcattacgacggtaacttgatcaccttgttgcagcaggacttgccaggtttgcaacagttgatcgtcaaggacgctacttggattgccgttcaaccaatcccaaccgctttcgttgtcaacttgggtttgaccttgaaggtcatcaccaacgagaagttcgagggttccatccatagagtcgttaccgatccaaccagagacagagtttccatcgctaccttgatcggtccagactactcttgtaccatcgagccagctaaggagttgttgaaccaggacaacccaccattgtacaagccatactcctactccgagttcgcagacatctacttgtccgacaagtccgattacgattccggcgttaagccatacaagattaacgttggcggtaaaggtccaggcgatggtccaggaggttcaggaggtccaagaggcggcgaaaatttgtacttccaatccggtcaccaccatcatcatcatcatcacggaggtagaggaggagcagcagcttaa

>Hn-H₆H(SEQ ID NO:6)

MATFVSNWSTKSVSESFIAPLQKRAEKDVPVGNDVPIIDLQQHHHLLVQQITKACQDFGLFQVINHGFPEELMLETMEVCKEFFALPAEEKEKFKPKGEAAKFELPLEQKAKLYVEGEQLSNEEFLYWKDTLAHGCHPLDQDLVNSWPEKPAKYREVVAKYSVEVRKLTMRMLDYICEGLGLKLGYFDNELSQIQMMLTNYYPPCPDPSSTLGSGGHYDGNLITLLQQDLPGLQQLIVKDATWIAVQPIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSIHRVVTDPTRDRVSIATLIGPDYSCTIEPAKELLNQDNPPLYKPYSYSEFADIYLSDKSDYDSGVKPYKINVGGKGPGDGPGGSGGPRGGENLYFQSGHHHHHHHHGGRGGAAA

实施例1、酶的制备

1、4-香豆酸辅酶A的克隆

(1)总RNA的提取与检测

剪下三分三毛状根100mg，液氮中将组织研磨成粉末，分装至Ep管中，液氮挥发后加1ml Trizol-x-100，立即用力震荡5-8次(没有块状物为止)，室温静置5min；用等体积氯仿抽提2次，7500g离心15min；上清液加入等体积提前预冷的异丙醇，混匀后室温放置30min，4℃10000g离心10min；沉淀加入1ml 75％乙醇进行清洗，4℃10000g离心10min；沉淀室温干燥10min后溶于25μl DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

(2)反转录合成cDNA

采用TakaRa公司提供的PrimeScript反转录试剂盒，合成三分三mRNA第一条互补链。

(3)4-香豆酸辅酶A连接酶的克隆

经过大量的研究、分析和实验，本发明人从诸多候选基因中筛选确定4-香豆酸辅酶A连接酶的候选基因。

利用Vector NTI软件设计1对扩增引物如表2。以三分三的cDNA为模板，按照以下体系[

FastPfu Fly bμffer 10μl，dNTP(2.5mM)4μl，引物(10μM)各2μl，cDNA1μl，

FastPfu Fly DNA聚合酶1μl，补加ddH₂O至终体积50μl扩增基因，反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，40个循环，72℃终延伸5min，16℃保存。扩增结果与1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增得到的Aa-4CL片段，如图2。

利用Axygen公司的Agarose Gel Fragment Recovery Kit Ver.2.0纯化PCR产物。

表2、扩增所需引物

5、表达载体的转化

取1μl测序正确的表达载体和康为公司的BL21(DE3)感受态细胞在冰上孵育30分钟。42℃热激1min 30s，冰上放置2min，加入800μl的LB培养基，放置在37℃摇床复苏1小时。将菌体全部涂板在卡那抗性的LB平板上，放置在37℃培养箱过夜培养。

6、蛋白纯化

从卡那平板上挑取单菌落至LB(Kan)试管培养过夜，并按1％的比例加入到LB(Kan)摇瓶中(培养37℃，2-3h)至OD＝1.0，加入0.4mM的IPTG，16℃诱导过夜。在4℃，3800rpm，离心10min收集菌体。用蛋白纯化buffer(20m M Tris-HCl、500mM NaCl定容后用浓HCl调至PH＝8.0)悬浮菌体得到20％浓度的菌液。用压榨仪器破碎菌体，在4℃，18000g下离心1小时并收集上清。镍柱的填料取2ml，将离心好的溶液上清加入洗好的填料中，过3遍柱子，依次用蛋白纯化buffer，20mM，50mM洗至无杂蛋白，最后用100mM，250mM咪唑收集蛋白质，蛋白纯化的胶图见图3，图4，图5。

酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶的制备是类似的。

实施例2、联用4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶产莨菪碱类似物

1、生成莨菪碱的结构类似物

取100mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM的四香豆酸/阿魏酸/苯丙酸，2mM的CoA(CoA-SH)，2mM的MgCl₂，2mM的ATP，2mM的假托品醇/托品醇，20uM的Aa-4CL，20uM的EcCS，反应在30℃进行1小时。

上述Aa-4CL和EcCS的反应液生成莨菪碱的结构类似物，后续作为H6H的底物。如表3。

表3

根据图6，LC/MS分析显示，Aa-4CL、EcCS催化假托品醇和四香豆酸的反应，产物为四香豆酰假托品醇。

2、生成山莨菪碱的结构类似物

在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)中配制酶的反应体系，10mMα-酮戊二酸(α-KG)，4mM抗坏血酸钠，0.4mM的硫酸亚铁，2mg/mL的过氧化氢酶，取10μL的反应液作为底物(上述Aa-4CL和EcCS的反应液生成的莨菪碱的结构类似物)，66μM的Aa-H6H/Hn-H6H，反应总体积200μL，30℃反应5小时。

根据图7，LC/MS分析显示，Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和四香豆酸的反应，产物为四香豆酰假托品醇的羟基化产物(表4)。

表4

根据图8，LC/MS分析显示，Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和阿魏酸的反应，产物为阿魏酰假托品醇的羟基化产物(表5)。

表5

根据图9，LC/MS分析显示，Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化假托品醇和苯丙酸的反应，产物为苯丙酰假托品醇的环氧化产物(表6)。

本发明的结果表明，H6H对于不同的底物催化效率不同，可以生成醇的羟基化产物和醇的环氧化产物。

表6

以其它的底物酸与假托品醇反应，以Aa-4CL、EcCS、Aa-H6H/Hn-H6H催化，同样地，也能形成莨菪碱类似物、山莨菪碱类似物、东莨菪碱类似物(表7)。

表7

实施例3、莨菪碱类似物的分子质量鉴定

取上述反应5小时后的产物用等体积的甲醇沉淀蛋白，12000g离心5min，上清过0.22μm滤膜后利用高分辨质谱进行检测，用于分离的色谱柱为Agilent 300C18(4.6×150mm，3.5μm)，温度设定为35℃。流动相A(H₂O+0.1％甲酸)和B(乙腈)在以下梯度程序中以0.8mL/min的速度运行：0-5分钟，5％B；5-20分钟，95％B；20-25分钟，95％B。

四香豆酰假托品醇的核磁氢谱图如图10。

经过查询SciFinder，图6-10中的产物都为新化合物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 基于生物酶法合成托品骨架化合物的方法及应用

<130> 212377

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> 三分三(Anisodus acutangulus)

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatggtgcc gatggagacc 120

tcaacaaagc aatcaggaga tataattttc cgatcaaaac tccctgatat ttacatccct 180

aaacatctac cattacattc ttattgcttc gaaaacattt cggagttcag ttcccgccct 240

tgtttgattg atggtgctaa tgatcaaata tacacttatg ctgaagttga actcacttcg 300

agaaaagttg ctgctggtct taacaaattg gggatccaac agaaggacac aatcatgatc 360

ctcttgccta attcccctga atttgtgttc gcttttatgg gcgcatcgta tctcggagcc 420

atttccacca tggccaatcc tatgtttaca tcagcagagg ttgtaaagca agccaaagcc 480

tcaagcgcga agattattat aacgctagct tgctatgtgg gcaaagtgaa ggactatgca 540

atcgaaaatg aagtcaaggt aatttgcatt gattctgcac cagaaggttg tctccatttc 600

tccgaattga ctcaatcgga tgaacacgac cttcctgagg tgaaattcca gccggacgac 660

gttgtagcgc tgccgtattc ctcggggact acgggaatgc ccaaaggggt gatgttgaca 720

cacaagggat tagtcacgag tgttgcgcaa caagttgatg gcgaaaatgc caacttgtat 780

atgcacagcg aggatgtgtt gatgtgtgtg ttacctttat tccatattta ctctctcaac 840

tctattttgc tctgtggatt gagagtcgga gcagcgattt tgattatgca aaaattcgac 900

attgtttcgt ttttggagtt gatacagaag tataaggtgt caattgggcc atttgttcct 960

cctattgttc tggcccttgc taagagtccg ttggttgata attatgatct ttcatcagta 1020

aggacagtca tgtctggtgg tgcaccatta ggaaaggaac ttgaagacgc tgtgcgaaca 1080

aaattcccta acactaaact tggtcagggt tatggaatga cggaagccgg gccggtgctg 1140

gcaatgtgtt tggcatttgc aaaagaacct tttgaaataa aatcaggcgc atgtggtacc 1200

gtcgtgagaa atgcagagat gaaaattgtg gatccggata caggtttctc tctgccccgg 1260

aaccaacccg gtgagatttg cattagaggt gaccagatca tgaaaggtta cttgaatgat 1320

cctgaagcaa cgacgagaac aatagacaaa gaaggatggt tacacaccgg tgacattggg 1380

ttcatcgacg atgatgacga gcttttcatt gtggaccgac tgaaagaatt gatcaaatac 1440

aaaggatttc aagtggcacc tgccgagctt gaagctcttc ttgtcaacca tcccaacatt 1500

tctgatgctg ctgttgtccc aatgaaagat gagcaagcgg gagaagttcc agtggctttt 1560

attgttaggt caaatggatc cacaattact gaagatgaag tcaaggattt cgtctcgaag 1620

caggtgatat tttataagag aataaagcgc gtatttttcg tggagactgt accgaaagct 1680

ccgtcaggaa aaattcttag aaaggatttg agagctagat tggctgctgg tattccaaat 1740

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> 三分三(Anisodus acutangulus)

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Met Val Pro Met Glu Thr Ser Thr Lys Gln Ser Gly Asp Ile

35 40 45

Ile Phe Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile Tyr Ile Pro Lys His Leu Pro

50 55 60

Leu His Ser Tyr Cys Phe Glu Asn Ile Ser Glu Phe Ser Ser Arg Pro

65 70 75 80

Cys Leu Ile Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ile Tyr Thr Tyr Ala Glu Val

85 90 95

Glu Leu Thr Ser Arg Lys Val Ala Ala Gly Leu Asn Lys Leu Gly Ile

100 105 110

Gln Gln Lys Asp Thr Ile Met Ile Leu Leu Pro Asn Ser Pro Glu Phe

115 120 125

Val Phe Ala Phe Met Gly Ala Ser Tyr Leu Gly Ala Ile Ser Thr Met

130 135 140

Ala Asn Pro Met Phe Thr Ser Ala Glu Val Val Lys Gln Ala Lys Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ala Lys Ile Ile Ile Thr Leu Ala Cys Tyr Val Gly Lys Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Ile Glu Asn Glu Val Lys Val Ile Cys Ile Asp Ser

180 185 190

Ala Pro Glu Gly Cys Leu His Phe Ser Glu Leu Thr Gln Ser Asp Glu

195 200 205

His Asp Leu Pro Glu Val Lys Phe Gln Pro Asp Asp Val Val Ala Leu

210 215 220

Pro Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Met Pro Lys Gly Val Met Leu Thr

225 230 235 240

His Lys Gly Leu Val Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu Asn

245 250 255

Ala Asn Leu Tyr Met His Ser Glu Asp Val Leu Met Cys Val Leu Pro

260 265 270

Leu Phe His Ile Tyr Ser Leu Asn Ser Ile Leu Leu Cys Gly Leu Arg

275 280 285

Val Gly Ala Ala Ile Leu Ile Met Gln Lys Phe Asp Ile Val Ser Phe

290 295 300

Leu Glu Leu Ile Gln Lys Tyr Lys Val Ser Ile Gly Pro Phe Val Pro

305 310 315 320

Pro Ile Val Leu Ala Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Asn Tyr Asp

325 330 335

Leu Ser Ser Val Arg Thr Val Met Ser Gly Gly Ala Pro Leu Gly Lys

340 345 350

Glu Leu Glu Asp Ala Val Arg Thr Lys Phe Pro Asn Thr Lys Leu Gly

355 360 365

Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala Met Cys Leu

370 375 380

Ala Phe Ala Lys Glu Pro Phe Glu Ile Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr

385 390 395 400

Val Val Arg Asn Ala Glu Met Lys Ile Val Asp Pro Asp Thr Gly Phe

405 410 415

Ser Leu Pro Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Asp Gln

420 425 430

Ile Met Lys Gly Tyr Leu Asn Asp Pro Glu Ala Thr Thr Arg Thr Ile

435 440 445

Asp Lys Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Phe Ile Asp Asp

450 455 460

Asp Asp Glu Leu Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr

465 470 475 480

Lys Gly Phe Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Val Asn

485 490 495

His Pro Asn Ile Ser Asp Ala Ala Val Val Pro Met Lys Asp Glu Gln

500 505 510

Ala Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Ile Val Arg Ser Asn Gly Ser Thr

515 520 525

Ile Thr Glu Asp Glu Val Lys Asp Phe Val Ser Lys Gln Val Ile Phe

530 535 540

Tyr Lys Arg Ile Lys Arg Val Phe Phe Val Glu Thr Val Pro Lys Ala

545 550 555 560

Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Arg Leu Ala Ala

565 570 575

Gly Ile Pro Asn

580

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> 古柯(Erythroxylum coca)

<400> 3

atggagatga gcaagaaaaa gctggaaatc attctgcgta aaaccatcaa accgagcagc 60

agcaccccgc agcacctgca aaccttcgag ctgagctttt gggatgaacc gctgccgccg 120

gactacggta ccatcatttt cttttatcag accaacggca gcaaaaacga cgatgacgag 180

gcgctgagca tcttctttca gcgtagcagc agcctgcaaa acagcctgag caaaaccctg 240

attcactact atccgctggc gggtcgtctg aaggatgacg gcaccgcggt ggattgcaac 300

gacgagggtg cgtacttcgt tgaagcgcgt atcgattgcc aactgagcac cctgctgaac 360

cacccggatg cggacttcct gagccactat ttttgcccgg cgctggacag caacaacctg 420

ccgagcggct gcatgctggc gatccagctg accctgttta actgcggtgg catcgcgatt 480

agcgtgagcc cgagccacaa aattgcggat gcgagcagcg cgtgcacctt cgtgcaaagc 540

tgggcgagca tgaccaccat cggtgaggtt gcgccgaagc cgatttttct ggagccgagc 600

agcagcccgc cgcgtagcct gcgtaacgcg ccgatgctga ccgagatccc gggtgaattc 660

gtgaaacgtc gtttcgtttt tccggcgagc aaaattgcgc agctgcgtac caagaccacc 720

ggtccgagca gcccgaccgg caagcaacac atgagcgatg cggacctggt tatggcgctg 780

ttcatgaaat gcgcgatcct ggcgagccgt agcctgagca agagcagcag cggtccgtac 840

gtgctgtttc aggtggttga cctgcgtaaa cgtgttcgtc cgccgctgcc ggcgaacacc 900

attggtaacg tggttctgta ctataccacc cagatcgagg aaaaccaaat tgagctgaac 960

gaactggcgg gcaaattccg taagagcctg aacgagtttt gcaacctggc ggcgaacagc 1020

agcctgaacg aggaaccgga attcatcatt cagggtagcc cgtactgctg caccaacctg 1080

tgcggcttcc cgttttatga gatcgatttc ggttggggca aaccgagctg ggtgaccacc 1140

gaactgctgt ggtttcgtaa catcattgtt ctgcagaaaa ccaaggatgg tgacggcatt 1200

gagctgtggg ttagcatgga cgagaaggaa atggcgctgt ttgaacaaga tcacgacatc 1260

attgcgtacg cgagcaacaa cccgagcgtt ctggcggcgt atagccgtat gtaa 1314

<210> 4

<211> 437

<212> PRT

<213> 古柯(Erythroxylum coca)

<400> 4

Met Glu Met Ser Lys Lys Lys Leu Glu Ile Ile Leu Arg Lys Thr Ile

1 5 10 15

Lys Pro Ser Ser Ser Thr Pro Gln His Leu Gln Thr Phe Glu Leu Ser

20 25 30

Phe Trp Asp Glu Pro Leu Pro Pro Asp Tyr Gly Thr Ile Ile Phe Phe

35 40 45

Tyr Gln Thr Asn Gly Ser Lys Asn Asp Asp Asp Glu Ala Leu Ser Ile

50 55 60

Phe Phe Gln Arg Ser Ser Ser Leu Gln Asn Ser Leu Ser Lys Thr Leu

65 70 75 80

Ile His Tyr Tyr Pro Leu Ala Gly Arg Leu Lys Asp Asp Gly Thr Ala

85 90 95

Val Asp Cys Asn Asp Glu Gly Ala Tyr Phe Val Glu Ala Arg Ile Asp

100 105 110

Cys Gln Leu Ser Thr Leu Leu Asn His Pro Asp Ala Asp Phe Leu Ser

115 120 125

His Tyr Phe Cys Pro Ala Leu Asp Ser Asn Asn Leu Pro Ser Gly Cys

130 135 140

Met Leu Ala Ile Gln Leu Thr Leu Phe Asn Cys Gly Gly Ile Ala Ile

145 150 155 160

Ser Val Ser Pro Ser His Lys Ile Ala Asp Ala Ser Ser Ala Cys Thr

165 170 175

Phe Val Gln Ser Trp Ala Ser Met Thr Thr Ile Gly Glu Val Ala Pro

180 185 190

Lys Pro Ile Phe Leu Glu Pro Ser Ser Ser Pro Pro Arg Ser Leu Arg

195 200 205

Asn Ala Pro Met Leu Thr Glu Ile Pro Gly Glu Phe Val Lys Arg Arg

210 215 220

Phe Val Phe Pro Ala Ser Lys Ile Ala Gln Leu Arg Thr Lys Thr Thr

225 230 235 240

Gly Pro Ser Ser Pro Thr Gly Lys Gln His Met Ser Asp Ala Asp Leu

245 250 255

Val Met Ala Leu Phe Met Lys Cys Ala Ile Leu Ala Ser Arg Ser Leu

260 265 270

Ser Lys Ser Ser Ser Gly Pro Tyr Val Leu Phe Gln Val Val Asp Leu

275 280 285

Arg Lys Arg Val Arg Pro Pro Leu Pro Ala Asn Thr Ile Gly Asn Val

290 295 300

Val Leu Tyr Tyr Thr Thr Gln Ile Glu Glu Asn Gln Ile Glu Leu Asn

305 310 315 320

Glu Leu Ala Gly Lys Phe Arg Lys Ser Leu Asn Glu Phe Cys Asn Leu

325 330 335

Ala Ala Asn Ser Ser Leu Asn Glu Glu Pro Glu Phe Ile Ile Gln Gly

340 345 350

Ser Pro Tyr Cys Cys Thr Asn Leu Cys Gly Phe Pro Phe Tyr Glu Ile

355 360 365

Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Ser Trp Val Thr Thr Glu Leu Leu Trp

370 375 380

Phe Arg Asn Ile Ile Val Leu Gln Lys Thr Lys Asp Gly Asp Gly Ile

385 390 395 400

Glu Leu Trp Val Ser Met Asp Glu Lys Glu Met Ala Leu Phe Glu Gln

405 410 415

Asp His Asp Ile Ile Ala Tyr Ala Ser Asn Asn Pro Ser Val Leu Ala

420 425 430

Ala Tyr Ser Arg Met

435

<210> 5

<211> 1161

<212> DNA

<213> 三分三(Anisodus acutangulus)

<400> 5

atggctactt tcgtctccaa ttggtccacc aagtccgttt ccgaatcctt catcgctcca 60

ttgcagaaga gagccgaaaa ggacgttcca gttggtaacg acgtcccaat catcgacttg 120

caacaacacc accacttgtt ggtccagcaa atcaccaagg cttgccaaga cttcggtttg 180

ttccaggtca tcaaccacgg tttcccagaa gagttgatgt tggagaccat ggaggtttgc 240

aaggagttct tcgctttgcc agcagaagag aaggagaagt tcaagccaaa aggcgaagcc 300

gctaagttcg agttgccatt ggagcagaag gctaagttgt acgtcgaagg cgaacagttg 360

tccaacgagg agttcttgta ttggaaggac accttggctc acggttgtca tccattggat 420

caggacttgg tgaactcttg gccagaaaag ccagccaagt acagagaagt cgttgctaaa 480

tattctgtcg aagtcaggaa gttgaccatg aggatgttgg actacatttg cgagggcttg 540

ggtttgaagc ttggctactt cgacaacgag ttgtcccaga tccagatgat gttgaccaac 600

tactacccac cttgtccaga tccatcttcc actttgggtt caggaggtca ttacgacggt 660

aacttgatca ccttgttgca gcaggacttg ccaggtttgc aacagttgat cgtcaaggac 720

gctacttgga ttgccgttca accaatccca accgctttcg ttgtcaactt gggtttgacc 780

ttgaaggtca tcaccaacga gaagttcgag ggttccatcc atagagtcgt taccgatcca 840

accagagaca gagtttccat cgctaccttg atcggtccag actactcttg taccatcgag 900

ccagctaagg agttgttgaa ccaggacaac ccaccattgt acaagccata ctcctactcc 960

gagttcgcag acatctactt gtccgacaag tccgattacg attccggcgt taagccatac 1020

aagattaacg ttggcggtaa aggtccaggc gatggtccag gaggttcagg aggtccaaga 1080

ggcggcgaaa atttgtactt ccaatccggt caccaccatc atcatcatca tcacggaggt 1140

agaggaggag cagcagctta a 1161

<210> 6

<211> 386

<212> PRT

<213> 三分三(Anisodus acutangulus)

<400> 6

Met Ala Thr Phe Val Ser Asn Trp Ser Thr Lys Ser Val Ser Glu Ser

1 5 10 15

Phe Ile Ala Pro Leu Gln Lys Arg Ala Glu Lys Asp Val Pro Val Gly

20 25 30

Asn Asp Val Pro Ile Ile Asp Leu Gln Gln His His His Leu Leu Val

35 40 45

Gln Gln Ile Thr Lys Ala Cys Gln Asp Phe Gly Leu Phe Gln Val Ile

50 55 60

Asn His Gly Phe Pro Glu Glu Leu Met Leu Glu Thr Met Glu Val Cys

65 70 75 80

Lys Glu Phe Phe Ala Leu Pro Ala Glu Glu Lys Glu Lys Phe Lys Pro

85 90 95

Lys Gly Glu Ala Ala Lys Phe Glu Leu Pro Leu Glu Gln Lys Ala Lys

100 105 110

Leu Tyr Val Glu Gly Glu Gln Leu Ser Asn Glu Glu Phe Leu Tyr Trp

115 120 125

Lys Asp Thr Leu Ala His Gly Cys His Pro Leu Asp Gln Asp Leu Val

130 135 140

Asn Ser Trp Pro Glu Lys Pro Ala Lys Tyr Arg Glu Val Val Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Ser Val Glu Val Arg Lys Leu Thr Met Arg Met Leu Asp Tyr Ile

165 170 175

Cys Glu Gly Leu Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Gln Ile Gln Met Met Leu Thr Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Asp Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Leu Gly Ser Gly Gly His Tyr Asp Gly Asn Leu Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Gln Gln Asp Leu Pro Gly Leu Gln Gln Leu Ile Val Lys Asp

225 230 235 240

Ala Thr Trp Ile Ala Val Gln Pro Ile Pro Thr Ala Phe Val Val Asn

245 250 255

Leu Gly Leu Thr Leu Lys Val Ile Thr Asn Glu Lys Phe Glu Gly Ser

260 265 270

Ile His Arg Val Val Thr Asp Pro Thr Arg Asp Arg Val Ser Ile Ala

275 280 285

Thr Leu Ile Gly Pro Asp Tyr Ser Cys Thr Ile Glu Pro Ala Lys Glu

290 295 300

Leu Leu Asn Gln Asp Asn Pro Pro Leu Tyr Lys Pro Tyr Ser Tyr Ser

305 310 315 320

Glu Phe Ala Asp Ile Tyr Leu Ser Asp Lys Ser Asp Tyr Asp Ser Gly

325 330 335

Val Lys Pro Tyr Lys Ile Asn Val Gly Gly Lys Gly Pro Gly Asp Gly

340 345 350

Pro Gly Gly Ser Gly Gly Pro Arg Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

355 360 365

Ser Gly His His His His His His His His Gly Gly Arg Gly Gly Ala

370 375 380

Ala Ala

385

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(41)

<223> 引物

<400> 7

cagcaaatgg gtcgcggatc catggtgccg atggagacct c 41

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(44)

<223> 引物

<400> 8

ctcgagtgcg gccgcaagct tttaatttgg aataccagca gcca 44

Claims

1.一种制备托品骨架化合物的方法，包括：以4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶、莨菪-6-β-羟化酶联合，催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的苯丙烷酸包括具有式(I)结构的化合物；和/或，所述托品醇类酰基受体包括：假托品醇或托品醇，山莨菪；

其中，R1，R2，R3独立地选自：氢，羟基，-O-烷基，烷基，羰基、醛基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的山莨菪醇类化合物包括具有式(II)结构的化合物；和/或，所述的东莨菪醇类化合物包括具有式(III)结构的化合物；

4.如权利要求2-3任一所述的方法，其特征在于，所述的烷基为包括1～8个碳原子的烷基；较佳地，所述的式(I)结构的化合物包括选自如下结构的化合物或其异构体：

较佳地，所述的式(II)结构的化合物包括选自如下结构的化合物或其异构体：

较佳地，所述的式(III)结构的化合物包括选自如下结构的化合物或其异构体：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为胞内的反应体系或体外的反应体系；较佳地，在体外的反应体系中，分两步反应：

(a)以4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶联合，催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成莨菪碱类似物；较佳地，催化反应的体系中，还包括辅酶A，MgCl₂，ATP；

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4-香豆酸辅酶A来源于三分三(Anisodus acutangulus)；较佳地，所述4-香豆酸辅酶A是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的酶，或其保守性变异多肽；

所述的酰基转移酶来源于古柯(Erythroxylum coca)；较佳地，所述酰基转移酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的酶，或其保守性变异多肽；

所述的莨菪-6-β-羟化酶来源于天仙子(Hyoscyamus niger L.)或三分三(Anisodusacutangulus)；较佳地，所述莨菪-6-β-羟化酶是氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的酶，或其保守性变异多肽。

7.酶组合的用途，用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体，合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物；所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的苯丙烷酸包括具有式(I)结构的化合物；和/或，所述托品醇类酰基受体包括：假托品醇或托品醇，山莨菪；

9.构建体或含有所述构建体的遗传工程化的细胞，其中包括编码酶组合的多核苷酸；所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶，其用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成托品骨架化合物，所述托品骨架化合物包括山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物。

10.莨菪-6-β-羟化酶的应用，用于将山莨菪碱类化合物的C-6、C-7位环氧化，形成东莨菪碱类化合物。

11.一种制备东莨菪碱类化合物的方法，包括以莨菪-6-β-羟化酶催化山莨菪碱类化合物，从而在其C-6、C-7环氧化形成东莨菪碱类化合物。

12.一种用于制备托品骨架化合物的反应体系或试剂盒，其中包括：

(i)酶组合，所述酶组合包括：4-香豆酸辅酶A、酰基转移酶和莨菪-6-β-羟化酶，其用于催化苯丙烷酸与托品醇类酰基受体合成山莨菪醇类化合物或东莨菪醇类化合物；或

13.托品骨架类化合物，所述化合物为具有如下结构的化合物或其异构体：

较佳地，所述的异构体为A位置上的另一构型的异构体。