CN117448396A - 合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用 - Google Patents

合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用。所述方法包括：以功能新颖的异长春花苷内酰胺合成酶催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺。相比于化学催化的方法，本发明的技术方案中，合成异长春花苷内酰胺不需要经过异胡豆苷这一个催化中间体，仅利用本发明的异长春花苷内酰胺合成酶即可一步获得异长春花苷内酰胺，且反应过程对环境污染较小，产物易于纯化。本发明的技术方案可进一步应用于生产喜树碱等生物碱。

Description

合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用
技术领域
本发明属于活性化合物的合成领域，更具体地，本发明涉及合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用。
背景技术
异长春花苷内酰胺属于单萜吲哚类生物碱，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及镇咳平喘的活性。目前国内临床中药制剂包括胆木注射液、胆木浸膏糖浆和胆木浸膏胶囊等，对于急性扁桃腺炎、急性咽喉炎、急性结膜炎及上呼吸道感染等疾病治疗效果良好，异长春花苷内酰胺是这些药物的主要成分。因此，异长春花苷内酰胺的规模化制备是本领域所需。
异长春花苷内酰胺可提取自植物胆木(如其茎木、皮、叶)，但是提取量非常有限。目前，异长春花苷内酰胺的人工合成是通过化学的方法首先催化色胺衍生物与开环马钱子苷衍生物合成异胡豆苷衍生物，然后通过化学催化合成异胡豆苷，然后在以Na2CO3(如5％)处理的碱性条件下得到异长春花苷内酰胺。
目前，异长春花苷内酰胺的生物合成途径一直没有解析以及实验论证。本领域亟待明确其生物合成途径，以促进其规模化制备。
发明内容
本发明的目的在于提供合成异长春花苷内酰胺的新方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种合成异长春花苷内酰胺的方法，包括：以新型异长春花苷内酰胺合成酶催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺；其中，所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在一种或多种实施方式中，所述方法不存在合成“异胡豆苷”的中间过程。
在一种或多种实施方式中，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的保守性变异多肽包括：
(1)由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多肽；
(2)氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的多肽有80％(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)以上相同性，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多；或
(3)在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的、且保留其功能的多肽。
在一种或多种实施方式中，所述开环马钱子苷由马钱子苷转化而成；较佳地，以开环马钱子苷合酶(SLS)和细胞色素P450还原酶(ATR1)催化马钱子苷合成开环马钱子苷。
在一种或多种实施方式中，所述色胺由色氨酸转化而成；较佳地，以色氨酸脱羧酶(TDC)催化色氨酸合成色胺。
在一种或多种实施方式中，所述开环马钱子苷合酶(SLS)为SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在一种或多种实施方式中，所述细胞色素P450还原酶(ATR1)为SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在一种或多种实施方式中，所述色氨酸脱羧酶(TDC)为SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在一种或多种实施方式中，所述SEQ ID NO:8、10或12的保守性变异多肽包括：
(1)由SEQ ID NO:8、10或12所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多肽；
(2)氨基酸序列与SEQ ID NO:8、10或12所示的多肽有80％(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)以上相同性，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多肽；或
(3)在SEQ ID NO:8、10或12所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的、且保留其功能的多肽。
在一种或多种实施方式中，所述方法在胞内进行；较佳地，
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶的表达盒，从而催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺；或
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)表达盒，从而催化马钱子苷和色氨酸、直接合成所述异长春花苷内酰胺。
在本发明的另一方面，提供新型异长春花苷内酰胺合成酶的用途，用于催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺，所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在一种或多种实施方式中，所述开环马钱子苷由马钱子苷转化而成；较佳地，以开环马钱子苷合酶(SLS)和细胞色素P450还原酶(ATR1)催化马钱子苷合成开环马钱子苷。
在一种或多种实施方式中，所述色胺由色氨酸转化而成；较佳地，以色氨酸脱羧酶(TDC)催化色氨酸合成色胺。
在一种或多种实施方式中，该催化在细胞内进行。
在一种或多种实施方式中，在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒，从而催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺。
在一种或多种实施方式中，在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)表达盒，从而催化马钱子苷和色氨酸、直接合成所述异长春花苷内酰胺。
在一种或多种实施方式中，所述表达盒被包含在重组表达载体中。
在一种或多种实施方式中，所述的合成异长春花苷内酰胺的方法在pH4-11(如pH5、6、7、8、10)条件下进行；较佳地在5-10条件下进行；较佳地在pH为6-9条件下进行；更佳地在pH为6.5-9条件下进行。
在一种或多种实施方式中，所述的新型异长春花苷内酰胺合成酶为短小蛇根草、萝芙木或长春花等植物来源的酶(根据本发明披露的信息可以通过序列比较来获得其它植物来源的该类酶)；较佳地为短小蛇根草或萝芙木来源的酶。
在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其中包括外源引入的表达盒：新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)表达盒；所述重组细胞能以马钱子苷和色氨酸为底物、直接合成异长春花苷内酰胺；所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
在本发明的另一方面，提供制备所述的重组细胞的方法，包括：将新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)表达盒引入到细胞中，获得所述重组细胞；所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体；较佳地，所述表达盒被包含在重组表达载体中。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：原核细胞或真核细胞。
在一种或多种实施方式中，所述原核细胞包括大肠杆菌或链霉菌。
在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括酵母。
在一种或多种实施方式中，所述的酵母包括：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：植物细胞。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：藻类植物细胞。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：蓝藻细胞。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：放线菌细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的试剂盒，其中包括新型异长春花苷内酰胺合成酶或其表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)或其表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)或其表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)或其表达盒。
在本发明的另一方面，提供一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的试剂盒，其中包括所述的细胞。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括马钱子苷和色氨酸；所述开环马钱子苷合酶(SLS)和细胞色素P450还原酶(ATR1)催化马钱子苷合成开环马钱子苷；所述色氨酸脱羧酶(TDC)催化色氨酸合成色胺。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液催化结果。
图2、短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶生成的异长春花苷内酰胺的质谱结果。
图3、萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液催化结果。
图4、萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶生成的异长春花苷内酰胺的质谱结果。
图5、异长春花苷内酰胺工程菌株构建。
具体实施方式
本发明人通过挖掘植物活性基因，揭示一种功能新颖的异长春花苷内酰胺合成酶。在此基础上，本发明建立了一种新的生产异长春花苷内酰胺的方法，包括：以该功能新颖的异长春花苷内酰胺合成酶催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺。
目前异长春花苷内酰胺的合成是通过化学的方法进行，首先将色胺衍生物与开环马钱子苷衍生物合成异胡豆苷衍生物，然后通过化学催化合成异胡豆苷，然后在Na2CO3的碱性条件下得到异长春花苷内酰胺。这个化学反应过程比较复杂，且需要金属催化剂和酸碱催化剂，会对环境造成一定程度的污染。
相比于化学催化的方法，本发明的技术方案中，合成异长春花苷内酰胺不需要经过异胡豆苷这一个催化中间体，仅利用本发明的异长春花苷内酰胺合成酶即可一步获得异长春花苷内酰胺，且反应过程对环境污染较小，产物易于纯化，本发明的技术方案可应用于合成生物学等生产方式来生产喜树碱等生物碱。
活性多肽
本发明人通过挖掘植物活性基因，结合深入的研究和实验工作，揭示了新型的异长春花苷内酰胺合成酶，本发明人对所述酶进行异源表达发现，合成异长春花苷内酰胺不需要经过异胡豆苷这一个催化中间体，仅利用本发明的异长春花苷内酰胺合成酶即可一步获得异长春花苷内酰胺。
所述异长春花苷内酰胺合成酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明也包括所述异长春花苷内酰胺合成酶的保守性变异多肽。本发明中，所述的“保守性变异多肽”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述的“保守性变异多肽”可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述的“保守性变异多肽”可以包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较20个或10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
本发明的异长春花苷内酰胺合成酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、或Ty1等。
当出于生产本发明的异长春花苷内酰胺合成酶或其他酶的目的时，为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在本发明的多肽的氨基端添加上信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
编码本发明的异长春花苷内酰胺合成酶以及其它酶的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用编码所述多肽(含其保守性变异多肽)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码所述多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，多种质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体可以是真核表达载体(例如酵母表达载体)。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的异长春花苷内酰胺合成酶或其它酶的多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；或是原核细胞，如细菌细胞。代表性例子有：真菌细胞如酵母细胞，灵芝细胞；大肠杆菌细胞，链霉菌属细胞，枯草杆菌细胞；蓝藻细胞；放线菌细胞。
本发明也提供了一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的重组细胞，其中包括：新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒。该细胞用于催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺。
本发明也提供了另一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的重组细胞，其中包括：外源引入的表达盒：新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)表达盒；所述重组细胞能以马钱子苷(作为开环马钱子苷的前体)和色氨酸(作为色胺的前体)为底物、直接合成异长春花苷内酰胺。
如本文所用，“外源(的)”或“异源(的)”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的，形成所述表达盒。
如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种核酸构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能。
如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子被“可操作地连接”到该核酸序列上。
细胞宿主是一种生产工具，在本发明教导的基础上，本领域技术人员可以通过一些技术手段对酵母以外的其他宿主细胞进行改造，从而也实现如本发明的生物合成，由此构成的宿主细胞以及生产方法也应包含在本发明中。
应用及生产工艺
本发明的异长春花苷内酰胺合成酶或它们的保守性变异多肽，可应用于特异和高效地催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺。本发明提供了以色胺和开环马钱子苷为底物，通过异长春花苷内酰胺合成酶催化合成异长春花苷内酰胺的方法。
如本发明所用，所述的马钱子苷、色氨酸、开环马钱子苷、色胺、异长春花苷内酰胺包括其衍生物、结构类似物、异构体。本发明也涵盖了与马钱子苷、色氨酸、开环马钱子苷、色胺、异长春花苷内酰胺具有同样的母核结构、也能实现所述催化反应的化合物，参与本发明的反应。所述反应可以是体外状态下或为胞内状态下的反应。
本发明首次揭示异长春花苷内酰胺合成酶可以直接催化色胺和开环马钱子苷合成，在本发明的具体实施例中，分别采用了来自短小蛇根草和萝芙木的异长春花苷内酰胺合成酶，体外催化色胺和开环马钱子苷生成异长春花苷内酰胺。进一步地，把来源于长春花的异长春花苷内酰胺合成酶、开环马钱子苷合酶CrSLS、来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)来源的色氨酸脱羧酶RgnTDC导入细胞(如酵母细胞，进一步如酿酒酵母)，喂养马钱子苷和色氨酸，开环马钱子苷合酶CrSLS和细胞色素P450还原酶ATR1催化马钱子苷合成开环马钱子苷，色氨酸脱羧酶RgnTDC催化色氨酸合成色胺，喂养马钱子苷和色氨酸后，可以体内生产异长春花苷内酰胺。
在本发明的具体实施例中，本发明人发现，本发明所构建的生物合成异长春花苷内酰胺的体系，产物产量高且稳定，也即实现了高效的生物合成。同时，鉴于合成反应特异性好，产物成分不复杂、易于分离。
相对于传统的植物提取手段，本发明的生物合成方法具有速度快、受外界因素影响较小等优势；部分化合物通过微生物合成的产量远高于植物提取，已经成为天然产物获得的一种重要手段。异长春花苷内酰胺天然丰度低，并且在植物提取物中会因与化合物共存而使得分离纯化繁琐复杂。本发明中使用微生物发酵的方式来高效、定向得合成异长春花苷内酰胺，有效地降低了分离纯化这类化合物的成本。
本发明也提供了用于生物合成异长春花苷内酰胺的试剂盒，其中包括：新型异长春花苷内酰胺合成酶或其表达盒、开环马钱子苷合酶(SLS)或其表达盒、细胞色素P450还原酶(ATR1)或其表达盒、色氨酸脱羧酶(TDC)或其表达盒；较佳地还包括用于引入所述表达盒的细胞。
作为另一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的试剂盒，其中包括：重组细胞或细胞表达系统，该重组细胞中引入了所述的表达盒。
作为一种实施方式，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。
异长春花苷内酰胺是喜树碱生物合成的重要前体物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及镇咳平喘的活性。本发明的技术方案有利于规模化合成异长春花苷内酰胺，进而用于喜树碱的规模化生物合成。
同时，本发明首次揭示异长春花苷内酰胺合成酶具有催化色胺和开环马钱子苷直接合成异长春花苷内酰胺的功能，从而可在不同的环境或者其它宿主(如植物、蓝藻、放线菌)通过酶催化获得异长春花苷内酰胺。在体外粗酶液和微生物细胞工厂中利用异胡豆苷合酶催化色胺和开环马钱子苷直接合成异长春花苷内酰胺。
本发明反应过程对环境污染较小，产物易于纯化，同时本发明人发现了异长春花苷内酰胺合成酶具有催化色胺和开环马钱子苷直接合成异长春花苷内酰胺的功能，可在不同的环境或者不同宿主(如植物、蓝藻、放线菌)通过酶催化获得异长春花苷内酰胺。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
序列信息
SEQ ID NO:1(异长春花苷内酰胺合成酶核酸，短小蛇根草来源)
atggagttcttcgaatttattgaagcaccatcctacggaccaaacgcatacgcttttgactccgatggtgaactttacgcttccgtcgaagatggtagaattatcaagtatgataagccaagcaacaagttcttgacccacgctgttgcctctccaatctggaataatgcactttgtgagaacaatactaaccaagatctaaaacccttgtgtgggagagtatatgactttggattccactatgaaactcagagattatacatagccgattgttattttggtcttggttttgttggacccgacggaggccatgcaattcagcttgccactagtggagatggagtggagtttaagtggctttatgctttggctatagaccaacaagctggctttgtttatgtcacagatgtgagcacaaaatatgatgacagaggtgttcaagatatcataaggataaacgacacaacaggaagattaatcaaatatgatccatcaactgaggaagttacagttttgatgaaagggctaaatataccaggaggtacagaagtcagcaaagatggctcctttgttctggttggcgaattcgccagccatagaattctcaagtattggcttaagggacctaaagcaaatacatcagaattcttattgaaagtcagaggtccaggaaacataaagaggacaaaggatggagatttttgggtggcctcaagtgacaataatgggatcactgttactccaagagggataaggtttgatgaatttggcaacattttagaagttgtggctattcctctaccgtataaaggtgaacatattgaacaagttcaagagcatgatggtgcattatttgttggatctttgttccacgaatttgttgggatactacacaattacaagagttctgttgatcatcatcaggagaaaaattcaggtgggctcaatgcatcattcaaggaattttcttctttctag
SEQ ID NO:2(异长春花苷内酰胺合成酶蛋白，短小蛇根草来源)
MEFFEFIEAPSYGPNAYAFDSDGELYASVEDGRIIKYDKPSNKFLTHAVASPIWNNALCENNTNQDLKPLCGRVYDFGFHYETQRLYIADCYFGLGFVGPDGGHAIQLATSGDGVEFKWLYALAIDQQAGFVYVTDVSTKYDDRGVQDIIRINDTTGRLIKYDPSTEEVTVLMKGLNIPGGTEVSKDGSFVLVGEFASHRILKYWLKGPKANTSEFLLKVRGPGNIKRTKDGDFWVASSDNNGITVTPRGIRFDEFGNILEVVAIPLPYKGEHIEQVQEHDGALFVGSLFHEFVGILHNYKSSVDHHQEKNSGGLNASFKEFSSF
SEQ ID NO:3(异长春花苷内酰胺合成酶核酸，萝芙木来源)
atggccaagttgtccgactctcaaaccatggccttgttcaccgtcttcttgttgttcttgtcttcttccttggccttgtcctccccaattttgaaggagatcttgatcgaggctccatcctacgctccaaactctttcaccttcgactccaccaacaagggtttctacacttccgtccaggacggtagagttatcaagtacgagggtccaaactccggtttcgttgatttcgcctacgcttccccatattggaacaaggccttttgcgagaactccacagacgccgaaaagagacctttgtgcggtagaacctacgacatctcctacaacttgcagaacaaccagttgtacatcgttgattgttactaccacttgtccgttgttggttccgaaggaggtcacgctactcaattggctacttccgttgacggagttccattcaagtggttgtacgccgttaccgttgaccaaagaacaggtatcgtctacttcaccgacgtctctaccttgtacgacgatagaggcgtccaacagatcatggatacttccgacaagaccggtaggttgatcaagtacgacccatctaccaaggaaaccaccttgttgttgaaggagttgcacgtcccaggaggtgcagaagtttccgccgattcttctttcgtcttggttgccgaattcttgtcccaccaaatcgtcaagtattggttggagggcccaaagaagggtacagccgaagtcttggtcaagatcccaaacccaggtaacatcaagaggaacgcagacggtcacttttgggtttcctcttccgaagagttggacggtaacatgcacggtagagttgacccaaagggtatcaagttcgacgagttcggcaacatcttggaggttatcccattgccaccaccatttgcaggcgaacatttcgaacagatccaggaacacgacggcttgttgtacatcggtactttgttccacggttccgttggtatcttggtctacgacaagaagggcaactccttcgtctcctcccattaa
SEQ ID NO:4(异长春花苷内酰胺合成酶蛋白，萝芙木来源)
MAKLSDSQTMALFTVFLLFLSSSLALSSPILKEILIEAPSYAPNSFTFDSTNKGFYTSVQDGRVIKYEGPNSGFVDFAYASPYWNKAFCENSTDAEKRPLCGRTYDISYNLQNNQLYIVDCYYHLSVVGSEGGHATQLATSVDGVPFKWLYAVTVDQRTGIVYFTDVSTLYDDRGVQQIMDTSDKTGRLIKYDPSTKETTLLLKELHVPGGAEVSADSSFVLVAEFLSHQIVKYWLEGPKKGTAEVLVKIPNPGNIKRNADGHFWVSSSEELDGNMHGRVDPKGIKFDEFGNILEVIPLPPPFAGEHFEQIQEHDGLLYIGTLFHGSVGILVYDKKGNSFVSSH
SEQ ID NO:5(异长春花苷内酰胺合成酶核酸，长春花来源)
atggcaaacttttctgaatctaaatccatgatggcagttttctttatgtttttccttcttcttctttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcaccaattttgaaaaagatttttattgaaagcccttcctatgctccaaatgccttcaccttcgattcaactgataaagggttctacacttccgtccaagatggccgagttatcaaatatgaagggccaaattcaggcttcactgacttcgcctacgcatctcccttctggaacaaagctttttgtgagaacagcaccgatccagagaaaagaccattgtgtgggaggacatatgatatttcctatgactataagaacagccaaatttatattgttgatggccattaccatctttgtgtggttggaaaagaaggtgggtatgccacacaactagccacaagtgtgcaaggagtgccattcaaatggctctatgcagtaactgttgatcagagaacagggattgtttatttcacagatgttagctccatacatgatgacagtcccgaaggtgtggaagaaatcatgaatacaagtgatagaacagggagattaatgaagtatgatccttcaacaaaagaaaccaccttattattgaaagagctacatgttcctggcggggcagaaatcagcgcagatggttcctttgttgtagtagcagaatttttaagcaatcggatagtgaagtattggctagaagggccaaagaaaggcagtgcagagttcttagttacaatcccaaatccaggaaatataaagaggaattctgatggccatttttgggtgtcttcaagtgaagaattagatggaggtcaacatggaagagttgtttcaagaggaattaagtttgatggatttgggaatattcttcaagttataccacttccaccaccatatgaaggtgaacattttgaacagattcaagagcacgatggtttgttatacattggaagtctcttccatagctctgtgggtatattagtgtatgatgatcatgataacaagggaaattcttatgtttctagctag
SEQ ID NO:6(异长春花苷内酰胺合成酶蛋白，长春花来源)
MANFSESKSMMAVFFMFFLLLLSSSSSSSSSSSPILKKIFIESPSYAPNAFTFDSTDKGFYTSVQDGRVIKYEGPNSGFTDFAYASPFWNKAFCENSTDPEKRPLCGRTYDISYDYKNSQIYIVDGHYHLCVVGKEGGYATQLATSVQGVPFKWLYAVTVDQRTGIVYFTDVSSIHDDSPEGVEEIMNTSDRTGRLMKYDPSTKETTLLLKELHVPGGAEISADGSFVVVAEFLSNRIVKYWLEGPKKGSAEFLVTIPNPGNIKRNSDGHFWVSSSEELDGGQHGRVVSRGIKFDGFGNILQVIPLPPPYEGEHFEQIQEHDGLLYIGSLFHSSVGILVYDDHDNKGNSYVSS
SEQ ID NO:7(活泼瘤胃球菌色氨酸脱羧酶核酸)
atgtctcaagttattaaaaagaaaagaaacacttttatgattggtacagaatatattttgaattctacacaattagaagaagcaattaaatcattcgttcatgatttctgtgctgaaaagcatgaaattcatgatcaaccagttgttgttgaagctaaagaacatcaagaagataagattaaacaaattaaaattccagaaaaaggtagaccagttaacgaagttgtttctgaaatgatgaacgaagtttacagatacagaggtgacgcaaatcatccaagatttttctcttttgttccaggtccagcttcttcagtttcttggttgggtgacattatgacttcagcatacaatattcatgctggtggttctaagttggcaccaatggttaactgtatcgaacaagaagttttgaagtggttggctaagcaagttggttttactgaaaacccaggtggtgtttttgtttctggtggttcaatggcaaatattactgctttgacagctgcaagagataataagttgacagatatcaatttgcatttgggtactgcatacatctctgatcaaacacattcttcagttgctaagggtttgagaatcatcggtatcactgattctagaattagaagaattccaacaaactcacatttccaaatggatactacaaagttggaagaagctatcgaaactgataagaaatctggttacatcccattcgttgttattggtactgcaggtactacaaatacaggttctattgatccattgacagaaatctcagctttgtgtaagaaacatgatatgtggttccatatcgatggtgcttatggtgcatctgttttgttgtcaccaaagtacaagtctttgttaactggtacaggtttggcagattctatttcatgggatgctcataagtggttgttccaaacatacggttgtgctatggttttggttaaggatatcagaaatttgttccattcattccatgttaacccagaatacttgaaggatttggaaaacgatatcgataacgttaacacttgggatattggtatggaattgacaagaccagcaagaggtttgaagttgtggttgactttgcaagttttgggttctgatttgattggttcagctattgaacatggttttcaattggctgtttgggcagaagaagctttgaacccaaagaaagattgggaaatcgtttctccagcacaaatggctatgatcaacttcagatacgcaccaaaggatttgactaaggaagaacaagatatcttgaacgaaaagatttctcatagaattttagaatcaggttacgctgcaatttttactacagttttgaacggtaaaacagttttgagaatctgtgcaatccatccagaagctactcaagaagatatgcaacatacaatcgatttgttggatcaatacggtagagaaatctatactgaaatgaagaaagcttaa
SEQ ID NO:8(活泼瘤胃球菌色氨酸脱羧酶蛋白)
MSQVIKKKRNTFMIGTEYILNSTQLEEAIKSFVHDFCAEKHEIHDQPVVVEAKEHQEDKIKQIKIPEKGRPVNEVVSEMMNEVYRYRGDANHPRFFSFVPGPASSVSWLGDIMTSAYNIHAGGSKLAPMVNCIEQEVLKWLAKQVGFTENPGGVFVSGGSMANITALTAARDNKLTDINLHLGTAYISDQTHSSVAKGLRIIGITDSRIRRIPTNSHFQMDTTKLEEAIETDKKSGYIPFVVIGTAGTTNTGSIDPLTEISALCKKHDMWFHIDGAYGASVLLSPKYKSLLTGTGLADSISWDAHKWLFQTYGCAMVLVKDIRNLFHSFHVNPEYLKDLENDIDNVNTWDIGMELTRPARGLKLWLTLQVLGSDLIGSAIEHGFQLAVWAEEALNPKKDWEIVSPAQMAMINFRYAPKDLTKEEQDILNEKISHRILESGYAAIFTTVLNGKTVLRICAIHPEATQEDMQHTIDLLDQYGREIYTEMKKA
SEQ ID NO:9(长春花开环马钱子苷合成酶核酸)
atggagatggacatggacaccatcaggaaggctattgccgctaccatcttcgctttggttatggcttgggcttggagagttcttgattgggcctggtttaccccaaagagaatcgagaagaggttgagacagcaaggcttcagaggtaacccatacaggttcttggttggcgacgtcaaagaatccggtaagatgcaccaagaagccttgtccaagccaatggagttcaacaacgacatcgtcccaagattgatgccacacatcaaccacaccatcaacacctacggtaggaactccttcacttggatgggtagaattccaagaatccacgtcatggagccagagttgatcaaggaagtcttgacccactcctccaagtaccagaagaacttcgacgtccacaacccattggttaagttcttgttgaccggcgttggttcttttgaaggcgctaagtggtccaagcacaggagaatcatctcaccagccttcaccttggagaagttgaagtccatgttgccagccttcgccatttgttaccacgacatgctaaccaagtgggagaagatcgccgaaaagcaaggttctcacgaagtcgatatcttcccaaccttcgacgtgttgacctcagacgttatctccaaggttgccttcggttctacctacgaagaaggcggtaagatcttcaggttgctaaaggagctaatggacttgaccatcgattgcatgagggacgtctacattccaggttggagctacttgccaaccaagaggaacaagaggatgaaggagatcaacaaggagatcaccgacatgttgaggttcatcatcaacaagaggatgaaggctttgaaggcaggagaaccaggtgaagacgatttgttgggcgtcttgttggagtccaacatccaggagatccagaagcaaggtaacaagaaggacggcggtatgtctatcaacgacgtcatcgaggagtgcaagttgttctacttcgccggtcaagaaactaccggagttttgttgacctggaccaccatcttgttgtccaagcatcctgagtggcaggaaagagctagagaagaggtcttgcaggctttcggtaagaacaagccagagttcgagaggttgaaccacttgaagtacgtctccatgatcctatacgaggtcttgaggttgtacccaccagttatcgacttgaccaagatcgtccacaaggacaccaagttgggttcttacaccattccagccggtactcaagtcatgttgccaacagtcatgttgcacagggagaagtccatttggggagaagacgctatggagttcaacccaatgaggttcgttgacggcgttgctaacgctaccaagaacaacgtcacctacttgccattctcttggggtcctagagtttgcttgggtcaaaacttcgccttgttgcaggcaaagttgggtttggccatgatcttgcagaggttcaagttcgacgtcgctccatcttacgtccacgctccatttaccatcttgaccgtccaaccacagttcggttctcacgtcatctacaagaagttggagtcctga
SEQ ID NO:10(长春花开环马钱子苷合成酶蛋白)
MEMDMDTIRKAIAATIFALVMAWAWRVLDWAWFTPKRIEKRLRQQGFRGNPYRFLVGDVKESGKMHQEALSKPMEFNNDIVPRLMPHINHTINTYGRNSFTWMGRIPRIHVMEPELIKEVLTHSSKYQKNFDVHNPLVKFLLTGVGSFEGAKWSKHRRIISPAFTLEKLKSMLPAFAICYHDMLTKWEKIAEKQGSHEVDIFPTFDVLTSDVISKVAFGSTYEEGGKIFRLLKELMDLTIDCMRDVYIPGWSYLPTKRNKRMKEINKEITDMLRFIINKRMKALKAGEPGEDDLLGVLLESNIQEIQKQGNKKDGGMSINDVIEECKLFYFAGQETTGVLLTWTTILLSKHPEWQERAREEVLQAFGKNKPEFERLNHLKYVSMILYEVLRLYPPVIDLTKIVHKDTKLGSYTIPAGTQVMLPTVMLHREKSIWGEDAMEFNPMRFVDGVANATKNNVTYLPFSWGPRVCLGQNFALLQAKLGLAMILQRFKFDVAPSYVHAPFTILTVQPQFGSHVIYKKLES
SEQ ID NO:11(拟南芥细胞色素P450还原酶核酸)
atgacttctgctttgtatgcttccgatttgtttaagcagctcaagtcaattatggggacagattcgttatccgacgatgttgtacttgtgattgcaacgacgtctttggcactagtagctggatttgtggtgttgttatggaagaaaacgacggcggatcggagcggggagctgaagcctttgatgatccctaagtctcttatggctaaggacgaggatgatgatttggatttgggatccgggaagactagagtctctatcttcttcggtacgcagactggaacagctgagggatttgctaaggcattatccgaagaaatcaaagcgagatatgaaaaagcagcagtcaaagtcattgacttggatgactatgctgccgatgatgaccagtatgaagagaaattgaagaaggaaactttggcatttttctgtgttgctacttatggagatggagagcctactgacaatgctgccagattttacaaatggtttacggaggaaaatgaacgggatataaagcttcaacaactagcatatggtgtgtttgctcttggtaatcgccaatatgaacattttaataagatcgggatagttcttgatgaagagttatgtaagaaaggtgcaaagcgtcttattgaagtcggtctaggagatgatgatcagagcattgaggatgattttaatgcctggaaagaatcactatggtctgagctagacaagctcctcaaagacgaggatgataaaagtgtggcaactccttatacagctgttattcctgaataccgggtggtgactcatgatcctcggtttacaactcaaaaatcaatggaatcaaatgtggccaatggaaatactactattgacattcatcatccctgcagagttgatgttgctgtgcagaaggagcttcacacacatgaatctgatcggtcttgcattcatctcgagttcgacatatccaggacgggtattacatatgaaacaggtgaccatgtaggtgtatatgctgaaaatcatgttgaaatagttgaagaagctggaaaattgcttggccactctttagatttagtattttccatacatgctgacaaggaagatggctccccattggaaagcgcagtgccgcctcctttccctggtccatgcacacttgggactggtttggcaagatacgcagaccttttgaaccctcctcgaaagtctgcgttagttgccttggcggcctatgccactgaaccaagtgaagccgagaaacttaagcacctgacatcacctgatggaaaggatgagtactcacaatggattgttgcaagtcagagaagtcttttagaggtgatggctgcttttccatctgcaaaacccccactaggtgtattttttgctgcaatagctcctcgtctacaacctcgttactactccatctcatcctcgccaagattggcgccaagtagagttcatgttacatccgcactagtatatggtccaactcctactggtagaatccacaagggtgtgtgttctacgtggatgaagaatgcagttcctgcggagaaaagtcatgaatgtagtggagccccaatctttattcgagcatctaatttcaagttaccatccaacccttcaactccaatcgttatggtgggacctgggactgggctggcaccttttagaggttttctgcaggaaaggatggcactaaaagaagatggagaagaactaggttcatctttgctcttctttgggtgtagaaatcgacagatggactttatatacgaggatgagctcaataattttgttgatcaaggcgtaatatctgagctcatcatggcattctcccgtgaaggagctcagaaggagtatgttcaacataagatgatggagaaggcagcacaagtttgggatctaataaaggaagaaggatatctctatgtatgcggtgatgctaagggcatggcgagggacgtccaccgaactctacacaccattgttcaggagcaggaaggtgtgagttcgtcagaggcagaggctatagttaagaaacttcaaaccgaaggaagatacctcagagatgtctggtga
SEQ ID NO:12(拟南芥细胞色素P450还原酶蛋白)
MTSALYASDLFKQLKSIMGTDSLSDDVVLVIATTSLALVAGFVVLLWKKTTADRSGELKPLMIPKSLMAKDEDDDLDLGSGKTRVSIFFGTQTGTAEGFAKALSEEIKARYEKAAVKVIDLDDYAADDDQYEEKLKKETLAFFCVATYGDGEPTDNAARFYKWFTEENERDIKLQQLAYGVFALGNRQYEHFNKIGIVLDEELCKKGAKRLIEVGLGDDDQSIEDDFNAWKESLWSELDKLLKDEDDKSVATPYTAVIPEYRVVTHDPRFTTQKSMESNVANGNTTIDIHHPCRVDVAVQKELHTHESDRSCIHLEFDISRTGITYETGDHVGVYAENHVEIVEEAGKLLGHSLDLVFSIHADKEDGSPLESAVPPPFPGPCTLGTGLARYADLLNPPRKSALVALAAYATEPSEAEKLKHLTSPDGKDEYSQWIVASQRSLLEVMAAFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSSPRLAPSRVHVTSALVYGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAVPAEKSHECSGAPIFIRASNFKLPSNPSTPIVMVGPGTGLAPFRGFLQERMALKEDGEELGSSLLFFGCRNRQMDFIYEDELNNFVDQGVISELIMAFSREGAQKEYVQHKMMEKAAQVWDLIKEEGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQEQEGVSSSEAEAIVKKLQTEGRYLRDVW
实施例中所用的引物如表1。
表1
名称 序列 序列号
OpSTRF atggagttcttcgaatttattg SEQ ID NO:13
OpSTRR ctagaaagaagaaaattccttg SEQ ID NO:14
Pcold-OpSTRF gtatcgaaggtaggcatatggagttcttcgaatttattg SEQ ID NO:15
Pcold-OpSTRR ctatctagactgcaggtcgacctagaaagaagaaaattccttg SEQ ID NO:16
RsSTR-pCOLDF gtatcgaaggtaggcatatggccaagttgtccgactctc SEQ ID NO:17
RsSTR-pCOLDF ctatctagactgcaggtcgacttaatgggaggagacgaaggagt SEQ ID NO:18
STR01-HXT7F taagggttgtcgacctgcagcgtacgaagcttcagctgacttctcgtaggaacaatttc SEQ ID NO:19
STR01-HXT7R taaaagtgtttcttttctttttaataacttgagacattttttgattaaaattaaaaaaa SEQ ID NO:20
STR01-PRM5-F ggtagagaaatctatactgaaatgaagaaagcttaaaaacttttatgatattttgcaat SEQ ID NO:21
STR01-PRM5-R accggggtatctgtttggtggaacctgattagaggaaaatagaacccaaaaagagagac SEQ ID NO:22
STR01-RgnTDCF cacaaaaacaaaaagtttttttaattttaatcaaaaaatgtctcaagttattaaaaaga SEQ ID NO:23
STR01-RgnTDCR tgcttaaaaaaaatattgcaaaatatcataaaagtttttaagctttcttcatttcagta SEQ ID NO:24
STR01-UraF gaacacgcaggggcccgaaattgttcctacgagaagtcagctgaagcttcgtacgctgc SEQ ID NO:25
STR01-UraR ataaaacaacctttagacttacgtttgctactctcatgcgttggccgattcattaatgc SEQ ID NO:26
STR02-PGK-F taccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggacgcacagatattataacatc SEQ ID NO:27
STR02-PGK-R gattcgatgaagatcttcttcaagattggggacattgttttatatttgttgtaaaaagt SEQ ID NO:28
STR02-TEF2-F cattatgcaacgcttcggaaaatacgatgttgaaaatggggccgtatacttacatatag SEQ ID NO:29
STR02-TEF2-R cttaaacaaatcggaagcatacaaagcagaagtcatgtttagttaattatagttcgttg SEQ ID NO:30
STR02-PRM9-F acaacaagggtaactcctacgtctcttcctgaacagaagacgggagacactagcacaca SEQ ID NO:31
STR02-PRM9-R tacgcttgacatctactatatgtaagtatacggccccattttcaacatcgtattttccg SEQ ID NO:32
STR02-ENO2-F tcaaaccgaaggaagatacctcagagatgtctggtgataaagtgcttttaactaagaat SEQ ID NO:33
STR02-ENO2-F tcgagttctttgtaaagtctttcatagtagcttactcccaggtatcatctccatctccc SEQ ID NO:34
STR02-TCD-F tgcttgtatatgctcatcccgaccttccattcgcgccatagcttcaaaatgtttctact SEQ ID NO:35
STR02-TCD-R caatagccttcctgatggtgtccatgtccatctccattttgtttgtttatgtgtgttta SEQ ID NO:36
STR02-FBA1-F cggttctcacgtcatctacaagaagttggagtcctgaagttaattcaaattaattgata SEQ ID NO:37
STR02-FBA1-R acagtgatatgcatatgggagatggagatgatacctgggagtaagctactatgaaagac SEQ ID NO:38
STR02-CrSTR-F gtaattatctactttttacaacaaatataaaacaatgtccccaatcttgaagaagatct SEQ ID NO:39
STR02-CrSTR-R gtaaagttgtgtgctagtgtctcccgtcttctgttcaggaagagacgtaggagttaccc SEQ ID NO:40
STR02-CrSLS-F gaacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaaaatggagatggacatggacacca SEQ ID NO:41
STR02-CrSLS-R ctcattaaaaaactatatcaattaatttgaattaacttcaggactccaacttcttgtag SEQ ID NO:42
CrSTR02-ATR1-F ttagaatatacggtcaacgaactataattaactaaacatgacttctgctttgtatgctt SEQ ID NO:43
CrSTR02-ATR1-R cagaaaagactaataattcttagttaaaagcactttatcaccagacatctctgaggtat SEQ ID NO:44
STR02-His-F ttcaaatccgaacaacagagcatagggtttcgcaaagcagattgtactgagagtgcacc SEQ ID NO:45
STR02-His-R aatgcctattatgcagatgttataatatctgtgcgtcctgatgcggtattttctcctta SEQ ID NO:46
实施例1、异长春花苷内酰胺合成酶基因的获得
本发明采用了来自短小蛇根草、萝芙木和长春花的异长春花苷内酰胺合成酶，(短小蛇根草核苷酸序列SEQ ID NO:1，短小蛇根草氨基酸序列SEQ ID NO:2，萝芙木核苷酸序列SEQ ID NO:3，萝芙木氨基酸序列SEQ ID NO:4，长春花核苷酸序列SEQ ID NO:5，长春花氨基酸序列SEQ ID NO:6)，如表2。萝芙木和长春花来源的异长春花苷内酰胺合成酶进行酵母密码子优化；短小蛇根草来源的异长春花苷内酰胺合成酶以短小蛇根草的cDNA为模板，利用正向引物OpSTRF(SEQ ID NO:13)，反向引物OpSTRR(SEQ ID NO:14)，通过PCR反应扩增获得。
表2
实施例2、活泼瘤胃球菌来源的TDC和长春花来源的SLS基因的获得
本发明利用活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)来源的RgnTDC、长春花来源的CrSLS、长春花来源的异长春花苷内酰胺合成酶和拟南芥来源的ATR1(核苷酸序列SEQ IDNO:11，氨基酸序列SEQ ID NO:12)来构建重组酵母工程菌株，生产异长春花苷内酰胺。
活泼瘤胃球菌来源的TDC(核苷酸序列SEQ ID NO:7，氨基酸序列SEQ ID NO:8)和长春花来源的SLS(核苷酸序列SEQ ID NO:9，氨基酸序列SEQ ID NO:10)，如表3。
表3
实施例3、异长春花苷内酰胺合成酶蛋白的获得
设计引物Pcold-OpSTRF(核苷酸序列SEQ ID NO:15)、Pcold-OpSTRR(核苷酸序列SEQ ID NO:16)、RsSTR-pCOLDF(核苷酸序列SEQ ID NO:17)、RsSTR-pCOLDR(核苷酸序列SEQID NO:18)，分别以短小蛇根草和萝芙木来源的异长春花苷内酰胺合成酶基因(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3)为模板，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶回收获得异长春花苷内酰胺合成酶基因的大片段。
通过快切酶NdeI和SalI酶切pCold-TF载体(TaKaRa公司)，然后通过琼脂糖凝胶回收的方式获得含有NdeI和SalI重组位点的pCold-TF载体的大片段。
通过同源重组酶将短小蛇根草和萝芙木来源的异长春花苷内酰胺合成酶基因的大片段分别重组到pCold-TF载体。
分别将重组产物转入大肠杆菌TOP10，对阳性大肠杆菌TOP10进行质粒抽提，得到带有目的基因的质粒。
然后将带有目的基因的质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有短小蛇根草或萝芙木来源的异长春花苷内酰胺合成酶基因的大肠杆菌。
用100mL液体LB培养基进行发酵，转速为180rpm，温度为37℃，当发酵液OD600＝0.6时，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷诱导蛋白表达；转速为180rpm，温度为16℃，培养12h；12000rpm下将发酵液离心10min，去除上清后得菌体，用5mL PBS缓冲液(pH6.0)均匀重悬菌体；用高压压榨破碎菌体后12000rpm离心10min，得到的上清即为短小蛇根草或萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶蛋白粗酶液。
实施例4、异长春花苷内酰胺合成酶催化色胺与开环马钱子苷获得异长春花苷内酰胺
短小蛇根草或萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液催化分别在100μL反应体系中进行，反应体系包括2μL开环马钱子苷(终浓度1mM)，2μL色胺(终浓度1mM)，96μL短小蛇根草或萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液(PBS缓冲液，pH 6.0)。另外，煮沸变性10min的蛋白溶液作为催化反应组的空白对照，其它条件和反应组相同。
将反应液置于37℃水浴锅中反应3h，加入100μL甲醇混合终止反应，用0.22μm的有机滤膜过滤混合物，然后进行液相质谱检测。
如图1，短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶反应组产物的出峰时间是5.50min，异长春花苷内酰胺标品的出峰时间是5.50min，出峰时间一致。
如图2，短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶反应组产物的碎片与异长春花苷内酰胺的分子碎片一致。
上述结果说明，在短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶的催化下，在反应液中有异长春花苷内酰胺生成，异长春花苷内酰胺产量为22.4mg/L，从而可以利用短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶催化色胺和开环马钱子苷合成异长春花苷内酰胺。
如图3，萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶反应组产物的出峰时间是5.51min，异长春花苷内酰胺标品的出峰时间是5.50min，出峰时间相同(0.01min属于误差范围)。
如图4，萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶反应组产物的碎片与异长春花苷内酰胺的分子碎片一致。
上述结果说明，在萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶的催化下，在反应液中有异长春花苷内酰胺生成，异长春花苷内酰胺产量为13.1mg/L。
分别用pH 4.5、6.0、7.0、8.0的PBS缓冲液破碎菌体，得到不同pH值的短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液，然后按照上述催化方法进行催化，测定异长春花苷内酰胺的含量。不同条件下异长春花苷内酰胺合成酶的催化结果如表4所示。
表4
结果显示，随着反应液pH的升高，短小蛇根草异长春花苷内酰胺合成酶催化生成的异长春花苷内酰胺越多。
按照同样的方法进行了pH 8.0的萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶粗酶液催化，结果发现反应液异长春花苷内酰胺的产量为64.6mg/L，高于pH 6.0时的产量13.1mg/L。
因此，碱性环境呈现显著的产量促进作用，更有利于所述异长春花苷内酰胺合成酶催化生成异长春花苷内酰胺。可以利用萝芙木异长春花苷内酰胺合成酶催化色胺和开环马钱子苷合成异长春花苷内酰胺。
实施例5、利用微生物细胞工厂生产异长春花苷内酰胺
1、制备对照菌株STR01
利用引物STR01-HXT7F(SEQ ID NO:19)、STR01-HXT7R(SEQ ID NO:20)，引物STR01-PRM5F(SEQ ID NO:21)、STR01-PRM5R(SEQ ID NO:22)，以出发菌株酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别得到扩增产物：启动子HXT7和终止子PRM5。
利用引物STR01-RgnTDCF(SEQ ID NO:23)、STR01-RgnTDCR(SEQ ID NO:24)，以RgnTDC(SEQ ID NO:7)为模板进行PCR扩增，得到扩增产物RgnTDC。
以扩增产物HXT、RgnTDC和PRM5为模板，利用引物STR01-HXT7-F和STR01-PRM5-R通过融合PCR方法克隆获得RgnTDC表达盒(HXT-RgnTDC-PRM5操作性连接)。
利用引物STR01-UraF(核苷酸序列SEQ ID NO:25)、STR01-UraR(核苷酸序列SEQID NO:26)，以商业化酵母表达质粒pESC-URA为模板进行PCR扩增，获得克隆产物URA表达盒作为筛选标记。
RgnTDC的3’端和URA表达盒的5’端含有59bp的同源臂；RgnTDC表达盒的5’端和URA表达盒的3’端分别含有rDNA位点36bp的同源臂。两个表达盒通过LiAC/ssDNA法转化酿酒酵母菌株BY4742，通过缺陷型筛选获得菌株STR01(对照菌株)。
2、制备工程菌株STR02
利用引物STR02-PGK-F(核苷酸序列SEQ ID NO:27)、STR02-PGK-R(核苷酸序列SEQID NO:28)，STR02-TEF2-F(核苷酸序列SEQ ID NO:29)、STR02-TEF2-R(核苷酸序列SEQ IDNO:30)，STR02-PRM9-F(核苷酸序列SEQ IDNO:31)、STR02-PRM9-R(核苷酸序列SEQ ID NO:32)，STR02-ENO2-F(核苷酸序列SEQ ID NO:33)、STR02-ENO2-R(核苷酸序列SEQ ID NO:34)，STR02-FBA1-F(核苷酸序列SEQ ID NO:35)、STR02-FBA1-R(核苷酸序列SEQ IDNO:36)，STR02-TCD-F(核苷酸序列SEQ ID NO:37)、STR02-TCD-R(核苷酸序列SEQ ID NO:38)，分别以出发菌株酿酒酵母BY4742的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物PGK1启动子、TEF2启动子、PRM9终止子、ENO2终止子、FBA1终止子和TCD启动子。
利用引物STR02-CrSTR-F(核苷酸序列SEQ ID NO:39)、STR02-CrSTR-R(核苷酸序列SEQ ID NO:40)，以合成的基因CrSTR(GenBank登录号P18417.2)为模板进行PCR扩增，获得扩增片段CrSTR。
利用引物STR02-CrSLS-F(核苷酸序列SEQ ID NO:41)、STR02-CrSLS-R(核苷酸序列SEQ ID NO:42)，以合成的基因CrSLS为模板进行PCR扩增，获得PCR产物CrSLS。
利用引物CrSTR02-STR1-F(核苷酸序列SEQ ID NO:43)、CrSTR02-STR1-R(核苷酸序列SEQ ID NO:44)，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，获得PCR产物ATR1。
利用引物STR02-PGK-F和STR02-PRM9-R，以前述获得的PCR扩增产物PGK1启动子、CrSTR、PRM9终止子为模板进行融合PCR扩增，获得表达盒CrSTR(PGK1-CrSTR-PRM9操作性连接)。
利用引物STR02-TEF2-F和STR02-ENO2-R，以PCR扩增产物TEF2启动子、ATR1、ENO2终止子为模板进行融合PCR扩增，获得表达盒ATR1(TEF2-ATR1-ENO2操作性连接)。
利用引物STR02-PGK-F和STR02-PRM9-R，以PCR扩增产物PGK1启动子、CrSTR、PRM9终止子为模板进行融合PCR扩增，获得表达盒CrSTR(PGK1-CrSTR-PRM9操作性连接)。
利用引物STR02-TCD-F和STR02-FBA1-R，以PCR扩增产物TCD、CrSLS、FBA1为模板进行融合PCR扩增，获得表达盒CrSLS(TCD-CrSLS-FBA1操作性连接)。
利用引物STR02-His-F(核苷酸序列SEQ ID NO:45)、STR02-His-R(核苷酸序列SEQID NO:46)，以商业化酵母表达质粒pESC-HIS为模板进行PCR扩增，获得克隆产物HIS表达盒作为筛选标记。
表达盒HIS、CrSTR、ATR1和CrSLS依次相邻(5’端→3’端)。这4个表达盒通过LiAC/ssDNA法转化酵母菌株STR01，通过缺陷型筛选获得菌株STR02(工程菌株)。
3、对照菌株STR01和工程菌株STR02的目标产物的生产
对照菌株STR01和工程菌株STR02，挑取单克隆加入2mL YPD液体培养30℃发酵培养2天，加入终浓度为1mM的色氨酸和马钱子苷；饲喂培养3天，取1mL发酵液，17000g离心10min，上清用0.22μm的滤膜过滤，然后进行HPLC-MS分析。
如图5所示，在工程菌株STR02的发酵液中可以明显检测到异长春花苷内酰胺的生成，且具有较高的量。而对照菌株STR01则没有异长春花苷内酰胺生成。
因此，可以利用微生物细胞工厂，通过异长春花苷内酰胺合成酶、开环马钱子苷合成酶和色氨酸脱羧酶的催化进行异长春花苷内酰胺的生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (14)

1.一种合成异长春花苷内酰胺的方法，其特征在于，包括：以新型异长春花苷内酰胺合成酶催化开环马钱子苷和色胺，从而直接合成所述异长春花苷内酰胺；
其中，所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的保守性变异多肽包括：
(1)由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多肽；
(2)氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的多肽有80％以上相同性，且具有合成异长春花苷内酰胺功能的多；或
(3)在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的、且保留其功能的多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开环马钱子苷由马钱子苷转化而成；较佳地，以开环马钱子苷合酶和细胞色素P450还原酶催化马钱子苷合成开环马钱子苷。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色胺由色氨酸转化而成；较佳地，以色氨酸脱羧酶催化色氨酸合成色胺。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在胞内进行；较佳地，
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶的表达盒，从而催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺；或
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶表达盒、细胞色素P450还原酶表达盒、色氨酸脱羧酶表达盒，从而催化马钱子苷和色氨酸、直接合成所述异长春花苷内酰胺；
较佳地，所述表达盒被包含在重组表达载体中。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的合成异长春花苷内酰胺的方法在pH4-11条件下进行；较佳地在5-10条件下进行；较佳地在pH为6-9条件下进行；更佳地在pH为6.5-9条件下进行。
7.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的新型异长春花苷内酰胺合成酶为短小蛇根草、萝芙木或长春花等植物来源的酶；较佳地为短小蛇根草或萝芙木来源的酶。
8.新型异长春花苷内酰胺合成酶的用途，用于催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺，所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述开环马钱子苷由马钱子苷转化而成；较佳地，以开环马钱子苷合酶和细胞色素P450还原酶催化马钱子苷合成开环马钱子苷；
所述色胺由色氨酸转化而成；较佳地，以色氨酸脱羧酶催化色氨酸合成色胺。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，该催化在细胞内进行；较佳地，
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒，从而催化开环马钱子苷和色胺、直接合成所述异长春花苷内酰胺；或
在细胞中引入新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶表达盒、细胞色素P450还原酶表达盒、色氨酸脱羧酶表达盒，从而催化马钱子苷和色氨酸、直接合成所述异长春花苷内酰胺；
较佳地，所述表达盒被包含在重组表达载体中。
11.一种重组细胞，其中包括外源引入的表达盒：新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶表达盒、细胞色素P450还原酶表达盒、色氨酸脱羧酶表达盒；所述重组细胞能以马钱子苷和色氨酸为底物、直接合成异长春花苷内酰胺；所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体。
12.制备权利要求11所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括：将新型异长春花苷内酰胺合成酶表达盒、开环马钱子苷合酶表达盒、细胞色素P450还原酶表达盒、色氨酸脱羧酶表达盒引入到细胞中，获得所述重组细胞；所述新型异长春花苷内酰胺合成酶为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽或其保守性序列变体；较佳地，所述表达盒被包含在重组表达载体中。
13.一种用于生物合成异长春花苷内酰胺的试剂盒，其中包括新型异长春花苷内酰胺合成酶或其表达盒、开环马钱子苷合酶或其表达盒、细胞色素P450还原酶或其表达盒、色氨酸脱羧酶或其表达盒；或
其中包括权利要求11所述的细胞。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括马钱子苷和色氨酸；所述开环马钱子苷合酶和细胞色素P450还原酶催化马钱子苷合成开环马钱子苷；所述色氨酸脱羧酶催化色氨酸合成色胺。
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