JPH08322579A

JPH08322579A - 慢性関節リウマチに関与するｍｓｒｖ−１ウイルス並びに病原性および／または感染性ｍｓｒｖ−２剤

Info

Publication number: JPH08322579A
Application number: JP8091642A
Authority: JP
Inventors: Herve Perron; エルヴェィ・ペロン; Bernard Mandrand; ベルナール・マンドラン; Francois Mallet; フランソワ・マレ; Frederic Bedin; フレデリック・ベダン; Frederic Beseme; フレデリック・ベジム
Original assignee: Biomerieux SA; Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux SA; Biomerieux Inc
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 1996-12-10
Also published as: NO964760L; FR2731356B1; WO1996028552A1; AU5007396A; NO964760D0; CZ328796A3; FR2731356A1; NZ303694A; PL317200A1; EP0731168A1; CA2171242A1; BR9605926A

Abstract

(57)【要約】【課題】慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質
による感染および／または前記病原性および／または感
染性の作因の再活性化を検出、予防もしくは治療するた
めの診断、予防もしくは治療組成物を得る。【解決手段】ＰＯＬ−２株およびＭＳ７ＰＧ株、並び
に前記ウイルス株ＰＯＬ−２またはＭＳ７ＰＧのウイル
スに対応する少なくとも一つの抗原に対して向けられた
少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも一
つの抗原を備えたウイルスからなる変異株から選択され
た、逆転写酵素活性を有するウイルス株から誘導され
た、逆転写酵素活性を備えたウイルス性物質、および病
原性および／または感染性の作因の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】慢性関節リウマチ（ＲＡ）
は、最も一般的なヒトの炎症性リウマチであり、特に高
い有病率の３％である（１）。開始期では診断が困難で
あり、その診療の不均一性および時には顕著な免疫異常
に係る関節外の症状が事態を複雑にする。これは、その
病因が未知の疾患であり、自己抗原に対して悪化した免
疫反応が存在することから“自己免疫”疾患の分野に分
類される。

【０００２】

【従来の技術】ＲＡに関するウイルス性および／または
細菌性の病因がしばしば挙げられるが、ＲＡの原因成分
の捜索はこれまで成功していない（２）。

【０００３】ＲＡを自己免疫疾患として定義付ける概
念、およびウイルス性、もしくは細菌性の病因の仮説を
指示する概念が、Fujinami R.S.とOldstone M.B.A.
（３）によって記載されたように、感染した宿主におけ
る自己免疫反応を微生物が促進し得る種々のメカニズム
の理解に結びつけられる。細菌もしくはウイルス起源の
分子、あるいは内在性レトロウイルス起源の分子が、い
わゆる超抗原の特徴を備えていることが知られている
（４，５）。ある“Ｔ”レセプターのＶ領域と結合する
ことによる、異なる抗原に特異的なＴリンパ球の直接的
刺激の特定の特徴は、このような分子が自己免疫の病因
のエチオパソジェニック(aetiopathogenic)な工程と密
接に関連するという仮説を引き出した（６）。しかしな
がら、特異的な細菌またはウイルスの病原性の作因、お
よび可能性のある超抗原の産生者は、慢性関節リウマチ
とは明確な関連づけがされていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＲＡの病因を探す出願
人の研究によって、ＲＡの病状と独立にもしくは共に関
連づけられた二つの病的および／または感染性の作因の
存在を見出した。

【０００５】多発性硬化症（ＭＳ）に係り、仏国特許出
願第９２０４３２２号、第９２１３４４７号、第９２１
３４４３号、第９２０１５２９号、第９４０１５３０
号、第９４０１５３１号および第９４０１５３２号並び
にH. Perronらによる刊行物（７）（上記刊行物を参照
として本記載に取り込む）に記載された作因に関する、
出願人によって行われた研究で用いられるレトロウイル
ス性物質を培養および検出する技術は、ＭＳと関連する
作因とＲＡと関連する本発明の主題を成す作因との間の
全く予期せぬ類似性を示すことを可能にした。

【０００６】ＲＡにおいて、その工程が関節で起こり、
特に滑膜に関係するものであれば、培養は、ＲＡ患者の
患部の関節から破裂した滑液から誘導された細胞からな
る。このような培養を用いると、ｉｎｖｉｔｒｏで増
殖される繊維芽細胞系の細胞を得ることが可能であり、
これによっていくらかの走行（run）を行うことができ
る。対応する培養基は、超遠心で濃縮された感染性粒子
と関わる逆転写酵素活性の研究に用いられ、等密度勾配
で精製した。ＭＳから誘導されたＬＭ７株用に開発され
た検出条件（７）の使用により、この勾配のいくつかの
分離された画分における重要な逆転写酵素活性を検出す
ることを可能にした。その後、逆転写酵素活性を備えた
酵素の共通配列に類似した縮重したプライマー（８）を
用いた、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）技術によ
り、これらの画分で増幅された核酸配列の分析が、多発
性硬化症のケースから誘導された培養において以前に同
定された、病原性および／または感染性の作因ＭＳＲＶ
１およびＭＳＲＶ２の配列と同一の重要配列の存在を明
らかにした。

【０００７】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】し
かして、本発明の種々の主題は、以下の通りである： i）１９９２年７月２２日にＶ９２０７２２０２の受付
番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＯＬ−２および１９９
３年１月８日にＶ９３０１０８１６の受付番号でＥＣＡ
ＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと称される株から、並びに
前記ウイルス株ＰＯＬ−２またはＭＳ７ＰＧのウイルス
に対応する少なくとも一つの抗原に対して向けられた少
なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも一つ
の抗原を備えたウイルスからなる変異株から選択され
た、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質による
感染または前記物質の再活性化（reactivation）を検
出、予防もしくは治療するための診断、予防もしくは治
療組成物を得るための、逆転写酵素活性を有するウイル
ス株から誘導され、内在性レトロウイルスのファミリー
に関する、単離または精製された状態の、逆転写酵素活
性を備えたウイルス性物質の使用。

【０００８】ii）１９９２年７月２２日に９２０７２２
０１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＬＩ−２お
よび１９９３年１月８日に９３０１０８１７の受付番号
でＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称されるライン
から選択されるセルラインによって、あるいは前記ライ
ンＰＬＩ−２またはＬＭ７ＰＣによって産生されるウイ
ルスに対応する少なくとも一つの抗原に対して向けられ
た少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも
一つの抗原を備えたウイルスを産生し得る感染細胞培養
によって産生される、慢性関節リウマチに係る前記ウイ
ルス性物質による感染または前記物質の再活性化を検
出、予防もしくは治療するための診断、予防もしくは治
療組成物を得るための、内在性レトロウイルスのファミ
リーに関する、単離または精製された状態の、逆転写酵
素活性を備えたウイルス性物質の使用。

【０００９】iii）ゲノムが、ＳＥＱＩＤＮＯ１、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２
およびＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配列、並び
にこれらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤＮＯ１、
ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、
ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ
４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列か
ら選択されたヌクレオチド配列に対して、特に１００個
連なるモノマーのどこの配列に対しても、少なくとも５
０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を示すヌク
レオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配
列を含む、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質
による感染または前記物質の再活性化を検出、予防もし
くは治療するための診断、予防もしくは治療組成物を得
るための、ウイルス性物質の使用。

【００１０】iv）ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、レトロウイ
ルスＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−９のゲノムのｐｏｌ
遺伝子に属するヌクレオチド配列と、特に少なくとも５
０％、好ましくは少なくとも６５％の相同性を有する等
価のヌクレオチド配列を含む、慢性関節リウマチに係る
前記ウイルス性物質による感染または前記物質の再活性
化を検出、予防もしくは治療するための診断、予防もし
くは治療組成物を得るための、レトロウイルス性物質の
使用。

【００１１】v）ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、レトロウイ
ルスＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−９のゲノムのｐｏｌ
遺伝子にコードされたペプチド配列と少なくとも５０
％、好ましくは７０％の相同性を有するペプチド配列を
コードする、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物
質による感染または前記物質の再活性化を検出、予防も
しくは治療するための診断、予防もしくは治療組成物を
得るための、レトロウイルス性物質の使用。

【００１２】vi）ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ
３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ
８、ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ４２およびＳＥＱＩＤＮＯ４３、並びに
これらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列にコ
ードされたペプチド配列と、少なくとも３０個連なるア
ミノ酸のどこの配列に対しても少なくとも５０％、好ま
しくは少なくとも７０％の相同性を有するペプチド配列
をコードする、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性
物質による感染または前記物質の再活性化を検出、予防
もしくは治療するための診断、予防もしくは治療組成物
を得るための、レトロウイルス性物質の使用。

【００１３】vii）ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配
列、並びにこれらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相
補配列から選択された配列と、特に１００個連なるモノ
マーのどこの配列に対しても、少なくとも５０％、好ま
しくは少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド
配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質による
感染または前記物質の再活性化を検出、予防もしくは治
療するための診断、予防もしくは治療組成物を得るため
の、ヌクレオチドフラグメントの使用。

【００１４】viii）vii）に記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係るウイルス性物質のＲＮＡま
たはＤＮＡを合成により増幅するための特異的プライマ
ーの使用；好ましい使用では、プライマーが、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１６、ＳＥＱＩＤＮＯ１７、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１８、ＳＥＱＩＤＮＯ１９、ＳＥＱＩＤＮＯ２
０、ＳＥＱＩＤＮＯ２１、ＳＥＱＩＤＮＯ２２、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２３、ＳＥＱＩＤＮＯ２４、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ２５、ＳＥＱＩＤＮＯ２６、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ３１、ＳＥＱＩＤＮＯ３２、ＳＥＱＩＤＮＯ３
３、ＳＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４９およびこれらの相補配列から選択さ
れたヌクレオチド配列を含む。

【００１５】ix）vii）に記載のフラグメントのヌクレ
オチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌクレ
オチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配列
に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少な
くとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、生物学的試料における慢性関節リウマチに係るウイ
ルス性物質もしくは前記ウイルス性物質の再活性化の検
出、分離または同定用の組成物を得るためのプローブの
使用；好ましい使用では、プローブが、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１６、ＳＥＱＩＤＮＯ１７、ＳＥＱＩＤＮＯ１
８、ＳＥＱＩＤＮＯ１９、ＳＥＱＩＤＮＯ２０、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２１、ＳＥＱＩＤＮＯ２２、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ２３、ＳＥＱＩＤＮＯ２４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ２５、ＳＥＱＩＤＮＯ２６、ＳＥＱＩＤＮＯ３
１、ＳＥＱＩＤＮＯ３２、ＳＥＱＩＤＮＯ３３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４８、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ４９およびこれらの相補配列から選択されたヌ
クレオチド配列を含む。

【００１６】x）１９９２年７月２２日にＶ９２０７２
２０２の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＯＬ−２
および１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１６の受付
番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと称される
株、並びにその変異株から選択されたウイルス株から誘
導され、前記ウイルス株ＰＯＬ−２またはＭＳ７ＰＧの
病原性および／または感染性の作因のいずれかに対応す
る少なくとも一つの抗原に対して向けられた少なくとも
一つの抗体によって認識される少なくとも一つの抗原を
備えた病原性および／または感染性の作因からなる、慢
性関節リウマチに係る前記病原性および／または感染性
の作因による感染または前記作因の再活性化を検出、予
防もしくは治療するための診断、予防もしくは治療組成
物を得るための、単離または精製された状態の、ポイン
トi）ないしvi）のいずれか一項に記載のウイルス性物
質とは異なる、病原性および／または感染性の作因の使
用。

【００１７】xi）１９９２年７月２２日に９２０７２２
０１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＬＩ−２お
よび１９９３年１月８日に９３０１０８１７の受付番号
でＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称されるライン
から選択されたセルラインによって、並びに病原性およ
び／または感染性の作因の少なくともいずれかおよび／
またはその変異体を産生し得る感染細胞培養によって、
あるいは前記ラインＰＬＩ−２またはＬＭ７ＰＣによっ
て産生される病原性および／または感染性の作因のいず
れかに対応する少なくとも一つの抗原に対して向けられ
た少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも
一つの抗原を備えた病原性および／または感染性の作因
を産生し得る感染細胞培養によって産生される、慢性関
節リウマチに係る前記病原性および／または感染性の作
因による感染または前記病原性および／または感染性の
作因の再活性化を検出、予防もしくは治療するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための、ポイント
i）ないしvi）のいずれか一項に記載のウイルス性物質
とは異なる、単離または精製された状態の、病原性およ
び／または感染性の作因の使用。

【００１８】xii）ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ
４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、およ
びこれらと等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１
２、ＳＥＱＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およ
びこれらの相補配列から選択された配列を有するヌクレ
オチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも
９０％の相同性を有するヌクレオチド配列から選択され
たヌクレオチド配列を含む核酸を有する、慢性関節リウ
マチに係る前記病原性および／または感染性の作因によ
る感染または前記病原性および／または感染性の作因の
再活性化を検出、予防もしくは治療するための診断、予
防もしくは治療組成物を得るための、病原性および／ま
たは感染性の作因の使用。

【００１９】xiii）ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、お
よびこれらと等価の配列であって、特に１００個連なる
モノマーのどこの配列に対しても、ＳＥＱＩＤＮＯ１
０、ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれ
らの相補配列から選択された配列と少なくとも７０％、
好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオ
チド配列から選択されたヌクレオチド配列を含む、慢性
関節リウマチに係る前記病原性および／または感染性の
作因による感染または前記病原性および／または感染性
の作因の再活性化を検出、予防もしくは治療するための
診断、予防もしくは治療組成物を得るための、ヌクレオ
チドフラグメントの使用。

【００２０】xiv）xiii）に記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係る病原性および／または感染
性の作因のＲＮＡもしくはＤＮＡを合成することによっ
て増幅するための、プライマーの使用；有利な使用で
は、プライマーが、ＳＥＱＩＤＮＯ１３、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１４、ＳＥＱＩＤＮＯ１５、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ２７、ＳＥＱＩＤＮＯ２８、ＳＥＱＩＤＮＯ２
９、ＳＥＱＩＤＮＯ３０、ＳＥＱＩＤＮＯ３４、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ３５、ＳＥＱＩＤＮＯ３６、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ３７、ＳＥＱＩＤＮＯ４４、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４５、ＳＥＱＩＤＮＯ４６およびこれらの相補配
列から選択されたヌクレオチド配列を含む。

【００２１】xv）xiii）に記載のフラグメントのヌクレ
オチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌクレ
オチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配列
に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少な
くとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係る前記病原性および／または
感染性の作因による感染または前記病原性および／また
は感染性の作因の再活性化を検出、予防もしくは治療す
るための診断、予防もしくは治療組成物を得るための、
プローブの使用；有利な使用では、プローブが、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１３、ＳＥＱＩＤＮＯ１４、ＳＥＱＩＤＮＯ１
５、ＳＥＱＩＤＮＯ２７、ＳＥＱＩＤＮＯ２８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２９、ＳＥＱＩＤＮＯ３０、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ３４、ＳＥＱＩＤＮＯ３５、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３６、ＳＥＱＩＤＮＯ３７、ＳＥＱＩＤＮＯ４
４、ＳＥＱＩＤＮＯ４５、ＳＥＱＩＤＮＯ４６およ
びこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列を
含む。

【００２２】xvi）単離または精製された状態の、二つ
の病原性および／または感染性の作因、すなわち逆転写
酵素活性を備え、内在性のレトロウイルスの成分のファ
ミリーに関連するヒトウイルスもしくは前記ウイルスの
変異体からなる第一の作因と、第二の作因もしくは前記
第二の作因の変異体であって、これら二つの病原性およ
び／または感染性の作因は、１９９２年７月２２日にＶ
９２０７２２０２の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託された
ＰＯＬ−２および１９９３年１月８日にＶ９３０１０８
１６の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと
称される株から、並びに前記株の変異体から選択された
同じウイルス株から誘導されたものとされる、慢性関節
リウマチに係る第一の病原性および／または感染性の作
因および第二の病原性および／または感染性の作因によ
る感染、もしくは前記第一の作因または第二の作因のい
ずれかの再活性化を検出、予防もしくは治療するための
診断、予防もしくは治療組成物を得るための、二つの病
原性および／または感染性の作因を含む組み合わせ(ass
ociation)または組成物の使用。

【００２３】xvii）単離または精製された状態の、二つ
の病原性および／または感染性の作因、すなわち逆転写
酵素活性を備え、内在性のレトロウイルスの成分のファ
ミリーに関連するヒトウイルスもしくは前記ウイルスの
変異体からなる第一の作因と、第二の作因もしくは前記
第二の作因の変異体であって、これら二つの病原性およ
び／または感染性の作因は、１９９２年７月２２日に９
２０７２２０１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰ
ＬＩ−２および１９９３年１月８日に９３０１０８１７
の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称さ
れるラインから選択される同じセルラインによって、並
びに病原性および／または感染性の作因の少なくともい
ずれかを産生し得る感染細胞培養および／またはその変
異体によって産生されたものとされる、慢性関節リウマ
チに係る第一の病原性および／または感染性の作因およ
び第二の病原性および／または感染性の作因による感
染、もしくは前記第一の作因または第二の作因のいずれ
かの再活性化を検出、予防もしくは治療するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための、二つの病原
性および／または感染性の作因を含む組み合わせの使
用。

【００２４】xviii）単離または精製された状態の、二
つの病原性および／または感染性の作因、すなわちゲノ
ムが、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４
３、これらの相補配列、並びにこれらと等価の配列であ
って、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３
およびこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配
列に対して、特に１００個連なるモノマーのどこの配列
に対しても、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも
７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなる群か
ら選択されたヌクレオチド配列を含む、ウイルスもしく
は前記ウイルスの変異体からなる第一の作因、および、
ゲノムが、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１
１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４０、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、およびこれら
と等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、
ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの
相補配列から選択されたヌクレオチド配列と、特に１０
０個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少なくと
も７０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有す
るヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を
含む第二の病原性および／または感染性の作因からな
る、慢性関節リウマチに係る第一の病原性および／また
は感染性の作因および第二の病原性および／または感染
性の作因による感染、もしくは前記第一の作因または第
二の作因のいずれかの再活性化を検出、予防もしくは治
療するための診断、予防もしくは治療組成物を得るため
の、二つの病原性および／または感染性の作因を含む組
み合わせの使用。

【００２５】xix）ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配
列、並びにこれらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相
補配列から選択されたヌクレオチド配列に対して、特に
１００個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少な
くとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を
有するヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌク
レオチド配列を含む第一のフラグメント、およびヌクレ
オチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４
０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、および
これらと等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮＯ
１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、
ＳＥＱＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこ
れらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列と、特
に１００個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少
なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性
を有するヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド
配列を含む第二のフラグメントを含み、前記各フラグメ
ントが特にプローブである、慢性関節リウマチに係る第
一の病原性および／または感染性の作因および第二の病
原性および／または感染性の作因、もしくは前記第一の
作因または第二の作因のいずれかの再活性化を検出する
ための診断、予防もしくは治療組成物を得るための、ヌ
クレオチドフラグメントの組み合わせの使用。

【００２６】xx）ix）に記載された第一のヌクレオチド
フラグメントに部分的または全体的にコードされた第一
のポリペプチドおよびix）に記載された第二のヌクレオ
チドフラグメントに部分的または全体的にコードされた
第二のポリペプチドを含む、慢性関節リウマチに係る第
一の病原性および／または感染性の作因および第二の病
原性および／または感染性の作因を検出するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための組み合わせの
使用；有利な使用では、この組み合わせが、上記第一の
ポリペプチドに特異的な抗体等の第一のリガンド、およ
び上記第二のポリペプチドに特異的な抗体等の第二のリ
ガンドを含む。

【００２７】xxi）慢性関節リウマチ患者の関節流体の
剥離した繊維芽細胞およびシノビオサイト(synoviocyt
e)から選択された滑液流体破裂(synovial fluid punctu
res)の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養することを特徴と
する、慢性関節リウマチに係る、i）ないしvi）のいず
れか一項記載の第一の病原性および／または感染性の作
因および／または請求項x）ないしxii）のいずれか一項
記載の第二の病原性および／または感染性の作因の製造
方法。

【００２８】xxii）エプスタイン・バールウイルスによ
って不死化した、慢性関節リウマチ患者に由来するＢリ
ンパ球細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養することを特徴と
する、慢性関節リウマチに係る、ポイントi）ないしv
i）のいずれか一項記載の第一の病原性および／または
感染性の作因および／またはポイントx）およびxii）の
いずれか一項記載の第二の病原性および／または感染性
の作因の製造方法。

【００２９】xxiii）ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ
４３、これらの相補配列、並びにこれらと等価の配列で
あって、特にＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ
４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列か
ら選択された配列と、１００個連なるモノマーのどこの
配列に対しても、少なくとも５０％、好ましくは少なく
とも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列からなる群
から選択されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド
フラグメント。

【００３０】xxiv）xxiii）記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含
む、i）、ii）、iii）、iv）、v）もしくはvi）に記載
のウイルス性物質のＲＮＡまたはＤＮＡを合成により増
幅するための特異的プライマー；本発明の好ましいプラ
イマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４
８、ＳＥＱＩＤＮＯ４９およびこれらの相補配列から
選択されたヌクレオチド配列を含む。

【００３１】xxv）xxiii）記載のフラグメントのヌクレ
オチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌクレ
オチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配列
に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少な
くとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む、
i）、ii）、iii）、iv）、v）もしくはvi）に記載のウ
イルス性物質のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブリ
ダイズし得るプローブ；本発明の好ましいプローブは、
ＳＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４９およびこれらの相補配列から選択される
ヌクレオチド配列を含む。

【００３２】xxvi）ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、
並びにこれらと等価の配列であって、特にＳＥＱＩＤ
ＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの相補配
列から選択された配列と、１００個連なるモノマーのど
この配列に対しても、少なくとも７０％、好ましくは少
なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列からな
る群から選択されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチ
ドフラグメント。

【００３３】xxvii）xxvi）記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含
む、x）、xi）もしくはxii）に記載のウイルス性物質の
ＲＮＡもしくはＤＮＡを合成することによって増幅する
ための特異的プライマー；本発明の好ましいプライマー
は、ＳＥＱＩＤＮＯ４４、ＳＥＱＩＤＮＯ４５、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４６およびこれらの相補配列から選択さ
れたヌクレオチド配列を含む。

【００３４】xxviii）xxvi）記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含
む、x）xi）もしくはxii）のいずれか一項に記載のウイ
ルス性物質のＲＮＡもしくはＤＮＡと特異的にハイブリ
ダイズし得るプローブ；本発明の好ましいプローブは、
ＳＥＱＩＤＮＯ４４、ＳＥＱＩＤＮＯ４５、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４６およびこれらの相補配列から選択される
ヌクレオチド配列を含む。

【００３５】本発明を詳細に記載する前に、明細書およ
び特許請求の範囲で使用した種々の用語について定義す
る。

【００３６】株または単離物とは、例えば、ウイルス及
び／又はバクテリア及び／又は寄生虫等を含み、病原性
及び／又は抗原性能を産生し、培養物または生きた宿主
によって保持された、感染性及び／又は病原性の生物学
的画分を意味するもので、例えば上記の定義に係るウイ
ルス株は、病原性の原生生物等の共感染作因を含むこと
ができる。

【００３７】本明細書中で使用される“ＭＳＲＶ”とい
う用語は、ＭＳもしくはＲＡに係る病原性及び／又は感
染性の作因を示し、特にウイルス種、前記ウイルス種の
弱毒化された株、もしくはこの種から誘導された欠陥干
渉粒子を示す。ウイルス、特にＲＮＡを有するウイルス
が多様性を有すること、特に以下の等価物の観念を定義
する上で考慮すべき比較的高いレベルの自発的変異
（９）を有することが知られている。

【００３８】ヒトウイルスは、ヒトに感染することがで
きるウイルスを意味する。

【００３９】本発明を実施する際に遭遇する自然のある
いは誘導された変形物に鑑み、上記および特許請求の範
囲に定義された発明の主題は、特にヌクレオチドまたは
ペプチド相同配列の、以下に定義された種々の生物学的
物質の同等物または誘導物を含むとされる。

【００４０】本発明に係るウイルスまたは病原性及び／
又は感染性の作因の変異体は、前記ウイルス及び／又は
前記病原生及び／又は感染性の作因に対応する少なくと
も一つの抗原向けの少なくとも一つの抗体によって認識
される少なくとも一つの抗原、及び／又は当業者によく
知られた特定のハイブリダイゼーション条件下で、少な
くとも一つのハイブリダイゼーションプローブ、及び／
又はＳＥＱＩＤＮＯ１３ないしＳＥＱＩＤＮＯ３８
並びにＳＥＱＩＤＮＯ４４ないしＳＥＱＩＤＮＯ４
９から選択されたヌクレオチド配列およびこれらの相補
配列を有するプライマー等の前記ウイルス及び／又は病
原性及び／又は感染性の作因に特異的な少なくとも一つ
のヌクレオチド増幅プライマーによって検出されるゲノ
ムを含む。

【００４１】本発明によれば、ヌクレオチドフラグメン
トまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
は、モノマーが並んだものもしくは生体高分子であって
天然の核酸の情報の配列によって特徴づけられ、予め決
められた条件下でいかなる他のヌクレオチドフラグメン
トともハイブリダイズすることができ、この配列は、種
々の化学構造のモノマーを含むとともに、天然の核酸の
分子から得ることができ、及び／又は遺伝子組換え及び
／又は化学的合成によって得ることができる。

【００４２】しかして、モノマーは、構成要素が、糖、
リン酸基および窒素塩基とされた、普通の核酸のヌクレ
オチドとすることができる；ＲＮＡでは糖がリボースで
あり、ＤＮＡでは糖が２−デオキシリボースである；核
酸がＤＮＡかＲＮＡかによって窒素塩基はアデニン、グ
アニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択され
る；またヌクレオチドは、三つの構成要素の少なくとも
一つを修飾することができ、例えば、塩基では、イノシ
ン、５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、
５−（ジメチルアミノ）デオキシウリジン、２，６−ジ
アミノプリン、５−ブロモデオキシウリジンおよびハイ
ブリダイゼーションを促進する他の修飾された塩基等の
修飾塩基を生じる修飾を起こすことができる；糖では、
修飾は、少なくとも一つのデオキシリボースをポリアミ
ドで置換したもの（１０）、かつリン酸基では、修飾
は、ジホスファート、アルキル−およびアリルホスホナ
ートおよびホスホロチオアートエステル等から選択され
たエステルによって置換することからなる。

【００４３】“情報配列”は、モノマーが並んだ一連の
ものを意味し、その化学的特性および参照方向への並び
は、天然の核酸と同質の機能情報の項目(item)を構成す
ると否とに関わらない。

【００４４】ハイブリダイゼーションは、適切な操作条
件下で、十分相補的な配列を有する二つのヌクレオチド
フラグメントが対になって多重鎖、好ましくはヘリック
スの形態で、特にダブルまたはトリプル鎖を形成する間
の工程を意味する。

【００４５】プローブは、化学的に合成されたヌクレオ
チドフラグメント、あるいは長いヌクレオチドフラグメ
ントを分解または酵素的に切断することによって得られ
たヌクレオチドフラグメントを含み、少なくとも６個の
モノマー、有利的には１０〜１００個のモノマー、そし
て好ましくは１０〜３０個のモノマーを含み、特定の条
件下でハイブリダイゼーションの特異性を有するもの
で、好ましくは、１０個より少ないモノマーを有するプ
ローブは単独で使用せずに、他の同じくらい短いプロー
ブ等の存在下で用いられる；ある特定の条件下では、例
えば１００個のモノマーより大きいサイズの長いプロー
ブを使用することもできる；プローブは、特に診断の目
的で使用することもでき、このようなプローブとして
は、例えば捕捉及び／又は検出プローブとされる。

【００４６】捕捉プローブは、適切な手段、すなわち直
接または間接的に、例えば共有結合または受動的な吸着
によって固体状の支持体に固定することができる。

【００４７】検出プローブは、特に放射性同位元素、特
にペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼから
選択された酵素、および発色性、蛍光性または発光性の
基質を加水分解することができる酵素、発色性の化学化
合物、発色性、蛍光性または発光性化合物、ヌクレオチ
ド塩基の類似体およびビオチンから選択された標識手段
によって標識することができる。

【００４８】本発明の診断目的に使用されるプローブ
は、特に、“ドットブロット”（１１）、“サザンブロ
ット”（１２）、標的にＲＮＡを用いる以外は“サザン
ブロット”技術と同様の“ノーザンブロット”、および
サンドウィッチ技術（１３）と称される技術等の、既知
のあらゆるハイブリダイゼーション技術に用いることが
できる；本発明では、捕捉プローブおよび検出プローブ
が少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を持たな
ければならないという理解の上で、特異的な捕捉プロー
ブ及び／又は特異的な検出プローブを含むサンドウィッ
チ技術を用いることが有利である。

【００４９】また、本発明は、特に翻訳及び／又は転写
等の複製現象、及び／又は前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ
の分解を妨げるために、in vivoまたはin vitroでＲＮ
Ａ及び／又はＤＮＡとハイブリダイズし得るプローブを
含む。

【００５０】プライマーは、少なくとも６個のモノマ
ー、有利的には１０〜３０個のモノマーを有し、例えば
ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）等の増幅技術、シ
ークエンシング等の延長工程、逆転写方法等において、
酵素による重合反応の開始用に特定の条件下でハイブリ
ダイゼーションの特異性を有するプローブである。

【００５１】関係する技術における適用または使用に関
して、機能的に対応する生体高分子が、同一ではなくて
も、実質的に同じ役割を果たことができるならば、二つ
のヌクレオチド配列またはペプチド配列は、互いにまた
は基準の配列に対して等価もしくは誘導されたものと称
される；自然の可変性、特に変異が同定される種の自然
変異、もしくは相同な配列であるような誘導された可変
性の結果として得られた場合には、二つの配列は等価物
とされる。相同性に関しては以下に記載する。

【００５２】変異性は、配列の自然または誘導された修
飾を意味し、特にヌクレオチド及び／又はヌクレオチド
フラグメントの置換及び／又は挿入及び／又は欠失、及
び／又は一端または両端における配列の伸長または短縮
を意味するものである：不自然な変異性は、遺伝子工学
技術によるもので、例えば、核酸の増幅用に選択された
変成または未変成（デジェネレート）合成プライマーの
選択によるものである；この多様性は、参照と見なされ
るあらゆる出発配列の修飾に明らかにすることができ、
前記参照配列に対する相同性の度合いで表すことができ
る。

【００５３】相同性は、比較される二つのヌクレオチド
またはペプチドフラグメントが類似する度合いを特徴づ
ける；参照のヌクレオチドまたはペプチド配列と、ヌク
レオチドまたはペプチド配列を直接比較することによっ
て決定される類似性の割合によって測定される。

【００５４】この類似の割合は、一方でＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１〜ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４２およびＳＥＱＩＤＮＯ４３（ＭＳ
ＲＶ−１）に同定されたフラグメントと相同であり、他
方でＳＥＱＩＤＮＯ１０〜ＳＥＱＩＤＮＯ１２およ
びＳＥＱＩＤＮＯ４０〜ＳＥＱＩＤＮＯ４３（ＭＳ
ＲＶ−２）に同定されたフラグメントと相同である、本
発明の一部を構成するヌクレオチドフラグメント、さら
に一方でＳＥＱＩＤＮＯ１６〜ＳＥＱＩＤＮＯ２６
およびＳＥＱＩＤＮＯ３１〜ＳＥＱＩＤＮＯ３３並
びにＳＥＱＩＤＮＯ４７〜ＳＥＱＩＤＮＯ４９に同
定されたプローブおよびプライマーと相同なプローブお
よびプライマー、および他方でＳＥＱＩＤＮＯ１３〜
ＳＥＱＩＤＮＯ１５、ＳＥＱＩＤＮＯ２７〜ＳＥＱ
ＩＤＮＯ３０、ＳＥＱＩＤＮＯ３４〜ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３７およびＳＥＱＩＤＮＯ４４〜ＳＥＱＩＤＮＯ
４６に同定されたプローブおよびプライマーと相同なプ
ローブおよびプライマーに特に決定されており、例え
ば、以下に説明する工程に基づいてＬＭ７ＰＣおよびＰ
ＬＩ−２系から得られたＭＳＲＶ−１ウイルスＲＮＡの
フラグメントから得られた核酸の種々の一般的共通配列
の間に観察される類似性の最小の割合は、図２に記載さ
れた領域では６７％である。

【００５５】参照配列に等価のヌクレオチド配列を所有
するものであれば、どんなヌクレオチドフラグメント
も、等価もしくは参照配列から誘導されたものと称され
る；この定義に基づいて、以下のものが参照のヌクレオ
チドフラグメントに等価である：ａ）参照フラグメントに相補的なものと部分的にハイブ
リダイズすることができるフラグメントｂ）他の分類学上のグループを起源とする他のフラグメ
ントを用いたものより、参照フラグメントを用いた整列
が、より大なる数の同一の連続塩基の証明となるフラグ
メントｃ）種の天然の変異体から得られる、または得ることが
できるフラグメントｄ）参照フラグメントに適用された遺伝子工学技術から
得ることのできるフラグメントｅ）参照フラグメントにコードされたペプチドに相同ま
たは同一であるペプチドをコードする少なくとも８個の
連続したヌクレオチドを含むフラグメント、ｆ）少なくとも一つのモノマーの挿入、欠失または置
換、もしくはその一方または両方の端における伸長また
は減縮による参照フラグメントとは異なるフラグメン
ト；例えば、ポリペプチドをコードしないヌクレオチド
配列が、その一方または両方の端に位置する参照フラグ
メントに対応したフラグメント。

【００５６】ポリペプチドは、特に少なくとも二つのア
ミノ酸のペプチド、特に人の介入によって、抽出され、
分離され、本質的に単離され、合成されたオリゴヌクレ
オチドまたはタンパク質、特に化学的合成によって、ま
たは組換え生物体で発現することによって得られたもの
を意味すると解する。

【００５７】ヌクレオチドフラグメントに部分的にコー
ドされたポリペプチドは、前記ヌクレオチドフラグメン
トに含まれた少なくとも９個の連続したモノマーによっ
てコードされた少なくとも３個のアミノ酸を有するポリ
ペプチドを意味する。

【００５８】極性、疎水性及び／又は塩基度及び／又は
酸度及び／又は中性度等の各物理化学的特性が実質的に
同一であれば、アミノ酸は他方のアミノ酸の類似体（ア
ナログ）と称する；しかして、ロイシンは、イソロイシ
ンの類似体である。

【００５９】比較されるポリペプチドが、特に同じ抗原
性、免疫学的、酵素学的及び／又は分子認識特性等の同
じ特性を本質的に有するならば、等価または参照のポリ
ペプチドから誘導されたものと称する；特に以下に挙げ
るものは、参照のポリペプチドに等価である：ａ）少なくとも一つのアミノ酸が、類似のアミノ酸によ
って置換された配列を有するポリペプチド、ｂ）前記参照ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチド
をコードするヌクレオチドフラグメントの、自然または
誘導された変異によって得られた等価のペプチド配列を
有するポリペプチドｃ）前記参照ポリペプチドのミモトープ（mimotope）、ｄ）一つ以上のアミノ酸が、Ｌ型から、逆のＤ型に置換
されたポリペプチド、ｅ）対応する親のペプチド（そのペプチド鎖にＮＨ−Ｃ
Ｏ結合を含まない）のペプチド鎖の少なくとも一つのＣ
Ｏ−ＮＨ結合、さらに有利的には全てのＣＯ−ＮＨ結合
を一つ（あるいはそれ以上）のＮＨ−ＣＯ結合で置き換
えたポリペプチド、ｆ）対応する親のペプチド（そのペプチド鎖にＮＨ−Ｃ
Ｏ結合を含まない）のペプチド鎖の少なくとも一つのＣ
Ｏ−ＮＨ結合、さらに有利的には全てのＣＯ−ＮＨ結合
を一つ（あるいはそれ以上）のＮＨ−ＣＯ結合で置き換
えたポリペプチドであって、各アミノアシル残基のキラ
リティーは、一つ以上の上述のＣＯ−ＮＨ結合に関わる
と否とによらず、前記親ペプチドを構成する対応するア
ミノアシル残基に対して保存もしくは逆転され、このペ
プチドの型の化合物は、イムノレトロイド(immunoretro
ids)としても意味される、ｇ）配列に、例えば、アミン基のアセチル化、チオール
基のカルボキシル化、カルボキシル基のエステル化等の
アミノ酸の側鎖の修飾が導入されたポリペプチド、ｈ）配列内の一つ以上のペプチド結合が、例えばｃａｒ
ｂａ、ｒｅｔｒｏ、ｉｎｖｅｒｓｏ、ｒｅｔｒｏ−ｉｎ
ｖｅｒｓｏ、還元されたおよびメチレンオキシ結合等で
修飾されたポリペプチド、ｉ）その少なくとも一つの抗原が、参照のポリペプチド
の抗原で認識されるポリペプチド。

【００６０】本発明では、比較された二つのペプチドフ
ラグメントの相同性を特徴づける類似性の割合が、少な
くとも５０％、好ましくは少なくとも７０％である。

【００６１】逆転写酵素活性を有するウイルスは、遺伝
的にＲＮＡおよびＤＮＡの形態で同様に特徴づけられる
ことから、ウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、逆
転写酵素活性（ＭＳＲＶ−１）等を有するウイルスに係
る配列を決めるために調べる。

【００６２】病原性及び／又は感染性の作因（ＭＳＲ
Ｖ）−２が、感染した細胞のＤＮＡとＲＮＡの両方に検
出されることから、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にも特徴
づけられる。

【００６３】“第一ヌクレオチド配列”等の、本明細書
および請求の範囲に用いられた順序表現は、特別な順序
を表すためのものではなく、本発明をより明確に記載す
るためのものである。

【００６４】添付された図面を参照して記載された以下
の詳細な説明により、本発明をよりよく理解することが
できる。

【００６５】図１は、Ｓｈｉｈの工程（８）に従ってＬ
Ｍ７培養物から得られたＭＳＲＶ−２Ａ型の配列を示
す；この配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ１０に同定されてい
る。

【００６６】図２は、ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系統
を起源とするウイルスＤＮＡから、“ｐｏｌ”領域にお
いてＰＣＲ技術で増幅されたＭＳＲＶ−１Ｂ配列の一般
的な核酸の共通配列を示し、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５およびＳＥＱＩ
ＤＮＯ６に同定され、増幅プライマーと共通に一致す
るものはＳＥＱＩＤＮＯ７を有する。

【００６７】図３は、Ｓｈｉｈ（８）によって記載され
た“ｐｏｌ”領域におけるＰＣＲによって得られたＭＳ
ＲＶ−１Ｂ型の配列の系統樹を示す。

【００６８】図４は、各ＭＳＲＶ−１Ｂ／“ＰＣＲｐ
ｏｌ”型のファミリーに対する機能的な読み枠の定義を
与えるもので、前記ファミリーＡ〜Ｄは、それぞれ図２
記載のＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ５及びＳＥＱＩＤＮＯ６のヌクレオチド
配列によって与えられたものである。

【００６９】図５は、ＭＳＲＶ−２Ｂ配列の共通配列の
例を与えるもので、ＳＥＱＩＤＮＯ１１に同定されて
いる。

【００７０】図６は、クローンＰＳＪ１７のヌクレオチ
ド配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ９）。

【００７１】図７は、Ｍ００３−Ｐ００４と称されるク
ローンのヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ８を示す。

【００７２】図８は、クローンＦ１１−１のヌクレオチ
ド配列ＳＥＱＩＤＮＯ２を示し、プライマー領域の二
つの矢印の間に位置する部分は、Ｆ１１−１のクローニ
ングに用いられたプライマーの選択によって負わされた
可変性に対応している；同図には、アミノ酸への翻訳が
示されている。

【００７３】図９は、ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１、およびＳＥＱＩＤＮＯ１の可能な機能的読み枠
をアミノ酸で示しており、同図には、レトロウイルスの
逆転写酵素の共通配列に下線が施されている。

【００７４】図１０は、ＭＳＲＶ２ＥＬ１と称されるク
ローンのヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ１２を示
す。

【００７５】図１１、図１２および図１３は、連続した
３つの図１１／２４〜１３／２４からなり、６つの可能
な読み枠に従って、プライマーＳＥＱＩＤＮＯ１３を
含むＳＥＱＩＤＮＯ１２のアミノ酸への翻訳を示す。

【００７６】図１４は、ＭＳＲＶ２−ＥＬ１配列（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ１２）のＭＳＲＶ２−Ａ配列（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１０）の並びを示し、ＳＥＱＩＤＮＯ１３
（クローニングの尾から分離されたもの）に同定された
プライマーのハイブリダイゼーション領域が四角で囲ま
れており、ＳＥＱＩＤＮＯ１４に同定されたプライマ
ーのハイブリダイゼーション領域が、［］の間に示され
ている。

【００７７】図１５は、実施例７に記載するように、慢
性関節リウマチの関節流体(articular fluids)の細胞の
培養の上清に存在する感染性および／または病原性の作
因の平衡点まで沈降させたスクロース勾配の画分におけ
る、実施例７に定義された条件下での逆転写酵素活性の
測定を示すものであり、曲線は、勾配の種々の画分にお
ける逆転写酵素活性の変化を示す。この活性は、Ｙ軸上
にＤＰＭ（単位分当たりの崩壊）で示され、Ｘ軸は増加
する密度に従った（画分１から１０）勾配に回収された
画分を示す。

【００７８】図１６は、Ａ、ＢおよびＣに分けられてお
り、Ａでは、ＳＥＱＩＤＮＯ３９に同定され、実施例
９に定義された条件下でＲＡの試料に得られたクローン
“ＭＳＲＶ−１ｐｏｌＰＲ”の配列；ＢおよびＣでは、
ＭＳ源の試料で得られたレトロウイルスＭＳＲＶ−１の
配列に対応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１およびＳＥＱＩＤ
ＮＯ６を有するこのクローンの配列の並びを示す。

【００７９】図１７は、Ａ、ＢおよびＣに分けられてお
り、Ａでは、ＳＥＱＩＤＮＯ４０に同定され、実施例
９に定義された条件下でＲＡの試料で得られたクローン
“ＭＳＲＶ２ｓＰＲ”の配列；ＢおよびＣでは、ＭＳ源
の試料で得られた感染性の作因ＭＳＲＶ−２の配列に対
応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１０およびＳＥＱＩＤＮＯ
１２を有するこのクローンの配列の並びを示す。

【００８０】図１８は、実施例１０に定義された条件下
で、ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４１に同定されたクローンＭＳＲＶ２ｃＰＲ
の配列を示す。

【００８１】図１９は、ＲＡの関節流体の細胞を用いて
得られた、ＳＥＱＩＤＮＯ４１に同定されたクローン
ＭＳＲＶ２ｃＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料で得られ
た感染性の作因ＭＳＲＶ−２の配列に対応する、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１０を備えたクローンの配列の末端部（６５
４−７０５）の並びである。

【００８２】図２０および図２１は、ＲＡの関節流体の
細胞を用いて得られた、ＳＥＱＩＤＮＯ４１に同定さ
れたクローンＭＳＲＶ２ｃＰＲの配列を示し、ＭＳ源の
試料で得られた感染性の作因ＭＳＲＶ−２の配列に対応
する、ＳＥＱＩＤＮＯ１２を備えたクローンの配列の
並びである。

【００８３】図２２は、ＲＡの関節流体を用いて得られ
た、ＳＥＱＩＤＮＯ４２に同定されたクローンＭＳＲ
Ｖ１ｎＰＲの配列を示す。

【００８４】図２３および図２４は、ＲＡの関節流体の
細胞を用いて得られた、ＳＥＱＩＤＮＯ４３に同定さ
れたクローンＭＳＲＶ１ｎＰＲの配列を示し、ＭＳ源の
試料を用いて得られたレトロウイルスＭＳＲＶ−１の配
列に対応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１を備えたクローンの
配列の並びである。

【００８５】

【実施例】

実施例１：ＬＭ７系統の細胞培養から精製された感染性
の作因の調製におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
の遺伝子の保存領域を増幅することによるＭＳＲＶ−２
Ａと称されるＭＳＲＶ−２クローンの調製

【００８６】分子的な試みは、外因性および内在性のレ
トロウイルス、またはＢ型肝炎ウイルス等の逆転写酵素
（ＲＴ）活性を有する酵素をコードするウイルスのｐｏ
ｌ遺伝子、そして疑うまでもなく、ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼの遺伝子、もしくは使用された増幅プライマ
ーによって定義された領域に十分な配列の相同性を示す
酵素の遺伝子の比較的保存された領域を増幅することが
可能なＰＣＲ技術（８）を用いることに本領がある。こ
のＰＣＲ技術は、それまで−８０℃に冷凍されていた原
型のＬＭ７培養物（７）の上清から、工程（１４）に基
づいて得られた感染性の作因の精製された調製物から抽
出された核酸に対して使用された。ＬＭ７様のＲＴ活性
のピークを含む画分を、グアニジンチオシアナートを含
む一体積のバッファーに取り込み（１５）、核酸をＰ．
Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉによって記載された技術に基づい
て抽出するまで−８０℃に保存した（１５）。

【００８７】ＰＣＲ反応の前に、製造者の説明に従っ
て、最も近いログファクターに対する、試料中のＲＮＡ
の量の近似値に基づいて、“ｃＤＮＡ合成システムプラ
ス”キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた、いわゆる
“ランダム”プライマー（混合されたヘキサヌクレオチ
ド）で、試料のＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に翻
訳した。

【００８８】ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ
を、ＴＡクローニングキット（British Biotechnolog
y）を用いてプラスミドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶
液を、５μｌの無菌蒸留水、１μｌの１０倍濃縮された
リゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッフ
ァー”、２μｌの“ｐＣＲ^TMベクター”（２５ｎｇ／ｍ
ｌ）および１μｌの“ＴＡＤＮＡリガーゼ”と混合し
た。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。
以下の工程は、ＴＡクローニングキットの説明に従って
行った。操作の最後に、培養し、かついわゆる“ミニプ
レップ（miniprep）”操作（１６）によって取り込まれ
たプラスミドの抽出を行うために、組換えられたバクテ
リアの白色のコロニーを取り出した。各組換えコロニー
から抽出されたプラスミドを、適当な制限酵素で切断
し、アガロースゲルで分析した。“ＴＡクローニングキ
ット”のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロ
モーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーショ
ンさせた後に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外
線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを、
挿入物の配列決定のために選択した。次いで、配列決定
の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レ
ディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミ
ネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Ap
plied Biosystemsの照合番号４０１３８４）の使用に推
奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Bi
osystemsの“オートマティック・シークエンサー”モデ
ル３７３Ａ装置で、製造者の説明に従って行った。

【００８９】得られた配列を、核酸配列のコンピュータ
ー化されたデータバンク、ジーンバンクで、マックベク
ターおよびジーンワークスといったソフトウエアを用い
て分析し、核酸配列の読み枠から推定されるアミノ酸配
列をスイスプロット（SwissProt）で分析した。溶解さ
れたＬＭ７の上清を起源とするウイルス試料から得られ
たスクロース勾配で逆転写酵素活性のピークで精製され
た配列の分析は、予想される“ｐｏｌ”領域において既
知のレトロウイルスと部分的に相同性を示す他の配列の
個々が表現する範囲（常に５％より小さいか、希に１０
％）と比べて、クローンの大半を示した（約４２％のク
ローン）。このクローンは、ＭＳＲＶ２−Ａと称され、
ＳＥＱＩＤＮＯ１０に同定された（図１参照）。ＰＣ
Ｒプライマーの間の増幅された領域は、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１１（図５参照）に同定された、対応する配列ＭＳＲ
Ｖ２−Ｂと相同であり、実施例２に記載されている。Ｐ
ＣＲプライマーに位置する配列に見られる違いは、種々
の技術的な条件下で用いられた、混合物の形態の退化プ
ライマーの使用によって説明される。ジーンバンクデー
タバンクの疑問は、同じ配列または十分な相同性を表す
配列を示すことができなかった。

【００９０】この配列は、図１に示されている。図１に
示されたこの配列は、末端に二つのＰＣＲプライマーを
有する枠に読み取り枠を有するが、これらのプライマー
間の予想された領域における既知のレトロウイルスの配
列のセットより短い。下流プライマーに先行する配列が
あるが、上流プライマーの配列の後に、対応するレトロ
ウイルスの配列（８）に関して、４５塩基対の欠如（１
５アミノ酸）が観察された。しかしながら、読み枠はオ
ープンであって、プライマーを含む全体の配列を妨害す
るものではなく、推定されるアミノ酸配列は、既知のレ
トロウイルスの対応する領域と十分な相同性を示す。Ｐ
ＣＲプライマーの内側の配列において、レトロウイルス
および逆転写酵素活性（８）を有する既知のウイルスの
ｐｏｌ領域に通常かなりよく保存されているアミノ酸、
Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＰｒｏおよびＡｓｐが、新規
配列の読み枠に正しい配置で保存されている。

【００９１】最後に、この配列が、データバンクに既に
記載されたレトロウイルスの配列と十分に異なることか
ら、ＭＳＲＶ−２Ａと称される新規の感染性及び／又は
病原性の作因に属する配列であると提唱することができ
る。得られた配列の分析に基づいて、この作因は、原則
としてはレトロウイルスに係るものであるが、この配列
を得るために用いた技術から、例えばＢ型肝炎ウイル
ス、ＨＢＶ（８）のように、逆転写酵素活性を付随的に
備えた酵素をコードするゲノムを備えたＤＮＡを含むウ
イルスであるかもしれない。さらに、ＰＣＲ増幅技術に
用いられた退化プライマーのランダムな性質は、予期せ
ぬ配列の相同性または関連する酵素の遺伝子の保存され
た部位により、原核または真核の病原性及び／又は共感
染性(co-infective)の作因（原生生物）を起源とする核
酸の増幅を非常によく行うことができる。

【００９２】実施例２：ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系
統を起源とするビリオン調製物のレトロウイルスの保存
されたｐｏｌ領域の“重ね合わせ（NESTED）”ＰＣＲ増
幅による、レトロウイルスＭＳＲＶ−１および共感染性
の作因ＭＳＲＶ２をそれぞれ定義づける、ＭＳＲＶ−１
ＢおよびＭＳＲＶ−２Ｂと称されるクローンの調製

【００９３】Ｓｈｉｈ（８）によって公開された技術か
ら誘導されたＰＣＲ技術を使用した。この技術は、ＤＮ
アーゼで反応媒体の全ての構成要素を処理することによ
りわずかな混入ＤＮＡの全てを除去することができる。
付随的に、異なるがオーバーラップするプライマーを二
つの連続したＰＣＲ増幅サイクルに用いることにより、
始めに少量であるとともに、ＲＮＡにおけるＤＮアーゼ
の妨害作用が働くことによって試料中でさらに減少した
ＲＮＡ量から合成されたｃＤＮＡを増幅する機会を増す
ことができる。実際に、ＤＮアーゼは、８５℃で１０分
間熱して、試料中に残ったこの酵素が不活性化する前に
全ての少量の混入ＤＮＡを除去することができるような
過剰な活性の条件下で用いられる。Ｓｈｉｈ（８）によ
って記載されたＰＣＲ技術のこの変形を、一方でＰＬＩ
−２系統（ＥＣＡＣＣＮｏ．９２０７２２０１）で生
成された“ＰＯＬ−２”単離物（ＥＣＡＣＣＮｏ．Ｖ
９２０７２２０２）、および一方でＭＳ７ＰＣ系統（Ｅ
ＣＡＣＣＮｏ．９３０１０８１７）で生成されたＭＳ
７ＰＧ単離物（ＥＣＡＣＣＮｏ．Ｖ９３０１０８１
６）からＨ．Ｐｅｒｒｏｎ（１４）によって記載された
技術に基づいてスクロース勾配で精製された感染性粒子
の画分の核酸から合成されたｃＤＮＡに用いた。これら
の培養物は、国際特許公開ＷＯ９３／２０１８８および
ＷＯ９３／２０１８９の主題をなす方法に基づいて得ら
れた。

【００９４】ＴＡクローニングキットを用いて上記技術
によって増幅した生成物をクローニングし、実施例１に
記載したオートマティック・シークエンサーを用いて配
列分析を行った後に、最新の利用可能なバージョンのジ
ーンバンクデータバンクでジーンワークスソフトウエア
を用いて配列を分析した。

【００９５】上記の試料からクローン化され、配列決定
された配列は、特に二つの型の配列に対応する：クロー
ンの大半（ＰＬＩ−２培養物のＰＯＬ−２単離物を起源
とするクローンの５５％、およびＬＭ７ＰＣ培養物のＭ
Ｓ７ＰＧ単離物を起源とするクローンの６７％）に見ら
れる第一の型の配列は、ＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−
９と称される内在性ヒトレトロウイルスに似ているが別
の“ｐｏｌ”配列のファミリーに対応しており、第二の
型の配列は、前にＭＳＲＶ−２と称された感染性及び／
又は病原性の作因に帰する配列に非常に強い相同性を有
する配列に対応する。

【００９６】クローンの大半を示す第一の型の配列は、
配列の可変性が、配列の４つのサブファミリーを定義す
ることができる配列からなる。ＨＩＶ−１レトロウイル
ス（１７）でよく知られているように、同じレトロウイ
ルスを起源とする類似の種である、あるいは生産細胞内
で共制御されたいくつかの内在性プロウイルスへの障害
となった結果であると見なすことができるため、これら
のサブファミリーは互いに十分に似ている。これらの多
かれ少なかれ不完全な内在性の構成要素は、内在性レト
ロウイルスの同一のファミリーに属することから（１
８）、複製し得るプロウイルスによって生成される同一
の制御シグナルに敏感である。内在性レトロウイルスの
この新規のファミリー、もしくは、類似の種の世代を培
養物中に得ることができ、以下の共通配列を含むレトロ
ウイルスのこの新規の種は、ＭＳＲＶ−１Ｂと称され
る。

【００９７】図２は、この実験で配列決定された種々の
ＭＳＲＶ−１Ｂの配列の一般的な共通配列を示してお
り、これらの配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５およびＳＥＱＩ
ＤＮＯ６に同定されている。これらの配列はジーンバ
ンク（商標）データベースにＸ５７１４７およびＭ３７
６３８に示されたＨＳＥＲＶ９配列と７０％〜８８％の
範囲の核酸の相同性を示す。これらの配列の系統樹は、
図３に示されている。この図において、サブファミリー
Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＭＳ７ＰＧおよびＰＯＬ−２単
離物から精製されたビリオンの純粋なＲＮＡ試料におい
て、繰り返し行われた類似の実験で優勢になった配列を
示している。これらの配列のファミリーから、おそらく
は外因性のレトロウイルスＭＳＲＶ−１Ｂの種々の類似
の種、もしくは外因性のレトロウイルスＭＳＲＶ−１Ｂ
の異なるサブファミリーを表す４つの“共通”核酸配列
が定義される。これらの代表的な共通配列は、アミノ酸
への翻訳とともに図４に示されている。機能的な読み枠
は、これらのＭＳＲＶ−１Ｂ配列の各サブファミリーに
対して存在し、機能的な読み取り枠が、それぞれの場合
において、核酸配列の下の二行目に示されたアミノ酸配
列に対応しているのがわかる。ＳＥＱＩＤＮＯ７に同
定され、“ｐｏｌ”領域におけるＰＣＲ技術によって得
られたＭＳＲＶ−１Ｂ配列の一般的な共通部分は、図２
に示されている。

【００９８】配列決定されたクローンの大半を示す第二
の型の配列は、図５に図示された配列ＭＳＲＶ−２Ｂに
示され、ＳＥＱＩＤＮＯ１１に同定されている。ＰＣ
Ｒプライマー間の増幅された領域は、実施例１に記載さ
れた、ＰＣＲプライマー間のＭＳＲＶ２−Ａ配列（図１
のＳＥＱＩＤＮＯ１０）と相同である。ＰＣＲプライ
マーに対応する配列に観察される違いは、種々の技術条
件下で用いられた混合形態における退化プライマーの使
用により説明される。

【００９９】配列ＭＳＲＶ−２Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ１
０）とＭＳＲＶ−２Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）とは、
明らかに相同、または等価でさえあり、同じ生物体から
誘導されたものであると共に、データバンクに既に記載
されたレトロウイルスの配列とは十分に異なるため、こ
の配列領域は、ＭＳＲＶ−２と称される新規の感染性の
作因に属すると考えられる。この感染性の作因は、原則
としては、得られた第一の配列の分析に基づいて、レト
ロウイルスに係るものであるが、この配列を得るために
用いた技術から、例えばＢ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ
（８）のように、逆転写酵素活性を付随的に備えた酵素
をコードするゲノムを備えたＤＮＡウイルスであるかも
しれない。さらに、このＰＣＲ増幅技術に用いられた退
化プライマーのランダムな性質は、予期せぬ配列の相同
性または関連する酵素の遺伝子に保存された部位によ
り、原核または真核の病原性及び／又は共感染性の作因
（原生生物）を起源とする核酸の増幅を非常によく行う
ことができる。

【０１００】実施例３：ＰＬＩ−２系から得られたビリ
オン調製物と内在性逆転写酵素を反応させることによ
る、レトロウイルスＭＳＲＶ−１を定義するクローンＰ
ＳＪ１７の調製

【０１０１】この試みは、これと同じ単離物に存在する
逆転写酵素活性を用いて、単離物中のおそらくはレトロ
ウイルスＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ配列を得ること
を意図したものである。この逆転写酵素活性は、理論的
には、プライマーｔＲＮＡに結合したレトロウイルスＲ
ＮＡの存在下、もしくはレトロウイルス粒子（１９）で
既に逆転写された短い鎖のＤＮＡとハイブリダイズした
ときのみに機能することができる。しかして、細胞性核
酸が混入した物質中の特定のレトロウイルス配列の調製
は、ウイルスの逆転写酵素活性でウイルスＲＮＡを特定
の酵素的増幅することにより、作者らによって最適化さ
れた。このため、作者らは、ウイルスに含まれるＲＮＡ
の逆転写のこの酵素活性が、ｉｎｖｉｔｒｏで効果的
になる、特別な物理化学的条件を決定した。これらの条
件は、以下に示した工程の技術的記載に対応する（内在
性ＲＴ反応、精製、クローニングおよび配列決定）。

【０１０２】分子的な試みは、ＰＬＩ−２系統の培養物
の上清から得られた濃縮されてはいるが未精製のビリオ
ンの調製物を用いることに本領があり、調製は以下の方
法に基づくものである：培養物の上清を毎週２度回収
し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで３０分
間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工程に用
いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２時間、
１０００００ｇ（またはタイプ４５ＴのＬＫＢ−ＨＩＴ
ＡＣＨＩローターで３００００ｒｐｍ）で３０％ＰＢＳ
−グリセロールの緩衝剤に遠心する。上清を除去した
後、沈澱物を少量のＰＢＳにとり、濃縮されてはいるが
未精製のビリオンの画分を構成する。濃縮されてはいる
が未精製のウイルス試料を、以下に記載するように、い
わゆる内在性逆転写酵素反応を行うために使用した。上
記の工程に基づいて精製され、約１−５百万ｄｐｍの逆
転写酵素活性を含む２００μｌのビリオンを、液相が現
れるまで３７℃で溶解し、氷上に移した。５倍に濃縮さ
れたバッファーを以下の組成で調製した：Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣｌｐＨ８．２，５００ｍＭ；ＮａＣｌ７５ｍＭ；Ｍ
ｇＣｌ₂ ２５ｍＭ；ＤＴＴ７５ｍＭおよび０．１０％
のＮＰ４０。１００μｌの５Ｘバッファー＋２５μｌの
ｄＡＴＰの１００ｍＭ溶液＋２５μｌのｄＴＴＰの１０
０ｍＭ溶液＋２５μｌのｄＧＴＰの１００ｍＭ溶液＋２
５μｌのｄＣＴＰの１００ｍＭ溶液＋１００μｌの滅菌
蒸留水＋２００μｌのＰＢＳ中のビリオンの懸濁液（Ｒ
Ｔ活性は５百万ＤＰＭ）を混合し、４２℃で３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、反応混合物
を、バッファー化されたフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール混合物（Ｓｉｇｍａ、照合番号Ｐ３
８０３）に直接添加し；水相を回収し、一定量の滅菌蒸
留水を有機相に加えて残留した核酸物質を再抽出する。
回収された水相を合わせて、３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ
５．２を１／１０体積＋２体積のエタノール＋１μｌの
グリコーゲン（Boehringer-Mannheim 参照番号９０１３
９３）を添加して、含まれている核酸を沈降させ、この
試料を−２０℃で４時間または＋４℃で一晩放置する。
遠心後に得られた沈澱物を、７０％エタノールで洗浄
し、６０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。この反応生成物
を、以下に記載した工程に基づいて精製、クローン化お
よび配列決定した：端部に対を形成していないアデニン
を備えた平滑末端ＤＮＡを生成した：“埋立”反応を最
初に行った：予め精製された２５μｌのＤＮＡ溶液を、
等モルのｄＡＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ＋ｄＣＴＰを含
有する２μｌの２．５ｍＭ溶液／１μｌのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（Boehringer-Mannheim 参照番号１００４７
８６）／５μｌの１０Ｘ“制限酵素用インキュベーショ
ンバッファー”（Boehringer-Mannheim 参照番号１４１
７９７５）／１μｌの１％ウシ血漿アルブミン溶液／１
６μｌの滅菌蒸留水と混合した。この混合物を、１１℃
で２０分間インキュベートした。この混合物に５０μｌ
のＴＥバッファーと１μｌのグリコーゲン（Boehringer
-Mannheim 参照番号９０１３９３）を添加し、核酸をフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉ
ｇｍａ、照合番号Ｐ３８０３）で抽出し、上述のように
酢酸ナトリウムで沈澱させた。遠心後のＤＮＡ沈澱物
を、１０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓバッファーｐＨ７．
５に再懸濁した。５μｌのこの懸濁物を、２０μｌの５
ＸＴａｑＤＮＡバッファー、２０μｌの５ｍＭｄＡ
ＴＰ、１μｌ（５Ｕ）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Ａｍｐｌｉｔａｑ^TM）および５４μｌの滅菌蒸留水と
混合した。この混合物を、溶液の表面上に油膜を張った
状態で７５℃で２時間インキュベートした。インキュベ
ーション後に油膜下の水溶液に懸濁されているＤＮＡ
を、上述のようにして沈澱させ、２μｌの滅菌蒸留水に
再懸濁した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングキッ
ト^TMを用いてプラスミドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶
液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮され
たリゲーションバッファー“１０Ｘリゲーションバッフ
ァー”、２μｌの“ｐＣＲ^TM ベクター”（２５ｎｇ／
ｍｌ）および１μｌの“ＴＡＤＮＡリガーゼ”と混合
した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートし
た。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（British
Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わり
に、培養し、かついわゆる“ミニプレップ（minipre
p）”操作（１６）に基づいて取り込まれたプラスミド
の抽出を行うために、組換えられたバクテリアの白色の
コロニーを回収した。各組換えコロニーから抽出された
プラスミドを、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲ
ルで分析した。ＴＡクローニングキットのクローニング
プラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプ
ライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、ゲルを
エチジウムブロミドに浸して、紫外線照射下で検出され
た挿入物を所有するプラスミドを、挿入物の配列決定の
ために選択した。次いで、配列決定の前の反応を、“プ
リズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオ
キシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キ
ット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）
の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定を
Applied Biosystemsの“オートマティック・シークエン
サー，モデル３７３Ａ”装置で、製造者の説明に従って
行った。

【０１０３】反応混合物中に存在するＤＮＡフラグメン
トからクローン化された配列のコンピューター化された
データバンクにおける識別により、レトロウイルス型の
配列が示された。対応するクローンＰＳＪ１７が、完全
に配列決定され、図８に示すＳＥＱＩＤＮＯ９に同定
され、得られた配列をデータバンク、最新の“ジーンバ
ンク”で“ジーンワークス”ソフトウエアを用いて分析
した。上述の配列は、データバンクの分析からは見いだ
すことができなかった。ある既知のレトロウイルスの構
成要素と、部分的のみの相同性が見いだされた。最も使
用できる比較的相同性は、参考文献（２０）に基づい
て、ＥＲＶ−９、またはＨＳＥＲＶ−９と称される内在
性レトロウイルスと関連している。

【０１０４】実施例４：クローン“ＰＯＬＭＳＲＶ−
１Ｂ”によって定義された５’領域とクローンＰＳＪ１
７によって定義された３’領域との間に含まれる核酸配
列のＰＣＲ増幅

【０１０５】５種のオリゴヌクレオチド、Ｍ００１、Ｍ
００２−Ａ、Ｍ００３−ＢＣＤ、Ｐ００４およびＰ００
５を、精製されたＰＯＬ−２ウイルスを起源とするＲＮ
Ａを増幅するために定義した。基準対照反応を、混入物
の存在をチェックするために行った（水での反応）。増
幅は、実施例２に記載した工程に従うＲＴ−ＰＣＲ段階
からなり、次いで欧州特許公開第０５６９２７２号公報
に記載のＰＣＲ工程に基づく“重ね合わせ”ＰＣＲを行
う。最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルにおいて、プライマー
Ｍ００１およびＰ００４またはＰ００５を用いた。第二
のＰＣＲサイクルにおいて、プライマーＭ００２−Ａま
たはＭ００３−ＢＣＤおよびプライマーＰ００４を用い
た。プライマーは、以下のように配置する。

【表１】

【０１０６】これらの組成物は、以下の通りである。

【化１】

【０１０７】得られた、Ｍ００３−Ｐ００４と称される
“重ね合わせ”増幅産物は図７に示され、これはＳＥＱ
ＩＤＮＯ８に対応する。

【０１０８】実施例５：逆転写酵素活性のピークで精製
されたウイルス試料における、既に同定された配列を用
いたＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの一部の増幅お
よびクローニング

【０１０９】Ｆｒｏｈｍａｎ（２１）によって公開され
た技術から導かれたＰＣＲ技術を用いた。この誘導され
た技術は、増幅されるゲノムの３’末端における特定の
プライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域への
配列の伸長を可能にする。この変形した技術は、上記の
ように精製されたビリオンの画分に使用される製品
“５'−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ^TM ＲＡＣＥＫｉｔ”
を提供する会社ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓＩｎｃ．，（Ｐａｌｏ−ＡｌｔｏＣａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ，ＵＳＡ）の文献に記載されている。

【０１１０】ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲ増幅用のキッ
トプロトコルで用いられた特定の３’プライマーは、そ
れぞれ以下のＭＳＲＶ−１配列に相補的である：

【化２】

【０１１１】ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法
（１６）に基づくアガロースゲルで精製した後に、１０
ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴
の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデ
ニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡ
クローニング^TMキット（British Biotechnology）を用
いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液
を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮された
リゲーションバッファー“１０Ｘリゲーションバッファ
ー”、２μｌの“ｐＣＲ^TM ベクター”（２５ｎｇ／ｍ
ｌ）および１μｌの“ＴＡＤＮＡリガーゼ”と混合し
た。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。
以下の段階を、ＴＡクローニングキット（British Biot
echnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、
培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（１６）に
基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、
組換えられたバクテリアの白色のコロニーを選択した。
各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制
限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクロ
ーニングキットのクローニングプラスミドに存在するＳ
ｐ６プロモーターの相補的なプライマーとハイブリダイ
ゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルを
エチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された
挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列
決定の前の反応を、“プリズム・レディー・リアクショ
ン・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル
・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、
照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によっ
て行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル
３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、
製造者の説明に従って行った。

【０１１２】この技術を、一方のＰＬＩ−２系統によっ
て生成された“ＰＯＬ−２”単離物、および一方のＬＭ
７ＰＣ系統によって生成されたＭＳ７ＧＰ単離物から、
スクロースで以下に記載するように精製されたビリオン
の二つの画分に最初に適用した：培養物の上清を毎週２
度回収し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで
３０分間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工
程に用いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２
時間、１０００００ｇ（またはタイプ４５ＴＬＫＢ−Ｈ
ＩＴＡＣＨＩローターで３００００ｒｐｍ）で３０％Ｐ
ＢＳ−グリセロールの緩衝剤に遠心する。上清を除去し
た後、沈澱物を少量のＰＢＳにとり、濃縮されてはいる
が未精製のビリオンの画分を構成する。濃縮されたウイ
ルスを、滅菌されたＰＢＳバッファー（１５〜５０％
重量／重量）におけるスクロース勾配に適用し、カップ
を具備したローターで＋４℃、１２時間３５０００ｒｐ
ｍ（１０００００ｇ）で超遠心した。１０個の画分を回
収し、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（７）に記載された技術に基づ
いて逆転写酵素活性を検定するために、ホモジェナイゼ
ーション後に各画分から２０μｌを取り出した。“ＬＭ
７型の”ＲＴ活性のピークを含む画分を滅菌したＰＢＳ
に希釈し、ウイルス粒子を沈澱させるために３５０００
ｒｐｍ（１０００００ｇ）で１時間超遠心した。得られ
た精製されたビリオンの沈澱物を、ＲＮＡの抽出に適し
た少量のバッファーに取り込む。上述のｃＤＮＡ合成反
応を、精製された細胞外のビリオンから抽出されたこの
ＲＮＡに対して行った。上述の技術に係るＰＣＲ増幅
は、クローンＦ１−１１を得ることを可能にし、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ２に同定されたこのクローンの配列が、図８
に示されている。

【０１１３】このクローンは、図９に示したように、以
前に配列決定された種々のクローンで、ＭＳＲＶ−１レ
トロウイルスの“ｐｏｌ”遺伝子を表す領域を定義する
ことができる。ＳＥＱＩＤＮＯ１と称されるこの配列
は、その端部が重複する種々のクローンから、全体の読
み枠を人為的に妨げる、プライマーおよび増幅産物に結
合した人為産物の調節もしくはクローニング技術によっ
て再構成される。

【０１１４】図９では、アミノ酸への翻訳と共に、可能
な読み枠が核酸配列の下に示されている。

【０１１５】実施例６：ＭＳＲＶ−２で感染した培養物
における、既に同定された配列を用いた一部のＭＳＲＶ
−２ゲノムの捕捉、増幅およびクローニング

【０１１６】Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（７）によって記載され
たものと類似する“ＬＭ７型の”逆転写酵素活性を発現
する細胞培養物の上清を、数週間定期的に回収し、１０
％のグリセロールを添加して−８０℃のディープフリー
ザー(deep-freezer)に保存した。上清を解凍し、超遠心
で感染粒子を濃縮し、かつスクロース勾配で平衡点まで
遠心して精製した；次いで逆転写酵素活性を、Ｈ．Ｐｅ
ｒｒｏｎによって記載された方法（１４）に基づき、勾
配で回収された種々の画分で測定した。

【０１１７】ＲＮＡの精製を意図した工程（１５）に基
づいて核酸を抽出するために、逆転写酵素活性のピーク
を示す異なる画分を集めたが、抽出された核酸は、ＤＮ
アーゼで処理しなかった。Ｓｈｉｈ（８）によって記載
された技術から誘導されたＰＣＲ増幅を、欧州特許公開
第０５６９２７２号公報記載のＲＮＡ増幅方法に基づい
てＤＮアーゼ非処理の核酸試料に直接行った。その全体
量は、１００μｌで、２００ｎｇのＲＮＡ、１μｌのＲ
ＮＡガード、およびＳｈｉｈ（８）によって記載された
直接（ＤＮＡ）のＰＣＲに使用されるものと同じ３３μ
ｍｏｌのプライマーの混合物（ＭＯＰ）を含有し、０．
２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０μｌの１０Ｘバッファー、
２．５ｕのＴａｑ酵素および０．４μｌのＲＴ酵素（Ｒ
Ｔ−ＡＭＶ；１０ｕ）を試料に添加する。増幅サイクル
は、以下のようにして行われる：ＲＮＡの変性６５℃／
１０分、ｃＤＮＡの合成５０℃／８分、次いでサイクル
は、Ｓｈｉｈ（８）によって記載されたＰＣＲと同じで
ある。対照基準の反応を、混入物が入っていないことを
チェックするために行った（水における反応）。精製物
を１０％アクリルアミドゲルで分析した。

【０１１８】次いで、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された
試料を、実施例１記載の技術に基づいてクローン化およ
び配列決定した。

【０１１９】ＲＴ−ＰＣＲ生成物から配列決定されたク
ローンの大半は、実施例１および２に記載したようにＭ
ＳＲＶ−２Ａ配列およびその等価物のＭＳＲＶ−２Ｂに
相当する。

【０１２０】さらに、人為的な配列を除去した後で、配
列決定された他のクローンは、実施例１および２に記載
されたＭＳＲＶ−１タイプの配列に対応することがわか
る。

【０１２１】少なくとも一部が逆転写酵素活性に関わ
る、感染性粒子を含むこれらの精製された画分に由来す
るこの核酸物質に存在する配列を確認した後、残りの核
酸物質を、実施例１および２に同定および記載したＭＳ
ＲＶ２配列を有する核酸の特定の取り込みを行うために
使用した。

【０１２２】前の段階において、ＭＳＲＶ２配列を有す
る遺伝的物質を、単一のプライマーを用いて５０サイク
ルの単一方向の(unidirectional)ＰＣＲ技術によって増
幅した。このプライマーは、３’末端でビオチン分子と
結合し、３’から５’への一方向増幅を行うことがで
き、ＳＥＱＩＤＮＯ３８に同定された以下の配列に対
応する。

【化３】

【０１２３】その後、アビジンと結合したマグネチック
ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を含む溶液で、製品（Ｄ
ｙｎａｌ）の説明書に従って捕捉し、ビオチンに結合し
ていない核酸を除去できるような温度で一連の洗浄を行
い、３’における特定のプライマーと、不規則な配列を
有する１０塩基（１０ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドの
溶液によって与えられる５’末端におけるプライマーを
用いてＰＣＲをこれらの洗浄されたビーズに直接行っ
た。

【０１２４】３’から５’の向きに配向された特定の増
幅プライマーは、ＳＥＱＩＤＮＯ１３に同定された配
列に相当する。

【化４】

【０１２５】これらのプライマーを用いて３５℃で４０
サイクル以上行ったＰＣＲは、第一のＰＣＲ段階で特別
にビオチン化され、Ｄｙｎａｂｅａｄｓのビーズに捕捉
された遺伝物質を増幅することができた。実施例１記載
の技術に基づいて、前記第二のＰＣＲ段階によって増幅
されたＤＮＡの“ＴＡクローニング”キット用いたクロ
ーニングおよび組換えクローニングの配列決定を行い、
７４８塩基対の配列が得られた。この核酸配列ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１２は、図１０に示されている。この伸長さ
れた配列を、後にＭＳＲＶ−２ＥＬ１と称する。

【０１２６】プライマーＳＥＱＩＤＮＯ１３に相補的
な逆の配列が３’端に存在し、図１０において四角で囲
まれている。このプライマーの上流に、ＭＳＲＶ−２Ａ
およびＭＳＲＶ−２Ｂクローンに既に同定された配列が
見られる。

【０１２７】６つの可能な読み枠に基づいたこの配列の
アミノ酸への翻訳は、図１１、図１２および図１３に示
されている。

【０１２８】ＭＳＲＶ−２ＥＬ１配列（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１２）でのＭＳＲＶ２−Ａ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１
０）の整列を図１４に示す。ＭＳＲＶ−２Ａを得るため
に用いられた退化プライマーに対応する領域にいくつか
の差異が見られること以外は、ＭＳＲＶ−２Ａ配列は、
伸長された配列と厳密に同じであることに注意すべきで
ある。この領域は、この図では下線が施されており、さ
らにプライマーＳＥＱＩＤＮＯ１３（クローニングの
尾部とは別）のハイブリダイゼーション領域は四角で囲
んであり、プライマーＳＥＱＩＤＮＯ１４のハイブリ
ダイゼーション領域は［］の中に示されている。この領
域のＭＳＲＶ−２ゲノムの真の配列は、ＭＳＲＶ−２Ａ
（およびＭＳＲＶ−２Ｂも同様）の場合のように、厳密
性の低いハイブリダイズされたプライマーによらない、
ＭＳＲＶ−２ＥＬ１のものであろう。

【０１２９】従って、ＭＳＲＶ−２ＥＬ１配列は、ＭＳ
ＲＶ−２ゲノムの新規に配列決定された領域に対応す
る。これは、本実施例に記載されたクローニングに使用
された核酸における特定の増幅を行う、ＭＳＲＶ−２Ｅ
Ｌ１およびＭＳＲＶ−２Ａに定義された新規のＰＣＲプ
ライマーを用いて確認された。

【０１３０】ＭＳＲＶ−２ＥＬ１配列に係る、１９９４
年８月に行ったジーンバンクデータバンクの疑問の結果
は、既知の遺伝子配列との重要な相同性を全く示さなか
った。しかしながら、このＭＳＲＶ−２ＥＬ１配列の６
つの可能な読み枠に基づくアミノ酸への可能性のある翻
訳の疑問は、バクテリア、ウイルスもしくは細胞の配列
と部分的な相同性を示した。

【０１３１】正常のヒトＤＮＡへの特定のプライマーで
のＰＣＲ増幅の欠如は、この配列が細胞由来のものでは
ないことを示している。このため、ＭＳＲＶ−２は、ヒ
トにとって外的な感染性の作因である。しかしながら、
ＭＳＲＶ−２ＡおよびＭＳＲＶ−２Ｂと称される第一の
配列の要素を同定することを可能にした、Ｓｈｉｈ
（８）によって記載された技術の多用性に基づいて用い
られたプライマーの混合物の退化した特徴が、レトロウ
イルスまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコード
する遺伝子に属さないゲノムを予期せず増幅する。

【０１３２】実施例７：慢性関節リウマチを患う患者の
関節流体(articular fluids)の細胞の培養および培養Ｌ
Ｍ７の産生物に類似した転写活性の検出

【０１３３】関節流体（ＡＦ）を、慢性関節リウマチを
患う患者の炎症した膝関節から、無菌状態で採取した。
この流体を１８００ｒｐｍ、＋４℃で１０分間遠心し
た。上清を除き、−８０℃で各画分に分けた後、細胞ペ
レットを以下の組成のＲＰＭＩ培養液；ペニシリン（２
０００００Ｕ／Ｌ）、ストレプトマイシン（２００ｍｇ
／Ｌ）、Ｌ-グルタミン（６ｍＭ／ｌ）、ピルビン酸塩
(pyruvate)（１％）、非必須アミノ酸（１％）、任意に
抗ヒトβ-インターフェロンポリクローナル抗体（１０
Ｕ／ｍｌ）、および３０分間５６℃でインキュベートし
て不完全化(decomplemented)した２０％ウシ胎児血清を
含有するＲＰＭＩ１６４０培地に取り込んだ。懸濁液の
細胞を小型培養フラスコ（２５ｃｍ³）に移し、体積を
上記培地で５ｍｌまで増やし、細胞を、オーブンで５％
のＣＯ₂および３７℃の条件下でｉｎｖｉｔｒｏで培養
した。

【０１３４】４日後、培地を同じ組成の新鮮な培地で置
換し、培地を採取し、１８００ｒｐｍで１０分間遠心し
た。上清を、各画分に分け、−８０℃に保存した；培養
フラスコに付着していない細胞からなるペレットを培地
に取り込み、他のフラスコに移した。これらの細胞を、
細胞懸濁液として培養液に維持した。

【０１３５】培養液は、週に少なくとも２度交換した。

【０１３６】３週間培養した後、病因性関節流体の細胞
の第一のパッセージ(passage)を行ったフラスコは、有
糸分裂の“範囲(range)”による増殖を示すマクロファ
ージ型および他の繊維芽細胞型の付着細胞を含む。これ
らの増殖範囲は、徐々に培養フラスコの下方表面をカバ
ーし、集密的段階において、これらの繊維芽細胞をかき
集めて検出し、５ｍｌの培地を有する２５ｃｍ³の二つ
のフラスコに分けた。次いで、これらの付着細胞をパス
し、増殖可能性と同じくらいの頻度で分けた。実際に、
６回目のパッセージの後、すなわち約２ヶ月間培養した
後、繊維芽細胞は増殖を停止し、細胞が退化(degenerat
e)するまでフラスコを保存した。

【０１３７】懸濁液中の細胞をパスするために用いられ
たフラスコ内で、主にリンパ系の細胞、マクロファージ
型もしくは繊維芽細胞型の付着細胞が、遅い段階で付着
することがある。懸濁液のリンパ系細胞は、増加するこ
となしに退化し、３週間後の培養液には維持されていな
かった。

【０１３８】上記フラスコ全体の培養上清を、−８０℃
で、各画分に分けて貯蔵した。

【０１３９】ＲＡを患う患者の上記の病因性関節流体の
細胞によって産生されたレトロウイルス性の作因の調査
は、多発性硬化症の神経系細胞の培養の上清における逆
転写酵素活性の研究（７）のために、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ
らによって成されたような、未知のレトロウイルスによ
ってコードされた酵素の非選択的検出するための種々の
物理化学的条件に従って逆転写酵素活性を調べることで
ある。慢性関節リウマチ（ＲＡ）の場合のＡＦの細胞の
培養上清における逆転写酵素活性に特異的なシグナルを
検出する条件を、多発性硬化症（ＭＳ）の場合から得ら
れる培養ＬＭ７によって産生されるレトロウイルスの検
出に最適な条件と非常に類似したものにした。ＲＡのＡ
Ｆの培養上清から得られた粒子の濃度の平衡まで、スク
ロース勾配で沈降を行った後に、ＭＳで単離されたレト
ロウイルスＭＳＲＶ１／ＬＭ７と同じ条件でこの活性が
検出できるかどうか確かめようとした。

【０１４０】全体量が少なくとも１００ｍｌ使用できる
よう、ＲＡのＡＦの付着細胞の一連の培養液上清を解凍
した。これらの上清を混合し、細胞の破片を除去するた
めに予備的遠心を行い、可能性のあるレトロウイルスの
粒子を沈降させるために超遠心を行い、沈降したペレッ
トをスクロース勾配に移した。超遠心ペレットに存在す
る成分を分離し、等量および増加するスクロース密度の
画分を回収した後でこれらの各画分の逆転写酵素活性を
アッセイするために、前記スクロース勾配を１００００
０ｇで遠心した。上記操作の全てを、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ
（１４）に記載された条件下で行った。

【０１４１】“ＲＡ”勾配の画分における、ＬＭ７株に
適した条件を用いた逆転写酵素活性のアッセイの結果を
図１５に示す。十分な逆転写酵素活性（２０００ｄｐｍ
のカットオフ(cut-off)より大きい）が、画分２〜５お
よび画分９に見られることがわかる。最も低い密度の画
分に見られる活性はほとんど集密化されていないが、こ
れは勾配に載せた物質が過剰であったためと思われる
（５ｍｌチューブ）。より集密化された画分（Ｎｏ．
９）の第二のピークは、ＬＭ７系で産生されたビリオン
で調製された勾配において既に観察されているように
（１４）、エンベロープ（キャプシド）を失ったより密
度の高いビリオンからなると考えられる。

【０１４２】ＲＡに由来するＡＦの細胞培養で行われた
研究のこの段階では、これらの細胞が、ＭＳの軟膜ＬＭ
７細胞によって産生されたビリオンに検出されるものと
同型の逆転写酵素を備える粒子を産生するように思われ
る。

【０１４３】実施例８：慢性関節リウマチ（ＲＡ）の患
者のリンパ芽球Ｂ細胞の培養

【０１４４】当業者に良く知られた工程に従い、エプス
タイン・バールウイルス（ＥＢＶ）のｉｎｖｉｔｒｏ
での添加により、あるいは患者のＢリンパ球にかくまわ
れた自己の株によって不死化したリンパ芽球系を、ＲＡ
の患者の末梢血液のＢリンパ球から確立した。

【０１４５】簡潔に、単核性の(mononucleate)血液細胞
を、Ficoll-Hypaque勾配（Flow/ICN）で遠心して分離
し、ＲＰＭＩ１６４０で遠心して洗浄してから、ペニシ
リン（２０００００Ｕ／Ｌ）、ストレプトマイシン（２
００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ-グルタミン（２ｍＭ／ｌ）、ピル
ビン酸塩（１％）、非必須アミノ酸（１％）、ＨＥＰＥ
Ｓバッファー（１％）および３０分間５６℃でインキュ
ベートして不完全化した２０％ウシ胎児血清を含有する
ＲＰＭＩ１６４０培地に取り込んだ。懸濁液中の上記細
胞を、小型培養フラスコ（２５ｃｍ³）に移し、体積を
上記培地で５ｍｌまで増やし、細胞を、オーブンで５％
のＣＯ₂および３７℃の条件下でｉｎｖｉｔｒｏで培養
した。

【０１４６】培地は、一週間に二度、半分だけ交換す
る：フラスコを少なくとも２時間垂直に配置した後、上
清培地の半分を除去し（ライン(line)が確立されたら直
ぐに−８０℃のディープフリーザーに保管し）、沈降し
たリンパ球を分散させる新鮮な培地に置換する。ライン
が確立され、フラスコの細胞密度が十分となったら、ピ
ペットで分散された細胞を二つのフラスコに分け、培養
を分割する。

【０１４７】培養からのＴリンパ球の阻害および除去を
行うため、フィコール(Ficoll)での分離後、リンパ系細
胞を１０〜２０日間シクロスポリンＡの存在下に移す。
この理由は、これらのリンパ球がＥＢＶウイルスによる
培養中に存在するＢリンパ球の不死化をブロックする能
力を備えているからである。

【０１４８】各ケースごとに、シクロスポリンＡで処理
した後に、患者自身が保有するＥＢＶ株によるＢ細胞の
不死化の可能な発現を待つように（患者がこのウイルス
にセロポジティブである場合）培養を維持するか、ある
いは、ＥＢＶ株Ｂ９５でＢリンパ球を強力に感染させる
ため、並びに少数のＢクローンをずっと多く不死化する
ために、ＥＢＶビリオンを産生するラインＢ９５の１ｍ
ｌの上清を、ホルボールの酪酸エステルで誘発した後、
培養フラスコに添加する。

【０１４９】上清にリンパ球を含有するフラスコを少な
くとも３ヶ月間培養中に維持し、その間に、培地に浮遊
している細胞の“クラスター”として増殖する不死化し
たＢリンパ球クローンの発現を、光学顕微鏡(light-opt
ical microscope)で観察する。

【０１５０】ＲＡ患者からリンパ芽球ラインが確立され
たら、それらを規則的に分け、連続培養で維持する。培
地を補充する際の週に二度回収した上清を、上清分析、
すなわち逆転写酵素活性、培地のＢ細胞によって発現さ
れた病原性および／または感染性の作因のゲノムのＰＣ
Ｒ検出等のために−８０℃で冷凍する。ＲＡに係る病原
性および／または感染性の作因を現しかつ特徴決定する
ために、これらの培養物を用いることを以下の実施例に
示す。

【０１５１】実施例９：ＲＡの滑液またはリンパ芽球ラ
インの細胞培養から精製された病原性および／または感
染性の作因の調製におけるＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の保存されたＰＯＬ領域の増幅によるクローン
ＭＳＲＶ−２およびＭＳＲＶ−１の産生

【０１５２】実施例１のように、分子的試みは、Ｓｈｉ
ｈのＰＣＲ技術（８）を用いることからなり、この技術
によれば、外因性および内因性のレトロウイルスや、特
にヘパチチスＢ(hepatitis B)ウイルスおよび、暗に、
用いた増幅プライマーによって定義された領域に十分な
配列相同性を備えたあらゆるＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼまたは酵素の遺伝子のウイルス等の逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）活性を備えた酵素をコードするウイルスのｐｏｌ遺
伝子の比較的保存された領域を増幅することができる。
このＰＣＲ技術は、実施例７に記載された工程に従って
得られた慢性関節リウマチ（ＲＡ）のケースからの病理
学的な関節流体（ＡＦ）の細胞培養の上清からＰｅｒｒ
ｏｎＨ．（１４）によって記載された工程に従って勾
配で精製された感染性の作因の調製から抽出された核酸
に用いられた。ＬＭ７株（７）用に最適化された条件に
従って測定されたＲＴ活性のピークを含む画分を、グア
ニジンチオシアナートを含む１ボリュームのバッファー
に取り込み、ＣｈｏｍｚｙｎｓｋｉＰ．（１５）によ
って記載された技術に従って核酸を抽出するまで、−８
０℃に保存した。

【０１５３】ＰＣＲ反応の前に、製造者の説明に従っ
て、最も近いログファクターに対する、試料中のＲＮＡ
の量の近似値に基づいて、試料中のＲＮＡを“ｃＤＮＡ
合成システムプラス”キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用
いて、いわゆる“ランダム”プライマー（混合されたヘ
キサヌクレオチド）を備えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
に翻訳した。選択的に、ｃＤＮＡの合成を、欧州特許公
開第０５６９２７２号公報に記載された一段階の“ＲＴ
−ＰＣＲ”法に基づいてＰＣＲ用に用いられたプライマ
ーの存在下で直接的に行うことができる。

【０１５４】ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後に得られたＤＮＡ
を、ＴＡクローニングキット(British Biotechnology)
を用いてプラスミドに挿入し、実施例１および２に記載
された工程に従って選択、抽出および配列決定した。

【０１５５】得られた配列を、核酸配列のコンピュータ
ー化されたデータバンク、ジーンバンクで、マックベク
ターおよびジーンワークスといったソフトウエアを用い
て分析し、核酸配列の読み枠から推定されるアミノ酸配
列をスイスプロット（SwissProt）コンピューター化さ
れたデータバンクで分析した。ＲＡのＡＦの細胞培養の
解凍された上清に由来する逆転写酵素活性のピークで沈
降する粒子の試料から得られた配列の分析は、二つの型
の配列を示した：クローンの少数に見られる第一の型の
配列は、以前にＭＳ患者から単離および特徴付けされた
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの等価“ｐｏｌ”領域と十
分な相同性を備えた配列に対応し（仏国特許出願９２０
４３２２、９２１３４４７、９２１３４４３、９２０１
５２９、９４０１５３０、９４０１５３１および９４０
１５３２）、第二の型の配列は、以前にＭＳ患者から単
離および特徴付けされたＭＳＲＶ−２と称される感染性
および／または病原性の作因に起因する配列と非常に高
度に相同性を有する配列に対応する、クローンの多数に
見られる（仏国特許出願９２０４３２２、９２１３４４
７、９２１３４４３、９２０１５２９、９４０１５３
０、９４０１５３１および９４０１５３２）。

【０１５６】ＲＡのＡＦの細胞培養によって産生された
ウイルス性物質から増幅およびクローン化されたＭＳＲ
Ｖ−１型の配列（クローン“ＭＳＲＶ１ｐｏｌＰＲ”、
ＳＥＱＩＤＮＯ３９）と、ＭＳ患者の細胞によって産
生されたビリオンからクローン化されたＭＳＲＶ−１参
照配列との比較を、図１６に示す。

【０１５７】ＲＡのＡＦの細胞培養によって産生された
感染性物質から増幅およびクローン化されたＭＳＲＶ−
２型の配列（クローン“ＭＳＲＶ２ｓＰＲ”、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４０）と、ＭＳ患者の細胞によって産生された
感染性物質からのＭＳＲＶ−２参照配列との比較を、図
１７に示す。

【０１５８】Ｓｈｉｈら（８）の“逆転写酵素”退化プ
ライマーで見出された二つの型の配列は、脈絡ギョウ(c
horoid plexus)または種々のＭＳ患者を起源とするＢリ
ンパ芽球ラインの軟膜細胞培養における類似した条件下
で見出されるものに正確に対応している（仏国特許出願
９２０４３２２、９２１３４４７、９２１３４４３、９
２０１５２９、９４０１５３０、９４０１５３１および
９４０１５３２）。

【０１５９】実施例１０：特異的ＰＣＲプライマーおよ
びＥＬＯＳＡ技術に従う特異的ハイブリダイゼーション
を用いた、細胞培養の上清および直接的にＲＡ患者の生
物学的流体中のＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ−２の存在
の検出

【０１６０】いくつかのＰＣＲ技術を用いて、ＲＡ患者
および他のリウマチ疾患（ＲＡではない）の患者の細
胞、血漿および関節流体の培養の上清におけるＭＳＲＶ
−１およびＭＳＲＶ−２を検出した。

【０１６１】回収後−８０℃でディープフリーザーに保
存した１ｍｌの培養上清または血漿にグアニジウムチオ
シアナートを含有するバッファーを一体積添加した後
に、血漿および培養上清のＲＮＡの抽出をＰ．Ｃｈｏｍ
ｚｙｎｓｋｉ（１５）によって記載された技術に従って
行った。

【０１６２】関節流体（ＡＦ）および単核性血液細胞
（リンパ球および単球）のＲＮＡの抽出を、以下の工程
に従って行った：溶液の全てを、微量のＲＮＡアーゼの
全てを取り除くためにＤＥＰＣで処理した蒸留水中に調
製した；ＡＦの５００μｌ〜１ｍｌを解凍し、これに、
２０％ＳＤＳ溶液の１／１００体積を、ＡＦ１ｍｌ当た
り７μｌの割合のプロテイナーゼＫ溶液と共に添加す
る；この液体を短くボルテックスし、ＲＮＡｓｉｎ（Bo
ehringer）またはＲＮＡガード（Pharmacia）の添加後
３７℃でインキュベートする；１時間インキュベートし
た後、Chomzynski（１５）の１ボリュームのＧＵＴバッ
ファーを添加し、混合物を直ちにボルテックスする。次
いで、混合物中に存在するＲＮＡを、Chomzynski（１
５）に記載された上記工程に従って抽出する。

【０１６３】ＭＳＲＶ２の検出のために、配列ＭＳＲＶ
−２ＥＬ１（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）は、ＰＣＲ技術に
よって特定のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するのに用いら
れるいくつかのペアのオリゴヌクレオチドプライマーを
定義することができる。

【０１６４】以下に定義された最初のペアのＭＳＲＶ２
プライマーは、欧州特許公開第０５６９２７２号公報に
記載されたＲＮＡ増幅工程に従って一回のＰＣＲまたは
ＲＴ−ＰＣＲによって、種々のヒト細胞におけるＭＳＲ
Ｖ−２ゲノムの特定の検出を成すことを可能にする。

【０１６５】使用されたプライマーは以下のものであ
る：５’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ１４に同定され
たもの

【化５】３’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ１５に同定されたも
の

【化６】

【０１６６】ｃＤＮＡ合成段階後、ＰＣＲを、一連の３
５鎖合成サイクル(chain-buildingcycles)、９４℃で１
分間、５４℃で１分間および７２℃で１分間行う。

【０１６７】この例のために、ＤＮアーゼで処理せずに
種々の細胞の型から抽出した全ＲＮＡ（１５）を、この
ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いて、ＲＮＡに富んだ核酸抽出物
における病原に特異的なＲＮＡおよびＤＮＡの検出を行
った。我々の実験では、ＭＳＲＶ２に特異的なＤＮＡ
が、通常にＲＮＡの抽出を意図した上記工程に従って抽
出された核酸中に、容易に検出され得ることが示され
た。

【０１６８】ＲＡ患者の関節流体の培養細胞からのＰＣ
ＲプライマーＳＥＱＩＤＮＯ１４とＳＥＱＩＤＮＯ
１５を用いてこの技術に従って増幅されたクローン“Ｍ
ＳＲＶ２ｃＰＲ”の配列を、図１８に示す。図１９およ
び図２０ならびに図２１は、ＭＳＲＶ２ヌクレオチド配
列ＳＥＱＩＤＮＯ１０およびＳＥＱＩＤＮＯ１２を
それぞれ有するクローン“ＭＳＲＶ２ｃＰＲ”、ＭＳ患
者から得られたクローンの配列の並びを示す。ＲＡまた
はＭＳの試料から得られた配列が、非常に相同であるこ
とが観察される。

【０１６９】二つの連続した工程のＰＣＲ（“ネスティ
ド(nested)”ＰＣＲと呼ばれる）もしくは欧州特許公開
第０５６９２７２号公報に記載されたＲＮＡ増幅工程に
従うＲＴ−ＰＣＲによって、以下に定義するＭＳＲＶ２
プライマーの新規のペアは、患者の種々の生物学的流体
のＭＳＲＶ−２ゲノムの特定の検出を成すことを可能に
した。ＭＳＲＶ−２配列を生物学的試料におけるＲＮＡ
またはＤＮＡの形態で検出することができる。

【０１７０】この“ネスティド”ＰＣＲは、記載されて
おり、ＤＮアーゼで処理されていない方法に従って、抽
出された核酸試料で行われる。

【０１７１】４８℃のハイブリダイゼーション温度を備
えた４０サイクルの第一段階に使用されるプライマー
は、以下のものである：５’プライマー、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４４に同定されたもの

【化７】３’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ１５に同定されたも
の

【化８】

【０１７２】この工程の後、１０μｌの増幅産物を回収
し、既に増幅された領域内に位置するプライマーで第二
のいわゆる“ネスティド”ＰＣＲ増幅を行うために使用
した。この第二工程は、５０℃のプライマーハイブリダ
イゼーション温度（“アニーリング”）で、３５〜４０
サイクルにわたって行う。反応量は、１００μｌであ
る。

【０１７３】第二の工程に用いられるプライマーは以下
のものである。５’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ４５
に同定されたもの

【化９】３’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ４６に同定されたも
の

【化１０】

【０１７４】上記“ネスティドＰＣＲ”技術に従って行
われた一連のＭＳＲＶ−２ＰＣＲで得られた結果は、
この明細書に添付された表IIに示されている。

【０１７５】ＭＳＲＶ−１用に、ｃＤＮＡ合成前に、増
幅を二つの工程（“ネスティド”ＰＣＲ）で行った。さ
らに、ＲＴ−ＰＣＲ増幅がＭＳＲＶ−１ＲＮＡにかな
り由来するものであることを確認するために、核酸試料
をＤＮアーゼで前処理し、ＲＴの無いＰＣＲコントロー
ル（ＡＭＶ逆転写酵素）を二つの増幅工程で行う。陽性
ＲＴの無いコントロールの場合には、各画分に分けられ
るＲＮＡの出発試料を、ＤＮアーゼで再度処理し、再度
増幅する。

【０１７６】ＲＮアーゼ活性の無いＤＮアーゼを用いた
処理の工程は、以下の通りである：抽出ＲＮＡを、１０
μｌ中に１μｇの終濃度となるまで、ＤＥＰＣ処理した
水中に“ＲＮアーゼ阻害剤”(Boehringer-Mannheim)が
存在する条件下で各画分に分ける；この１０μｌに、１
μｌの“ＲＮアーゼ・フリー・ＤＮアーゼ(RNase-free
DNase)”(Boehringer-Mannheim)と、０．１Ｍ／ｌの酢
酸ナトリウムおよび５ｍＭ／ｌのＭｇＳＯ₄を含むｐＨ
５の１．２μｌのバッファーとを添加する；この混合物
を１５分間、２０℃でインキュベートし、“サーモサイ
クラー(thermocycler)”で１．５分間９５℃に維持し
た。

【０１７７】ＭＳＲＶ−１ＲＴ−ＰＣＲの最初の工程
を、欧州特許公開第０５６９２７２号公報に記載された
ＲＮＡ増幅工程の変形に従って行うことができる。特
に、ｃＤＮＡ合成の段階は、４２℃、１時間で行われる
が、ｃＤＮＡ合成は以下の方法で行うことが好ましい：
ＤＮアーゼで処理し、氷上に維持したＲＮＡを、６５
℃、１０分間加熱する、次いで直ちに氷中に入れる；次
いでＰＣＲ用のサーモサイクラー中で４２℃に維持し
た、１ｘＰＣＲバッファーに１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、
２５０μＭの各ｄＮＴＰ、３００−４００ｎＭの各プラ
イマー（ＰＣＲの第一工程の５’および３’）、１０ユ
ニットのＲＴ−ＡＭＶおよび２．５ユニットのＴａｑを
含み、最終的な体積が１００μｌとされた混合物に添加
する；この混合物を４２℃で１〜２時間維持し、ＲＴ−
ＡＭＶを変成するために９５℃で５分間維持する。次い
で、５３℃、１分間のプライマーのハイブリダイゼーシ
ョン段階（アニーリング）、７２℃、２〜３分間の伸長
段階および９５℃、１分間のＤＮＡの変成段階を備えた
ＰＣＲ増幅サイクルを開始し、４０サイクル以上続け
た。

【０１７８】この最初の段階に用いられたプライマー
は、以下の通りである。５’プライマー、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１６に同定されたもの

【化１１】３’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ１７に同定されたも
の

【化１２】

【０１７９】この段階の後に、１０μｌの増幅生成物を
得て、既に増幅された領域内に位置したプライマーで第
二のいわゆる“ネスティド”ＰＣＲ増幅を行う。このＰ
ＣＲ増幅サイクルは、５３℃、１分間でプライマーのハ
イブリダイゼーション段階（“アニーリング”）、７２
℃、１〜２分間で伸長段階および９５℃、１分間でＤＮ
Ａ変成段階を備えており、３５〜４０サイクル行う。反
応混合物の組成物は、ＲＴ−ＡＭＶを添加することを除
いて前述の段階と同じである。

【０１８０】この第二の段階に用いたプライマーは、以
下のものである。− ５’プライマー、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１８に同定されたもの

【化１３】 − ３’プライマー、ＳＥＱＩＤＮＯ１９に同定され
たもの

【化１４】

【０１８１】ＲＡ患者の関節流体のＲＮＡから、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１６とＳＥＱＩＤＮＯ１７のＰＣＲプライ
マー、次いでＳＥＱＩＤＮＯ１８とＳＥＱＩＤＮＯ
１９を用いた上述の技術に従って増幅されたクローン
“ＭＳＲＶ１ｎＰＲ”の配列を図２２に示す。図２３お
よび図２４は、ＭＳ患者で得られた参照のクローンのＭ
ＳＲＶ１ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ０１を備え
たクローン“ＭＳＲＶ１ｎＰＲ”の配列の並びである。
ここでもまた、ＲＡまたはＭＳの配列が、非常に相同的
であることがわかる。

【０１８２】これまで、ＲＡの試料から上記ＰＣＲ技術
に従って増幅された他のＭＳＲＶ１およびＭＳＲＶ２配
列も、ＭＳ患者で得られた配列と同一または相同である
ことが示された。

【０１８３】上記ネスティド“ＲＴ−ＰＣＲ”技術に従
って行われた一連のＭＳＲＶ−１ＰＣＲでは、本明細書
に添付した表Ｉに示す結果が得られた。

【０１８４】しかして、ＭＳＲＶ−１レトロウイルス性
ゲノムおよびＭＳＲＶ−２ゲノムは、ＲＡ患者の生物学
的流体の試料中に確かに確認された。より広い範囲で得
られた他の結果は、これらの結果を確実にするものであ
る。

【０１８５】さらに、上記ＰＣＲ技術で増幅された配列
の特異性は、F. Mallet(22)によって並びに仏国特許出
願第２６６３０４０号に記載された“ＥＬＯＳＡ”技術
によって確認および評価することができる。

【０１８６】ＭＳＲＶ−１では、上記ネスティドＰＣＲ
の産物は、ＭＳＲＶ−１の共通配列Ａおよび共通配列Ｂ
＋Ｃ＋Ｄを分けて検出することが可能な二つのＥＬＯＳ
Ａシステムで試験することができ、実施例２および図
２、３および４に記載されたサブファミリーに対応す
る。共通配列Ａに類似した配列が、正常なヒト細胞性Ｄ
ＮＡに必須に見出されるが、共通配列Ｂ＋Ｃ＋Ｄに類似
した配列は、培養から精製された、あるいはＲＡもしく
はＭＳ患者の細胞外生物学的流体で増幅されたＭＳＲＶ
−１ビリオン由来のＲＮＡ試料中に必須に確かに見出さ
れる。

【０１８７】サブファミリーＡのＰＣＲ産物の捕獲およ
び特異的ハイブリダイゼーションのＥＬＯＳＡ／ＭＳＲ
Ｖ−１システムは、仏国特許公開第２６６３０４０号公
報に記載された技術に従って結合した５’アミンを備え
た捕獲オリゴヌクレオチドｃｐＶ１Ａと、仏国特許公開
第２６６３０４０号公報に記載された技術に従ってペル
オキシダーゼと連結した（もしくは任意にビオチンに連
結した）検出オリゴヌクレオチドｄｐＶ１Ａを用いる。
これらはそれぞれ以下の配列を有する：

【化１５】

【０１８８】サブファミリーＢ＋Ｃ＋ＤのＰＣＲ産物の
捕獲および特異的ハイブリダイゼーションのためのＥＬ
ＯＳＡ／ＭＳＲＶ−１システムは、上記の技術に従って
ペルオキシダーゼに連結した（または任意にビオチンに
連結した）同じ検出オリゴヌクレオチドｄｐＶ１Ａ、お
よび以下の配列

【化１６】を備えた上記技術に従って結合した５’アミンを備えた
捕獲オリゴヌクレオチドｃｐＶ１Ｂを用いる。

【０１８９】表Ｉでわかるように、このような技術を、
種々のリウマチ性疾患の患者の生物学的流体の増幅ＰＣ
Ｒ産物に適用した：ＢＥＴで標識したアガロースゲルで
検出できる予想されたサイズの増幅されたＤＮＡバンド
を有する全てのＲＡ患者は、Ｂ＋Ｃ＋Ｄ型のＭＳＲＶ１
に陽性であり、ＭＳＲＶ１−Ａに陰性であった；一人の
非ＲＡコントロールのみが、ＢＥＴで標識されたゲル上
で見える、視覚的に正しいサイズの増幅されたバンドを
備えていた；他の非ＲＡコントロールのＰＣＲ産物の全
てとともに、対応するＰＣＲ産物は、ＥＬＯＳＡＭＳ
ＲＶ１−ＡおよびＭＳＲＶ１−ＢＣＤで陰性であること
がわかった；この増幅産物のクローニングおよび配列決
定後、ＭＳＲＶ１と無関係の人為的配列に対応している
ことがわかった。

【０１９０】上述のネスティドＲＴ−ＰＣＲと連結した
ＥＬＯＳＡＭＳＲＶ１技術は、患者の生物学的流体に
おけるレトロウイルスＭＳＲＶ１の非常に敏感で非常に
特異的な検出試験を行うことを可能にする。

【０１９１】ＭＳＲＶ−１および／またはＭＳＲＶ−２
の感染および／または再活性化(reactivation)の診断並
びに患者の生物学的流体におけるこれらの作因の検出を
“無効にする”効果に基づいたＲＡの治療を評価するこ
とは、成された発見および慢性関節リウマチの範囲内で
本発明者らが開発した方法により想到できる。さらに、
まだＲＡのリウマチ性の徴候を示していない個人におけ
る早期の検出は、関節の攻撃の様相に対応した損傷の段
階に先立つほど、比例的に次の診療の進展に効果的であ
る治療を行うことを可能にする。これまでＲＡの診断
は、炎症または病変の症候学の開始前に確立されず、関
節の攻撃の既に顕著な診療徴候が現れる前には治療はな
にも開始されない。

【０１９２】ヒトにおけるＭＳＲＶ−１および／または
ＭＳＲＶ−２の感染および／または再活性化の診断は、
ファクターを調べることであり、本発明は、関係する神
経学的（ＭＳ）またはリウマチ性（ＲＡ）症候の範囲
内、もしくは選択的に症候前またはまだ良く特徴がわか
っている病状まだ関連づけられていない感染／再活性化
の範囲内の両方の診断方法を提供する。

【０１９３】しかして、ＭＳＲＶ−１及び／又はＭＳＲ
Ｖ−２の感染及び／又は再活性化の診断を行うこととは
別に、患者の生物学的流体における上記作因の検出を
“無効にする(negate)”効果に基づいてＭＳ、ＲＡもし
くは他のあらゆる関連性疾患の徴候における治療法を検
討することができる。

【０１９４】表ＩＥＬＯＳＡ技術に従うハイブリダイゼーションで行った
ＰＣＲによる、ＲＡおよび他のリウマチ性疾患の患者の
生物学的流体におけるＭＳＲＶ−１ゲノムの検出結果

【表２】

【０１９５】表II ＥＬＯＳＡ技術に従うハイブリダイゼーションで行った
ＰＣＲによる、、ＲＡおよび他のリウマチ性疾患の患者
の生物学的流体におけるＭＳＲＶ−２ゲノムの検出結果

【表３】

【０１９６】

【配列表】

（１）一般情報（i）出願人： PERRON Herve MANDRAND Bernard MALLET Francois BEDIN Frederic BESEME Frederic （ii）発明の名称：（iii）配列の数：４９（iv）連絡の住所：（Ａ）住所：オリフ・アンド・ベリッジ(OLIFF & BER
RIDGE) （Ｂ）ストリート：７００サウスワシントンストリ
ート、スーツ３００(700 South Washington Street, Su
ite 300) （Ｃ）都市名：アレキサンドリア(Alexandria) （Ｄ）州名：バージニア（Ｅ）国名：米国（Ｆ）郵便番号(ZIP)：２２３１４（v）コンピューターが読み込むことのできる形態：（Ａ）媒体種：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩ
ｎ）リリース＃１．０、バージョン＃１．３０（vi）本出願の情報：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９６年３月（Ｃ）分類：（viii）弁理士／代理人の情報：（Ａ）名前： Berridge, William P （Ｂ）登録番号：３００２４（Ｃ）参照／事件整理番号：ＷＰＢ（ix）通信情報：（Ａ）電話：７０３−８３６−６４００（Ｂ）７０３−８３６−２７８７

【０１９７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１５８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１

【化１７】

【０１９８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２

【化１８】

【０１９９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３

【化１９】

【０２００】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４

【化２０】

【０２０１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ５

【化２１】

【０２０２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ６

【化２２】

【０２０３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ７

【化２３】

【０２０４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６４５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ８

【化２４】

【０２０５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７４１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ９

【化２５】

【０２０６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
０（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１０

【化２６】

【０２０７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
１（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１１

【化２７】

【０２０８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
２（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７４８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１２

【化２８】

【０２０９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
３（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１３

【化２９】

【０２１０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
４（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１４

【化３０】

【０２１１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
５（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１５

【化３１】

【０２１２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
６（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１６

【化３２】

【０２１３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
７（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１７

【化３３】

【０２１４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
８（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１８

【化３４】

【０２１５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１
９（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ１９

【化３５】

【０２１６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
０（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（ix）配列の特徴（Ｂ）ロケーション：５，７，１０，１３（Ｄ）他の情報：Ｇはイノシン（i）を示す（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２０

【化３６】

【０２１７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
１（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２１

【化３７】

【０２１８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
２（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２２

【化３８】

【０２１９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
３（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２３

【化３９】

【０２２０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
４（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２４

【化４０】

【０２２１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
５（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２５

【化４１】

【０２２２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
６（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２６

【化４２】

【０２２３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
７（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２７

【化４３】

【０２２４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
８（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（ii）配列の種類：相補的ＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２８

【化４４】

【０２２５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２
９（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ２９

【化４５】

【０２２６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
０（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３０

【化４６】

【０２２７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
１（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３１

【化４７】

【０２２８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
２（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（ix）配列の特徴（Ｂ）ロケーション：６，１２，１９（Ｄ）他の情報：Ｇはイノシン（i）を示す（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３２

【化４８】

【０２２９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
３（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３３

【化４９】

【０２３０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
４（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３４

【化５０】

【０２３１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
５（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３５

【化５１】

【０２３２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
６（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３６

【化５２】

【０２３３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
７（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３７

【化５３】

【０２３４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
８（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３８

【化５４】

【０２３５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３
９（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ３９

【化５５】

【０２３６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
０（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４０

【化５６】

【０２３７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
１（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７０５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４１

【化５７】

【０２３８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
２（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６４８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４２

【化５８】

【０２３９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
３（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６４８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４３

【化５９】

【０２４０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
４（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４４

【化６０】

【０２４１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
５（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４５

【化６１】

【０２４２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
６（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４６

【化６２】

【０２４３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
７（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４７

【化６３】

【０２４４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
８（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４８

【化６４】

【０２４５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
９（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ４９

【化６５】

【０２４６】参考文献 (1) Sauvezio B. et al., “慢性関節リウマチ、現在の
状況および展望”, SanyJ., 1-13, Collection Me deci
ne-Sciences Flammarion, Paris, 1987 (2) Kahen A., ウイルスと慢性関節リウマチ、“慢性関
節リウマチ、現在の状況および展望”, Sany J., 1-13,
Collection Me decine-Sciences Flammarion, Paris,
1987 (3) Fujinami R.S. と Oldstone M.B.A., ed. Current
Topics in Microbiologyand Immunology, vol. 145, Be
rlin, Springer-Verlag, 1989 (4) Acha-Orbea H.とPalmer E., Mls -レトロウイルス
は免疫システムを利用する- Immunology Today 1991; 1
2, 271-276 (5) Cole B.C.とAtkin C.L., マイコプラズマ関節炎Ｔ
細胞マイトージェン、ＭＡＭ：超抗原モデル、Immunolo
gy Today 1991; 12, 271-276 (6) Posnet D.N., 超抗原は自己免疫において役割を演
じるか Semin. Immunol.1993; 5, 65-72 (7) Perron H. et al., Res. Virol. 1989, 140, 551-5
61 (8) Shih A., Misra R. およびRush M.G., Res. Virol.
1989, 63, 64-75 (9) Fields と Knipe, Fondamental Virology 1986, Re
v Press N.Y. (10) Nielsen P.E. et al., Science 1991; 254, 1497-
1500 (11) Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spri
ng Harbor, 1982 (12) Southern. E.M., J. Mol. Biol. 1975, 98, 503 (13) Dunn A.R. and Hassel J.A., Cell 1977, 12, 23 (14) Perron H. et al., Res. Vir. 1992, 143, 337-35
0 (15) Chomzynski P. and N. Sacchi, Analytical Bioch
emistry 1987, 162, 156-159 (16) Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., M
olecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989 (17) Meyerhans et al., Cell 1989, 58, 901-910 (18) Linial M.L. and Miller A.D., “微生物学および
免疫学の現在のトピックス。レトロウイルス、複製機
構” vol. 157, 125-152; Swanstrom R. and Vogt P.
K., editors., Springer-Verlag, Heidelberg 1990 (19) Lori F. et al., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074 (20) La Mantia et al., Nucleic Acids Research 199
1, 19, 1513-1520 (21) Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19
88, 85, 8998-9002 (22) F. Mallet et al., Journal of Clinical Microbi
ology 1993; 31, 1444-1449

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｓｈｉｈの工程（８）に従ってＬＭ７培養物か
ら得られたＭＳＲＶ−２Ａ型の配列を示す；この配列
は、ＳＥＱＩＤＮＯ１０に同定されている。

【図２】ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系統を起源とする
ウイルスＤＮＡから、“ｐｏｌ”領域においてＰＣＲ技
術で増幅されたＭＳＲＶ−１Ｂ配列の一般的な核酸の共
通配列を示し、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ
４、ＳＥＱＩＤＮＯ５およびＳＥＱＩＤＮＯ６に同
定され、増幅プライマーと共通に一致するものはＳＥＱ
ＩＤＮＯ７を有する。

【図３】Ｓｈｉｈ（８）によって記載された“ｐｏｌ”
領域におけるＰＣＲによって得られたＭＳＲＶ−１Ｂ型
の配列の系統樹を示す。

【図４】各ＭＳＲＶ−１Ｂ／“ＰＣＲｐｏｌ”型のフ
ァミリーに対する機能的な読み枠の定義を与えるもの
で、前記ファミリーＡ〜Ｄは、それぞれ図２記載のＳＥ
ＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ５及びＳＥＱＩＤＮＯ６のヌクレオチド配列によっ
て与えられたものである。

【図５】ＭＳＲＶ−２Ｂ配列の共通配列の例を与えるも
ので、ＳＥＱＩＤＮＯ１１に同定されている。

【図６】クローンＰＳＪ１７のヌクレオチド配列を示す
（ＳＥＱＩＤＮＯ９）。

【図７】Ｍ００３−Ｐ００４と称されるクローンのヌク
レオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ８を示す。

【図８】クローンＦ１１−１のヌクレオチド配列ＳＥＱ
ＩＤＮＯ２を示し、プライマー領域の二つの矢印の間
に位置する部分は、Ｆ１１−１のクローニングに用いら
れたプライマーの選択によって負わされた可変性に対応
している；同図には、アミノ酸への翻訳が示されてい
る。

【図９】ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ１、および
ＳＥＱＩＤＮＯ１の可能な機能的読み枠をアミノ酸で
示しており、同図には、レトロウイルスの逆転写酵素の
共通配列に下線が施されている。

【図１０】ＭＳＲＶ２ＥＬ１と称されるクローンのヌク
レオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ１２を示す。

【図１１】連続した３つの図１１／２４〜１３／２４か
らなり、６つの可能な読み枠に従って、プライマーＳＥ
ＱＩＤＮＯ１３を含むＳＥＱＩＤＮＯ１２のアミノ
酸への翻訳を示す。

【図１２】連続した３つの図１１／２４〜１３／２４か
らなり、６つの可能な読み枠に従って、プライマーＳＥ
ＱＩＤＮＯ１３を含むＳＥＱＩＤＮＯ１２のアミノ
酸への翻訳を示す。

【図１３】連続した３つの図１１／２４〜１３／２４か
らなり、６つの可能な読み枠に従って、プライマーＳＥ
ＱＩＤＮＯ１３を含むＳＥＱＩＤＮＯ１２のアミノ
酸への翻訳を示す。

【図１４】ＭＳＲＶ２−ＥＬ１配列（ＳＥＱＩＤＮＯ
１２）のＭＳＲＶ２−Ａ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１０）
の並びを示し、ＳＥＱＩＤＮＯ１３（クローニングの
尾から分離されたもの）に同定されたプライマーのハイ
ブリダイゼーション領域が四角で囲まれており、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１４に同定されたプライマーのハイブリダイ
ゼーション領域が、［］の間に示されている。

【図１５】実施例７に記載するように、慢性関節リウマ
チの関節流体(articular fluids)の細胞の培養の上清に
存在する感染性および／または病原性の作因の平衡点ま
で沈降させたスクロース勾配の画分における、実施例７
に定義された条件下での逆転写酵素活性の測定を示すも
のであり、曲線は、勾配の種々の画分における逆転写酵
素活性の変化を示す。この活性は、Ｙ軸上にＤＰＭ（単
位分当たりの崩壊）で示され、Ｘ軸は増加する密度に従
った（画分１から１０）勾配に回収された画分を示す。

【図１６】Ａ、ＢおよびＣに分けられており、Ａでは、
ＳＥＱＩＤＮＯ３９に同定され、実施例９に定義され
た条件下でＲＡの試料で得られたクローン“ＭＳＲＶ−
１ｐｏｌＰＲ”の配列；ＢおよびＣでは、ＭＳ源の試料
で得られたレトロウイルスＭＳＲＶ−１の配列に対応す
る、ＳＥＱＩＤＮＯ１およびＳＥＱＩＤＮＯ６を有
するこのクローンの配列の並びを示す。

【図１７】Ａ、ＢおよびＣに分けられており、Ａでは、
ＳＥＱＩＤＮＯ４０に同定され、実施例９に定義され
た条件下でＲＡの試料で得られたクローン“ＭＳＲＶ２
ｓＰＲ”の配列；ＢおよびＣでは、ＭＳ源の試料で得ら
れた感染性の作因ＭＳＲＶ−２の配列に対応する、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ１０およびＳＥＱＩＤＮＯ１２を有する
このクローンの配列の並びを示す。

【図１８】実施例１０に定義された条件下で、ＲＡの関
節流体の細胞を用いて得られた、ＳＥＱＩＤＮＯ４１
に同定されたクローンＭＳＲＶ２ｃＰＲの配列を示す。

【図１９】ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１に同定されたクローンＭＳＲＶ２ｃ
ＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料で得られた感染性の作
因ＭＳＲＶ−２の配列に対応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１
０を備えたクローンの配列の末端部（６５４−７０５）
の並びである。

【図２０】ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１に同定されたクローンＭＳＲＶ２ｃ
ＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料で得られた感染性の作
因ＭＳＲＶ−２の配列に対応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１
２を備えたクローンの配列の並びである。

【図２１】ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１に同定されたクローンＭＳＲＶ２ｃ
ＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料で得られた感染性の作
因ＭＳＲＶ−２の配列に対応する、ＳＥＱＩＤＮＯ１
２を備えたクローンの配列の並びである。

【図２２】ＲＡの関節流体を用いて得られた、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４２に同定されたクローンＭＳＲＶ１ｎＰＲ
の配列を示す。

【図２３】ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４３に同定されたクローンＭＳＲＶ１ｎ
ＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料を用いて得られたレト
ロウイルスＭＳＲＶ−１の配列に対応する、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１を備えたクローンの配列の並びである。

【図２４】ＲＡの関節流体の細胞を用いて得られた、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４３に同定されたクローンＭＳＲＶ１ｎ
ＰＲの配列を示し、ＭＳ源の試料を用いて得られたレト
ロウイルスＭＳＲＶ−１の配列に対応する、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ１を備えたクローンの配列の並びである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者フランソワ・マレフランス・69100・ヴィリューバン・リュ・アナトール・フランス・84 (72)発明者フレデリック・ベダンフランス・69002・リヨン・リュ・ガスパール・アンドレ・６ (72)発明者フレデリック・ベジムフランス・38090・ヴィルフォンテーヌ・リュ・ドゥ・ラ・ヌワエラ・39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１９９２年７月２２日にＶ９２０７２２
０２の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＯＬ−２お
よび１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１６の受付番
号でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと称される株か
ら、並びに前記ウイルス株ＰＯＬ−２またはＭＳ７ＰＧ
のウイルスに対応する少なくとも一つの抗原に対して向
けられた少なくとも一つの抗体によって認識される少な
くとも一つの抗原を備えたウイルスからなる変異株から
選択された、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物
質による感染または前記物質の再活性化を検出、予防も
しくは治療するための診断、予防もしくは治療組成物を
得るための、逆転写酵素活性を有するウイルス株から誘
導され、内在性レトロウイルスのファミリーに関する、
単離または精製された状態の、逆転写酵素活性を備えた
ウイルス性物質の使用。
【請求項２】１９９２年７月２２日に９２０７２２０
１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＬＩ−２およ
び１９９３年１月８日に９３０１０８１７の受付番号で
ＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称されるラインか
ら選択されるセルラインによって、あるいは前記ライン
ＰＬＩ−２またはＬＭ７ＰＣによって産生されるウイル
スに対応する少なくとも一つの抗原に対して向けられた
少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも一
つの抗原を備えたウイルスを産生し得る感染細胞培養に
よって産生される、慢性関節リウマチに係る前記ウイル
ス性物質による感染または前記物質の再活性化を検出、
予防もしくは治療するための診断、予防もしくは治療組
成物を得るための、内在性レトロウイルスのファミリー
に関する、単離または精製された状態の、逆転写酵素活
性を備えたウイルス性物質の使用。
【請求項３】ゲノムが、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ
４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮＯ
９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２およ
びＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配列、並びにこ
れらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、
ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列から選択
されたヌクレオチド配列に対して、特に１００個連なる
モノマーのどこの配列に対しても、少なくとも５０％、
好ましくは少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチ
ド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質による
感染または前記物質の再活性化を検出、予防もしくは治
療するための診断、予防もしくは治療組成物を得るため
の、ウイルス性物質の使用。
【請求項４】ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、レトロウイル
スＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−９のゲノムのｐｏｌ遺
伝子に属するヌクレオチド配列と、特に少なくとも５０
％、好ましくは少なくとも６５％の相同性を有する等価
のヌクレオチド配列を含む、慢性関節リウマチに係る前
記ウイルス性物質による感染または前記物質の再活性化
を検出、予防もしくは治療するための診断、予防もしく
は治療組成物を得るための、レトロウイルス性物質の使
用。
【請求項５】ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、レトロウイル
スＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−９のゲノムのｐｏｌ遺
伝子にコードされたペプチド配列と少なくとも５０％、
好ましくは７０％の相同性を有するペプチド配列をコー
ドする、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質に
よる感染または前記物質の再活性化を検出、予防もしく
は治療するための診断、予防もしくは治療組成物を得る
ための、レトロウイルス性物質の使用。
【請求項６】ゲノムのｐｏｌ遺伝子が、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４２およびＳＥＱＩＤＮＯ４３、並びにこれら
の相補配列から選択されたヌクレオチド配列にコードさ
れたペプチド配列と、少なくとも３０個連なるアミノ酸
のどこの配列に対しても少なくとも５０％、好ましくは
少なくとも７０％の相同性を有するペプチド配列をコー
ドする、慢性関節リウマチに係る前記ウイルス性物質に
よる感染または前記物質の再活性化を検出、予防もしく
は治療するための診断、予防もしくは治療組成物を得る
ための、レトロウイルス性物質の使用。
【請求項７】ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ
１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ
６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配列、並
びにこれらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤＮＯ
１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ
６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列
から選択された配列と、特に１００個連なるモノマーの
どこの配列に対しても、少なくとも５０％、好ましくは
少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列か
らなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、慢性
関節リウマチに係る前記ウイルス性物質による感染また
は前記物質の再活性化を検出、予防もしくは治療するた
めの診断、予防もしくは治療組成物を得るための、ヌク
レオチドフラグメントの使用。
【請求項８】請求項７に記載のフラグメントのヌクレ
オチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌクレ
オチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配列
に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少な
くとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、慢性関節リウマチに係るウイルス性物質のＲＮＡま
たはＤＮＡを合成により増幅するための特異的プライマ
ーの使用。
【請求項９】プライマーが、ＳＥＱＩＤＮＯ１６、
ＳＥＱＩＤＮＯ１７、ＳＥＱＩＤＮＯ１８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１９、ＳＥＱＩＤＮＯ２０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ２１、ＳＥＱＩＤＮＯ２２、ＳＥＱＩＤＮＯ２
３、ＳＥＱＩＤＮＯ２４、ＳＥＱＩＤＮＯ２５、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２６、ＳＥＱＩＤＮＯ３１、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ３２、ＳＥＱＩＤＮＯ３３、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４８、ＳＥＱＩＤＮＯ４９
およびこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配
列を有することを特徴とする請求項８記載の使用。
【請求項１０】請求項６に記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含
む、生物学的試料における慢性関節リウマチに係るウイ
ルス性物質の検出、分離または同定用の組成物を得るた
めのプローブの使用。
【請求項１１】プローブが、ＳＥＱＩＤＮＯ３、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ１６、
ＳＥＱＩＤＮＯ１７、ＳＥＱＩＤＮＯ１８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１９、ＳＥＱＩＤＮＯ２０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ２１、ＳＥＱＩＤＮＯ２２、ＳＥＱＩＤＮＯ２
３、ＳＥＱＩＤＮＯ２４、ＳＥＱＩＤＮＯ２５、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２６、ＳＥＱＩＤＮＯ３１、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ３２、ＳＥＱＩＤＮＯ３３、ＳＥＱＩＤＮＯ
４７、ＳＥＱＩＤＮＯ４８、ＳＥＱＩＤＮＯ４９お
よびこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする請求項１０記載の使用。
【請求項１２】１９９２年７月２２日にＶ９２０７２
２０２の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＯＬ−２
および１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１６の受付
番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと称される
株、並びにその変異株から選択されたウイルス株から誘
導され、前記ウイルス株ＰＯＬ−２またはＭＳ７ＰＧの
病原性および／または感染性の作因のいずれかに対応す
る少なくとも一つの抗原に対して向けられた少なくとも
一つの抗体によって認識される少なくとも一つの抗原を
備えた病原性および／または感染性の作因からなる、慢
性関節リウマチに係る前記病原性および／または感染性
の作因による感染または前記作因の再活性化を検出、予
防もしくは治療するための診断、予防もしくは治療組成
物を得るための、単離または精製された状態の、請求項
１ないし６のいずれか一項に記載のウイルス性物質とは
異なる、病原性および／または感染性の作因の使用。
【請求項１３】１９９２年７月２２日に９２０７２２
０１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＬＩ−２お
よび１９９３年１月８日に９３０１０８１７の受付番号
でＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称されるライン
から選択されたセルライン、病原性および／または感染
性の作因の少なくともいずれかを産生し得る感染細胞培
養および／またはその変異体、あるいは前記ラインＰＬ
Ｉ−２またはＬＭ７ＰＣによって産生される病原性およ
び／または感染性の作因のいずれかに対応する少なくと
も一つの抗原に対して向けられた少なくとも一つの抗体
によって認識される少なくとも一つの抗原を備えた病原
性および／または感染性の作因を産生し得る感染細胞培
養によって産生される、慢性関節リウマチに係る前記病
原性および／または感染性の作因による感染または前記
作因の再活性化を検出、予防もしくは治療するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための、請求項１な
いし６のいずれか一項に記載のウイルス性物質とは異な
る、単離または精製された状態の、病原性および／また
は感染性の作因の使用。
【請求項１４】ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４
０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、および
これらと等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮＯ
１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、
ＳＥＱＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこ
れらの相補配列から選択された配列を有するヌクレオチ
ド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０
％の相同性を有するヌクレオチド配列から選択されたヌ
クレオチド配列を含む核酸を有する、慢性関節リウマチ
に係る前記病原性および／または感染性の作因による感
染または前記作因の再活性化を検出、予防もしくは治療
するための診断、予防もしくは治療組成物を得るため
の、病原性および／または感染性の作因の使用。
【請求項１５】ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４
０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、および
これらと等価の配列であって、特に１００個連なるモノ
マーのどこの配列に対しても、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、
ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの
相補配列から選択された配列と少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド
配列から選択されたヌクレオチド配列を含む、慢性関節
リウマチに係る前記病原性および／または感染性の作因
による感染または前記作因の再活性化を検出、予防もし
くは治療するための診断、予防もしくは治療組成物を得
るための、ヌクレオチドフラグメントの使用。
【請求項１６】請求項１５に記載のフラグメントのヌ
クレオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌ
クレオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの
配列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と
少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を
含む、慢性関節リウマチに係る病原性および／または感
染性の作因のＲＮＡもしくはＤＮＡを合成することによ
って増幅するための、プライマーの使用。
【請求項１７】プライマーが、ＳＥＱＩＤＮＯ１
３、ＳＥＱＩＤＮＯ１４、ＳＥＱＩＤＮＯ１５、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ２７、ＳＥＱＩＤＮＯ２８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ２９、ＳＥＱＩＤＮＯ３０、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ３４、ＳＥＱＩＤＮＯ３５、ＳＥＱＩＤＮＯ３
６、ＳＥＱＩＤＮＯ３７、ＳＥＱＩＤＮＯ４４、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４５、ＳＥＱＩＤＮＯ４６およびこれ
らの相補配列から選択されたヌクレオチド配列を有する
ことを特徴とする請求項１６記載の使用。
【請求項１８】請求項１５に記載のフラグメントのヌ
クレオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌ
クレオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの
配列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と
少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を
含む、慢性関節リウマチに係る前記病原性および／また
は感染性の作因による感染または前記作因の再活性化を
検出、予防もしくは治療するための診断、予防もしくは
治療組成物を得るための、プローブの使用。
【請求項１９】プローブが、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、
ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１３、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ１４、ＳＥＱＩＤＮＯ１５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ２７、ＳＥＱＩＤＮＯ２８、ＳＥＱＩＤＮＯ２
９、ＳＥＱＩＤＮＯ３０、ＳＥＱＩＤＮＯ３４、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ３５、ＳＥＱＩＤＮＯ３６、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ３７、ＳＥＱＩＤＮＯ４４、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４５、ＳＥＱＩＤＮＯ４６およびこれらの相補配列
から選択されたヌクレオチド配列を有することを特徴と
する請求項１８記載の使用。
【請求項２０】単離または精製された状態の、二つの
病原性および／または感染性の作因、すなわち逆転写酵
素活性を備え、内在性のレトロウイルスの成分のファミ
リーに関連するヒトウイルスもしくは前記ウイルスの変
異体からなる第一の作因と、第二の作因もしくは前記第
二の作因の変異体であって、これら二つの病原性および
／または感染性の作因は、１９９２年７月２２日にＶ９
２０７２２０２の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰ
ＯＬ−２および１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１
６の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＳ７ＰＧと称
される株から、並びに前記株の変異体から選択された同
じウイルス株から誘導されたものとされる、慢性関節リ
ウマチに係る第一の病原性および／または感染性の作因
および第二の病原性および／または感染性の作因による
感染、もしくは前記第一の作因または第二の作因のいず
れかの再活性化を検出、予防もしくは治療するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための、二つの病原
性および／または感染性の作因を含む組み合わせの使
用。
【請求項２１】単離または精製された状態の、二つの
病原性および／または感染性の作因、すなわち逆転写酵
素活性を備え、内在性のレトロウイルスの成分のファミ
リーに関連するヒトウイルスもしくは前記ウイルスの変
異体からなる第一の作因と、第二の作因もしくは前記第
二の作因の変異体であって、これら二つの病原性および
／または感染性の作因は、１９９２年７月２２日に９２
０７２２０１の受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＰＬ
Ｉ−２および１９９３年１月８日に９３０１０８１７の
受付番号でＥＣＡＣＣに寄託されたＬＭ７ＰＣと称され
るラインから選択される同じセルラインによって、並び
に病原性および／または感染性の作因の少なくともいず
れかを産生し得る感染細胞培養および／またはその変異
体によって産生されたものとされる、慢性関節リウマチ
に係る第一の病原性および／または感染性の作因および
第二の病原性および／または感染性の作因による感染、
もしくは前記第一の作因または第二の作因のいずれかの
再活性化を検出、予防もしくは治療するための診断、予
防もしくは治療組成物を得るための、二つの病原性およ
び／または感染性の作因を含む組み合わせの使用。
【請求項２２】単離または精製された状態の、二つの
病原性および／または感染性の作因、すなわちゲノム
が、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ
５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ
３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３、
これらの相補配列、並びにこれらと等価の配列であっ
て、ＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ３、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ
５、ＳＥＱＩＤＮＯ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ８、ＳＥＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ
３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３お
よびこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列
に対して、特に１００個連なるモノマーのどこの配列に
対しても、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７
０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなる群から
選択されたヌクレオチド配列を含む、ウイルスもしくは
前記ウイルスの変異体からなる第一の作因、および、ゲ
ノムが、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１
１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４０、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、およびこれら
と等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、
ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの
相補配列から選択されたヌクレオチド配列と、特に１０
０個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少なくと
も７０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有す
るヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を
含む第二の病原性および／または感染性の作因からな
る、慢性関節リウマチに係る第一の病原性および／また
は感染性の作因および第二の病原性および／または感染
性の作因による感染、もしくは前記第一の作因または第
二の作因のいずれかの再活性化を検出、予防もしくは治
療するための診断、予防もしくは治療組成物を得るため
の、二つの病原性および／または感染性の作因を含む組
み合わせの使用。
【請求項２３】ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３、これらの相補配列、
並びにこれらと等価の配列であって、ＳＥＱＩＤＮＯ
１、ＳＥＱＩＤＮＯ２、ＳＥＱＩＤＮＯ３、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ５、ＳＥＱＩＤＮＯ
６、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ８、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ９、ＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列
から選択されたヌクレオチド配列に対して、特に１００
個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少なくとも
５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する
ヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチ
ド配列を含む第一のフラグメント、およびヌクレオチド
配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、ＳＥＱＩＤＮＯ１
１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ４０、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、およびこれら
と等価の配列であって、特に、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、
ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの
相補配列から選択されたヌクレオチド配列と、特に１０
０個連なるモノマーのどこの配列に対しても、少なくと
も７０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有す
るヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を
含む第二のフラグメントを含み、前記各フラグメントが
特にプローブである、慢性関節リウマチに係る第一の病
原性および／または感染性の作因および第二の病原性お
よび／または感染性の作因による感染、もしくは前記第
一の作因または第二の作因のいずれかの再活性化を検
出、予防もしくは治療するための診断、予防もしくは治
療組成物を得るための、ヌクレオチドフラグメントの組
み合わせの使用。
【請求項２４】請求項２３に記載された第一のヌクレ
オチドフラグメントに部分的または全体的にコードされ
た第一のポリペプチドおよび請求項２３に記載された第
二のヌクレオチドフラグメントに部分的または全体的に
コードされた第二のポリペプチドを含む、慢性関節リウ
マチに係る第一の病原性および／または感染性の作因お
よび第二の病原性および／または感染性の作因による感
染、もしくは前記第一の作因または第二の作因のいずれ
かの再活性化を検出、予防もしくは治療するための診
断、予防もしくは治療組成物を得るための、組み合わせ
の使用。
【請求項２５】使用が、請求項２４記載の第一のポリ
ペプチドに特異的な抗体等の第一のリガンド、および請
求項２４記載の第二のポリペプチドに特異的な抗体等の
第二のリガンドを含むことを特徴とする請求項２４記載
の使用。
【請求項２６】慢性関節リウマチ患者の関節流体の剥
離した繊維芽細胞およびシノビオサイトから選択された
滑液流体破裂の細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養すること
を特徴とする、慢性関節リウマチに係る、請求項１ない
し６のいずれか一項記載の第一の病原性および／または
感染性の作因および／または請求項１３ないし１５のい
ずれか一項記載の第二の病原性および／または感染性の
作因の製造方法。
【請求項２７】エプスタイン・バールウイルスによっ
て不死化した、慢性関節リウマチ患者に由来するＢリン
パ球細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養することを特徴とす
る、慢性関節リウマチに係る、請求項１ないし６のいず
れか一項記載の第一の病原性および／または感染性の作
因および／または請求項１３および１４のいずれか一項
記載の第二の病原性および／または感染性の作因の製造
方法。
【請求項２８】ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４２、ＳＥＱＩＤＮＯ４
３、これらの相補配列、並びにこれらと等価の配列であ
って、特にＳＥＱＩＤＮＯ３９、ＳＥＱＩＤＮＯ４
２、ＳＥＱＩＤＮＯ４３およびこれらの相補配列から
選択された配列と、１００個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、少なくとも５０％、好ましくは少なくと
も７０％の相同性を示すヌクレオチド配列からなる群か
ら選択されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチドフ
ラグメント。
【請求項２９】請求項２８記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に
記載のウイルス性物質のＲＮＡまたはＤＮＡを合成によ
り増幅するための特異的プライマー。
【請求項３０】ＳＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４８、ＳＥＱＩＤＮＯ４９およびこれらの相補配
列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する請求項２９記載のプライマー。
【請求項３１】請求項２８記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に
記載のウイルス性物質のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的に
ハイブリダイズし得るプローブ。
【請求項３２】ＳＥＱＩＤＮＯ４７、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４８、ＳＥＱＩＤＮＯ４９およびこれらの相補配
列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する請求項３１記載のプローブ。
【請求項３３】ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１、これらの相補配列、並
びにこれらと等価の配列であって、特にＳＥＱＩＤＮ
Ｏ４０、ＳＥＱＩＤＮＯ４１およびこれらの相補配列
から選択された配列と、１００個連なるモノマーのどこ
の配列に対しても、少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列からなる
群から選択されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチ
ドフラグメント。
【請求項３４】請求項３３記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする、請求項１２ないし１４のいずれか一
項に記載の病原性および／または感染性の作因のＲＮＡ
もしくはＤＮＡを合成することによって増幅するための
特異的プライマー。
【請求項３５】ＳＥＱＩＤＮＯ４４、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４５、ＳＥＱＩＤＮＯ４６およびこれらの相補配
列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する請求項３４記載のプライマー。
【請求項３６】請求項３３記載のフラグメントのヌク
レオチド配列の少なくとも一部と同じまたは等価のヌク
レオチド配列、特に、１０個連なるモノマーのどこの配
列に対しても、前記フラグメントの少なくとも一部と少
なくとも９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする、請求項１２ないし１４のいずれか一
項に記載の病原性および／または感染性の作因のＲＮＡ
もしくはＤＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプロー
ブ。
【請求項３７】ＳＥＱＩＤＮＯ４５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ４６、ＳＥＱＩＤＮＯ４７およびこれらの相補配
列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴と
する請求項３６記載のプローブ。