CZ328796A3 - Msrv-1 virus and pathogenic and/or infection inducing msrv-2 factor being connected with rheumatic arthritis - Google Patents

Description

Oblast techniky i . . ,

-ΐ f- X i X

Vynález se týká viru MSRV-1 a patogenního a/nebo infekci ·('□ způsobujího činitele MSRV-2, spojených s revmatickou artrífL· dou, jakož i purifikovaného nebo izolovaného virálního materiálu, majícího aktivitu reverzní transkriptázy, který se váže k skupině endogenních retrovirálních složek a/nebo patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, purifikovaného nebo izolovaného, odlišného od uvedeného virálního materiálu, přičemž uvedený materiál nebo uvedený činitel je získán z virálního kmene majícího aktivitu reverzní transkriptázy. zvoleného ze souboru, zahrnujícího kmeny nazvané POL-2 a MS7PG a dále kmeny, představující jejich varianty, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekcí uvedeným virálním materiálem a/nebo uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě.

Dosavadní stav techniky

Revmatická artritida je nejčastější z lidských zánětlivých revmatických onemocnění a její výskyt je obzvláště vysoký: 3 % (1). Diagnostika je od počátku obtížná: klinická heterogenita stejně tak jako mimokloubní symptomy spojené s imunologie- 2kými anomáliemi, které jsou občas významné, komplikují celkový obraz. Jedná se o nemoc, jejíž etiologie je dosud neznámá a je zařazována do kategorie nemocí ‘''autoimunitních” z důvodu existence exacerbovaných imunologických reakcí proti vlastním antigenům.

Virální a/nebo bakteriální etiologie revmatické artritidy je často zmiňována, ale hledání činitele, způsobujícího revmatickou artritidu nebylo dosud ukončeno (2).

Koncepty, definující revmatickou artritidu jako autoimunitní nemoc a koncepty, podporující virální nebo dokonce bakteriální etiologii choroby, mohou být nyní sjednoceny na základě pochopení různých mechanizmů, kterými mohou mikroorganizmy indukovat autoimunitní reakci u infikovaného hostitele, jak to popsali Fujinami, R.S. a Oldstone, M.B.A. (3). O molekulách bakteriálního nebo virálního původu nebo dokonce endogenního retrovirálního původu je známo, že mají vlastnosti, nazývané superantigenové (4,5). Jejich zvláštní schopnosti přímé stimulace lymfocytů T. které jsou specifické na různé antigeny, vazbou na oblast V některých receptorů “T” daly vzniknout hypotéze, že tyto molekuly jsou přímo asociované na etiopatogenní procesy autoimunitních patologií (6). Přesto však žádný specifický patogenní činitel, bakteriální nebo virální, který by případně produkoval superantigeny, nebyl dosud zřetelně asociován s revmatickou artritidou.

- 3Podstata vvnálezu v

Práce přihlašovatele, provedené ve výzkumu etiologie revmatické artritidy vedly v současné době k objevení existence dvou patologických a/nebo infekci způsobujících Činitelů, které jsou nezávisle na sobě nebo současně vázány k patologickým stavům revmatické artritidy.

Techniky kultivace a detekce retrovirálního materiálu použité v pracích provedených přihlašovatelem, které se vztahovaly k činiteli, vázanému k roztroušené mozkomíšní skleróze a popsané v přihláškách francouzských vynálezů 92 04322. 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532 a v publikaci H. PERROX a kol. (7) (jejíž obsah je prostřednictvím reference připojen k popisu vynálezu), dovolily prokázat zcela neočekávaným způsobem totožnost činitelů asociovaných k roztroušené mozkomíšní skleróze a činitelů, představujících předmět předkládaného vynálezu, vztahujících se k revmatické artritidě.

Vycházejíce z toho, že při revmatické artritidě se proces odehrává v kloubech a speciálně v synoviální bláně, byly kultivovány buňky získané ze synoviální tekutiny, získané ze zasažených kloubů pacientů s revmatickou artritidou. Vycházejíce z takové kultury bylo možno získat buňky fibroblastického typu, které se množily τη vitro, což dovolilo provést několik běhů. Odpovídající kultivační prostředí byla použita pro zkoumání aktivity reverzní transkriptázy, asociované s infikujícími částicemi, koncentrovanými ultracentrifugací a poté purifikovanými izopyknickým gradientem. Použití detekčních podmínek, využitých pro kmen LM7, pocházející z roztroušené mozkomíšní sklerózy (7), dovolilo určit signifikativní aktivitu reverzní transkriptázy v ně- 4kolika individualizovaných frakcích tohoto gradientu. Následná analýza sekvencí nukleových kyselin, amplifikovaných v těchto frakcích metodou PCR (polymerázová řetězová reakce) s degenerovanými primery, analogickými s konvenčními sekvencemi enzymů s aktivitou reverzní transkriptázy (8), odhalila přítomnost signifikativních sekvencí, identických sekvencím v patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelích MSRVl a MSVR2, již dříve identifikovaných v kulturách, nalezených v případech onemocnění roztroušenou mozkomíšní sklerózou.

Na základě toho předmětem předkládaného vynálezu je:

i) použití purifikovaného nebo izolovaného virálního materiálu, majícího aktivitu reverzní transkriptázy, náležející skupině endogenních retrovirálních složek, pocházejících z virálního kmene majícího aktivitu reverzní transkriptázy, zvoleného ze skupiny zahrnující kmeny označené POL-2, který byl uložen dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, čímž se rozumí kmeny virů, obsahujících alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, náležejícímu jednomu z uvedených kmenů POL-2 a MS7PG, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

ii) použití purifikovaného nebo izolovaného virálního materiálu, majícího aktivitu reverzní transkriptázy, náležející skupině endogenních retrovirálních složek, pocházejících z buněčné li- 0nie, zvoleného ze skupiny zahrnující linie označené PLI-2, která byla uložena dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, která byla uložena dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat virus, obsahující alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, náležejícímu jednomu nebo druhému z virů, produkovaných výše uvedenými liniemi PLI-2 a LM7PC, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

iii) použití virálního materiálu, jehož genom obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou mezi SEQ ID NO 1, SEQ ID NO

2. SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementárními sekvencemi a jejich ekvivalentními sekvencemi, zejména nukleotidovými sekvencemi, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

- 6iv) použití retrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu obsahuje nukleotidovou sekvenci ekvivalentní, zejména takovou, která vykazuje alespoň 50 % homologie a výhodně alespoň 65 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí náležející genu pol genomu retrovirů ERV-9 nebo HSERV-9, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

v) použití retrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu kóduje peptidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 50 % homologie a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z peptidových sekvencí, kódovaných genem pol genomu retrovirů ERV9 nebo HSERV-9, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

vi) použití retrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu kóduje peptidovou sekvenci, která vykazuje pro každou část alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z peptidových sekvencí, kódovaných nukleotidovou sekvencí, zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k řev(matické artritidě;

vii) použití nukleotidového fragmentu, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2. SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39. SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě;

viii) použití specifického příměru obsahujícího nukletidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu, definovaného v vii), zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro polymerační amplifikaci RNA nebo DNA virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě; ve výhodném provedení primer obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ

- 8ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence;

ix) použití sondy, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu definovaného v vii), zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro získání kompozice pro detekci, separaci nebo identifikaci virálního materiálu nebo reaktivace uvedeného virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě, v biologickém vzorku; ve výhodném provedení primer obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence;

x) použití purifikovaného nebo izolovaného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, odlišného od virálního materiálu definovaného v některém z bodů i) až vi), pocházejícího z virálního kmene, zvoleného ze skupiny zahrnující kmeny označené POL-2, který byl uložen dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, představovaný patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem obsahujícím alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu

- 9antigenu, odpovídajícímu jednomu či druhému z patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů výše uvedených virálních kmenů POL-2 a MS7PG, odlišný od jednoho či druhého retrovirálního materiálu uvedených kmenů, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem nebo reaktivace uvedeného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k revmatické artritidě;

xi) použití purifikovaného nebo izolovaného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, odlišného od virálního materiálu definovaného v některém z bodů i) až vi), produkovaného buněčnou linií, zvolenou ze skupiny zahrnující linie označené PLI-2, která byla uložena dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, který byl uložen dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat alespoň jeden nebo druhý z patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů a/nebo jejich variant nebo každou infikovanou buněčnou kulturu schopnou produkovat patogenní a/nebo infekci způsobující činitel, obsahující alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, náležejícímu jednomu nebo druhému z virů, produkovaných výše uvedenými liniemi PLI-2 a LM7PC, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem nebo reaktivace uvedeného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k revmatické artritidě;

- 10xii) použití patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, obsahujícího nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence vykazující alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s nukleotidovou sekvencí, obsahující sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem nebo reaktivace uvedeného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k revmatické artritidě;

xiii) použití nukleotidového fragmentu obsahujícího nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence vykazující v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s nukleotidovou sekvencí, zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem nebo reaktivace uvedeného patogenního a/nebo infekci způsobujícího

- 11činitele, který se váže k revmatické artritidě;

xiv) použití primerů obsahujícího nukletidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu, definovaného v xiii), zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro polymerační amplifikaci RNA nebo DNA patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k revmatické artritidě; ve výhodném provedení primer obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence;

xv) použití sondy, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu definovaného v xiii), zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobe jdoucích monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro detekci, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem nebo reaktivace uvedeného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k revmatické artritidě; ve výhodném provedení sonda obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID

- 12NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence;

xvi) použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představované prvním činitelem, který je představován lidským virem, majícím aktivitu reverzní transkriptázy a náležejícím do skupiny endogenních retrovirů a nebo variantu takovéhoto viru a druhým činitelem nebo variantou tohoto druhého činitele, přičemž tyto dva patogenní a/nebo infekci způsobující činitelé jsou takoví jako činitelé vzešlí z téhož virálního kmenu, zvoleného ze skupiny, zahrnující kmen označený POL-2, který byl uložen dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele;

xvii) použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představované prvním činitelem, který je představován lidským virem, majícím aktivitu reverzní transkriptázy a náležejícím do skupiny endogenních retrovirů a nebo variantou takovéhoto viru a druhým činitelem nebo variantou tohoto druhého činitele, přičemž tyto dva patogenní a/nebo infekci způsobující činitelé jsou takoví jako činitelé produkovaní touž buněčnou linií, zvolenou

- 13ze skupiny zahrnující linii označenou PLI-2, která byla uložena dne 22.07.1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, která byl uložen dne 08.01.1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat alespoň jeden z jednoho či druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele a/nebo jejich varianty, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele;

xviii) použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představované prvním Činitelem, který je představován virem nebo variantu takovéhoto viru, jehož genom obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, jehož genom obsahuje

- 14nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleot idových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím Činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele;

xix) použití kompozice, obsahující dva nukleotidové fragmenty, představované prvním fragmentem, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence a

- 15druhým fragmentem, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, přičemž každý z fragmentů může být zejména sonda, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro detekci prvního patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele a druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele;

xx) použití kompozice, obsahující první polypeptid, kódovaný částečně nebo úplně prvním nukleotidovým fragmentem, definovaným v ix) a druhý polypeptid, kódovaný částečně nebo úplně druhým nukleotidovým fragmentem, definovaným v ix), pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro detekci prvního patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele a druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, které se vážou k revmatické artritidě; ve výhodném provedení toto použití zahrnuje první ligand, zejména protilátku, specifický pro první polypeptid a druhý ligand, zejména protilátku, specifický pro druhý polypeptid, přičemž uvedený první a druhý polypeptid jsou definovány výše;

xxi) způsob získání prvního patogenního a/nebo infekci způ- 16sobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z bodů i) až vi) a/nebo druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z bodů x) až xii), které se váží k revmatické artritidě, vyznačující se tím, že se in vitro kultivují buňky získané punkcí ze synoviocytů a fibroblastů deskvamovaných z kloubní tekutiny pacientů trpících revmatickou artritidou;

xxii) způsob získání prvního patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z bodů i) až vi) a/nebo druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z bodů x) až xii), které se váží k revmatické artritidě, vyznačující se tím, že se in vitro kultivují buňky lymfocytů B pacientů trpících revmatickou artritidou, imortalizované virem Epstein-Barr;

xxiii) nukleotidový fragment, jehož nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodné alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence;

xxiv) specifický primer pro amplifikaci RNA nebo DNA virálního materiálu, definovaného v kterémkoliv z bodů i), ii), iii), iv), v), vi) polymeraci, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle xxiii), zejména nukleotidové sekvence,

- 17vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu; speciálně tento primer obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48 a SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence;

xxv) sonda schopná specificky hybridizovat s RNA nebo DNA virálního materiálu, definovaného v kterémkoliv z bodů i), ii), iii), iv), v), vi), zahrnující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukíeotidové sekvence fragmentu podle xxiii), zejména nukíeotidové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu; speciálně tato sonda obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48 a SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence;

xxvi) nukleotidový fragment, jehož nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 40 a SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukíeotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 40 a SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence;

xxvii) specifický primer pro amplifikaci RNA nebo DNA patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, definovaného v kterémkoliv z bodů x), xi) a xii) polymeraci, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukíeotidové sekvence fragmentu podle xxvi), zejména nukleoti- 18dové sekvence, vykazující pro každou Část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu; speciálně tento primer obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 a SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence;

xxviii) sonda schopná specificky hybridizovat s RNA nebo DNA virálního materiálu, definovaného v kterémkoliv z bodů x), xi) a xii), zahrnující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle xxvi), zejména nukleotidové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu; speciálně tato sonda obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 a SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence.

Před tím. než bude vynález popsán detailně, budou definovány různé výrazy, použité v popisu vynálezu a znění patentových nároků:

- kmen nebo izolát znamená každou infikující a/nebo patogenní biologickou frakci, obsahující například viry a/nebo bakterie a/nebo parazity a vytvářející patogenní a/nebo antigenní schopnosti, sídlící v žijící kultuře nebo hostiteli; jako příklad; virální kmen podle této definice může obsahovat koinfikující činitel, jako například patogenní protista,

- výraz “MSRV”, používaný v popisu předkládaného vynálezu označuje každý patogenní a/nebo infekci způsobující činitel,

- 19který se váže k roztroušené mozkomíšní skleróze nebo k revmatické artritidě, zejména virální druh, kmeny oslabené uvedeným virálním druhem, nebo detektivní interferentní částice odvozené od tohoto druhu. Je známo, že viry a obzvláště viry obsahující RNA mají variabilitu, vyplývající zejména z relativně vysokého podílu spontánních mutací (9), což bude vzato v úvahu později při definici ekvivalence,

- lidský virus znamená virus, který může infikovat lidskou bytost, s uvážením všech přirozených i indukovaných variací, se kterými je možno se setkat v oblasti předkládaného vynálezu je předmět tohoto vynálezu, tak jak je popsán níže a definován v patentových nárocích, vyjádřen tak, že zahrnuje ekvivalenty nebo odvozené výskyty různých biologických materiálů, popsaných níže, zejména homologické nukleotidové nebo peptidové sekvence,

- varianta viru nebo patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele podle vynálezu obsahuje alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, odpovídajícímu uvedenému viru nebo patogennímu a/nebo infekci způsobujícímu činiteli a/nebo genom, jehož celá část je detekována alespoň jednou hybridizační sondou a/nebo alespoň jeden amplifikační nukleotidový přiměř specifický pro daný virus nebo patogenní a/nebo infekci způsobující činitel, což nastává například pokud obsahují nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru obsahujícího SEQ ID NO 13 až SEQ ID NO 38 a SEQ ID NO 44 až SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence a to za určených hybridizačních podmínek,

- 20dobře známých odborníkům, podle vynálezu je nukleotidový fragment nebo oligonukleotid nebo polynukleotid řetězcem monomerů nebo biopolymerem, vyznačeným informační sekvencí přirozených nukleových kyselin, schopných hybridizovat na kterýkoliv jiný nukleotidový fragment za předem daných podmínek, přičemž řetězec může obsahovat monomery o různé chemické struktuře a být získán z přirozené molekuly nukleové kyseliny a/nebo genetickou rekombinací a/nebo chemickou syntézou,

- monomer tedy může být přirozený nukleotid nukleové kyseliny, jenž se sestává z cukru, fostátové skupiny a dusíkaté báze; v RNA je cukrem ribóza a v DNA je cukrem 2-deoxyribóza; podle toho, zda se jedná o RNA nebo o DNA je dusíkatá báze zvolena ze souboru, zahrnujícího adenin, guanin, uráčil, cytosin a thymin; nebo nukleotid může být modifikován v jednom ze třech po sobě následujících prvků; jako příklad je možno uvést, že modifikace může nastat na úrovni báze, čímž vznikne modifikovaná báze, jako například inosin, 5-methyldeoxycytidin, desoxyuridin, 5-dimethylamino-deoxyuridin, 2,6-diaminopurin, 5-bromdeoxyuridin a kterákoliv další modifikovaná báze, usnadňující hybridizaci; na úrovni cukru může modifikace spočívat v náhradě desoxyribózy polyaminem (10) a na úrovni fosfátové skupiny může modifikace spočívat v jejím nahražení esterem, zajména esterem zvoleným ze souboru, zahrnujícího estery difosfátu, alkylu a arylfosfonátu a fosforthioátu,

- pod “informační sekvencí” se rozumí každá uspořádaná posloupnost monomerů, jejíž chemická struktura a pořadí v referenčním směru vytváří nebo nevytváří funkční informaci stej- 21ného druhu jako je informace daná přirozenými nukleovými kyselinami,

- hybridizací se rozumí proces, v jehož průběhu se za vhodných operačních podmínek dva nukleotidové fragmenty, mající dostatečně komplementární sekvence, spojí a vytvoří vícenásobné vlákno, zejména dvojnásobné nebo trojnásobné, výhodně ve formě šroubovice,

- pod sondou se rozumí nukleotidový fragment, syntetizovaný chemickou cestou nebo získaný natrávením nebo přerušením delšího nukleotidového fragmentu, obsahující alespoň šest monomerů, výhodně od 10 do 100 monomerů a ještě výhodněji od 10 do 30 monomerů a mající hybridizační specificitu za určených podmínek; výhodně není sonda obsahující méně než 10 monomerů používána sama o sobě, ale za přítomnosti dalších sond, které mohou, ale nemusí mít stejně malé rozměry; je také možno používat delší sondy, například sondy delší než 100 monomerů; sonda může být zejména používána pro diagnostiku a nebo se jedná například o sondu určenou pro zachycení a/nebo detekci;

- sonda pro zachycení může být imobilizována na pevném nosiči kterýmkoliv vhodným způsobem, to jest přímo či nepřímo, například kovalentně nebo pasivní adsorpcí;

-detekční sonda může být označena prostředkem pro označování zvoleným zejména z radioizotopů, enzymů, zvolených zejména ze souboru, zahrnujícího peroxydázu a alkalickou fosfatázu a enzymů schopných hydroiyzovat chromogenní, fluorogenní nebo luminiscentní substrát, chromoforních chemických sloučenin, chromogenních, fluorogenních a luminiscentních sloučenin, analogů

- 22nukleotidových bází a biotinu,

- sondy podle vynálezu, použité pro diagnostické účely, mohou být vytvořeny všemi známými hybridizačními technikami a zejména technikami nazývanými “DOT-BLOT” (11), ‘'SOUTHERN BLOT” (12), “NORTHERN BLOT”, což je technika identická s technikou “SOUTHERN BLOT”, ale užívá RNA jako cílovou sekvenci, technika SANDWICH (13); výhodně je v předkládaném vynálezu používána technika SANDWICH, používající specifickou sondu pro zachycování a/nebo specifickou detekční sondu, přičemž se rozumí, že sonda pro zachycování a detekční sonda musejí vykazovat alespoň částečně odlišné nukleotidové sekvence;

- vynález také pokrývá sondu schopnou hvbridizovat in vivo nebo in vitro na RNA a/nebo DNA pro blokaci fenoménů replikace. zejména translace a/nebo transkripce a/nebo pro degradaci uvedené DNA a/nebo RNA,

- primer je sonda obsahující alespoň šest monomerů a výhodně od 10 do 30 monomerů, mající hybridizační specificitu za daných podmínek, užívaná pro inicializaci enzymatické polymerace například v amplifikační technice jako je PCR (Polymerase Chain Reaction), v procesu elongace, jako je sekvenace, v metodě reverzní transkripce a analogických,

- dvě nukleotidové sekvence se nazývají ekvivalentní nebo odvozené jedna z druhé nebo vzhledem k referenční sekvenci, jestliže funkčně mohou odpovídající biopolymery může hrát zhruba stejnou roli, aniž by byly identické, vzhledem k uvažovaným oblastem působení nebo v technikách, ve kterých vystupují; zejména

- 23jsou ekvivalentní dvě sekvence, získané v důsledku přirozené variability, zejména spontánní mutace druhu, ze kterého byly identifikovány nebo odvozeny, stejně tak jako homologické sekvence, přičemž homologie sekvencí je definována později,

- pod variabilitou se rozumí každá modifikace sekvence, spontánní nebo indukovaná, zejména způsobená substitucí a/nebo vložením a/nebo vynecháním nukleotidů a/nebo nukleotidových fragmentů a/nebo prodloužení a/nebo zkrácení sekvence na alespoň jednom z jejích konců; variabilita, která není přirozená, může povstat z použití technik genového inženýrství, například použití primerů syntézy, které mohou být degenerované nebo nedegenerované, pro amplifikaci nukleové kyseliny; tato variabilita se může projevovat jako modifikace celé výchozí sekvence, považované za referenční a může být vyjádřena stupněm homologie vzhledem k uvedené referenční sekvenci,

- homologie charakterizuje stupeň podobnosti dvou porovnávaných nukleotidových nebo peptidových fragmentů; měří v procentech jejich shodnost, která je zejména určena přímým porovnáním nukleotidových nebo peptidových sekvencí vzhledem k referenčním nukleotidovým nebo peptidovým sekvencím;

- toto procento shodnosti je specificky určeno pro nukleotidové fragmenty, kterých se týká předkládaný vynález, homologické fragmentům daným sekvencemi SEQ ID NO 1 až SEQ ID NO 9 a SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 (MSRV1) na jedné straně, homologické fragmentům daným sekvencemi SEQ ID NO 10 až SEQ ID NO 12 a SEQ ID NO 40 až SEQ ID NO 43 (MSRV-2) na druhé straně, stejně tak jako pro sondy a primery homologické sondám a primerům daným sekvencemi

- 24SEQ ID NO 16 až SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 31 až SEQ ID NO 33 a SEQ ID NO 47 až SEQ ID NO 49 na jedné straně a sondám a primerům daným sekvencemi SEQ ID NO 13 až SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 27 až SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 34 až SEQ ID NO 37 a SEQ ID NO 44 až SEQ ID NO 46 na druhé straně; jako příklad je možno uvést nejslabší procento shodnosti pozorované mezi různými obecnými nukleovými kyselinami, získanými z fragmentů virální RNA MSRV-1, vycházejícího z linií LM7PC a PLI-2 podle protokolu, blíže popsaného později a představující 67 % v oblasti popsané na obr. 2,

- kterýkoliv nukleotidový fragment se nazývá ekvivalentní nebo odvozený od referenčního fragmentu, jestliže ná nukleotidovou sekvenci ekvivalentní referenční sekvenci; podle této definice jsou zejména ekvivalentní referenční nukleotidové sekvenci:

a) kterýkoliv fragment, schopný hybridizovat alespoň částečně s komplementem referenčního fragmentu

b) každý fragment, jehož souběžné porovnání s referenčním fragmentem vede k prokázání přítomnosti identických posloupností po sobě následujících bází v počtu významnějším, než s jakýmkoliv jiným fragmentem, pocházejícím z jiné taxonomické skupiny

c) každý fragment, který vznikl nebo mohl vzniknout v důsledku přirozené variability druhu, ze kterého je získán

d) každý fragment, který může vzniknout pomocí technik genového inženýrství, aplikovaných na referenční fragment

e) každý fragment, obsahující alespoň osm po sobě jdoucích nukleotidů, kódující peptid homologický nebo identický peptidu, kódovanému referenčním fragmentem

f) každý fragment, lišící se od referenčního fragmentu vlože- 25ním, vynecháním, substitucí alespoň jednoho monomeru, prodloužením nebo zkrácením na alespoň jednom ze svých konců; například každý fragment, odpovídající referenčnímu fragmentu, doplněnému na alespoň jednom z konců nukleotidovou sekvencí, která nekóduje polypeptid,

- polypeptid znamená zejména každý peptid o alespoň dvou aminokyselinách, zejména oligopeptid, protein, extrahovaný, separovaný nebo izolovaný nebo syntetizovaný zásahem lidské ruky, zajména takový, který je získán chemickou syntézou nebo expresí v řekombinujícím organizmu,

- polypeptidem, kódovaným částečným způsobem nukleotidovým fragmentem se rozumí polypeptid s alespoň 3 aminokyselinami, kódovaný alespoň 9 po sobě jdoucími monomery, obsaženými v uvedeném nukleotidovém fragmentu,

- aminokyselina se nazývá analogická jiné aminokyselině, jestliže její fyzikálně chemické vlastnosti, jako jsou polyrita, hydrofobie a/nebo bazicita a/nebo kyselost a/nebo neutralita jsou zhruba stejné; takto je například leucin analogický isoleucinu,

- každý polypeptid se nazývá ekvivalentní nebo odvozený od referenčního polypeptidu, jestliže porovnávané polypeptidy mají zhruba stejné vlastnosti a zejména, jestliže mají stejné vlastnosti antigenní, imunologické, enzymologické a/nebo vlastnosti molekulárního rozpoznávání; zejména jsou ekvivalentní referenčnímu polypeptidu:

a) každý polypeptid, mající sekvenci, ve které alespoň jedna aminokyselina je substituována analogickou aminokyselinou,

b) každý polypeptid, který má ekvivalentní peptidovou sek- 26venci, získanou přirozanou nebo indukovanou variací uvedeného referenčního polypeptidu a/nebo nukleotidového fragmentu, kódujícího uvedený polypeptid,

c) mimotop uvedeného referenčního polypeptidu,

d) každý polypeptid, v jehož sekvenci je jedna nebo více aminokyselin L nahražena aminokyselinou D a naopak,

e) každý polypeptid, u něhož alespoň jedna vazba CO-NH a výhodně všechny vazby CO-NH peptidového řetězce odpovídajícího základního peptidu (nezahrnujíce v to vazby NH-CO jeho peptidového řetězce) je nebo jsou nahraženy vazbou nebo vazbami NH-CO,

f) každý polypeptid, u něhož alespoň jedna vazba CO-NH a výhodně všechny vazby CO-NH peptidového řetězce odpovídajícího základního peptidu (nezahrnujíce v to vazby NH-CO jeho peptidového řetězce) je nebo jsou nahraženy vazbou nebo vazbami NH-CO a chiralita každého aminoacylového residua, ať vstupuje nebo nevstupuje do některé nebo některých vazeb CONH uvedených výše, je buď zachována nebo invertována vzhledem k odpovídajícím aminoacylovým residuum vytvářejícím základní peptid, tyto sloučeniny peptidového typu jsou ještě označeny jako imunoretroidní

g) každý polypeptid, v jehož sekvenci byla provedena změna postranního řetězce aminokyselin, jako je například acetylace aminové skupiny, karboxylace skupiny thiol nebo esterifikace karboxylové skupiny,

h) každý polypeptid, v jehož sekvenci byla jedna nebo více peptidových vazeb modifikována jako například jsou vazby karba, retro, inverzo, retro-inverzo, redukovaná a methylen-oxy

i) každý polypeptid, jehož alespoň jeden antigen je rozpoznáván antigenem referenčního polypeptidu,

- 27- procento shodnosti charakterizující homologii dvou peptidových fragmentů porovnávaných podle předkládaného vynálezu je alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 %.

Vycházejíce z toho, že virus, vykazující enzymatickou aktivitu reverzní transkriptázy může být geneticky charakterizován stejně tak ve formě RNA jako DNA, bude pro charakterizaci sekvencí vztahujících se k viru, majícímu uvedenou aktivitu reverzní transkriptázy (MSRV-1) použito stejně tak RNA jako DNA.

Vycházejíce z toho, že patogenní a/nebo infekci způsobující činitel (MSRV-2) je detekován v infikovaných buňkách jak na základě DNA tak i na základě RNA, může být také charakterizován ve formě DNA nebo RNA.

Vyjádření pořadí, používané v popisu a patentových nárocích, jako jsou “první nukleotidová sekvence” nemají za cíl vyjádřit určité pořadí, ale definovat jasnějším způsobem vynález.

Přehled obrázků na výkrese

Vynález bude lépe pochopen z podrobného popisu, který následuje a odvolává se na připojené obrázky ve kterých:

Obr. 1 představuje sekvenci typu MSRV-2A, získanou z kultury LM7 podle protokolu Shih (8); tato sekvence je identifikována pod označením SEQ ID NO 10,

Obr. 2 představuje společnou sekvenci nukieových kyselin sekvencí MSRV-1B, amplifikovaných technikou PCR v oblasti

- 28pol” vycházejíce z virální DNA z linií LM7PC a PLI-2, identifikovaných pod označením SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 a SEQ ID NO 6 a společnou sekvenci s amplifikačním primerem, nesoucím označení SEQ ID NO D

Obr. 3 představuje fylogenetický strom sekvencí typu MSHV1B, získaných pomocí PCR v oblasti pol”, definovaný pomocí Shih (8),

Obr. 4 dává definici rastru pro funkční čtecí rámec pro každou skupinu typu MSRV-1B/“PCR pol”, přičemž uvedené skupiny A až D jsou definovány odpovídajícími nukleotidovými sekvencemi SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 a SEQ ID NO 6, podanými na obr. 2,

Obr. 5 dává příklad konvenční sekvence MSRV-2B, identifikované jako SEQ ID NO 11,

Obr. 6 představuje nukleotidovou sekvenci klonu PSJ17 (SEQ ID NO 9),

Obr. 7 představuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO 8 klonu nazvaného M003-P004,

Obr. 8 představuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO 2 klonu F11-1; označená část mezi dvěma šipkami v oblasti primeru odpovídá variabilitě, přičítané volbě primeru, který sloužil při klonování Fll-1; na témž obrázku je podán překlad na sekvenci aminokyselin,

Obr. 9 představuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO 1 a možný funkční čtecí rámec aminokyselin SEQ ID NO 1; na

- 29této sekvenci jsou podtrženy konvenční sekvence retrovirálních reverzních transkriptáz,

Obr. 10 představuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO 12 klonu nazvaného MSRV2EL1,

Obr. 11, rozložený do tří listů 11/23 až 13/23 představuje překlad sekvence SEQ ID NO 12, zahrnující primer SEQ ID NO 13, na aminokyseliny podle 6 možných čtecích rámců,

Obr. 12 představuje souběžné porovnání sekvence MSRV2-A (SEQ ID NO 10) se sekvencí MSRV2-EL1 (SEQ ID NO 12); na témž obrázku je v rámečku hybridizaČní oblast primeru identifikovaného pod označením SEQ ID NO 13 (bez klonovacího konce); oblast primeru identifikovaného pod označením SEQ ID NO 14 je vyznačena hranatými závorkami,

Obr. 13 představuje měření aktivity reverzní transkriptázy v podmínkách definovaných v příkladě 7 ve frakcích gradientu sacharozy, kde byla realizována rovnovážná sedimentace infekci způsobujících a patogenních činitelů přítomných v supernatantu buněk kloubní tekutiny revmatické artritidy, tak, jak je to popsáno v příkladu 7; křivka představuje změny aktivity reverzní transkriptázy v různých frakcích gradientu; tato aktivita je měřena v DPM (dezintegrace za minutu) na ose y, osa x představuje frakce získané v gradientu ve směru rostoucí hustoty (frakce 1 až 10),

Obr. 14 rozdělený na obr. 14A, obr. 14B a obr. 14C ukazuje na obr. 14A sekvenci klonu “MSRV-lpolPR” identifikovanou pod označením SEQ ID NO 39, získanou na vzorku revmatické artritidy za podmínek, definovaných v příkladu 9, na

- 30obr. 14B a obr. 14C souběžné porovnání sekvence tohoto klonu se SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 6, odpovídajícími sekvenci retrovirů MSRV-l, získaného ze vzorků, pocházejících z roztroušené sklorózy,

Obr. 15 rozdělený na obr. 15A, obr. 15B a obr. 15C ukazuje na obr. 15A sekvenci klonu “MSRV2sPR” identifikovanou pod označením SEQ ID NO 40, získanou na vzorku revmatické artritidy za podmínek, definovaných v příkladu 9, na obr. 15B a obr. 15C souběžné porovnání sekvence tohoto klonu se SEQ ID NO 10 a SEQ ID NO 12, odpovídajícími sekvenci retrovirů MSRV-2, získaného ze vzorků, pocházejících z roztroušené sklorózy,

Obr. 16 ukazuje sekvenci klonu MSRV2cPR, identifikovanou jako SEQ ID NO 41, získanou z buněk kloubní tekutiny revmatické artritidy za podmínek, definovaných v příkladu 10,

Obr. 17 ukazuje sekvenci klonu MSRV2cPR identifikovanou pod označením SEQ ID NO 41, získanou z buněk kloubní tekutiny revmatické artritidy a souběžné porovnání terminální části (654-705) sekvence tohoto klonu s SEQ ID NO 10, odpovídající sekvenci infekci způsobujícího činitele MSRV-2, získaného ze vzorků, pocházejících z roztroušené sklorózy.

Obr. 18 ukazuje sekvenci klonu MSRV2cPR identifikovanou pod označením SEQ ID NO 41, získanou z buněk kloubní tekutiny revmatické artritidy a souběžné porovnání sekvence tohoto klonu s SEQ ID NO 12, odpovídající sekvenci

- 31infekci způsobujícího činitele MSRV-2, získaného ze vzorků, pocházejících z roztroušené sklorózy,

Obr. 19 ukazuje sekvenci klonu MSRVlnPR identifikovanou pod označením SEQ ID NO 42, získanou z kloubní tekutiny revmatické artritidy za podmínek, definovaných v příkladu 10,

Obr. 20 ukazuje sekvenci klonu MSRVlnPR identifikovanou pod označením SEQ ID NO 43, získanou z buněk kloubní tekutiny revmatické artritidy a souběžné porovnání sekvence tohoto klonu s SEQ ID NO 1, odpovídající sekvenci retroviru MSRV-1, získaného ze vzorků, pocházejících z roztroušené sklorózy,

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1: Získání klonů MSRV-2, označených MSRV-2A, amplifikaci konzervovaných oblastí genů RNA-závislé DNA polymerázy na purifikovaném infekci způsobujícím činiteli z kultury buněk linie LM7

Molekulární přístup spočívá v použití techniky PCR (8), která dovoluje amplifikaci relativně konzervované oblasti genu pol exogenních a endogenních retrovirů, ale také virů, kódujících enzym s aktivitou reverzní transkriptázy (RT) takové, jako je zejména virus hepatitidy B a implicitně každé RNA-závislé DNA-polymerázy nebo enzymu, vykazující dostatečné homologie sekvencí v oblasti, definované použitými amplifikačními primery. Tato těch- 32nika PCR byla použita na nukleové kyseliny, extrahované z předem připravených purifiko váných infekci způsobujících činitelů, získaných protokolem podle (14) ze supernatantu původní kultury LVI7 (7), uchovávané ve zmraženém stavu při -80°C. Frakce typu LM7, obsahující nejvyšší aktivitu RT, jsou získány z pufru, obsahujícího thiokyanát guanidinu (15) a jsou uchovávány při 80°C až do extrakce nukleových kyselin technikou, kterou popsal P. Chomzynski (15).

Před reakcí PCR byla RNA vzorku přepsána na komplementární DNA (cDNA) pomocí primerů, nazývaných “náhodné” (random) (směs hexanukleotidů) pomocí soupravy “cDNA synthesis systém plus” (Amersham) podle instrukcí výrobce a vycházejíce z hodnoty množství RNA, přítomné ve vzorku, určené s přesností na nejbližší logaritmický faktor.

DNA získaná po PCR amplifikaci cDNA byla vložena do plasmidu s pomocí soupravy TA Cloning ® (British Biotechnology). 2μ1 roztoku DNA byly smíchány s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μλ 10 krát koncentrovaného ligačního pufru “10X LIGATION BUFFER”, 2 μΐ “pCR™ VECTOR” (25 ng/ml) a 1 μΐ “TA DNA LIGASE”. Tato směs byla inkubována po jednu noc při 12°C. Následující etapy byly realizovány v souladu s instrukcemi soupravy TA Cloning ® . Na konci postupu byly bílé kolonie rekombinantních bakterií přeneseny, aby byly dále kultivovány a dovolily extrakci obsažených plasmidů procedurou, nazývanou “miniprep” (16). Příprava plasmidů každé rekombinantní kolonie byla přerušena vhodným restrikčním enzymem a analyzována na gelu agarózy. Byla provedena selekce plasmidů, obsahující insert, určených pod UV světlem po označení gelu

- 33bromidem ethidia, pro sekvenaci vložené části po hybridizaci s primerem komplementárním k promotoru Sp6, přítomném v klonovacím plasmidu ze soupravy “TA cloning kit. Potom byla provedena reakce předcházející sekvenaci metodou, doporučenou pro použití sekvenační soupravy “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384) a byla provedena automatická sekvenace přístrojem Automatic Sequencer”, model 373 A Applied Biosystems podle instrukcí výrobce.

Získané sekvence byly potom analyzovány pomocí programů Mac Vector ® a Geneworks ® na informační databázi Genebank ® pro nukleové kyseliny a Swiss Prot ® pro sekvence aminokyselin, odvozené z čtecích rámců použitých na nukleové sekvence. Analýza sekvencí, získaných z virálního vzorku pocházejícího ze supernatantu rozmražených LM7 a purifikovaných na špičku aktivity reverzní transkriptázy na gradientu sacharózy prokázala majoritní populaci klonů (zhruba 42 % klonů) vzhledem k individuálnímu výskytu dalších sekvencí (stále nižší než 5 %, nebo 10 % pro malý počet případů) a vykazující částečné homologie se známými retroviry v očekávané oblasti “pol”. Tento klon je označen MSRV2-A a identifikován SEQ ID NO 10 (viz Obr. 1). Oblast amplifikovaná mezi primery PCR je homologická sekvenci odpovídající MSRV2-B, identifikované SEQ ID NO 11 (viz Obr. 5), popsané v příkladě 2. Pozorované rozdíly v sekvencích, situované v primerech PCR se vysvětlují použitím degenerovaných primerů jako směsi, použitých za různých technických podmínek. Prozkoumání databáze Genebank ® , aktualizované k současnému datu, neumožnilo prokázat sekvenci, která by byla identická a nebo by vykazovala signifikantní ho- 34mologie.

Tato sekvence je znázorněna na Obr. 1. Sekvence, znázorněná na Obr. 1 vykazuje otevřený čtecí rámec ve fázi se dvěma primery PCR, nacházejícími se na koncích, ale je kratší, než soubor známých retrovirálních sekvencí v očekávané oblasti mezi svými primery. Bylo zde pozorováno vynechání 45 párů bází (15 aminokyselin) vzhledem k odpovídajícím retrovirálním sekvencím (8) následujících sekvenci předního primeru, zatímco sekvence předcházející zadní primer jsou přítomny. Čtecí rámec je nicméně otevřen a nepřerušen po celé délce sekvence se zahrnutím primerů a odvozená sekvence aminokyselin vykazuje signifikantní homologie s oblastí odpovídající známým retrovirům. V sekvenci, která se nachází uvnitř primerů PCR jsou aminokyseliny Glu, Arg, Gin, Pro a Asp, v normálním případě dosti dobře konzervované v této oblasti pol známých retrovirů a virů s aktivitou reverzní transkriptázy (8), nalezeny konzervovány ve správných pozicích ve čtecím rámci originální sekvence.

Nakonec, vzhledem k tomu, že tato sekvence je dostatečně odchylná od retrovirálních sekvencí, již popsaných v datových bázích, je možno uzavřít, že se jedná o sekvenci, náležející novému infekci způsobujícímu a/nebo patogennímu činiteli, označenému MSRV-2A. Tento činitel se na základě analýzy získaných sekvencí a priori řadí k retrovirům, ale s uvážením techniky, použité pro získání této sekvence, se také může jednat o DNA virus jehož genom kóduje enzym, který má náhodně aktivitu reverzní transkriptázy, jako se stalo například v případě viru hepatitidy B, HBV (8). Navíc náhodný charakter degenerovaných primerů, použitých pro tuto techniku amplifikace PCR, může velmi dobře dovolit vzhledem k nepředvídaným homoiogiím sekvencí nebo !

Z' /

- ! t /

/ 'o

konzervovaným místům v genu odpovídajícího enzymu..amplifikaci nukleové kyseliny pocházející z prokaryotního nebo eukaryotního patogenního a/nebo koinfikujícího činitele (protisty).

PŘÍKLAD 2; Získání klonů MSRV-1B a MSRV-2B, definujících retrovirus MSRV-1 a ko-infikující činitel MSRV2, “zahnízděnou” PCR amplifikaci konzervovaných oblastí pol retrovirů na viriony z linií LM7PC a PLI-2

Byla použita technika PCR, odvozená z techniky, kterou publikoval Shih (8). Tato technika dovoluje zpracováváním všech složek v reakčním prostředí DNázou eliminovat všechny stopy kontaminující DNA. Dovoluje současně použitím různých ale překrývajících se primerů ve dvou po sobě jdoucích sériích amplifikačních cyklů PCR zvýšit pravděpodobnost amplifikace cDNA syntetizované z RNA, které je na počátku málo a je dále ve vzorku sníženo parazitní akcí DNázy na RNA. DNáza je takto použita za podmínek zvýšené aktivity, což dovoluje eliminovat všechny stopy kontaminující DNA před inaktivací tohoto enzymu, který zbývá ve vzorku, ohřátím na 85°C po dobu 10 minut. Tato varianta techniky PCR, popsané Shihem (8) byla použita na cDNA syntetizovanou z nukleových kyselin frakcí purifikovaných infikujících částic na gradientu sacharózy technikou, kterou popsal H. Perron (14), vycházejíce z izolátu “POL-2” (ECACC č. V92072202), produkovaného linií PLI-2 (ECACC č. 92072201) na jedné straně a z izolátu MS7PG (ECACC č. 93010816) produkovaného linií LM7PC (ECACC č. 93010817) na druhé straně. Tyto kultury byly získány metodami, které tvořily předmět přihlášky vynálezu publikované pod č. WO 93/20188 a WO 93/20189.

- 36Po klonování amplifikovaných produktů touto technikou pomocí soupravy TA Cloning Kit ® a analýze sekvencí s využitím automatického sekvenátoru způsobem, který byl popsán v příkladu 1 byly sekvence analyzovány pomocí programu Geneworks ® na poslední dostupné verzi databáze Genebank ® .

Sekvence, které byly klonované a sekvencované z těchto vzorků, odpovídaly zejména dvěma typům sekvencí: první typ sekvencí, nalezený v majoritní části klonů (55 % klonů vzešlých z izolátu POL-2 kultury PLI-2 a 67 % klonů vzešlých z izolátu MS7PG kultury LM7PG), který odpovídá skupině sekvencí “pol” blízkých, ale odlišných od lidského endogenního retroviru označovaného ERV-9 nebo HSERV-9 a druhý typ sekvencí, který odpovídá sekvencím velmi silně homologickým sekvencím, které jsou připisovány infekci způsobujícímu a/nebo patogennímu činiteli, který byl výše označen MSRV-2.

První typ sekvencí, představující majoritní část klonů, je tvořen sekvencemi, jejichž variabilita dovoluje definovat čtyři podsoubory sekvencí. Tyto podsoubory jsou si mezi sebou dostatečně blízké na to, aby mohly být považovány za kvazidruhy, pocházející od téhož retroviru, což je dobře známo pro retrovirus HIV-1 (17), nebo jako výsledek interference s více endogenními proviry, ko-regulovanými v produkujících buňkách. Tyto endogenní elementy, které jsou více či méně defektní, jsou citlivé na tytéž regulační signály generované popřípadě replikativním provirem, neboť přináležejí ke stejné skupině endogenních retrovirů (18). Tato nová skupina endogenních retrovirů nebo alternativně tento nový retrovirální druh, jehož kvazidruhové generace byly získány v kultuře a který obsahuje konvenční sekvenci popsanou

- 37níže, byl nazván MSRV-lB.

Na obr. 2 jsou jsou podány obecné konvenční sekvence různých klonů sekvence MSRV-lB vzniklé z tohoto pokusu a tyto sekvence jsou postupně označeny jako SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 a SEQ ID NO 6. Tyto sekvence vykazují homologii nukleových kyselin, která jde od 70 % do 88 %, se sekvencí HSERV9, označovanou X557147 a M37638 v databázi Genebank ® . Fylogenetický strom této sekvence je podán na obr. 3. Na tomto obrázku podskupiny A, B, C, D představují sekvence, které byly nalezeny s významným výskytem v podobných experimentech, opakovaných později ve vzorcích čisté RNA virionů purifikovaných z izolátů MP7PG a POL-2. Z těchto skupin sekvencí byly definovány čtyři konvenční” nukleové sekvence, představující různé popřípadě endogenní kvazidruhy retrovirů MSRV-lB. Tyto reprezentativní konvenční sekvence jsou znázorněny na obr. 4 s překladem na aminokyseliny. Pro každou podskupinu sekvencí MSRV-lB existuje funkční čtecí rámec a je možné vidět, že otevřený funkční čtecí rámec odpovídá pokaždé sekvenci aminokyselin, která se nachází v druhé řádce pod sekvencí nukleových kyselin. Obecná konvenční sekvence odpovídající sekvencím MSRV-lB, označená jako SEQ ID NO 7 a získaná touto technikou PCR v oblsati “pol” je znázorněna na obr. 2.

Druhý typ sekvencí, představující majoritní část sekvencovaných klonů je představována sekvencí MSRV-2B, znázorněnou na obr. 5 a označenou jako SEQ ID NO 11. Oblast amplifikovaná mezi primery PCR je homologická až na jednu bázi sekvenci MSRV2-A ( SEQ ID NO 10 podle obr. 1) uvnitř PCR primerů popsaných v příkladu 1. Pozorované diference mezi sekvencemi,

- 38odpovídajícími primerům PCR se vysvětlují použitím degenerovaných primerů ve směsi, používaných za různých technických podmínek.

Sekvence MSRV-2A ( SEQ ID NO 10) a MSRV-2B ( SEQ ID NO 11) jsou evidentně homologické nebo dokonce identické, vycházející ze stejného organizmu a dostatečně odlišné od retrovirálních sekvencí, které již byly popsány v datových bázích, na to, aby bylo možno vyvodit, že se jedná o oblast sekvencí, náležejících novému infekci způsobujícímu činiteli, který byl nazván MSRV-2. Tento infekci způsobující činitel přináleží a priori, na základě prvních získaných sekvencí, retroviru, ale s uvážením technik, které byly použity pro získání této sekvence, by se také mohlo jednat o DNA virus, jehož genom kóduje enzym, který má aktivitu reverzní transkriptázy, jako je tomu například u viru hepatitidy B, HBV (8). Navíc náhodný charakter použitých degenerovaných primerů, použitých pro tuto techniku amplifikace PCR, mohl docela dobře dovolit vzhledem k neočekávaným homologiím sekvencí nebo konzervovaným místům v genu přináležejícího enzymu amplifikaci nukleové kyseliny, pocházející z prokaryotního nebo eukaryotního patogenního a/nebo koinfikujícího činitele (protisty).

PŘÍKLAD 3: Získání klonu PSJ17, definujícího retrovirus MSRV1, reakcí endogenní reverzní transkriptázy na virion, získaný z linie PLI-2

Tento přístup si klade za cíl získat reverzně transkribováné sekvence DNA z RNA v izolátů, o které je předpokládáno, že je retrovirová, použitím aktivity reverzní transkriptázy, který se nachází v tomto izolátů. Tato aktivita reverzní transkriptázy ne- 39může teoreticky fungovat jinak, než v přítomnosti virální RNA, vázané k tRNA primerů nebo hybridizované na krátká vlákna již reverzně transkribované DNA v retrovirálních částicích (19). Takto tedy bylo získání specifických retrovirálních sekvencí v materiálu, kontaminovaném buněčnými nukleovými kyselinami, optimalizováno podle těchto autorů díky specifické enzymatické ampíifikací částí virální RNA pomocí virální aktivity reverzní transkriptázy. Za tímto účelem autoři určili speciální fyzikálněchemické podmínky ve kterých tato aktivita reverzní transkriptázy na RNA, obsaženou ve virionech, může být účinná in vitro. Tyto podmínky odpovídají technickému popisu protokolů, popsaných níže (reakce endogenní reverzní transkriptázy, purifikace, klonování a sekvenace).

Molekulární přístup spočíval v použití předem připravených koncentrovaných, ale nepurifikovaných virionů, získaných ze supernatantu kultury linie PLI-2, připravené následující metodou: supernatanty kultury jsou sbírány dvakrát týdně, předběžně centrifugovány při 10 000 otáčkách za minutu po 30 minut pro eliminování buněčných zbytků a potom zmrazený na -80°C nebo použity takové, jaké jsou v následujících etapách. Supernatanty v čerstvém stavu nebo zmražené jsou centrifugovány na vrstvě 30 % PBS-polyglycerolu při 100 OOOg (nebo 30 000 otáček za minutu v přístroji LKB-HITACHI typu 45 T) po 2 hodiny při 4°C. Po odstranění supernatantů je sediment vyjmut rozpuštěním v malém objemu PBS a představuje frakci koncentrovaných ale nepurifikovaných virionů. Tento koncentrovaný, ale nepurifikovaný vzorek je použit pro provedení reakce, nazývané endogenní reverzní transkripce, takové, jaká je popsána dále: 200 μΐ virionů, purifikovaných výše popsaným způsobem a obsahu- 40jících aktivitu reverzní transkriptázy zhruba 1-5 milionů dpm je rozmraženo při 37°C až do objevení se kapalné fáze, potom umístěno na led. Pětkrát koncentrovaný pufr se připraví z následujících složek: Tris-HCl pH 8,2, 500 mM; NaCl 75 mM; MgCL· 25 mM; DTT 75 mM a NP 40 0,10 %. 100 μΐ pufru 5X -{- 25 μϊ roztoku dATP 100 mM 4- 25 μϊ roztoku dTTP 100 mM + 25 μϊ roztoku dGTP 100 mM + 25 μϊ roztoku sCTP 100 mM + 100 μϊ sterilní destilované vody + 200 μϊ suspenze virionů (aktivita reverzní transkriptázy 5 milionů DPM) v PBS se smíchají a inkubují při 42³C po 3 hodiny. Po této inkubaci se reakční směs přímo přidá k pufrované směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol (Sigma ref. P 3803); vodné fáze se odeberou a k organické fázi se přidá sterilní destilovaná voda, aby se reextrahoval residuální nukleový materiál. Odebrané vodné fáze se sloučí a v nich obsažené nukleové kyseliny se precipitují přidáním octanu sodného 3M, pH 5,2 do 1/10 dílu 4- 2 dílů ethanolu + 1 μΐ glykogenu (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) a vzorek se umístí při -20°Cpo 4 hodiny nebo noc při +4°C. Precipitát získaný po centrifugování je potom promýván 70 % ethanolem a resuspendován v 60 ml destilované vody. Produkty této reakce potom jsou purifikovány, klonovány a sekvencovány podle protokolu, který je popsán dále: byly vytvořeny DNA s volnými konci a nespárovanými adeniny na koncích: nejprve byla provedena reakce “zaplnění”: 25 μϊ roztoku předem purifikované DNA byl smícháno s 2 μΐ roztoku 2,5 mM obsahujícímu v ekvimolárním množství dATP + dGTP + dTTP + dCTP / 1 μΐ DNA polymerázy T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1004 786) / 5 μΐ 10 X “inkubačního pufru pro restrikční enzym” (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975) / 1 μΐ 1 % roztoku hovězího serumalbuminu / 16 μΐ sterilní destilované vody. Tato směs byla inkubována 20

- 41minut při ll’C. K tomu bylo přidáno 50 μΐ pufru TE a 1 μΐ glykogenu (Boehringer-Mannheim ref. 901 393j před extrakcí nukleových kyselin směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol (Sigma ref. P 3803) a precipitací v octanu sodném, jak bylo popsáno výše. DNA precipitovaná po centrifugaci byla resuspendována v 10 μΐ pufru 10 mM Tris pH 7,5. Potom bylo 5 μΐ této suspenze smícháno s 20 μΐ pufru Taq 5X, 20 μΐ 5mM dATP, 1 μΐ (5 U) Taq DNA polymerázy (Amplitaq™) a 54 μΐ sterilní destilované vody. Tato směs byla inkubována 2 hodiny pti 75°C s olejovým filmem na povrchu roztoku. DNA v suspenzi ve vodném roztoku, odebraná zpod olejového filmu po inkubaci, byla precipitována tak, jak bylo popsáno výše a resuspendována v 2 μΐ sterilní destilované vody. Získaná DNA byla vložena do plasmidu s využitím soupravy TA Cloning™. 2 micro 1 roztoku DNA bylo smícháno s 5 μΐ sterilní destilované vody, 1 μΐ ligačního pufru 10 krát koncentrovaného “10X LIGATION BUFFER”, 2 μΐ “pCR™VECTOR” (25 ng/ml) a 1 μΐ “TA DNA LIGASE”. Tato směs byla inkubována po jednu noc při 12°C. Následující etapy byly realizovány v souladu s instrukcemi soupravy TA Cloning ® (British Technology). Po ukončení procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (white) přeočkovány za účelem kultivace a umožnění extrakce obsažených plasmidů procedurou, která je nazývána “miniprep” (16). Příprava plasmidů z každé rekombinantní kolonie byla přerušena vhodným restrikčním enzymem a analyzována na gelu agarózy. Plasmidy, obsahující insert, detekované pod UV zářením po označení gelu bromidem ethidia byly vybrány pro sekvenování insertu po hybridizaci s komplementárním primerem promotoru Sp6, který je přítomen v klonovacím plasmidu soupravy TA Cloning Kit ® . Potom byla provedena reakce, předcházející sekvenaci, podle metody

- 42doporučené pro použití sekvenační soupravy “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384) a automatická sekvenace byla provedena přístrojem “Automatic Sequencer, model 373 A” firmy Applied Biosystems, postupujíce podle návodu výrobce.

Diskriminační analýza sekvencí klonovaných z fragmentů DNA, přítomných v reakční směsi, provedená v informačních databázích, dovolila prokázat přítomnost sekvence retrovirálního typu. Odpovídající klon PSJ17 byl plně sekvenován a získaná sekvence, podaná na obr. 8 a označená jako SEQ ID NO 9 byla analyzována pomocí programu “Geneworks ® ” na aktualizované databázi “Genebank ® ”. Analýza databází neumožnila nalezení sekvenci, která by byla identická zde popsané sekvenci. Bylo možno nalézt pouze částečnou homologii s některými známými retrovirálními elementy. Nejzajímavější relativní homologie se týká endogenního retroviru ERV-9 nebo HSERV-9 podle reference (20).

PŘÍKLAD 4: PCR amplifikace nukleové sekvence obsažené mezi oblastí 5’, definované klonem “pol MSRV-1B” a oblastí 3’, definované klonem PSJ17

Bylo definováno pět oligonukleotidů, M001, M002-A, M003BCD, P004 a P005 pro amplifikaci RNA, pocházející z purifikovaných virionů POL-2. Byly provedeny kontrolní reakce, aby byla přezkoušena přítomnost kontaminantů (reakce s vodou). Amplifikace spočívala v etapě RT-PCR podle protokolu, popsaného v příkladu 2, následované “zahnízděnou” PCR podle protokolu, popsaného v dokumentu EP-A-0569272. V prvním cyklu RT-PCR byly použity primery M001 a P004 nebo P005. V dru- 43hém cyklu PCR byly použity primery M002-A nebo M003-BCD a primer P004. Primery byly umístěny následujícím způsobem:

M002-A

M003-3CD

M001 _

P004 POO5

PSJ17

ARN

POL-2 <---------->

pol MSRV-1

Složení primerů bylo:

primer M001: GGTC ITICCICAIGG (SEQ ID NO 20) primer M002-A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT (SEQ ID NO 21) primer M003-BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT (SEQ ID NO 22) primer P004: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT (SEQ ID NO 23) primer P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT ( SEQ ID NO 24)

Získaný produkt “zahnízděné” amplifikace, označený M003P004, je podán na obr. 7 a odpovídá sekvenci SEQ ID NO 8.

PŘÍKLAD 5: Amplifikace a klonování části genomu retrovirů MSRV-1 pomocí již identifikované sekvence, ve vzorku viru, purifikovaného na vrchol aktivity reverzní transkriptázy

Byla použita technika PCR, odvozená od techniky, kterou publikoval Frohman (21). Odvozená technika dovoluje za pomoci specifického primeru na 3’ konci genomu, určeného k amplifikaci, prodlužovat sekvenci směrem ke konci 5’ genomu, určeného

- 44k analyzování. Tato varianta techniky je popsána v dokumentaci firmy “Clontech Laboratories lne., (Palo-Alto, Calif., USA), dodávané s jejím produktem “5’-AmpliFINDER^T^¹ Race Kit”, který byl použit na frakci purifikováných virionů, jak je popsáno výše.

Specifické 3’ primery, použité v protokolu soupravy pro syntézu cDNA a amplifikaci PCR jsou komplementární k následujícím MSRV-l sekvencím:

cDNA: TCATCCATGTACCGAAGG (SEQ ID NO 25) amplifikace: ATGGGGTTCCCAAGTTCCCT SEQ ID NO 26)

Produkty, vzešlé z PCR byly purifikovány po purifikaci na gelu agarózy konvenčními metodami (16), poté resuspendovány v 10 ml destilované vody. Vzhledem k jedné vlastnosti polymerázy Taq, spočívající v přidání adeninu na každý z 3’ konců obou vláken DNA, získaná DNA byla přímo vložena do plasmidu pomocí soupravy TA Cloning^T^^r (British Biotechnology). 2 μϊ roztoku DNA byly smíchány s 5 μϊ sterilní destilované vody, 1 μϊ ligačního 10 krát koncentrovaného pufru “10 X LIGATION BUFFER”, 2 μϊ “pCR™ VECTOR” (25 ng-ml) a 1 μϊ “TA DNA LIGASE”. Tato směs byla inkubována po jednu noc při 12°C. Následující etapy byly realizovány v souladu s instrukcemi soupravy TA Cloning ® (British Biotechnology). Na konci procedury byly bílé kolonie rekombinantních bakterií (white) přeočkovány za účelem kultivace a extrakce obsažených plasmidů procedurou, která je nazývána “miniprep” (16). Příprava plasmidů každé rekombinantní kolonie byla přerušena vhodným restrikčním enzymem a analyzována na gelu agarózy. Plasmidy, obsahující insert určený pod UV zářením po označení

- 45gelu bromidem ethidia, byly selektovány pro sekvenaci insertu po hybridizací s komplementárním primerem promotoru Sp6 na klonovacím plasmidu soupravy TA Cloning Kit ® . Poté byla provedena reakce, předcházející sekvenaci, podle metody doporučené pro použití sekvenacní soupravy “Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems, ref. 401384) a následovala automatická sekvenace, prováděná přístrojem “automatic sequencer, model 373 A” Applied Biosystems podle instrukcí výrobce přístroje.

Tato technika byla nejprve aplikována na dvě frakce purifikovaných virionů, jak je popsáno dále, na sacharóze vycházejíce z izolátu “POL-2”, produkovaného linií PLI-2 na jedné straně a vycházejíce z izolátu MS7PG, produkovaného linií LM7PC na druhé straně: supernatanty kultury jsou odebírány dvakrát týdně, předběžně centrifugovány při 10 000 otáčkách za minutu po 30 minut pro eliminaci buněčných zbytků a potom zmrazený při -80°C nebo použity takové, jaké jsou v následujících etapách. Supernatanty v čerstvém stavu nebo zmraženéjsou centrifugovány na vrstvě 30 % PBS-polyglycerolu při 100 OOOg (nebo 30 000 otáček za minutu v přístroji LKB-HITACHI typu 45 T) po 2 hodiny při 4°C. Po odstranění supernatantu je sediment vyjmut rozpuštěním v malém objemu PBS a představuje frakci koncentrovaných ale nepurifikovaných virionů. Koncentrovaný virus je potom vložen na gradient sacharózy v sterilním pufru PBS (15 až 50 % hmotnostních) a ultracentrifugován při 35 000 otáčkách za minutu (100 000 g) po 12 hodin při 4°C. Bylo získáno 10 frakcí, 20 μ\ každé frakce bylo odebráno po homogenizaci, aby zde byla měřena aktivita reverzní transkriptázy technikou, kterou popsal H. Perron (7). Frakce, obsahující špičku aktivity

- 46reverzní transkriptázy “typu LM7” byly potom zředěny ve sterilním pufru PBS a ultracentrifugovány po jednu hodinu při 35 000 otáčkách za minutu (100 000 g). aby virální částice sedimentovaly. Takto získaný sediment purifikovaných virionů byl potom vyjmut rozpuštěním v malém objemu pufru, adekvátního pro extrakci RNA. Reakce syntézy cDNA, uvedená výše, byla provedena na tuto RNA, extrahovanou z purifikovaných extracelulárních virionů. Amplifikace PCR technikou, uvedenou výše, dovolila získat klon Fl-11, jehož sekvence, označená jako SEQ ID NO 2, je podána na obr. 8.

Tento klon dovolil definovat spolu s různými již sekvenovanými klony reprezentující oblast genu pol” retroviru MSRV-1, tak jak je znázorněna na obr. 9. Tato sekvence, označená jako SEQ ID NO 1 je rekonstituována z různých kmenů, překrývajících se na svých koncích, po eliminaci artefaktů, vztahujících se k primerům a technikám amplifikace nebo klonování, které uměle přerušují čtecí rámec systému jako celku.

Na obr. 9 je pod sekvencí nukleových kyselin znázorněn potenciální čtecí rámec s jeho překladem na aminokyseliny.

PŘÍKLAD 6: Zachycení, amplifikace a klonování části genomu MSRV-2 pomocí již identifikované sekvence v kultuře infikované MSRV-2

Supernatanty buněčné kultury, exprimující aktivitu reverzní transkriptázy “typu LM7”, podobnou aktivitě, kterou popsal H. Perron (7), byly pravidelně odebírány po několik týdnů a konzervovány zmrazené na -80°C po přidání 10 % glycerolu. Soubor supernatantů byl potom rozmražen za účelem koncentrace infek- 47tujících částic ultracentrifugací a purifikace rovnovážnou centrifugací na gradientu sacharózy; aktivita reverzní transkriptázy byla potom měřena v různých získaných frakcích na gradientu metodou, kterou popsal H. Perron (14).

Různé frakce, představující špičku účinku reverzní transkriptázy byly spojeny pro extrakci nukleových kyselin pomocí protokolu, určeného na purifikaci RNA (15), ale extrahované nukleové kyseliny nebyly ošetřeny DNázou. Přímo na tento vzorek nukleových kyselin, neošetřených DNázou, byla provedena amplifikace PCR, odvozená od techniky, kterou popsal Shih (8), podle postupu amplifikace RNA, který je popsán v dokumentu EP-A-0 569 272, v celkovém objemu 100 μΐ, obsahujícím 200 ng RNA, μΐ 1 RNA Guard, 33 μηιο^ každé směsi primerů (MOP) popsaných Shihem (8) a identických primerům, použitým pro přímou PCR (DNA); dále bylo do vzorků přidáno 0,25 mM každého dNTP, 10 μΐ pufru 10X, 2,5 u enzymu Taq a 0,4 μΐ enzymu RT (RT-AMV; 10 u). Amplifikační cykly byly realizovány následujícím způsobem: denaturace RNA 65°C/10 minut, syntéza cDNA 50°C/8 minut, potom cykly identické cyklům PCR, popsaným Shihem (8). Byly provedeny kontrolní reakce, určené na ověření nepřítomnosti kontaminantů (reakce na vodě). Produkty byly analyzovány na acrylamidovém gelu 10 %.

Vzorky amplifikované pomocí RT-PCR byly potom klonovány a sekvenovány technikami, popsanými v příkladu 1.

Majoritní část sekvencovaných klonů, vzešlých z produktů RT-PCR, odpovídala sekvenci MSRV-2A a jejímu ekvivalentu MSRV-2B, které již byly popsány v příkladech 1 a 2.

- 48Navíc se ukázalo, že po eliminaci artefaktálních sekvencí ostatní sekvencované klony odpovídaly sekvencím typu MSRV-1, tak jak byla popsána v příkladu 1 a 2.

Po verifikaci sekvencí, přítomných v tomto nukleovém materiálu, pocházejícím z purifikovaných frakcí, obsahujících infektující částice, jejichž alespoň Část je asociována s aktivitou reverzní transkriptázy, byl zbývající materiál použit pro specifické zachycení nukleových kyselin nesoucích sekvenci MSRV2, která již byla identifikována a popsána v příkladech 1 a 2.

V předběžné etapě byl genetický materiál, nesoucí sekvenci MSRV2, amplifikován jednosměrnou PCR technikou s 50 cykly za pomoci jediného primeru. Tento primer je vázán k molekule biotinu na svém 3’ konci, dovoluje jednosměrnou amplifikaci od 3’ k 5’ a odpovídá následující sekvenci, která je označena jako SEQ ID NO 33:

5’ TAAAGATCTAGAATTCGGCTATAGGCGGCATCCGGCAACT 3’

Poté bylo provedeno zachycení v roztoku s magnetickými kuličkami, vázanými s avidinem (Dynabeads ® ) podle instrukcí výrobce (Dynal) a po sérii promývání při teplotě okolí, dovolujících vymytí nukleových kyselin, které nejsou zachyceny biotinem, byla provedena PCR přímo na promyté kuličky s primerem specifickým v 3’ a primerem v 5’ neseným roztokem oligonukleotidu s 10 bázemi (10-mer) s náhodnou sekvencí.

Specifický primer, orientovaný od 3’ k 5’ odpovídal sekvenci, označené jako SEQ ID NO 13:

5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’

- 49PCR provedená při 35°C s 40 cykly a s těmito primery dovolila amplifikovat genetický materiál, specificky biotinovaný v první etapě PCR a zachycený na kuličkách Dynabeads ® . Po klonování DNA, amplifikované touto druhou etapou PCR, s využitím soupravy “TA Cloning” a sekvenaci rekombinantních klonů, využívajíce při tom techniky, popsané v příkladu 1, byla získána sekvence o 748 párech bází. Tato sekvence nukleových kyselin, označená SEQ ID NO 12, je podána na obr. 10. Tato prodloužená sekvence bude dále označována jako MSRV-2EL1.

Inverzní komplementární sekvence primeru SEQ ID NO 13 je přítomna na konci 3’ a je na obr. 10 zobrazena v rámečku. Na přední straně tohoto primeru lze nalézt sekvenci, která již byla identifikována v klonech MSRV-2A a MSRV-2B.

Překlad této sekvence na aminokyseliny podle 6 možných čtecích rámců je podána na obr. 11.

Souběžné porovnání sekvence MSRV2-A (SEQ ID NO 10) se sekvencí MSRV-2EL1 ( SEQ ID NO 12) je podána na obr. 12. Je možné si povšimnout, že sekvence MSRV-2A je striktně identická prodloužené sekvenci, s výjimkou několika odchylek v oblasti odpovídající degenerovaným primerům, použitým pro získání MSRV-2A. Tato oblast je na obrázku podtržena; mimo to je v rámečku zobrazena hybridizační oblast primeru SEQ ID NO 13 (s výjimkou klonovacího konce) a hybridizační oblast primeru SEQ ID NO 14 je znázorněna v hranatých závorkách. Skutečná sekvence genomu MSRV-2 v této oblasti je pravděpodobně tatáž jako MSRV-2EL1, kde nebyla vynucena hybridizovanými příměry s nízkou stringencí, jak je tomu v případě MSRV-2A (a stejně tak u MSRV-2B).

- 50Sekvence MSRV-2EL1 tedy odpovídá nové sekvencované oblasti genomu MSRV-2. To bylo ověřeno pomocí nových primerů PCR, definovaných v MSRV-2EL1 a MSRV-2A, které dovolily specifickou amplifikaci nukleových kyselin, použitých pro klonování v tomto příkladu.

Výsledek prohledávání databáze Genebank ® , aktualizované v srpnu 1994, na sekvenci MSRV-2EL1 neukazuje žádnou významnou homologii se sekvencemi, známými v té době. Nicméně dotaz na možné překlady této sekvence MSRV-21L1 na aminokyseliny podle 6 možných čtecích rámců ukazuje částečné homologie se sekvencemi bakteriálními, virálními a buněčnými.

Absence amplifikace PCR se specifickými primery na normální lidské DNA ukazuje, že se nejedná o sekvenci buněčného původu. Nicméně degenerovaná povaha směsi primerů. použitých ve variantě techniky, popsané Shihem (8), které dovolily identifikaci prvních elementů sekvence, označené MSRV-2 A a MSRV-2B, mohly způsobit, že byl nepředvídaně amplifikován genom, který nenáleží retrovirů a dokonce ani genu, kódujícímu RNA-dependentní DNA-polymerázu.

PŘÍKLAD 7: Kultura buněk kloubní tekutiny pacientů, trpících revmatickou artritidou a detekce aktivity transkriptázy, podobnému aktivitě produkovaného kulturou LM7

Z kolenního kloubu, zasaženého zánětlivým procesem pacienta, trpícího revmatickou artritidou, byla sterilně odebrána kloubní tekutina. Tato tekutina byla centrifugována při + 4°C a 1800 otáčkách za minutu po 10 minu. Po odebrání supernatantů a jeho rozdělení do alikvotů při -80°C byl buněčný sediment

- 51vyjmut do RPMI kultivačního prostředí o následujícím složení: prostředí RPMI 1640 s přidáním penicilinu (200 000 u/1), steptomycinu (200 mg-1), L-glutaminu (6 mM/Ι), pyruvátu (1 %), neesenciálních aminokyselin (1 %), popřípadě polyklonální protilátky proti lidskému beta interferonu (10 U/ml) a 20 % telecího fetálního séra dekomplementovaného inkubací při 56°C po 30 minut. Tyto buňky v suspenzi byly přemístěny do malé kultivační nádobky (25 cm³) a objem byl doplněn 5 ml výše popsaného kultivačního prostředí, ve kterém byly buňky udržovány v kultuře in vitro v inkubátoru při 5 % CO2 a 37°C.

Po 4 dnech bylo kultivační prostředí nahrazeno čerstvým prostředím stejného složení a odebraným prostředím, centrifugovaným při 1800 otáčkách za minutu po 10 minut. Supernatant byl rozdělen do alikvotů a uchováván při -80°C; sediment sestávající z buněk, které nepřilnuly ke kultivační nádobě byl vyjmut v kultivačním prostředí a umístěn v jiné nádobě. Tyto buňky byly kultivovány stejně jako buňky v suspenzi.

Kultivační prostředí bylo vždy měněno alespoň dvakrát týdně.

Po třech týdnech kultivace kultivační nádoba, ve které byl proveden první běh kultivace buněk patologické kloubní tekutiny, obsahovala buňky, náležející k makrofágovému typu a jiné, fibroblastického typu, které vykazovaly množení “desek” mitóz. Tyto rozmnožovací “desky” postupně pokryly spodní část povrchu kultivační nádoby a ve stádiu konfluence byly tyto fibroblastické buňky sebrány seškrábáním a rozděleny do dvou nádob o 25 cm³ s 5 ml kultivačního prostředí. Tyto přilnuté buňky byly potom kultivovány a rozdělovány tolikrát, kolikrát to jejich schopnost množení dovolovala. Ukázalo se, že po šestém opa- 52kování, to jest asi po dvou měsících kultivace, se fibroblastické buňky přestaly množit a kultivační nádoby byly uchovávány až do degenerace buněk.

V kultivačních nádobách, které sloužily pro buňky v suspenzi, především pro buňky lymfoidního typu, se buňky makrofágového nebo fibroblastického typu někdy objevily pozdě. Lymfoidní buňky v suspenzi degenerovaly, aniž by se rozmnožily a neuchovaly se v kultuře po třech týdnech.

Soubor supernatantů kultur ze všech kultivačních nádob byl uchováván, rozdělený do alikvotů, při -80°C.

Hledání případného retrovirálního činitele produkovaného buňkami patologické kloubní tekutiny pacienta, trpícího revmatickou artritidou, nejprve spočívalo v hledání aktivity reverzní transkriptázy za různých fyzikálně-chemických podmínek, dovolujících neselektivní detekci takovéhoto enzymu, kódovaného retrovirem, který nebyl předem znám, tak jak to bylo provedeno H. Perronem a kol. při hledání aktivity reverzní transkriptázy v supernatantech buněčných kultur nervového systému u roztroušené mozkomíšní sklerózy (7). Podmínky detekce specifického signálu aktivity reverzní transkriptázy v supernatantech buněčných kultur pocházejících z kloubní tekutiny v tomto případě revmatické artritidy se ukázaly jako velmi blízké podmínkám, za nichž bylo dosaženo optima detekce retrovirů, produkovaných kulturou LM7, pocházející z případu roztroušené mozkomíšní sklerózy. Bylo tedy ověřováno, zda tato aktivita může být detekována za stejných podmínek jako pro retrovirus MSRV1/LM7, izolovaný u roztroušené mozkomíšní sklerózy, po provedení rovnovážné sedimentace na gradientu sacharózy, i u koncentrátu

- 53částic, pocházejících ze supernatantů kultur kloubní tekutiny u revmatické artritidy.

Série supernatantů buněčných kultur, odvozených z kloubní tekutiny v tomto případě revmatické artritidy byla rozmražena, aby byl získán celkový objem alespoň 100 ml. Tyto supernatanty byly smíseny, precentrifugovány, aby byly odstraněny buněčné zbytky, ultracentrifugovány pro sedimentaci případných retrovirálních částic a takto vzniklý sediment byl umístěn na gradient sacharózy, který byl potom centrifugován při 100 000 g, aby bylo dosaženo separace elementů, přítomných v sedimentu ultracentrifugace a potom, po získání frakcí o stejných objemech a s rostoucí hustotou sacharózy, byla v každé frakci zkoumána aktivita reverzní transkriptázy. Soubor těchto operací byl prováděn za podmínek, které popsal H. Perron (14).

Výsledek zkoumání aktivity reverzní transkriptázy za podmínek optimalizovaných pro kmen LM7 ve frakcích gradientu pro revmatickou artritidu je znázorněn na obr. 13. Je možno vidět, že signifikativní aktivita reverzní transkriptázy (vyšší než “cutoff” 2000 dpm) byl nalezen u frakcí 2 až 5, stejně tak jako u frakce 9. Aktivita nalezená u frakcí, které nejsou tak husté, byla špatně soustředěna, což je pravděpodobně způsobeno přebytkem materiálu, nacházejícího se v gradientu (zkumavka 5 ml). Sekundární maximum u hustších frakcí (č. 9) je pravděpodobně tvořeno hustšími viriony, které ztratily svůj obal (kapsidy), stejně tak jako to bylo pozorováno u virionů, produkovaných linií LM7 (14)V této etapě prací provedených s buněčnými kulturami kloubní tekutiny, pocházejícími z revmatické artritidy se zdá, že kul- 54tury produkují částice, obsahující reverzní transkriptázu stejného typu, jako je transkriptáza nalezená ve virionech, produkovaných leptomeningními buňkami LM7 roztroušené mozkomíšní sklerózy.

PŘÍKLAD 8: Kultura lymfoblastických buněk B pacientů, trpících revmatickou artritidou

Protokolem, který je dobře znám odborníkům, byly z lymfocytů B periferní krve pacientů, trpících revmatickou artritidou, získány lymfoblastické linie, imortalizované přidáním in vitro kmene B95 Epstein-Barrova viru (EBV) nebo autologickým kmenem, nacházejícím se v lymfocytech B pacienta.

Ve stručnosti lze říci, že mononukleové krevní buňky byly separovány centrifugací na gradientu Ficoll-Hypaque ® (Flow/ICN), promývány centrifugací v RPMI 1640, potom vyjmuty v prostředí, obsahujícím RPMI 1640 s přidáním penicilinu (200 000 u/1), steptomycinu (200 mg/1), L-glutaminu (6 mM/Ι). pyruvátu (1 %), neesenciálních aminokyselin (1 %), pufru HEPES (1 %) a 20 % telecího fetálního séra dekomplementovaného inkubací při 56°C po 30 minut. Tyto buňky v suspenzi byly přemístěny do malé kultivační nádobky (25 cm³) a objem byl doplněn 5 ml výše popsaného kultivačního prostředí, ve kterém byly buňky udržovány v kultuře in vitro v inkubátoru při 5 % CO? a 37°C.

Prostředí byly obnovovány z jedné poloviny dvakrát týdně: po dekantaci nádob, umístěných vertikálně, po alespoň 2 hodiny byla polovina supernatantu prostředí odebrána (a uchovávána zmrazená na -80°C, jakmile se linie etablovala) a byla nahrazena čerstvým prostředím, ve kterém byly v emulzy sedimen- 55tované lymfocyty. Po etablování linie v nádobě byla dosažena dostatečná buněčná hustota, buňky takto emulzifikované se pipetou rozdělí do dvou nádob a kultura se takto rozdělí na dvě části.

Po separaci na Ficollu byly lymfoidní buňky vystaveny přítomnosti cyklosporinu A po 10 až 20 dní, aby byla umožněna inhibice a eliminace lymfocytů T z kultury, neboť ty mají schopnost blokovat imortalizaci lymfocytů B, přítomných v kultuře, virem EBV.

V závislosti na případu je kultura buď udržována taková, jaká je po ošetřením cyklosporinem A, aby bylo dosaženo případného objevení se imortalizace lymfocytů B kmenem EBV, který nese sám pacient (jestliže je séropozitivní na tento virus) a nebo je 1 ml supernatantu linie B95 produkující virion EBV, po indukci forbolesterem kyseliny máselné přidáno do kultivační nádoby, aby bylo dosaženo masivní infekce přítomných lymfocytů B kmenem B95 a tedy daleko pravděpodobnější imortalizace některých klonů B.

Kultivační nádoby, obsahující lymfocyty v suspenzi jsou udržovány v kultivačních podmínkách alespoň tři měsíce, po kterých je optickým mikroskopem sledováno objevení se imortalizovaných lymfocytů B, množících se ve formě “shluků” buněk, plovoucích v kultivačním prostředí.

Jakmile se objevily lymfoblastické linie, pocházející od pacientů trpících revmatickou artritidou, byly pravidelně rozdělovány a nepřetržitě kultivovány. Supernatanty, sbírané dvakrát týdně při výměně kultivačního prostředí, byly zmrazený při - 5680°C pro následující analýzu: aktivita reverzní transkriptázy, PCR detekce genomů patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů, exprimovaných buňkami B v prostředí atd. Použití těchto buněk pro prokázání a charakterizaci patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů, vázaných k revmatické artritidě budou podány v následujících příkladech.

PŘÍKLAD 9: Získání klonů MSRV-2 a MSRV-1 amplifikaci konzervovaných oblastí pol RNA-dependentních DNA genů na patogenním a/nebo infekci způsobujícím činiteli, purifikovaném z kultury buněk kloubní tekutiny nebo z lymfoblastické linie revmatické artritidy

Molekulární přístup spočíval, stejné tak jako v příkladu 1, v použití techniky PCR, kterou popsal Shih (8) a která dovoluje amplifikovat relativně konzervovanou oblast genu pol exogenních a endogenních retrovirů. ale také virů, kódujících enzym s aktivitou reverzní transkriptázy, jako je zejména virus hepatitidy B a implicitně všechny geny RNA-dependentní DNA polymerázy nebo enzymy vykazující dostatečné homologie sekvencí v oblastech definovaných použitými amplifikačními primery. Tato technika PCR byla použita na nukleové kyseliny, extrahované z předem připravených purifikovaných infikujících činitelů na gradientu protokolem, který popsal H. Perron (14), vycházejíce z supernatantů buněčné kultury patologické kloubní tekutiny v případě revmatické artritidy, získané protokolem popsaným v příkladu 7. Frakce, obsahující špičku aktivity reverzní transkriptázy, měřené v podmínkách optimalizovaných na kmen LM7 (7) byly vyjmuty rozpuštěním v pufru, obsahujícím thiokyanatan guadininu a byly uchovávány při -80°C až do extrakce nukleových kyselin technikou, kterou popsal Chomzyn- 57ski Ρ. (15).

Před provedením reakce PCR byla RNA vzorku transkribována na komplementární DNA (cDNA) pomocí primerů, nazývaných “random” (směs hexanukleotidů) pomocí soupravy “cDNA synthesis systém plus” (Amersham) podle instrukcí výrobce a vycházejíce z přibližné hodnoty množství RNA, přítomné ve vzorku, odhadnuté s přesností na nejbližší log faktor. Alternativně je možno syntézu cDNA provést přímo v přítomnosti primerů. použitých pro PCR podle protokolu “RT-PCR” v jedné etapě, jak je popsáno v dokumentu EP-A-0569272.

DNA získaná amplifikaci PCR z cDNA byla vložena do plasmidu s pomocí soupravy TA Cloning ® (British Biotechnology), replikována, extrahována a sekvenována protokolem, který byl popsán v příkladech 1 a 2.

Získané sekvence potom byly analyzovány pomocí programu Mac Vector ® a Geneworks ® na informační databázi Genebank ® pro nukleové sekvence a Swiss Prot ® pro sekvence aminokyselin, odvozené z čtecích rámců pro sekvence nukleových kyselin. Analýza sekvencí, získaných ze vzorků částic, sedimentujících ve špičce aktivity reverzní transkriptázy a pocházejících z rozmražených supernatantů buněčných kultur kloubní tekutiny revmatické artritidy prokázala přítomnost dvou typů sekvencí: první typ sekvencí, nacházející se u minoritní části klonů, odpovídal sekvencím signifikantně homologickým ekvivalentní oblasti “pol” retroviru MSRV-1, již dříve izolovaného a charakterizovaného u pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou (přihlášky francouzských vynálezů 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 10532) a

- 58druhý typ sekvencí, nacházející se u majoritní části klonů, který odpovídá sekvenci, velmi silně homologické sekvenci, připisované infekci způsobujícímu a/nebo patogennímu činiteli, označenému MSRV-2, již dříve izolovanému a charakterizovanému u pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou (přihlášky francouzských vynálezů 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01-529, 94 01530, 94 01531, 94 10532) .

Porovnání sekvence typu MSRV-l, ampifikované a klonované z virálního materiálu produkovaného buněčnou kulturou kloubní tekutiny revmatické artritidy (klon “MSRVlpolPR”, SEQ ID NO 39) a referenčních sekvencí MSRV-l, klonovaných z virionů, produkovaných buňkami, pocházejícími od pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou, je podáno na obr. 14.

Porovnání sekvence typu MSRV-2, ampifikované a klonované z infekci způsobujícího materiálu produkovaného buněčnou kulturou kloubní tekutiny revmatické artritidy (klon “MSRV2sPR”, SEQ ID NO 40) a referenčních sekvencí MSRV-2, klonovaných z infekci způsobujícího materiálu, produkovaných buňkami, pocházejícími od pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní skleró zou, je podáno na obr. 15.

Dva typy sekvencí, nalezených s degenerovanými primery “reverzních transkriptáz” podle Shiha a kol. (8) tedy odpovídají přesně těm, které byly nalezeny za podobných podmínek v kulturách leptomeningních buněk, plexus choroideus a lymfoblastických linií B pocházejících od různých pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou (přihlášky francouzských vynálezů 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 10532).

- 59PŘÍKLAD 10: Verifikace přítomnosti sekvencí MSRV-1 a MSRV2 v supernatantu kultury buněk a přímo v biologických tekutinách pacientů trpících revmatickou artritidou za pomoci specifických primerů PCR a specifické hybridizace podle techniky Elosa

Bylo použito několik technik PCR pro detekci genomů MSRV1 a MSRV-2 v supernatantech buněčných kultur, plasmy a kloubních tekutinách pacientů, trpících revmatickou artritidou a pacientů, trpících dalšími revmatickými onemocněními (jinými než revmatická artritida).

Extrakce RNA z plasmy a supernatantu kultur bylo provedeno pomocí techniky, kterou popsal P. Chomzynski (15), po přidání objemu pufru. obsahujícího thiokynanát guanidinu, na 1 ml plasmy nebo supernatantu kultury, uchovávané po získání zmražené na -80°C.

Extrakce RNA kloubní tekutiny a mononukleových krevních buněk (lymfocytů a monocytů) byla provedena následujícím protokolem:

všechny roztoky jsou realizovány v destilované vodě, ošetřené DEPC pro odstranění všch stop RNázy;

500 μΐ až 1 ml kloubní tekutiny bylo rozmraženo a byla přidána jedna setina objemu 20 % roztoku SDS stejně tak jako roztok proteinázy K v poměru 7 μΐ na ml kloubní tekutiny; tekutina je krátce zamíchána a inkubována při 37°C po adici RNAsinu (Boehringer) nebo RNA guardu (Pharmacia); po 1 hodině inkubace byl přidán 1 objem pufru GUT podle Chomzynského (15) a směs je okamžitě zamíchána. Poté je RNA ve směsi extrahována podle výše uvedeného protokolu, který popsal Chomzynski (15).

- 60Sekvence MSRV-2EL1 ( SEQ ID NO 12) dovolila definovat několik párů oligonukleotidových primerů pro detekci MSRV2, použitelných pro amplifikaci specifické DNA nebo RNA technikou PCR.

První páry primerů MSRV2, definovaných níže, dovolily realizovat specifickou detekci genomu MSRV-2 v různých lidských buňkách v jedné etapě PCR nebo RT-PCR podle postupu amplifikace RNA, tak, jak je to popsáno v dokumentu EP-A-0 569 272.

Použité primery byly následující: primer 5’, označený jako SEQ ID NO 14 5’ GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3^: primer 3’, označený jako SEQ ID NO 15 5^: GCATCCGGCAACTGCACG 3’

PCR byla prováděna v posloupnosti 35 po sobě následujících cyklech po etapě syntézy cDNA jako 1 min při 94°C, 1 min při 54°C a 1 min při 72°C.

V tomto příkladu byla všechna RNA, extrahovaná z různých typů buněk (15), neošetřená DNázou, použita v této reakci RTPCR, což dovolilo detekci specifických RNA a DNA patogenu v extraktu nukleových kyselin obohaceném o RNA. Náš příklad ukázal, že specifická DNA MSRV-2 může být snadno detekována v nukleových kyselinách, extrahovaných podle výše uvedeného protokolu, normálně určeného k extrakci RNA.

Sekvence klonu “MSRV2cPR”, amplifikovaného touto technikou s primery PCR SEQ ID NO 14 a SEQ ID NO 15 z buněk,

- 61kult i vo váných, z kloubní tekutiny pacienta, trpícího revmatickou artritidou, je podána na obr. 16. Na obr. 17 a 18 jsou podána souběžná porovnání sekvence klonu “MSRV2cPR” s nukleotidovými sekvencemi MSRV2 SEQ ID NO 10 a SEQ ID NO 12 klonů, získaných od pacientů trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou. Je možno konstatovat, že sekvence pocházející ze vzorků revmatické artritidy a roztroušené mozkomíšní sklerózy jsou signifikantně homologické.

Nové páry primerů MSRV2, definované dále, dovolily realizovat specifickou detekci genomu MSRV-2 v různých biologických tekutinách pacientů dvěmi etapami po sobě následujících PCR (nazývaných zahnízděnou” PCR nebo RT-PCR podle protokolu amplifikace způsobu amplifikace RNA, tak jak je popsán v dokumentu EP-A-0 569 272, přičemž sekvence MSRV-2 mohou být detekovány v biologických vzorcích ve formě RNA nebo DNA.

Tato “zahnízděná” PCR je prováděna na vzorcích nukleových kyselin extrahovaných tak, jak bylo popsáno a neošetřených DNázou.

Primery použité v první etapě o 40 cyklech s hybridizační teplotou 48°C byly následující: primer 5’, označený SEQ ID NO 44 5’ GCCGATATCACCCGCCATGG 3’ primer 3’, označený SEQ ID NO 15 5’ GCATCCGGCAACTGCACG 3’

Po této etapě bylo odebráno 10 μΐ amplifikačního produktu a použito pro realizaci druhé amplifikace PRC, nazývané “ za- 62hnízděná” s primery, situovanými uvnitř již amplifikované oblasti. Tato druhá etapa se provádí s 35 až 40 cykly, při hybridizační teplotě primerů (“annealing”) 50°C. Reakční objem je 100 μΐ.

Primery použité v druhé etapě byly následující: primer 5’, označený SEQ ID NO 45 5’ CGCGATGCTGGTTGGAGAGC 3’ primer 3’, označený SEQ ID NO 46 5’ TCTCCACTCCGAATATTCCG 3’

Výsledky, získané v sérii PCR MSRV-2, prováděné technikou “PCR nested”, popsanou výše, jsou podány v tabulce II, připojené k popisu předkládaného vynález.

Pro MSRV-1 byla amplifikace prováděna ve dvou etapách (“zahnízděná” PCR), předcházená etapou syntézy cDNA. Navíc bylo na vzorek nukleových kyselin předem působeno DNázou a byla provedena kontrolní PCR bez RT (AMV reverzní transkriptáza) ve dvou amplifikačních etapách, aby bylo ověřeno, že amplifikace PCR-RT pochází výhradně z RNA MSRV-1. V případě pozitivní kontroly bez RT byl výchozí vzorek RNA rozdělen na alikvotní části, znovu ošetřen DNázou a znovu amplifikován.

Postup ošetření DNázou bez aktivity RNázy byl následující: extrahovaná RNA byla rozdělena do alikvotních částí v přítomnosti “RNAse inhibitor” (Boehringer-Mannheim) ve vodě, ošetřené DEPC na finální koncentraci 1 /ig na 10 μΐ; do těchto 10 μ\ byl přidán 1 μ\ “RNAse-free DNAse” (Boehringer-Mannheim) a 1,2 μΐ pufru pH 5, obsahujícího 0,1 M/l octanu sodného a 5 mM/1 MgSO4; směs byla inkubována 15 minut v “termocykleru”.

- 63První etapa RT-PCR MSRV-1 může být provedena podle varianty způsobu amplifikace RNA, tak jak je popsán v dokumentu EP-A-0 569 272. Zejména se provádí syntéza cDNA při 42°C po jednu hodinu, ale syntézu cDNA je lépe provést následujícím postupem: RNA, ošetřená DNázou a udržovaná na ledu se na 10 minut ohřeje na 65°C, potom se okamžitě ponoří do ledu; potom se přidá ke směsi, udržované při 42°C v termocykleru, určenému na provádění PDR a obsahujícímu v pufru PCR IX

1.5 mM MgCb, 250 μΜ každého z dNTP, 300-400 nM každého primeru (5’ a 3’ v první etapě PCR). 10 jednotek RT-AMV a

2.5 jednotek Taq v výsledném objemu 100 μΐ; tato směs je udržována při 42°C po 1 až 2 hodiny a potom zahřáta na 95°C po 5 minut, aby byla denaturována RT-AMV. Potom následují amplifikační cykly PCR a je jich provedeno 40 s hybridizační fází primerů (“annealing”) při 53°C po 1 minutu, elongační fází při 72°C po 2 až 3 minut a DNA denaturační fází při 95°C po 1 minutu.

Primery použité v této první etapě byly následující: primer 5’, označený SEQ ID NO 16 δ’ AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3’ primer 3’, označený SEQ ID NO 17 5’ TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3’

Po této etapě bylo odebráno 10 μΐ amplifikačního produktu a použito pro realizaci druhé amplifikace PCR, nazývané “zahnízděná” s primery, situovanými ve vnitřku již amplifikované oblasti. Amplifikačních cyklů bylo 35 až 40, s hybridizační fází primerů (“annealing”) při 53°C po 1 minutu, elongační fází při 72°C po 1 až 2 minuty a DNA denaturační fází při 95°C po 1 minutu. Složení reakční směsi bylo stejné jako v předcházející

- 64fázi s výjimkou, že v tomto případě nebylo přidáno RT-AMV.

Primery použité v této druhé etapě byiy následující: primer 5’, označený SEQ ID NO 18 5’ TCCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3’ primer 3’, označený SEQ ID NO 19 5’ AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3’

Sekvence klonu “MSRVlnPR”, amplifikovaná výše popsanou technikou s primery PCR SEQ ID NO 16 a SEQ ID NO 17 a potom SEQ ID NO 18 a SEQ ID NO 19 z RNA kloubní tekutiny pacienta, trpícího revmatickou artritidou je podána na obr. 19. Na obr. 20 je podáno souběžné porovnání sekvence klonu “MSRVlnPR” s nukleotidovou sekvencí MSRVl SEO ID NO 1 v

referenčního klonu, získaného od pacienta, trpícího roztroušenou mozkomíšní sklerózou. I zde je možno konstatovat, že sekvence pocházející od revmatické artritidy a roztroušené mozkomíšní sklerózy jsou signifikantně homologické.

Do dnešního dne se ukázalo, že i další sekvence MSRVl a MSRV2, amplifikované těmito technikami PCR, získané ze vzorků revmatické artritidy, jsou identické nebo homologické sekvencím, získaným od pacientů, trpících roztroušenou mozkomíšní sklerózou.

V sérii PCR MSRV-1, prováděných výše popsanou zahnízděnou technikou “RT-PCR” byly získány výsledky, podané v tabulce I, připojené k popisu vynálezu.

Retrovirální genomy MSRV-1 a MSRV-2 byly tedy skutečně nalezeny ve vzorcích biologických tekutin pacientů, trpících rev- 65matickou artritidou. Další výsledky, získané z rozsáhlejší série pokusů, tento výsledek potvrzují.

Mimoto může být specificita sekvencí, amplifikovaných těmito technikami PCR, ověřena a rozvinuta technikou 'ELOSA”', kterou popsal F. Mallet (22) a lze ji nalézt také v dokumentu FR-2 663 040.

U MSRV-1 mohou být produkty zahnízděné PCR, popsané výše, testovány ve dvou systémech ELOSA, dovolujících oddělenou detekci konvenčních sekvencí A a B + C + D MSRV-1, odpovídajících podskupinám popsaným v příkladu 2 a na obr. 2, 3 a 4. Sekvence blízké konvenční sekvenci B -i- C + D se nacházejí hlavně ve vzorcích RNA, pocházejících z virionů MSRV1, purifikovaných z kultur nebo amplifikovaných z extracelulárních biologických tekutin pacientů, trpících revmatickou artritidou nebo roztroušenou mozkomíšní sklerózou, zatímco sekvence blízké konvenční sekvenci A se nacházejí hlavně v normální lidské buněčné DNA.

Systém ELOSA-MSRV-1 pro specifické zachycení produktů PCR podskupiny A používá oligonukleotid pro zachycení cpVlA s vazebným aminem v 5’ podle techniky, popsané v dokumentu FR-A-2 663 040 a detekční oligonukleotid dpVlA, vázaný na peroxydázu podle techniky, popsané v dokumentu FR-A-2 663 040 (nebo popřípadě vázaný na biotin), které mají následující sekvence:

cpVlA 5’ GATCTAGGCCACTTCTCAGGTCCAGS 3’ SEQ ID NO 47 dpVlA 5’ CATCTITTTGGGICAGGCAITAGC 3’ SEQ ID NO 48

Systém ELOSA,v/SRV-l pro zachycení a specifickou hybridi- 66zaci produktů PCR podskupiny B -i- C + D používá stejný detekční oligonukleotid dpVlA, vázaný na peroxydázu technikou popsanou výše (nebo popřípadě vázaný na biotin) a oligonukleotid pro zachycení cpVlB s aminovou vazbou v 5’ podle techniky popsané výše. mající sekvenci:

cpVlB 5’ CTTGAGCCAGTTCTCATACCTGGA 3’ SEQ ID NO 49

Jak může být vidět z tabulky I, takováto technika byla aplikována na produkty PCR, amplifikované z biologických tekutin pacientů, trpících různými revmatickými onemocněními: všichni pacienti, trpící revmatickou artritidou, kteří vykazují pásmo amplifikované DNA o očekávané velikosti detekovatelné na gelu agarózy, označeném BET, byli pozitivní pro MSRVl typu B -r C + D a negativní pro MSRVl-Α; jediný případ jiné choroby než revmatická artritida vykazoval viditelné amplifikované pásmo na gelu, označeném BET o zjevně správné velikosti; odpovídající produkty PCR se ukázaly jako negativní pro ELOSA MSRVl-A a MSRV1-BCD stejně tak jako soubor produktů PCR pro ostatní pacienty, trpící jinými chorobami než revmatická artritida; po klonování a sekvenaci tohoto amplifikovaného produktu se prokázalo, že odpovídá artefaktální sekvenci, která nemá vztah k MSRVl.

Technika ELOSA MSRVl, spojená s zahnízděnou RT-PCR, popsanou výše, tedy dovoluje realizovat test pro velmi citlivou a velmi specifickou detekci retroviru MSRV 1 v biologických tekutinách pacientů.

Díky provedeným objevům a vyvinutým metodám, které autoři vynálezu dosáhli při zkoumání revmatické artritidy, je tedy také možno si představit diagnostiku infekce a/nebo reaktivace

- 67MSRV-1 a/nebo MSRV-2 a zhodnocení terapie revmatické artritidy na základě její schopnosti “negovat” detekci těchto činitelů v biologických tekutinách pacientů. Navíc včasná detekce u osob, které ještě nevykazují revmatické signály revmatické artritidy mohou dovolit zahájení léčby, která je tím účinnější na pozdější klinický vývoj nemoci, cím více předchází lézické stádium, které odpovídá napadení kloubu. V současné době totiž diagnostika revmatické artritidy nemůže být provedena před vznikem zánětlivé nebo dokonce lézické symptomatiky a proto nemůže být započata žádná terapie před vznikem již citelné klinické indikace kloubního ataku.

Diagnostika infekce a/nebo reaktivace MSRV-1 a/nebo MSRV 2 u člověka je tedy určující a předkládaný vynález poskytuje prostředky takovéto diagnostiky stejně tak v rámci asociované symptomatiky neurologické (roztroušená mozkomíšní skleróza) nebo revmatologické (revmatická artritida) a nebo také v rámci presymptomatiky infekční/reaktivační nebo ještě neasociované na dobře charakterizované klinické příznaky.

Takto je možné kromě realizace diagnostiky infekce a/nebo reaktivace MSRV-1 a/nebo MSRV-2 zhodnotit terapii roztroušené mozkomíšní sklerózy, revmatické artritidy a nebo každé jiné asociované klinické symptomatiky na základě její účinnosti na “negování” detekce těchto činitelů v biologických tekutinách pacientů.

- 68TABULKA I

Výsledky detekce pomocí PCR, následované hybridizací podle techniky, nazývané ELOSA, genomu MSRV-1 v biologických tekutinách nemocných revmatickou artritidou (RA) a jinými revmatickými onemocněními.

Diagnosa	Počet testovaných	Vzorek	Hnízdová RT-PCR MSRV-1 (pásmo BET)	ELOSA MSRV-1 podskupina A	ELOSA MSRV-1 podskupina B (BaCaD)
revmatologická ne-RA	10	kultivační prostředí	10 -	10 -	10 -
(srovnávací)		buňky kloubní tekutiny	0 A	0 A	0 A
RA	10	kultivační prostředí buňky kloubní tekutiny	5 - 5 A	10 - 0 A	5 - 5 A
revmatologická ne-RA (srovnávací)	8	kloubní tekutina	8- 0 A	8 - 0 A	8 - 0 A
RA	5	kloubní tekutina	3 - 2 +	5 - 0 A	3 - 2 A
revmatologická ne-RA (srovnávací)	7	plasma	6 - 1 A	7 - 0 A	7 - 0 A
RA	6	plasma	4 - 2 A	6 - 0 A	4 - 2 A
revmatologická ne-RA	4	mononukleové buňky krve	4 -	4 -	4 -
(srovnávací)		(pevný sediment)	0 A	0 A	0 A
RA	2	mononukleové buňky krve (pevný sediment)	0 - 2 +	2 - 0 A	0 - 2 A

- 69TABULKA II

Výsledky detekce genomu MSRV-2 v biologických tekutinách nemocných revmatickou artritidou a dalšími revmatickými chorobami pomocí PCR, následované hybridizací podle techniky nazývané ELOSA.

Diagnosa	Počet testů	Vzorek	Hnízdová RT-PCR MSRV-2 (pásmo BET)	Poznámka
revmatologická ne-RA (srovnávací)	4	kloubní tekutina	4 - 0 -r
RA	6	kloubní tekutina	1 - •5 -r
revmatologická ne-RA (srovnávací)	5	plasma	4 - 1 +	pacien pozitivní =polytransfuzovaný
RA	8	plasma	6 - 2 +

- 70REFERENCE (1) Sauvezio. B. a kol., v “Polyarthritire rhumatoide, aspects actuels et perspectives”, Sány J., 1-13, Coilection MédicineSciences Flammarion, Paris, 1987 (2) Kahen, A., Virus et polyarthritide rhumatoide, v “Polyarthritite rhumatoide, aspects actuels et perspectives”, Sány J., 1-13, Coilection Médicine-Sciences Flammarion, Paris, 1987 (3) Fujinami. R.S. a Oldstone, M.B.A.. ed. Current Topics in Microbiology and Immunology, 145, Berlin, Springer Verlag, 1989 (4) Acha-Orbea, H. a Palmer, E., Mls -a retrovirus exploits the immune systém, Immunology Today 1991; 12, 271-276 (5) Cole, B.C. a Atkin, C.L., The mycoplasma arthritidis T-cell mitogen, MAM: a model superantigen, Immunology Today 1991, 12, 271-276 (6) Posnet, D.N., Do superantigens play a role in autoimmunity? Semin. Immunol. 1993, 5, 65-72 (7) Perron H. a kol., Res. Virol. 1989, 140. 551-561 (8) Shih A., Misra R. a Rush M.G., Res. Virol. 1989, 63, 64-75 (9) Fields a Knipe, Fondamental Virology 1986, Rev Press N.Y.

(10) Nielsen P.E. a kol., Science 1991, 254, 1497-1500 (11) Maniatis a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982

- 71(12) Southern E.M., J. Mol. Biol. 1975, 98, 503 (13) Dunn A.R. a Hassel J.A., Cell 1977, 12, 23 (14) Perron H. a kol., Res. Vir. 1992, 143. 337-350 (15) Chomzynski P. a Sacchi N., Analytical Biochemistry 1987, 162, 156-159 (16) Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989 (17) Meyerhans a kol., Cell 1989, 58, 901-910 (18) Linial M.L. a Miller A.D., “Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, strategies of replication” vol. 157, 125-152, Swanstrom R. a Vogt P.K., editors, Springer-Verlag, Heidelberg 1990 (19) Lori F. a kol., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074 (20) La Mantia a kol., Nucleic Acids Research 1991, 19, 15131520 (21) Frohman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1988, 85, 89989002 (22) Mallet F. a kol., Journal of Clinical Microbiology 1993, 31. 1444-1449

- 72SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: BIOMERIEUX (B) ULICE: žádná (C) MĚSTO: MARCY L’ETOILE (E) ZEMÉ: FRANCIE (F) POŠTOVNÍ SMĚR. ČÍSLO: 69280 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: SEP EXTENSION (iii) POČET SEKVENCÍ: 49 (iv) FORMA ZPRACOVATELNÁ POČÍTAČEM:

(A) DRUH NOSIČE: disketa (B) POČÍTAČ: IBM compatibie (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Verse #1.30 (OEB) (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 1 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1158 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

- 73(xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 1

CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGCAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60 CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGAGGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT CGACCTTAAG 130 GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT GACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240 CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAGGGATAGC 300 CCCCATCTAT TTGGCCAGGC ATTAGCCCAA GACTTGAGTC AATTCTCATA CCTGGACACT 360 CTTGTCCTTC AGTACATGGA 7GA7TTACTT TTAGTCGCCC GTTCAGAAAC CTTGTGCCAT 420 CAAGCCACCC AAGAACTCTT AACTTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAAGGT TTCCAAACCA 430 AAGGCTCGGC TCTGCTCACA GGAGATTAGA TACTNAGGGC TAAAATTATC CAAAGGCACC 540 AGGGCCCTCA GTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGCTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 600 AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TGGCATAACA GGTTTCTGCC GAAAACAGAT TCCCAGGTAC 660 ASCCCAATAG CCAGACCATT ATATACACTA ATTANGGAAA CTCAGAAAGC CAATACCTAT 720 TTAGTAAGAT GGACACCTAC AGAAGTGGCT TTCCAGGCCC TAAAGAAGGC CCTAACCCAA 730 GCCCCAGTGT TCAGCTTGCC AACAGGGCAA GATTTTTCTT TATA7GCCAC AGAAAAAACA 840 GGAATAGCTC TAGGAGTCCT TACGCAGGTC TCAGGGATGA GCTTGCAACC CGTGGTATAC 900 CTGAGTAAGG AAATTGATGT AGTGGCAAAG GG7TGGCCTC ATNGTT7ATG GGTAATGGNG 960 GCAGTAGCAG TCTNAGTATC TC-AAGCAGTT AAAATAATAC AGGGAAGAGA TCTTNCTGTG1020 TGGACATCTC ATGATGTGAA CGGCATACTC ACTGCTAAAG GAGACTTGTG GTTGTCAGAC1030 AACCATTTAC TTAANTATCA GGCTCTATTA CTTGAAGAGC CAGTGCTGNG ACTGCGCACT1140 TGTGCAACTC TTAAACCC 1153 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 297 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 2

CCCTTTGCCA CTACATCAAT TTTAGGAGTA AGGAAACCCA ACGGACAGTG GAGGTTAGTG 60 CAAGAACTCA GGATTATCAA TGAGGCTGTT GTTCCTCTAT ACCCAGCTGT ACCTAACCCT 120 TATACAGTGC TTTCCCAAAT ACCAGACGAA GCAGAGTGGT TTACAGTCCT CGACCTTAAG ISO GATGCCTTTT TCTGCATCCC TGTACGTCCT CACTCTCAAT TCTTGTTTGC CTTTGAAGAT 240 CCTTTGAACC CAACGTCTCA ACTCACCTGG ACTGTTTTAC CCCAAGGGTT CAAGGGA 297

- 74(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 3 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 3

GTTTACGGAT ANCCCTCATC TCTTTGGTCA GGTACTGGCC CAAGATCTAG CCCACTTCTC 60 AGGTCCAGSN ACTCTGTYCC TTCAG 35 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 4 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 86 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

- 75(xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 4

GTTCAGGGAT AGCCCCCATC TATTTGGCCA GGCACTAGC7 CAATACTTCA GCCAGTTCTC 60 ATACCTGGAG AYTCTYGTCG TTCGGT S6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 5 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 5

GTTCARRGA TAGCCCCCATC TATTTCGCCW RGYAT7AGCC CAAGACTTGA GYCAATTCTC 6 0 ATACC7GGA CACTCTTGTCC TTYRG 85 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 6 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 6

- 76GTTCAGGGAT AGCTCCCATC TATTTGGCCT GGCATTAACC CGAGACTTAA GCCAGTTCTY 60 ATACGTGGAC ACTCTTGTCC TTTGG ⁸⁵ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 7 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 111 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 7

GTGTTGCCAC AGGGGTTTAR RGATANCYCY CATCTMTTTG GYCWRGYAYT RRCYCRAKAY 60 YTRRGYCAVT TCTYAKRYSY RGSNAYTCT3 KYCCTTYRGT ACATGGATGA C 111 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 8 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 645 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 8

- 77TCAGGGATAG CCCCCATCTA TTTGGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGT CAATTCTCAT 60 ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTACATGG ATGATTTACT TTTAGTCCCC CGTTCAGAAA 120

CCTTGTGCCA TCAAGCCACC CAAGAACTCT TAACTTTCCT CACTACCTGT GGCTACAAGG 180 TTTCCAAACC AAAGGCTCGG CTCTGCTCAC AGGAGATTAG ATACTNAGGG CTAAAATTAT 240 CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCCTCATC 300 CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC AGGTTTCTGC CGAAAACAGA 360 TTCCCAGGTA CASCCCAATA GCCAGACCAT TATATACACT AATTANCCAA ACTCAGAAAG 420 CCAATACCTA TTTAGTAAGA TGGACACCTA CAGAAGTGGC TTTCCAGGCC CTAAAGAAGG 480 CCCTAACCCA AGCCCCAGTG TTCAGCTTGC CAACAGGGCA AGATTTTTCT TTATATGCCA 540 CAGAAAAAA.C AGGAATAGCT CTAGGAGTCC TTACGCAGGT CTCAGGGATG AGCTTGCAAC 600 CCGTGGTATA CCTGAGTAAG GAAATTGATG TAGTGGCAAA GGGTT 645 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 9 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 741 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 9

CAAGCCACCC AAGAACTCTT AAATTTCCTC ACTACCTGTG GCTACAACGT TTCCAAACCA 60 AAGGCTCAGC TCTGCTCAGA GGAGATTAGA TACTTAGGGT TAAAATTATC CAAAGGCACC 120 AGGGGCCTCA CTGAGGAACG TATCCAGCCT ATACTGGGTT ATCCTCATCC CAAAACCCTA 180 AAGCAACTAA GAGGGTTCCT TAGCATGATC AGGTTTCTGC CGAAAACAAG ATTCCCAGGT 240 ACAACCAAAA TAGCCAGACC ATTATATACA CTAATTAAGG AAACTCAGAA AGCCAATACC 300 TATTTAGTAA GATGGACACC TAAACAGAAG GCTTTCCAGG CCCTAAAGAA GGCCCTAACC 360 CAAGCCCCAG TGTTCAGCTT GCCAACAGGG CAAGATTTTT CTTTATATGG CACAGAAAAA 420 ACAGGAATCG CTCTAGGAGT CCTTACACAG GTCCGAGGGA TGAGCTTGCA ACCCGTGGCA 480 TACCTGAATA AGGAAATTGA TGTAGTGGCA AAGGGTTGGC CTCATNGTTT ATGGGTAATG 540 GNGGCAGTAG CAGTCTNAGT ATCTGAAGCA GTTAAAATAA TACAGGGAAG AGATCTTNCT 600 GTGTGGACAT CTCATGATGT GAACGGCATA CTCACTGCTA AAGGAGACTT GTGGTTGTCA 660 GACAACCATT TACTTAANTA TCAGGCTCTA TTACTTGAAG AGCCAGTGCT GNGACTGCGC 720 ACTTGTGCAA CTCTTAAACC C ^{74 1} (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 10

- 78(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 10

TGGAAAGTGT TGCCACAGGG CGCTGAAGCC TATCGCGTGC AGTTGCCGGA TGCCGCCTAT 60 AGCCTCTACA TGGATGACAT CCTGCTGGCC TCC 93 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 11 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 96 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 11

TTGGATCCAG TGYTGCCACA GGGCGCTGAA GCCTATCCCG TGCAGTTGCC GGATGCCGCC 60 TATAGCCTCT ACGTGGATGA CCTSCTGAAG CTTGAG 96 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 12 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 748 párů bází

- 79(B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 12

TGCAAGCTTC	ACCGCTTGCT	GGATGTACGC	CTCAGTACCG	GNGTGCCCCG	CGCGCTGTAG	60
TTCGATGTAG	AAAGCGCCCG	GAAACACGCG	GGACCAATGC	GTCGCCAGCT	TGCGCGCCAG	120
CGCCTCGTTG	CCATTGGCCA	GCGCCACGCC	GATATCACCC	GCCATGGCGC	CGGAGAGCGC	130
CAGCAGACCG	GCGGCCAGCG	GCGCATTCTC	AACGCCGGGC	TCGTCGAACC	ATTCGGGGGC	240
GATTTCCGCA	CGACCGCGAT	GCTGGTTGGA	GAGCCAGGCC	CTGCCCAGCA	ACTGGCACAG	300
GTTCAGGTAA	CCCTGCTTGT	CCCGCACCAA	CAGCAGCAGG	CGGGTCGGCT	TGTCGCGCTC	350
GTCGTGATTG	GTGATCCACA	CGTCAGCCCC	GACGATGGGC	TTCACGCCC?	TGCCACGCGC	420
TTCCTTGTAG	ANGCGCACCA	GCCCGAA.GGC	ATTGGCGAGA	TCGGTCAGCG	CCAAGGCGCC	4 30
CATGCCATCT	TTGGCGGCAG	CCTTGACGGC	ATCGTCGAGA	CGGACATTGC	CATCGACGAC	540
GGAATATTCG	GACTGGAGAC	GGAGGTGGAC	GAAGCGCGGC	CAATTCATCC	GCGTATTGTA	6 00
ACGGGTGACA	CCT7CCGCAA	r*. G C A T i C'_</G	ACGTGCCCGA	TTGACCCGGA	GCAA.CCCCGC	5 60
ACGGCTGCGC	GGGCAGTTAT	AATTTCCCCT	TACCAATCAA	CGGGTTACCC	CAGGGCGCTG	720
AAGCCTATCG	CGTGCAGTTG	CCGGATGC				7 4 3

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 13 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 13

GCATCCGGCA ACTGCACG

Co

CD

- 8(T (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 14 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 14

GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 15 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 15

GCATCCGGCA ACTGCACG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 16

- 81(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 16 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 17 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 17

TAAGAGTTGC ACAAGTGCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 18 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází

- 82(B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 18

I TCAGGGATAG CCCCCATCTA T 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 19 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 19

AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 20 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá

- 83(D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKY:

(B) UMÍSTĚNÍ: 5,7,10,13 (D) DALŠÍ INFORMACE: G představuje inosin (i) (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 20

GGTCGTGCCG CAGGG 13 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 21 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 21

TTAGGGATAG CCCTCATCTC T (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 22 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází

- 84(B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 22

TCAGGGATAG CCCCCATCTA i (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 23 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 23

AACCCTTTGC CACTACATCA ATTT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 24 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá

- 85(D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 24

GCGTAAGGAC TCCTAGAGCT ATT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 25 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 25

TCATCCATGT ACCGAAGG 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 26 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

- 86(xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 26

ATGGGGTTCC CAAGTTCCCT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 27 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 27

GCCGATATCA CCCGCCATGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 28 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 28

GCATCCGGCA ACTGCACG

- 87(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 29 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 29

CGCGATGCTG GTTGGAGAGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 30 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 30

TCTCCACTCC GAATATTCCG

- 88(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 31 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 31

GATCTAGGCC ACTTCTCAGG TCCAGS (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 32 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKY:

(B) UMÍSTĚNÍ: 6, 12, 19 (D) DALŠÍ INFORMACE: G představuje inosin (i) (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 32

CATCTGTTTG GGCAGGCAGT AGC

- 89(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 33 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 33

CTTGAGCC.-.G TTCTCATACC TGGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 34 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 34

AGTGYTRCCM CARGGCGCTG AA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 35

- 90(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 35 ( GMGGCCAGCA GSAXGTCATC CA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 36 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 36

GGATGCCGCC TATAGCCTCT AC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 37 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází

- 91(B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 37 .AAGCCTATCG CGTGCAGTTG CC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 38 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 38

TAAAGATCTA GAATTCGGCT ATAGGCGGCA TCCGGCAAGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 39 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 126 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá

- 92(D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 39

GTGCTACCAC AGGGGTTCAG GGATAGCTCC CATCTATTTG GCCTCACATT AACCČGAGAC TTAAGCCAGT TCTCATACGT GGACACTCTT GTCCTTTGGT ACGTGGATCA CATCCTGCTG GCCTCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 40 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 40

GTGCTGCCCC AGGGCCCTCA AGCCTATCGC GTGCAGTTGC CGGATGCCGC CTATAGCCTC TACGTGGATG ACCTGCTGCT GGCCTCC

120

126 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 41 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 705 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

- 93(xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 41

GTAGTTCGAT GTAGAAAGCG CCCGGAAACA CGCGGGACCA ATCCGTCGCC AGCTTCCCCG SO CCAGCGCCTC GTTGCCATTG GCCAGCGCCA CGCCGATATC ACCCGCCATG CCCGCCGGAG 120 AGCGCCAGCA GACCGGCGGC CAGCGGCGCA TTCTCCAACG CCGGGCTCGT CGAATCATTC ISO GGGGGCGATT TCCCCACGAC CGCGATGCTG CTTGGAGAGC CAGGCCCTCG CCAGCAACTG 240 GCACAGGTTC AGGTAACCCC TGCTTGTCCC CGCACCCAAC AGCAGCAGGC GGGTCGGCTT 300 GTCGCGCTCG TCCGTGATTG GTGGATCCAC AACGTCAGCC CCGACGATGG GCTTCACGCC 360 CTTGCCACGC GCTTCCTTGT AGAAGCGCAC CAGCCCGGAA GGCATTGGCG AGATCGGTCA 420 AGCGCCAAGG NSCCCCATGC CATCTTTGGC GGCAGGCCTT GACGGCATCG TCGAGACGGA 480 CATTGCCATC GACCGACGGA ATATTCGGAG TGGAGACGGA GGTGGACGAA GCGCGGCGAA 540 TTCATCCGCG TATTGTAACG GGTGACACCT TCCCCAAAGC ATTCCGGGCG TGCCCGATTG 600 ACCCGGAGCA ACCCCGCACG GCTGCGCGGG CAGTTATAAT TTCGGCTTAC GAATCAACGG 660 GTTACCCCAG GGCGCTGAAG CCTATCGCGT GCAGTTGCCG GATGC 705 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 42 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 648 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 42

CAGGGTATAG CCCCCATCTA TTTCGCCAGG CATTAGCCCA AGACTTGAGC CAGTTCTCAT 60 ACCTGGACAC TCTTGTCCTT CAGTATATGG ATGATTTACT TTTAGTGACC CATTCAGAAA 120 CCTTGTGATG TCAAGCCACA CAAGTGCTCT TAACTTTCCT CTTTACCTCT GGCTACAAGG 180 TTTTCAAACC AAAGCCTCAG CTCTGCTCAC AGCAGGTTAA ATATTTACGC CTAAAATTAT 240 CCAAAGGCAC CAGGGCCCTC AGTGAGGAAC GTATCCAGCC TATACTGGCT TATCTTCATC 300 CCAAAACCCT AAAGCAACTA AGAGGGTTCC TTGGCATAAC ACGCTTCTGC TGAATATGGA 360 TTCCCAGGTT YGGTGAAATA GCCAGGCCAT TAAATACACT AATTAAGGAA ACTCAGAAAG 420 CCAATACCCA TTTAGTAAGA TGGACATCTG AAGCACAATC AGCTTTCCAG GCACTAAAGA 480 AAGCCCTAAC CCAAGCCCCA GTGTTAAGCT TGCCAACAGG GCAAGACTTT TCTTTATATG 540 TCACAGAAAA AATAGGAATA GCTCTAGGAG TCCTTACACA GGTCTGAGGG ACAAGCTTGC 600 AACCCGTGGC ATATCTGAGT AAGGARRCTG ATGTAGTGGC AAAGGGTT 648 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 43

- 94(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 648 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 43

CAGGGTATAG	CCCCCATCTA	TTTGGCCAGG	CATTAGCCCA	AGACTTGAGC	CAGTTCTCAT	60
ACCTGGACAC	TCTTGTCCT?	CAGTATATGG	ATGATTTACT	TTTAGTGACC	CATTCAGAAA	120
CCTTGTGATG	TCAAGCCACA	CAAGTGCTC?	TAACTTTCCT	CTTTACCTCT	GGCTACAAGG	ISO
TTTTCAA.ACC	AAAGGCTCAG	CTCTGCTCAC	AGCAGGTTAA	AT A. TTT A GGG	CTAAAATTA?	240
CCAAAGGCAC	CAGGGCCCTC	AGTGAGGAAC	GTATCCAGCC	TATACTGGCT	TATCTTCATC	300
CCAAAACCCT	AAAGCAACTA	AGAGGGTTCC	TTGGCATAAC	AGGCTTCTGC	TGAA7A7GGA	360
TTCCCACCTT	YGGTCAAATA	GCCAGGCCAT	TAAATACACT	AATTAAGGAA	ACTCAGAAAG	420
CCAATACCCA	TTTAGTAAGA	TGCACATCTG	AAGCACAATC	ACCTTTCCAG	CCAC7AAAGA	4S0
AAGCCCTAAC	CCAAGCCCCA	GTGTTAAGCT	TCCCAACAGG	GCAAGACTTT	TCTTTATATG	540
TCACAGAAAA	AA T A G G AA T A	GCTCTAGGAG	TCCTTACACA	GCTCTGAGGG	ACAAGCTTGC	600
AACCCGTGGC	ATATCTGAG	AAGGARRCTG	ATCTAGTCGC	AAAGCCTT		643

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 44 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 44

GCCGATATCA CCCGCCATCG

- 95(2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 45 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 45

CGCGATGCTG GTTGGAGAGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 46 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 46

TCTCCACTCC GAATATTCCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 47

- 96(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 47

GATCTAGCCC ACTTCTCAGG TCCAGS (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 48 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 48 v · · — t

CATCTITTTG GICAGGCAI? AGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI SEQ ID NO 49 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází

- 97(B) TYP: nukleotid (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 49

CTTGAGCCAG TTCTCATACC TGGA

Zastupuje:

JUDr. Mtlan Hořejš

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití purifikovaného nebo izolovaného virálního materiálu, majícího aktivitu reverzní transkriptázy, náležející skupině endogenních retrovirálních složek, pocházejících z virálního kmene majícího aktivitu reverzní transkriptázy, zvoleného ze skupiny zahrnující kmeny označené POL-2, který byl uložen dne 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08. 01. 1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, čímž se rozumí kmeny virů, obsahujících alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, náležejícímu jednomu z uvedených kmenů POL-2 a MS7PG, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
2. 2. Použití purifikovaného nebo izolovaného virálního materiálu, majícího aktivitu reverzní transkriptázy, náležející skupině endogenních retrovirálních složek, pocházejících z buněčné linie, zvoleného ze skupiny zahrnující linie označené PLI-2, která byla uložena dne 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, který byl uložen dne 08. 01.1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat virus, obsahující alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, náležejícímu jednomu nebo druhému z virů, produkovaných výše uvedenými liniemi PLI-2 a LM7PC, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, pre- 99venci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
3. 3. Použití virálního materiálu, jehož genom obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou mezi SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO

   6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementárními sekvencemi a jejich ekvivalentními sekvencemi, zejména nukleotidovými sekvencemi, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO

   3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO

   7. SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
4. 4. Použití retrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu obsahuje nukleotidovou sekvenci ekvivalentní, zejména takovou, která vykazuje alespoň 50 % homologie a výhodně alespoň 65 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí náležející genu pol genomu retroviru ERV-9 nebo HSERV-9, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.

   - 1005. Použití retrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu kóduje peptidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 50 % homologie a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z peptidových sekvencí, kódovaných genem pol genomu retroviru ERV-9 nebo HSERV-9, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
5. 6. Použití rerrovirálního materiálu, jehož gen pol jeho genomu kóduje peptidovou sekvenci, která vykazuje pro každou část alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z peptidových sekvencí, kódovaných nukleotidovou sekvencí, zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO

   4. SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEo” ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
6. 7. Použití nukleotidového fragmentu, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně

   - 101alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce uvedeným virálním materiálem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivaci uvedeného virálního materiálu.
7. 8. Použití specifického primem obsahujícího nukletidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu, definovaného v nároku 7, zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro polymerační amplifikaci RNA nebo DNA virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě.
8. 9. Použití podle nároku 8, vyznačující se i í m, že primer obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence.
9. 10. Použití sondy, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu definovaného v nároku 6, zejména nukleotidovou sek- 102venci, vykazující pro každou část 10 po sobé jdoucích monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro získání kompozice pro detekci, separaci nebo identifikaci virálního materiálu, který se váže k revmatické artritidě, v biologickém vzorku.
10. 11. Použití podle nároku 10, vyznačující se tím, že sonda obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence.
11. 12. Použití purifikovaného nebo izolovaného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, odlišného od virálního materiálu definovaného v některém z nároků 1 až 6, pocházejícího z virálního kmene, zvoleného ze skupiny zahrnující kmeny označené POL-2, který byl uložen dne 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08. 01. 1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, představované patogenními a/nebo infekci způsobujícími činiteli obsahujícími alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, odpovídajícímu jednomu Či druhému z patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů výše uvedených virálních kmenů POL-2 a MS7PG, odlišných od jednoho či druhého retrovirálního materiálu uvedených kmenů, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, pre- 103venci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivace uvedeného činitele.
12. 13. Použití purifikovaného nebo izolovaného patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, odlišného od virálního materiálu definovaného v některém z nároků 1 až 6, produkovaného buněčnou linií, zvolenou ze skupiny zahrnující linie označené PLI-2, která byla uložena dne 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, který byl uložen dne 08. 01. 1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat alespoň jeden nebo druhý z patogenních a/nebo infekci způsobujících činitelů a/nebo jejich variant, nebo každou infikovanou buněčnou kulturou schopnou produkovat patogenní a/nebo infekci způsobující činitel, obsahující alespoň jeden antigen, který je rozpoznáván alepoň jednou protilátkou proti alespoň jednomu antigenu, odpovídajícímu jednomu nebo druhému patogennímu a/nebo infekci způsobujícímu činiteli, produkovanému výše uvedenými liniemi PLI-2 a LM7PC, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivace uvedeného činitele.
13. 14. Použití patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, obsahujícího nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence vykazující alespoň 70 %

    - 104a výhodně alespoň 90 % homologie s nukleotidovou sekvencí, obsahující sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivace uvedeného činitele.
14. 15. Použití nukleotidového fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence vykazující v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s nukleotidovou sekvencí, zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivace uvedeného činitele.

    -d6. Použití primeru obsahujícího nukletidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu, definovaného v nároku 15, zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou Část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro polymerační amplifikaci RNA nebo DNA patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, který se váže k

    - 105revmatické artritidě.
15. 17. Použití podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se t í m, že primer obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence,
16. 18. Použití sondy, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukíeotidové sekvence fragmentu definovaného v nároku 15, zejména nukleotidovou sekvenci, vykazující pro každou část 10 po sobě jdoucích monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro detekci, prevenci nebo léčení infekce, způsobované uvedeným patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, který se váže k revmatické artritidě nebo reaktivace uvedeného činitele.
17. 19. Použití podle nároku 18, vyznačující se tím, že sonda obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence.
18. 20. Použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představo- 106vané prvním činitelem, který je představován lidským virem, majícím aktivitu reverzní transkriptázy a náležejícím do skupiny endogenních retrovirů a nebo variantu takovéhoto viru a druhým činitelem, nebo variantou tohoto druhého činitele, přičemž tyto dva patogenní a/nebo infekci způsobující činitelé jsou takoví jako činitelé vzešlí z téhož virálního kmenu, zvoleného ze skupiny, zahrnující kmeny označené POL-2, který byl uložen dne 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem V92072202 a MS7PG, který byl uložen dne 08. 01. 1993 u ECACC pod číslem V93010816 a dále kmeny, představující jejich varianty, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele,
19. 21. Použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představované prvním činitelem, který je představován lidským virem, majícím aktivitu reverzní transkriptázy a náležejícím do skupiny endogenních retrovirů a nebo variantu takovéhoto viru a druhým činitelem nebo variantou tohoto druhého činitele, přičemž tyto dva patogenní a/nebo infekci způsobující činitelé jsou takoví jako činitelé produkovaní touž buněčnou linií, zvolenou ze skupiny zahrnující linie označené PLI-2, která byla uložena dne
20. 22. 07. 1992 u ECACC pod číslem 92072201 a LM7PC, který byl uložen dne 08. 01. 1993 u ECACC pod číslem 93010817 a dále všechny infikované buněčné kultury, schopné produkovat alespoň jeden z jednoho či druhého patogenního a/nebo infekci

    - 107způsobujícího činitele a/nebo jejich varianty, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele,

    22. Použití kompozice, obsahující dva izolované nebo purifikované patogenní a/nebo infekci způsobující činitele, představované prvním činitelem, který je představován virem nebo variantou takovéhoto viru, jehož genom obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9_r SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, jehož genom obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a

    - 108výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele,
21. 23. Použití kompozice, obsahující dva nukleotidové fragmenty, představované prvním fragmentem, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence a druhým fragmentem, jehož nukleotidová sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100

    - 109po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence, přičemž každý z fragmentů může být zejména sonda, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro zjišťování, prevenci nebo léčení infekce, způsobované prvním patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem a druhým patogenním a/nebo infekci způsobujícím činitelem, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele.
22. 24. Použití kompozice, obsahující první polypeptid, kódovaný částečně nebo úplně prvním nukleotidovým fragmentem, definovaným v nároku 23 a druhý polypeptid, kódovaný částečně nebo úplně druhým nukleotidovým fragmentem, definovaným v nároku 23, pro získání diagnostické, profylaktické nebo terapeutické kompozice pro detekci prvního patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele a druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího Činitele, které se vážou k revmatické artritidě nebo reaktivace jednoho či druhého uvedeného prvního činitele a uvedeného druhého činitele.

    2ó. Použití podle nároku 24, v y z n a č u j í c í se t í m, že zahrnuje první ligand, zejména protilátku, specifický pro první polypeptid a druhý ligand, zejména protilátku, specifický pro druhý polypeptid, přičemž uvedený první a druhý polypeptid jsou definovány v nároku 24.
23. 26. Způsob získání prvního patogenního a/nebo infekci způso- 110bujícího činitele definovaného v kterémkoliv z nároků 1 až 6 a/nebo druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z nároků 13 až 15, které se váží k revmatické artritidě, vyznačující se tím, že se in vitro kultivují buňky získané punkcí ze synoviální tekutiny, zejména ze synoviocytů a fibroblastů deskvamováných z kloubní tekutiny pacientů trpících revmatickou artritidou;
24. 27. Způsob získání prvního patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z nároků 1 až 6 a/nebo druhého patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele definovaného v kterémkoliv z nároků 13 nebo 14, které se váží k revmatické artritidě, vyznačující se tím, že se in vitro kultivují buňky lymfocytů B pacientů trpících revmatickou artritidou, imortalizované virem Epstein-Barr.
25. 28. Nukleotidový fragment, jehož nukleotidové sekvence obsahuje sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího sekvence SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 50 % a výhodně alespoň 70 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43 a jejich komplementární sekvence;
26. 29. Specifický primer pro amplifikaci RNA nebo DNA virálního materiálu, definovaného v kterémkoliv z bodů 1 až 6 polymerací, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle nároku 28, zejména nukleoti- ludové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou Částí uvedeného fragmentu.
27. 30. Primer podle nároku 29, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48 a SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence.
28. 31. Sonda schopná specificky hybridizovat s RNA nebo DNA virálního materiálu, definovaného v kterémkoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že zahrnuje nukleótidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné Části nukleotidové sekvence fragmentu podle nároku 28, zejména nukleotidové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 70 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu.
29. 32. Sonda podle nároku 31, vyznačující se t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48 a SEQ ID NO 49 a jejich komplementární sekvence,
30. 33. Nukleotidový fragment, jehož nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 40 a SEQ ID NO 41, jejich komplementární sekvence a jejich ekvivalentní sekvence, zejména nukleotidové sekvence, které obsahují v každé části 100 po sobě jdoucích monomerů alespoň 70 % a výhodně alespoň 90 % homologie s jednou z nukleotidových sekvencí zvolených ze souboru, zahrnujícího SEQ ID NO 40 a SEQ ID NO 41 a jejich komplementární sekvence.

    - 11234. Specifický primer pro amplifikaci polymeraci RNA nebo DNA patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, definovaného v kterémkoliv z nároků 12 až 14, obsahující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle 33, zejména nukleotidové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu.
31. 35. Primer podle nároku 34, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 a SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence,
32. 36. Sonda schopná specificky hybridizovat s RNA nebo DNA patogenního a/nebo infekci způsobujícího činitele, definovaného v kterémkoliv z nároků 12 až 14, zahrnující nukleotidovou sekvenci identickou nebo ekvivalentní alespoň jedné části nukleotidové sekvence fragmentu podle nároku 33, zejména nukleotidové sekvence, vykazující pro každou část 10 po sobě následujících monomerů alespoň 90 % homologie s alespoň jednou částí uvedeného fragmentu.
33. 37. Sonda podle nároku 36, v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 a SEQ ID NO 46 a jejich komplementární sekvence.