PL196676B1

PL196676B1 - Agonista ApoA-I, multimeryczni agoniści ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycje farmaceutyczne i zastosowania multimerycznych agonistów ApoA-I

Info

Publication number: PL196676B1
Application number: PL339745A
Authority: PL
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz
Original assignee: Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Dasseux Jean Louis; Gunther Metz; Renate Sekul
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-01-31
Also published as: IL135319A0; EP1019074A1; JP2001517710A; DE69837809T2; PL339745A1; HUP0103114A3; UA71552C2; NZ503718A; AU2002300464B2; ES2287982T3; KR100650953B1; NO20001598D0; US20050080013A1; AU2002300464C1; HUP0103114A2; RU2214831C2; CN1280500A; CA2304988C; NO329204B1; WO1999016458A1

Abstract

1. Agonista ApoA-I, znamienny tym, ze wykazuje przynajmniej oko lo 38% aktywno sci aktywacji LCAT w porównaniu z ludzk a ApoA-I i obejmuje: (i) 22 do 23 reszt peptydu lub jego analogu, który tworzy amfipatyczn a a-helis e w obecno sci lipidów i który obejmuje wzór strukturalny (I): Z 1 -X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 -X 6 -X 7 -X 8 -X 9 -X 10 -X 11 -X 12 -X 13 -X 14 -X 15 -X 16 -X 17 -X 18 -X 19 -X 20 -X 21 -X 22 -X 23 -Z 2 lub jego farmaceutycznie akceptowaln a sól, przy czym: X 1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p); X 2 oznacza reszt e alifatyczn a; X 3 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 4 oznacza Glu (E); X 5 oznacza reszt e alifatyczn a; X 6 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 7 oznacza Glu (E) lub Leu (L); X 8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q); X 9 oznacza Leu (L); X 10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G); X 11 oznacza reszt e kwa sna; X 12 oznacza Arg (R); X 13 jest Leu (L) lub Gly (G); X 14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G); X 15 oznacza Asp (D); X 16 oznacza Ala (A); X 17 oznacza Leu (L); X 18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q); X 19 oznacza reszt e zasadow a; X 20 oznacza reszt e zasadow a; ......... PL PL PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 339745 (22) Data zgłoszenia: 28.09.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

28.09.1998, PCT/US98/20326 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

08.04.1999, WO99/16458 PCT Gazette nr 14/99 (11) 196676 (13) B1 (51) Int.Cl.

C07K 14/775 (2006.01) A61K 38/16 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Agonista ApoA-I, multimeryczni agoniści ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycje farmaceutyczne i zastosowania multimerycznych agonistów ApoA-I (30) Pierwszeństwo:

29.09.1997,US,08/940,096 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

02.01.2001 BUP 01/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.01.2008 WUP 01/08 (76) Uprawniony i twórca wynalazku:

Dasseux Jean-Louis,Vielle Toulouse,FR Sekul Renate,Ladenburg,DE Buttner Klaus,Epfenbach,DE Cornut Isabelle,Croix de Rozon,CH Metz Gunther,Dossenheim,DE (74) Pełnomocnik:

Elżbieta Pietruszyńska-Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

(57) 1. Agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i obejmuje:

(i) 22 do 23 reszt peptydu lub jego analogu, który tworzy amfipatyczną α-helisę w obecności lipidów i który obejmuje wzór strukturalny (I):

Z1^-X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-X19^-X20^-X21^-X22^-X23^-Z lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól, przy czym:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p); X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza resztę alifatyczną;

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Glu (E) lub Leu (L);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza resztę kwaśną;

X12 oznacza Arg (R);

X13 jest Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza resztę zasadową;

X20 oznacza resztę zasadową; .........

PL 196 676 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest agonista ApoA-I, multimeryczni agoniści ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycje farmaceutyczne zawierające agonistę ApoA-I i zastosowania multimerycznych agonistów ApoA-I.

1. Wstęp

Kompozycje zawierające agonistów apolipoproteiny A-I (ApoA-I) mogą być zastosowane w leczeniu zaburzeń związanych z dyslipoproteinemią, w tym hypercholesterolemią, chorobą sercowonaczyniową, miażdżycą naczyń, restenozą i innymi za burzeniami takimi jak wstrząs septyczny.

2. Tło wynalazku

Cholesterol w krążeniu jest przenoszony przez lipoproteiny osocza - cząsteczki złożone z lipidu i białek, które transportują lipidy w krwi. Lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) i lipoproteiny o wysokiej gęstości są głównymi nośnikami cholesterolu. Uważa się, że LDL są odpowiedzialne za dostarczanie cholesterolu z wątroby (gdzie jest syntetyzowany lub uzyskiwany z diety) do tkanek pozawątrobowych w organizmie. Okreś lenie odwrotny transport cholesterolu opisuje transport cholesterolu z tkanek pozawątrobowych do wątroby, gdzie jest katabolizowany i eliminowany. Uważa się, że cząsteczki HDL osocza odgrywają główną rolę w procesie odwrotnego transportu, działając jako wymiatacze cholesterolu z tkanek.

Dowody łączące wysoki poziom cholesterolu w surowicy z chorobą wieńcową są przytłaczające. Na przykład miażdżyca naczyń jest powolnie postępującą chorobą charakteryzującą się nagromadzaniem cholesterolu w obrębie ściany tętnicy. Bardzo silne dowody wspierają koncepcję, że lipidy deponowane w uszkodzeniach miażdżycowych naczyń pochodzą przede wszystkim z LDL osocza, tak więc LDL są popularnie znane jako zły cholesterol. W przeciwieństwie, poziomy HDL w surowicy odwrotnie korelują z chorobą wieńcową - w istocie wysokie poziomy HDL w surowicy nie tylko chronią przed miażdżycą tętnic ale mogą w istocie powodować ustępowanie płytek miażdżycowych (np. zob. Badimon i wsp., 1992, Circulation 86 (suppl. III):86-94). Tak więc HDL są popularnie znane jako dobry cholesterol.

2.1. Transport cholesterolu

System transportu tłuszczów można podzielić na dwa szlaki: egzogenny dla cholesterolu i trójglicerydów absorbowanych z jelita i endogenny dla cholesterolu i trójglicerydów wchodzących do krwi z wą troby i innych tkanek niewą trobowych.

W szlaku egzogennym tłuszcze z diety są opakowywane w cząsteczki lipoproteiny nazywane chylomikronami, które wnikają do układu krążenia i dostarczają swoje trójglicerydy do tkanki tłuszczowej (do przechowywania) i do mięśni (dla utleniania w celu dostarczenia energii). Reszta chylomikronu, zawierająca estry cholesterylu, jest usuwana z krwiobiegu przez specyficzny receptor spotykany tylko na komórkach wątroby. Ten cholesterol następnie staje się dostępny ponownie dla metabolizmu komórkowego lub recyklizacji do tkanek pozawątrobowych jako lipoproteiny osocza.

W szlaku endogennym, wątroba wydziela dużą cząsteczkę lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL) do krwiobiegu. Rdzeń VLDL składa się głównie z trójglicerydów syntetyzowanych w wątrobie, z mniejszą ilością estrów cholesterylu (albo syntetyzowanych w wątrobie albo recyrkulowanych z chylomikronów). Dwa dominują ce biał ka są eksponowane na powierzchni VLDL, apoproteina B-100 i apoproteina E. Gdy VLDL osiąga naczynia włosowate tkanki tłuszczowej lub mięśni, jego trójglicerydy są ekstrahowane dając nowy rodzaj cząsteczki, zmniejszonej pod względem wielkości i wzbogaconej w estry cholesterylu ale zachowującej swoje dwie apolipoproteiny zwane lipoproteinami o gęstości pośredniej (IDL).

U ludzi około połowa cząsteczek IDL jest usuwana z krążenia szybko (w ciągu dwóch do sześciu godzin od wytworzenia), ponieważ wiążą się ściśle do komórek wątroby, które ekstrahują ich cholesterol aby wyprodukować nowe VLDL i kwasy żółciowe. Cząsteczki LDL, które nie są pobrane przez wątrobę dłużej pozostają w krążeniu. Z czasem apoproteina E dysocjuje od krążących cząsteczek, przekształcając je do LDL mających apoproteinę B-100 jako jedyne białko.

W pierwszym rzędzie wą troba pobiera i degraduje większość cholesterolu do kwasów żó łciowych, które są produktami końcowymi metabolizmu cholesterolu. W pobieraniu cząsteczek zawierających cholesterol pośredniczą receptory LDL, które są obecne w wysokich stężeniach na hepatocytach. Receptor LDL wiąże zarówno apoproteinę E i apoproteinę B-100 i jest odpowiedzialny za wiązanie i usuwanie zarówno IDL i LDL z krążenia. Jednak powinowactwo apoproteiny E dla receptora LDL jest większe niż apoproteiny B-100. W efekcie cząsteczki LDL mają o wiele dłuższy okres życia

PL 196 676 B1 w krążeniu niż czą steczki IDL - LDL krążą średnio przez dwa i pół dnia przed zwią zaniem się z receptorami LDL w wątrobie i innych tkankach. Wysokie poziomy LDL w surowicy (złego cholesterolu) są dodatnio skorelowane z chorobą wieńcową. Na przykład w miażdżycy naczyń, cholesterol pochodzący z krążących LDL akumuluje w ścianach naczyń prowadząc do tworzenia objętościowych płytek, które hamują przepływ krwi aż w końcu tworzy się skrzep, skutkujący zatkaniem naczynia, co powoduje zawał serca lub udar.

Ostatecznie ilość wewnątrzkomórkowego cholesterolu uwolnionego z LDL kontroluje metabolizm cholesterolu w komórce. Akumulacja komórkowego cholesterolu pochodzącego z VLDL i LDL kontroluje trzy procesy: po pierwsze zmniejsza syntezę cholesterolu w komórce przez wyłączanie syntezy reduktazy HMGCoA - kluczowego enzymu w szlaku biosyntezy cholesterolu. Po drugie wchodzący cholesterol pochodzący od LDL sprzyja magazynowaniu cholesterolu przez aktywację AGAT enzymu komórkowego, który przekształca cholesterol do estrów cholesterylu, które są deponowane w kropelkach magazynowych. Po trzecie akumulacja cholesterolu w obrębie komórki napędza mechanizm zwrotny, który hamuje komórkową syntezę nowych receptorów LDL. Komórki więc dopasowują swój zestaw receptorów LDL tak, by wystarczająca ilość cholesterolu była wprowadzana do zaspokojenia ich potrzeb metabolicznych, bez przeładowania (Przegląd - zobacz Brown i Goldstein, W: The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 8, Goodman i Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, rodz. 36, str. 874-896.

2.2 Odwrócony transport cholesterolu

W sumie obwodowe (niewątrobowe) komórki uzyskują cholesterol z kombinacji lokalnej syntezy i pobierania uprzednio wytworzonego sterolu z VLDL i LDL. Przeciwnie, odwrotny transport cholesterolu (RCT) jest szlakiem, za pomocą którego cholesterol komórek obwodowych może być zwrócony do wątroby do recyrkularyzacji do tkanek pozawątrobowych lub wydzielenia do jelita w żółci, albo w postaci modyfikowanej albo utlenionej jako kwasy ż ó ł ciowe. Szlak RCT przedstawia jedyny sposób usuwania cholesterolu z większości tkanek pozawątrobowych i jest krytyczny dla utrzymywania struktury i funkcji większości komórek w organizmie.

RCT składa się głównie z trzech etapów: (a) wypływu cholesterolu, wstępnego usunięcia cholesterolu z różnych puli komórek obwodowych; (b) estryfikacji cholesterolu przez działanie acylotransferazy lecytynowo-cholesterolowej (LCAT) zapobiegając ponownemu wejściu wypłyniętego cholesterolu do komórek; i (c) pobierania/dostarczania estru cholesterylu HDL do komórek wątroby. W szlaku RCT biorą udział HDL. HDL jest nazwą generyczną dla cząsteczek lipoproteiny, które charakteryzują się wysoką gęstością. Główne składniki lipidowe kompleksów HDL to różne fosfolipidy, cholesterol (ester) i trójglicerydy. Najbardziej wyraźnymi składnikami apolipoprotein są A-I i A-II, które okreś lają funkcjonalne cechy HDL; co więcej obserwowano niewielkie ilości apolipoprotein C-I, C-II, C-III, D, E, J itp. HDL może istnieć w szerokim zakresie różnych wielkości i różnych mieszanin wymienionych powyżej składników w zależności od stanu remodelowania w czasie kaskady metabolicznej RCT.

Kluczowym enzymem biorącym udział w szlaku RCT jest LCAT. LCAT jest produkowany głównie w wątrobie i krąży w osoczu związany z frakcją HDL. LCAT przekształca cholesterol pochodzący z komórek do estrów cholesterylu, które są chowane w HDL przeznaczonym do usunię cia. Białko przenoszące estry cholesterylu (CETP) i białko przenoszące fosfolipidy (PLTP) wpływają na dalsze remodelowanie krążącej populacji HDL. CETP może przesuwać estry cholesterylu tworzone przez LCAT do innych lipoprotein, szczególnie lipoprotein zawierających Apo-B, takich jak VLDL i LDL. PLTP dostarcza lecytynę do HDL. Trójglicerydy HDL mogą być katabolizowane przez zewnątrzkomórkową wątrobową lipazę trójglicerydów, i cholesterol lipoprotein jest usuwany przez wątrobę poprzez kilka mechanizmów.

Każda cząsteczka HDL zawiera przynajmniej jedną kopię (i zazwyczaj dwie do czterech kopii) ApoA-I. ApoA-I jest syntetyzowany przez wątrobę i jelito cienkie jako preapolipoproteina, która jest wydzielana jako probiałko, które jest szybko cięte aby dać dojrzały polipeptyd mający 243 reszty aminokwasów. ApoA-I składa się głównie z 6 do 8 różnych 22 aminokwasowych powtórzeń przerywanych przez łącznik, który często jest proliną i w niektórych przypadkach składa się z odcinka złożonego z kilku reszt. ApoA-I tworzy trzy rodzaje stabilnych kompleksów z lipidami: małe kompleksy ubogie w lipidy określane jako pre-beta-1 HDL; spłaszczone dyskoidalne cząsteczki zawierające polarne lipidy (fosfolipid i cholesterol) określane jako pre-beta-2 HDL; i kuliste cząsteczki zawierające zarówno polarne i niepolarne lipidy określane jako kuliste lub dojrzałe HDL (HDL3 i HDL2). Większość HDL w krążącej populacji zawiera zarówno ApoA-I i ApoA-II (drugie główne białko HDL) i są tu określane jako frakcja AI/AII-HDL HDL. Jednak ta frakcja HDL zawierająca tylko ApoA-I (określana tu jako frakcja AI4

PL 196 676 B1

HDL) wydaje się być bardziej skuteczna w RCT. Pewne badania epidemiologiczne popierają hipotezę, że frakcja AI-HDL działa przeciwmiażdżycowo (Parra i wsp., 1992, Athe-rioscler. Throm. 12:701-707; Decossin i wsp., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

Choć mechanizm przenoszenia cholesterolu z powierzchni komórki (tzn. wypływ cholesterolu) nie jest znany, uważa się, że kompleks ubogi w lipidy, pre-beta-1 HDL jest preferowanym akceptorem dla cholesterolu przenoszonego z obwodowej tkanki biorącej udział w RCT. (Zob. Davidson i wsp., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-22982; Bielicki i wsp., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1703; Rothblat i wsp., J. Lipid Res. 33:1091-1097; i Kawano i wsp., 1993, Biochemistry 32:5025-5028; Kawano i wsp., 1997, Biochemistry 36:9816-9825). W czasie procesu rekrutacji cholesterolu z powierzchni komórki, pre-beta-1 HDL jest szybko przekształcany do pre-beta-2 HDL. PLTP może zwiększać tempo tworzenia dyskowego pre-beta-2, ale brak jest danych wskazujących na rolę PLTP w RCT. CAT reaguje preferencyjnie z dyskowym i sferycznym HDL, przenosząc grupę 2-acylową lecytyny lub innych fosfolipidów na wolne reszty hydroksylowe cholesterolu generując estry cholesterylu (zatrzymywane w HDL) i lizolecytynę . Reakcja LCAT wymaga ApoA-I jako aktywatora, tzn. ApoA-I jest naturalnym kofaktorem dla LCAT. Przekształcenie cholesterolu do jego estru schowanego w HDL zapobiega ponownemu wnikaniu cholesterolu do komórki, czego efektem jest, że estry cholesterylu są przeznaczone do usunięcia. Estry cholesterylu w dojrzałych cząsteczkach HDL we frakcji AI-HDL (tzn. zawierające ApoA-I i bez ApoA-II) są usuwane z wątroby i przerabiane do żółci bardziej skutecznie niż pochodzące z HDL zawierającego zarówno ApoA-I i ApoA-II (frakcja AI/AII-HDL). To może częściowo wynikać z bardziej skutecznego wiązania AI-HDL do błon hepatocytów. Postulowano istnienie receptora HDL i niedawno receptor wymiataczy, SR-BI został zidentyfikowany jako receptor HDL (Acton i wsp., 1996, Science 271:518-520; Xu i wsp., 1997, J. Lipid Res. 38:1289-1298). SR-BI jest wyrażany najsilniej w tkankach steroidogennych (np. nadnerczach) i w wątrobie (Landshulz i wsp., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-995; Rigotti i wsp., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-33549).

CETP nie wydaje się odgrywać znacznej roli w RCT, i zamiast tego bierze udział w metabolizmie lipidów pochodzących od VLDL i LDL. Jednak zmiany w aktywności CETP lub jego akceptorów, VLDL i LDL, odgrywają rolę w remodelowaniu populacji HDL. Na przykład w nieobecności CETP, HDL stają się zwiększonymi cząsteczkami, które nie są usuwane (Przeglądy o RCT i HDL patrz Fielding i Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-228; Barrans i wsp., 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85; Hirano i wsp., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6):1053-1059.

2.3 Obecnie stosowane terapie dyslipoproteinemii

Dostępna jest obecnie pewna ilość terapii do obniżenia cholesterolu i trójglicerydów w surowicy (zob. np. Brown i Goldstein, powyżej). Jednak każda z nich ma swoje własne niedogodności i ograniczenia pod względem skuteczności, efektów ubocznych i kwalifikowanej populacji pacjentów.

Żywice wiążące kwasy żółciowe są klasą leków, które przerywają recyrkulację kwasów żółciowych z jelita do wątroby, np. cholestyramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb) i chlorowodorek kolestypolu (Colestid®, The Upjohn Company). Gdy są pobierane doustnie, te dodatnio naładowane żywice wiążą ujemnie naładowane kwasy żółciowe w jelicie. Ponieważ żywice nie mogą być absorbowane z jelita, są one wydalane wraz z kwasami żółciowymi. Jednak w najlepszym przypadku stosowanie takich żywic obniża poziom cholesterolu w surowicy o około 20% i jest związany z efektami ubocznymi ze strony przewodu pokarmowego, w tym zatwardzeniem i niedoborem pewnych witamin. Co więcej, ponieważ żywice wiążą inne leki, inne doustne leki muszą być podawane przynajmniej jedną godzinę przed lub cztery do sześciu godzin po konsumpcji żywicy; w ten sposób komplikując schemat pobierania leków pacjenta z chorobą serca.

Statyny są czynnikami obniżającymi cholesterol, które blokują syntezę cholesterolu przez hamowanie reduktazy HMGCoA - kluczowego enzymu biorącego udział w szlaku biosyntezy cholesterolu. Statyny, np. lowastatyna (Mevacor®, Merck & Co., Inc.) i prawastatyna (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.) są czasami stosowane w kombinacji z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Statyny znacząco obniżają poziomy cholesterolu i LDL w surowicy i zwalniają postęp miażdżycy tętnic wieńcowych. Jednak poziomy cholesterolu HDL w surowicy zwiększają się tylko umiarkowanie. Mechanizm efektu obniżenia LDL może obejmować zarówno obniżenie stężenia VLDL i indukcję komórkowej ekspresji receptora LDL, prowadząc do obniżonej produkcji i/lub zwiększonego katabolizmu LDL. Efekty uboczne, obejmujące zaburzenia wątroby i nerek są związane ze stosowaniem tych leków (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc. Montvals, N.J., 1997). Niedawno, FDA dopuściła atorwastatynę (inhibitor reduktazy HMGCoA opracowany przez Parke-Davis) (Warner Lambert) na rynek do leczenia rzadkich ale nagłych przypadków rodzinnej hipercholesterolemii (1995, Scrip 20(19):10).

PL 196 676 B1

Niacyna lub kwas nikotynowy jest rozpuszczalnym w wodzie kompleksem witaminy B stosowanym jako suplement diety i czynnik przeciwhiperlipidemiczny. Niacyna zmniejsza produkcję VLDL i jest skuteczna w obniżaniu LDL. W niektórych przypadkach jest stosowana w połączeniu z żywicą wiążącą kwasy żółciowe. Niacyna może zwiększać HDL gdy jest stosowana w odpowiednich dawkach, jednak jej pożyteczność jest ograniczona przez poważne efekty uboczne gdy jest stosowana w tak wysokich dawkach.

Fibraty są klasą obniżających lipidy leków stosowanych do leczenia różnych postaci hiperlipidemii (tzn. podwyższonych trójglicerydów w surowicy), które mogą być też związane z hipercholesterolemią. Fibraty wydają się obniżać frakcję VLDL i nieznacznie zwiększać HDL - jednak efekty tych leków na cholesterol surowicy są zmienne. W Stanach Zjednoczonych fibraty dopuszczono do stosowania jako leki przeciwlipidemiczne, ale nie zostały zaaprobowane jako czynniki na hipercholesterolemię. Na przykład klofibrat (Atromid-S®, Wyeth-Ayerst Laboratories) jest czynnikiem przecilipidemicznym, który działa (poprzez nieznany mechanizm) na obniżenie trójglicerydów w surowicy poprzez obniżenie frakcji VLDL. Choć cholesterol surowicy może być obniżony w niektórych subpopulacjach pacjentów, odpowiedź biochemiczna na lek jest zmienna i nie zawsze jest możliwe przewidzieć, u których pacjentów uzyska się korzystne wyniki. Nie wykazano by Atromid-S® był skuteczny w zapobieganiu chorobie wień cowej serca. Chemicznie i farmakologicznie spokrewniony lek gemfibrozyl (Lopid®, Parks-Davis) jest czynnikiem regulującym lipidy, który umiarkowanie obniża trójglicerydy i cholesterol VLDL surowicy i umiarkowanie zwiększa cholesterol HDL - subfrakcje HDL2 i HDL3 jak i zarówno ApoA-I i A-II (tzn. frakcję AI/AII-HDL). Jednak odpowiedź lipidowa jest heterogenna, w szczególnoś ci mię dzy róż nymi populacjami pacjentów. Co wię cej, podczas gdy zapobieganie chorobie wieńcowej serca zaobserwowano wśród pacjentów płci męskiej między 40-55 bez historii lub objawów istniejącej choroby wieńcowej serca, nie jest jasne w jakim stopniu te wyniki można ekstrapolować do innych populacji pacjentów (np. kobiet, starszych i młodszych mężczyzn). W istocie nie zaobserwowano żadnej skuteczności u pacjentów z ustaloną chorobą wieńcową. Ze stosowaniem fibratów są związane poważne efekty uboczne w tym toksyczność, taka jak złośliwe nowotwory (przede wszystkim nowotwory przewodu pokarmowego), choroby pęcherzyka żółciowego i zwiększona śmiertelność z przyczyn innych niż wieńcowe. Te leki nie są wskazane do leczenia pacjentów z wysokim LDL lub niskim HDL jako ich jedynym zaburzeniem lipidów (Physician's Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.).

Doustna estrogenowa terapia zastępcza może być rozważana dla umiarkowanej hipercholesterolemii u kobiet po menopauzie. Jednak zwiększeniu HDL może towarzyszyć zwiększenie trójglicerydów. Terapia estrogenowa jest oczywiście ograniczona do specyficznej populacji pacjentów (kobiet po menopauzie) i jest związana z poważnymi efektami ubocznymi w tym indukcją złośliwych nowotworów, choroby pęcherzyka żółciowego, choroby zakrzepowej, gruczolaka wątroby, podwyższonego ciśnienia krwi, nietolerancji glukozy i hiperkalcemii.

Tak więc istnieje potrzeba opracowania bardziej bezpiecznych leków, które są skuteczne w obniżaniu cholesterolu surowicy, zwiększaniu poziomów HDL, zapobieganiu chorobie wieńcowej i/lub leczeniu istniejącej choroby, szczególnie miażdżycy naczyń.

2.4 ApoA-I jako cel

Żaden z obecnie dostępnych leków do obniżenia bezpiecznie cholesterolu ani nie podwyższa poziomu HDL ani nie stymuluje RCT - większość wydaje się działać na szlak transportu cholesterolu, modulując pobieranie z dietą, recyrkulację, syntezę cholesterolu i populację VLDL.

Podczas gdy jest pożądane znalezienie leków, które stymulują wypływ i usuwanie cholesterolu, istnieje kilka potencjalnych celów w RCT, np. LCAT, HDL i jego różne składniki (ApoA-I, ApoA-II i fosfolipidy), PLTP i CETP - i nie wiadomo, który cel byłby najbardziej skuteczny w uzyskaniu pożądanych profili lipoprotein i efektów ochronnych. Zaburzenie dowolnego pojedynczego składnika szlaku RCT na ogół wpływa na skład krążącej populacji lipoprotein i na skuteczność RCT.

Kilka linii dowodów opartych na danych uzyskanych in vivo implikują HDL i jego główny składnik białkowy ApoA-I w zapobieganiu uszkodzeniom miażdżycowym, i potencjalnie w regresji płytek - czyniąc je atrakcyjnymi celami dla interwencji terapeutycznych. Po pierwsze, istnieje odwrotna korelacja między stężeniem ApoA-I(HDL) w surowicy i aterogenezą u człowieka (Gordon i Rifking, 1989, N. Eng. J. Med. 321:1311-1316; Gordon i wsp., 1989, Circulation 79:9-15). Faktycznie specyficzne subpopulacje HDL były wiązane z obniżonym ryzykiem miażdżycy naczyń u ludzi (Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597; Cheung i wsp., 1991, Lipid Res. 32:383-394); Fruchart i Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:79).

PL 196 676 B1

Po drugie badania nad zwierzętami popierają ochronną rolę ApoA-I (HDL). Traktowanie królików karmionych cholesterolem ApoA-I lub HDL zmniejszało rozwój i progresję powstawania płytek (pasma tłuszczowe) u królików karmionych cholesterolem (Koizumi i wsp., 1988, J. Lipid. Res. 29:1405-1415; Badimon i wsp., 1989, Lab. Invest. 60:455-461; Badimon i wp., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241). Jednak skuteczność zmieniała się w zależności od Żródła HDL (Beits i wsp., 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour i wsp., 1995, Atherosclerosis 113:237-246.

Trzeci bezpośredni dowód na rolę ApoA-I uzyskano z doświadczenia z udziałem zwierząt transgenicznych. Ekspresja ludzkiego genu na ApoA-I przeniesionego do myszy genetycznie predysponowanych do miażdżycy naczyń indukowanej przez dietę chroniła przed uszkodzeniami aorty (Rubin i wsp., 1991, Nature 353:265-267). Wykazano, że transgen ApoA-I też suprymował miażdżycę naczyń u myszy bez ApoE i myszy transgenicznych Apo(a) (Paszty i wsp., J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump i wsp., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Liu i wsp., 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2266). Podobne wyniki zaobserwowano u królików transgenicznych wyrażających ludzką ApoA-I (Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger i wsp., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 14:1424-1429) i u transgenicznych szczurów, gdzie podwyższone poziomy ludzkiego ApoA-I chroniły przed miażdżycą naczyń i hamowały restenozę po angioplastyce balonowej (Burkey i wsp., 1992, Circulation, Supplement I, 86:1-472, Abstract No. 1876; Burkey i wsp., 1995, J. Lipid Res. 36:1463-1473).

AI-HDL wydają się być bardziej skuteczne na RCT niż frakcje AI/AII-HDL. Badania z myszami transgenicznymi dla ludzkich ApoA-I lub Apo-I i ApoA-II (AI/AII) wykazały, że skład białkowy HDL znacząco wpływa na jego rolę - AI-HDL jest bardziej anty-aterogenny niż AI/AII-HDL (Schultz i wsp., 1993, Nature 365:762-764). Równoległe badania obejmujące myszy transgeniczne wyrażające ludzki gen LCAT wykazują, że umiarkowane zwiększenie aktywności LCAT znacząco zmienia poziomy lipoprotein cholesterolu i że LCAT ma znaczącą preferencję w stosunku do HDL zawierającego ApoA-I (Francone i wsp., 1995, J. Clinic. Invest. 96:1440-1448; Berard i wsp., 1995, J. Clinic. Invest. 96:1440-1448; Berard i wsp., 1997, Nature Medicine 3(7):744-749). Podczas gdy te dane wspierają znaczącą rolę ApoA-I w aktywacji LCAT i stymulacji RCT, dodatkowe badania wykazują bardziej złożony scenariusz: głównym składnikiem HDL, który bierze udział w wypływie cholesterolu komórkowego są fosfolipidy (Fournier i wsp., 1996, J. Lipid Res. 37:1704-1711).

Ze względu na potencjalną rolę HDL, tzn. zarówno ApoA-I i związanego z nią fosfolipidu, w ochronie przed chorobą miażdż ycową, rozpoczęto próby kliniczne na ludziach z zastosowaniem ApoA-I uzyskanej technikami rekombinacji, następnie ich zaniechano i wydaje się, że ponownie rozpoczęto przez UCB Belgium (Pharmaprojects, 27 październik, 1995; IMS R&D Focus, 30 czerwca, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2 (6):261-265) zobacz też M. Eriksson na Kongresie The Role of HDL in Disease Prevention, 7-9 listopad, 1996, Fort Worth; Lacko i Miller, 1997, J. Lip. Res. 38:1267-1273; i WO94/13819) i były rozpoczęte i zaniechane przez Bio-Tech (Pharmaprojects, 7 kwietnia, 1989). Był y też podję te próby stosowania ApoA-I do leczenia wstrz ą su septycznego (Opal, Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis, IBC's 7^th International Conference on Sepsis, 28-30 kwietnia, 1997, Waszyngton D.C.; Gouni i wsp., 1993; J. Lipid Res. 94: 139-146; Levine, WO 94/04916). Jednak jest wiele pułapek związanych z produkcją i stosowaniem ApoA-I, które powodują że nie jest on idealnym lekiem, np. ApoA-I jest dużym białkiem, które jest trudne i kosztowne w produkcji; muszą być pokonane znaczne problemy z produkcją i powtarzalno ścią odnośnie stabilności w czasie przechowywania, dostarczania jako produkt czynny i okresu półtrwania in vivo.

Ze względu na te problemy, poczyniono próby przygotowania peptydów imitujących ApoA-I.

Ponieważ kluczowe aktywności ApoA-I przypisywano obecności wielokrotnych powtórzeń unikalnej cechy struktury drugorzędowej w białku - amfipatycznej α-helisy klasy A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253), większość prób projektowania peptydów imitujących aktywność ApoA-I koncentrowało się na zaprojektowaniu peptydów, które by tworzyły amfipatyczne α-helisy klasy A.

Amfipatyczne α-helisy klasy A są unikalne, ponieważ naładowane dodatnio reszty aminokwasów są skupione na interfejsie obszaru hydrofobowego i hydrofilowego a negatywnie naładowane aminokwasy są skupione na środku powierzchni hydrofilowej. Co więcej, α-helikalne peptydy klasy A mają hydrofobowy kąt mniejszy niż 180° (Segrest i wsp., 1990: Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-117). Wstępne strategie de novo do projektowania związków 'imitujących ApoA-I nie były oparte na sekwencjach pierwszorzędowych naturalnie występujących apolipoprotein, ale raczej na włączeniu tych unikalnych cech helis klasy A do sekwencji analogów peptydowych, jak i pewnych

PL 196 676 B1 właściwości domen ApoA-I (zobacz np. Davidson i wsp., 1996, Proc. Natl. Aca. Sci USA 93:1360513610; Rogers i wsp., 1997. Biochemistry 36:288-300; Lins i wsp., 1993, Biochim. Biophys Acta biomembranes 1151:137-142; Ji i Joneas, 1995, J. Biol. Chem. 270:11290-11297; Collet i wsp., 1997, Journal of Lipid Research 38:634-644; Sparrow i Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow i Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas i wsp., 1993, J. Biol. Chem. 268:21403-21409; Wang i wsp., 1996, Biochim. Biophys. Acta 174-184; Minnich i wsp., 1992, J. Biol. Chem. 267:16553-16560; Holvoet i wsp., 1995, Biochemistry 34:13334-13342; Sorci-Thomas i wsp., 1997, J. Biol. Chem. 272 (11):7278-7284; i Frank i wsp., 1997, Biochemistry 36:1798-1806).

W jednych badaniach Fukushima i wsp, zsyntetyzowali peptyd 22-resztowy zł o ż ony wyłącznie z reszt Glu, Lys i Leu, uł o ż onych periodycznie tak, by stworzyć amfipatyczną α -helisę z rówymi powierzchniami hydrofilowymi i hydrofobowymi (Peptyd ELK) (Fukushima i wsp., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101 (13):3703-3704; Fukushima i wsp., 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657). Peptyd ELK ma 41% homologii sekwencji z fragmentem 198-219 ApoA-I. Przy badaniach za pomocą ilościowego ultrasączenia, chromatografii wnikania do żelu i dichroizmu kołowego, wykazano, że peptyd ELK skutecznie łączy się z fosfolipidami i imituje niektóre fizyczne i chemiczne właściwości ApoA-I (Kaiser i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1137-1140; Kaiser i wsp., 1984. Science 223:249-255; Fukushima i wsp., 1980 powyżej; Nakagawa i wsp., 1985; J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092). Yokoyama i wsp. wywnioskowali z takich badań, że krytycznym czynnikiem dla aktywacji LCAT jest poprostu obecność dostatecznie dużej struktury amfipatycznej (Yokoyama i wsp., 1980, J. Biol. Che,. 255 (15):7333-7339). Dimer tego 22-resztowego peptydu następnie okazał się bardziej dokładnie imitować ApoA-I niż monomer; w oparciu o te wyniki zasugerowano, że 44-mer, który jest w środku przerwany za pomocą przerywnika w postaci helisy (albo Gly albo Pro) reprezentuje minimalną funkcjonalną domenę w ApoA-I (Nakagawa i wsp., 1985, powyżej).

Inne badania obejmowały modelowe amfipatyczne peptydy zwane peptydami LAP (Pownall i wsp., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (6):3154-3158; Sparrow i wsp., 1981, W: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch i Gross, red., Pierce Chem. Co. Rockford, IL, 253-256). W oparciu o badania wią zania lipidów z fragmentami natywnych apolipoprotein, za projektowano kilka peptydów LAP, nazwanych LAP-16, LAP-20 i LAP-24 (zawierających odpowiednio 16, 20 i 24 reszty aminokwasów). Te modelowe peptydy amfipatyczne nie mają homologii sekwencji z apolipoproteinami i były zaprojektowane tak, by miały powierzchnie hydrofilowe zorganizowane w sposób niepodobny do amfipatycznych helikalnych domen klasy A związanych z apolipoproteinami (Segrest i wsp., 1992; J. Lipid Res. 33:141-166). Z tych badań, autorzy wywnioskowali, że minimalna długość 20 reszt jest potrzebna by nadać właściwości wiążące lipidy modelowym peptydom amfipatycznym.

Badania z mutantami LAP20 zawierającymi resztę prolinową w różnych pozycjach w sekwencji wskazały, że istnieje bezpośredni stosunek między wiązaniem lipidów i aktywacją LCAT, ale że potencjał helikalny samego peptydu nie doprowadza do aktywacji LCAT (Ponsin i wsp., 1986 J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). Co więcej obecność tego przerywnika helisy (Pro) w pobliżu środka peptydu obniżała jego powinowactwo do powierzchni fosfolipidowych jak i jego zdolność do aktywacji LCAT. Podczas, gdy wykazano, że niektóre z peptydów LAP wiązały fosfolipidy (Sparrow i wsp., powyżej), istnieje kontrowersja pod względem zakresu, w którym peptydy LAP są helikalne w obecności lipidów (Buchko i wsp., 1996, J. Biol. Chem. 271 (6):3039-3045; Zhong i wsp., 1994, Peptide Research 7(2):99-106.

Segrest i wsp. zsyntetyzowali peptydy złożone z 18 do 24 reszt aminokwasów, które nie mają homologii sekwencji do helis ApoA-I (Kannelis i wsp., 1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). Sekwencje były specyficznie zaprojektowane tak, aby imitować amfipatyczne helikalne domeny apolipoprotein wymienialnych z klasą A pod względem momentu hydrofobowego (Eisenberg i wsp., 1982, Nature

299:371-374) i rozmieszczenia ładunku (Segrest i wsp., 1990, Proteins 8:103-117; Patent USA

Nr 4,643,988). Jeden 18-resztowy peptyd, peptyd 18A został zaplanowany jako modelowa α-helisa klasy A (Segrest i wsp., 1990, powyżej). Badania z tymi peptydami i innymi peptydami mającymi odwróconą dystrybucję ładunku tak, jak peptyd 18R wykazały zgodnie, że rozmieszczenie ładunku jest krytyczne dla aktywności, peptydy z odwróconym rozmieszczeniem ładunku wykazują zmniejszone powinowactwo do lipidów względem mimetyków 18A klasy A i niższą zawartość helikalną w obecności lipidów (Kanellis i wsp., 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah i wsp., 1985, J. Biol.

Chem. 260:10248-10255; Chung i wsp., 1985, J. Biol. Chem. 260:10256-10262; Epand i wsp., 1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah i wsp., Adv. Exp. Med. Biol. 285:131-140.

PL 196 676 B1

Inne syntetyczne peptydy nie mające homologii sekwencji z apolipoproteinami, które były proponowane z ograniczonym sukcesem obejmowały dimery i trimery peptydu 18A (Anantharamaiah i wsp., 1986, Proteins of Biological Fluids 34:63-66), peptydy GALA i EALA (Subbarao i wsp., 1988, Proteins: Structure, Function and genetics 3:187-198) i peptydy ID (Labeur i wsp., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17:580-588) i peptyd 18AM4 (Brasseur i wsp., 1993, Biochim. Biophys Acta 1170:1-7).

Peptyd najwyższej zgodności zawierający 22 reszty aminokwasów oparte na sekwencji helis ludzkiej ApoA-I został także zaplanowany (Anantharamaiah i wsp., 1990, Ateriosclerosis 10(1):95-105; Venkatachalapathi i wsp., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. 6:585-596). Sekwencja była skonstruowana przez identyfikację najczęstszej reszty w każdej pozycji hipotetycznych helis ludzkiego ApoA-I. Podobnie do peptydów opisanych powyżej, helisa tworzona przez ten peptyd ma dodatnio naładowane reszty aminokwasów skupione na interfejsie hydrofilowohydrofobowym, ujemnie naładowane aminokwasy skupione w środku powierzchni hydrofilowe j i hydrofobowy kąt mniejszy od 180°C. Podczas gdy dimer tego peptydu jest w pewnym sensie skuteczny w aktywacji LCAT, monomer wykazał słabe właściwości wiązania lipidów (Venkatachalapathi i wsp., 1991, powyżej).

W oparciu przede wszystkim o badania in vitro z peptydami opisanymi powyżej, pojawił się zestaw reguł dla projektowania peptydów, które imitują rolę Apa-I. Znaczące jest, że uważa się, że amfipatyczna α-helisa mająca dodatnio naładowa ne reszty skupione na złączu hydrofilowohydrofobowym i ujemnie naładowane reszty aminokwasów skupione w środku płaszczyzny hydrofilowej jest wymagana dla powinowactwa do lipidów i aktywacji LCAT (Venkatachalapathi i wsp., 1991, powyżej). Anantharamaiah i wsp. też wskazali, że ujemnie naładowana reszta Glu w pozycji 13 peptydu 22-merowego o najwyższej zgodności, która jest umieszczona na hydrofobowej płaszczyźnie α-helisy odgrywa ważną rolę w aktywacji LCAT (Anantharamaiah i wsp., 1991, powyżej). Co więcej, Brasseur wskazał, że kąt hydrofobowy (kąt pho) mniejszy niż 180° wymagany jest dla optymalnej stabilności kompleksu lipid-apolipoproteina, i także tłumaczy tworzenie cząsteczek dyskoidalnych mających peptyd wokół krawędzi podwójnej warstwy lipidów (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24):16120-16127). Rossenau i wsp. także podkreślali, że kąt hydrofobowy mniejszy niż 180° wymagany jest do aktywacji LCAT (WO93/25581).

Jednak mimo tych reguł dotychczas nikt nie zaprojektował ani nie wyprodukował peptydu tak aktywnego jak ApoA-I - najlepsze mają mniej niż 40% aktywności ApoA-I mierzonej za pomocą tu opisanego oznaczenia aktywacji LCAT. Nie wykazano żeby jakikolwiek z mimetyków peptydowych opisanych w lite raturze był użyteczny jako lek.

Ze względu na to co podano uprzednio, istnieje potrzeba opracowania stabilnego agonisty ApoA-I, który imituje aktywność ApoA-I i który jest stosunkowo prosty i ekonomiczny w produkcji. Jednak reguły projektowania skutecznych mimetyków ApoA-I nie zostały rozszyfrowane i zasady projektowania cząsteczek organicznych z funkcją ApoA-I nie są znane.

3. Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest agonista ApoA-I, charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i obejmuje:

^Z1^-X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-X19^-X20^-X21^-X22^-X23^-Z2 lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól, przy czym:

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza resztę alifatyczną;

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Glu (E) lub Leu (L);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza resztę kwaśną;

PL 196 676 B1

X12 oznacza Arg (R);

X13 jest Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza resztę zasadową;

X20 oznacza resztę zasadową;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza resztę zasadową;

X23 jest nieobecny lub oznacza resztę zasadową;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza C(O)NRR, -C(O)OR lub -C(O)OH lub ich sól;

każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkiloaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl lub 1 do 7 resztowy peptyd lub jego analog;

każdy - między resztami X1 - X23 niezależnie oznacza połączenie amidowe, połączenie amidowe podstawione -C(O)NR, gdzie R oznacza (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, ewentualnie aryl, izoster amidu, gdzie izoster oznacza -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis i trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2 lub -CH2SO-; albo (ii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I), w której przynajmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂ lub X₂₃ jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.

Korzystnie stanowi zmienioną postać wzoru strukturalnego (I).

Korzystniej reszty hydrofobowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) a przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.

Jeszcze korzystniej we wzorze I:

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G), Asn (N) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X21 oznacza Leu (L); i przynajmniej jedna z X4, X7, X8, X11, X12, X15, X18, X19, X22 i X23 są konserwatywnie podstawione inną resztą.

Korzystnie reszty hydrofilowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) a przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.

Korzystniej we wzorze (I):

X4 oznacza Glu (E);

X7 oznacza Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X11 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X15 oznacza Asp (D);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K); i

PL 196 676 B1 przynajmniej jeden z X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiony inną resztą.

Jeszcze korzystniej X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L), X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G) i przynajmniej jedną z reszt X1, X2, X5, X13, X14, X15, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Korzystnie reszta podstawiająca jest klasyfikowana w tej samej podkategorii jak reszta podstawiana.

Korzystnie agonista ApoA-I stanowi peptyd lub analog peptydu o 22-23 resztach, o wzorze strukturalnym (I).

Korzystniej we wzorze (I) - między resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; i Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

Jeszcze korzystniej we wzorze (I):

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X7 oznacza Leu (L) lub Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

Najkorzystniej X23 jest nieobecny.

Najkorzystniej każdy z X10, X13 i X14 jest inny niż Gly (G).

Najkorzystniej każdy z X10, X13 i X14 oznacza Gly (G) a pozostałe reszty są inne niż Gly (G).

Korzystnie agonista ApoA-I jest wybrany z grupy złożonej z:

{SEQ	IO	NO:144)	pVDBLFENI^ERLLDAŁQKKDK;
<SEQ	ID	NO:145)	GVŁBŁFENŁDERŁ l.DADQKKDK ;
(SEQ	ID	NO:146)	PVDELFENŁ£iERŁWALQKKŁK ;
)SEQ	ID	NO:147)	PVŁELFEMLDERŁFDAŁQKKDK;
(SEQ	ID	NOi1465	FVLELFE»X.DERŁGDAl4QKKŁK?
(SEQ	ID	NO:149)	P VŁEŁFENŁWERLŁDA3^QKKDK ;
(SEQ	ID	NO:150)	PLŁEŁFENLLERLLDAIOKKLK;
(SSQ	ID	NO:151)	PVLEŁFENLOERhU5AŁQKKŁK ,*
(SSO	ID	NO:152)	pvfedfehłdbrx wałokkłk
(SSQ	ID	NO :153)	AVLEŁFENI,ŁSRDŁDALQXKDK ;
(S£Q	ID	NO:1S4)	PVLEŁFSNLLSRGŁDAIXJXKŁX ;
CSSQ	ID	NO:155)	PVI,EDFŁNWSRLLDRLOKXDX ;

i acylowane na N-koń cu i/lub amidowane na C-koń cu lub ich zestryfikowane postacie.

PL 196 676 B1

Przedmiotem wynalazku jest również multimeryczny agonista ApoA-I, charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (II):

(II) HH-{LLm-HH}nLLm-HH lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól, przy czym każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 10; każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej;

każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; i każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

Przedmiotem wynalazku jest też multimeryczny agonista ApoA-I, charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (III):

(III) X-Nya-X(ya-1)-(Nyb-X(yb-1))p lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól, przy czym każdy X oznacza niezależnie HH-(LLm-HH)nLLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej;

każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik;

każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8;

Nya i Nyb oznacza każdy niezależnie multifunkcyjną cząsteczkę łącznika, gdzie ya i yb oznacza liczbę grup funkcyjnych odpowiednio na Nya i Nyb; każdy ya lub yb oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 3 do 8; p oznacza liczbę całkowitą od 0 do 7; i każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

Przedmiotem wynalazku jest także multimeryczny agonista ApoA-I, charakteryzujący się tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (IV) lub (V):

każdy X oznacza niezależnie HH-(LLm-HH)nLLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono powyżej;

każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1; każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8;

R1 oznacza -OR lub -NRR; i każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkiloaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl.

PL 196 676 B1

Korzystnie bifunkcjonalny łącznik może ulegać cięciu.

Korzystnie n oznacza 0.

Korzystniej m oznacza 0.

Korzystnie każdy HH oznacza niezależnie określony powyżej peptyd agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym I, w którym - między resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; i Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

Korzystnie oznacza niezależnie określony powyżej peptyd agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym I, w którym

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza Leu (L);

X8 oznacza Phe (F);

X7 oznacza Leu (L) lub Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

Korzystnie każdy HH oznacza niezależnie określony powyżej peptyd wybrany z grupy złożonej z:

(SEC	ID
! SEC	ID
(SEC	ID
(SEQ	ID
(SEQ	ID
(SEC	ID
(SEQ	ID
CSEQ	ID
<sso	ID
(SSQ	ID
(SSC	ID
(SEC	ID

NO:144) NO :145) NO :146) NG;147) NO:148) NO: 149) NO:150) NO:151) NO:152} NO-.153} NO :154} NO:155) _?VLELFENLLERLLDALQKKLK ; GVLELFENLLERLLDALCKKLK; ?VLELFEHLLERLLDALQKKLK; ?VLELFEKLLERLFDALCKKLK; ?VLELFEKLLERLGDALCRKLK ; ?VLELFEKLWERLLDALCKKLK; FLLELFENLLERLLDALCKKLK ; E>VLELFENLGSRLŁDALQXKLK ; PVFELFENLLERLLDALCXXLK; AVLELFENLLSR LLD ALCKKLK ; ?VLSLFSNLLERCLDA1CXXLX; ?VLEL?LNLWERLLDALCXXLX :

i acylowane na N-końcu i/lub amidowane na C-końcu lub ich zestryfikowane postacie. Przedmiotem wynalazku jest również kompleks agonista ApoA-I-lipid obejmujący agonistę

ApoA-I i lipid, charakteryzujący się tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd określonym powyżej o wzorze sktrukturalnym I, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym II, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym III, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym IV lub V.

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi określony powyżej peptyd lub analog petydu o 22-23 resztach o wzorze strukturalnym I.

PL 196 676 B1

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi określony powyżej peptyd agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym I, w którym - między resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; i Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi określony powyżej peptyd agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym I, w którym

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X7 oznacza Leu (L) lub Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

Korzystnie agonistę ApoA-I stanowi określony powyżej peptyd wybrany z grupy złożonej z:

(SEO	ID	NO:144)
(SEO	ID	NO:14 5)
(SEO	ID	NO:146)
(SEO	ID	NO:147)
(SEO	ID	NO:14β)
(SEO	ID	NO:149)
(SEQ	ID	NO:150)
(SEO	ID	NO:151)
(SEO	ID	NO:152)
(SEO	ID	NO:153)
(SEO	ID	NO:154)
(SEQ	ID	NO:155)

pVljEbFENLŁ.ERLLDAliQKKI»K ; GVLELFENLI£RLLDALQKKbK; PVŁEŁFENŁŁERI«bDALOKKbK; PVLELFENXiLERŁFDALOKKDK ; PVLELFENŁIjER1iGDA1iQKKDK ; PVLEŁFENLWERLL.DAXQKKLK; PLLELFEKLLERLLDAU2KKLK; PVLELFENLGERLLDALQKKIiK ; PVFELFENLLERŁLDALQXKLK; AVLELFENLL3RLLDA1.C:<KLK; PVLELFENLLERGLDALCXKLX;

PVLELFLNLWERLLDAbQKXX.X;

i acylowane na N-końcu i/lub amidowane na C-końcu lub ich zestryfikowane postacie.

Korzystnie lipid stanowi sfingomielina.

Korzystnie lipid jest w postaci liofilizowanego proszku.

Korzystnie kompleks ma postać roztworu.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, przy czym agonistę ApoA-I stanowi peptyd określony powyżej o wzorze sktrukturalnym I, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym II, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym III, multimeryczny agonista ApoA-I określony powyżej o wzorze strukturalnym IV lub V.

PL 196 676 B1

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X7 oznacza Leu (L) lub Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).

::SEQ I» NO; 144} (SEO ID MO:145) iSEO ID NO;146} CSEQ ID MO:147) (SEQ ID MO :14 8} (SEQ ID MO:149) <SEQ ID MO:150} (SEQ ID MOt151} (SSO ID NO:152} (S2Q ID NO:153} (SSQ ID NO:154} (SSQ ID NO:155) pVUJŁFKiŁŁERLŁDAŁQKKI.K; G’«ZDEDFBMDDERŁX^DAŁQKKDK. ; PVDEDFENŁDERLDDALQKKDKj F VDEŁFE»ŁŁ,ERŁFDAŁQKK1>K ; ?VDEDFENI,1ER1GD ALQKK1K ; PVLEŁFBKLWEELDDAŁQKKŁK; PllEŁFENDLERLŁDALOfiKDK ; PV1E1?ENLGERLŁDALQX KIK; pvfełfekłdsrłddaloxkłx AVLEŁFENŁDSRLt,DAL-QKKI,K ; PVLEI,FSNŁŁ3RGLDM«XKLX: PVJ:EDFŁNLWERLŁDALOXXlX.f i acylowane na N-końcu i/lub amidowane na C-końcu lub ich zestryfikowane postacie.

Korzystnie agonista ApoA-I ma postać kompleksu agonista ApoA-I-lipid zawierającego agonistę ApoA-I i lipid.

Korzystniej agonista ApoA-I-lipid ma postać liofilizowanego proszku.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca określonego powyżej agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, do zastosowania do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia związanego z dyslipidemią.

PL 196 676 B1

Korzystnie agonista ApoA-I jest w postaci kompozycji farmaceutycznej, przy czym wymieniona kompozycja zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.

Korzystnie agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym wymieniony kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi hipercholesterolemia.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi choroba sercowo-naczyniowa.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi miażdżyca tętnic.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi ponowne zwężenie.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi niedobór HDL lub ApoA-I.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi hipertriglicerydemia.

Korzystnie zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi zespół metaboliczny.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca określonego powyżej agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, do zastosowania do wytwarzania leku do leczenia wstrząsu septycznego.

W przypadku kompozycji określonych powyżej wytwarzany lek przeznaczony jest do leczenia ludzi.

W przypadku kompozycji określonych powyżej wytwarzany lek przeznaczony jest do podawania w dawce około 0,5 mg/kg do około 100 mg/kg agonisty ApoA-I.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym II określonego powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym III określonego powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I o wzorze strukturalnym IV lub V określonego powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.

Agoniści ApoA-I według wynalazku są zdolni do tworzenia amfipatycznych α-helis, które imitują aktywność ApoA-I ze specyficznymi aktywnościami, tzn. jednostkami aktywności (aktywacja LCAT/jednostkę masy) zbliżonymi lub większymi od natywnej cząsteczki. W szczególności agoniści ApoA-I według wynalazku są peptydami lub analogami peptydów, które: tworzą amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy podobne do pre-β lub do HDL, aktywują LCAT, zwiększają poziomy frakcji HDL w surowicy i promują wypływ cholesterolu.

Wynalazek jest częściowo oparty na zaprojektowaniu i stwierdzeniu przez twórców wynalazku peptydów, które imitują funkcję ApoA-I. Peptydy według wynalazku były zaprojektowane w oparciu o przypuszczalną strukturę helikalną i amfipatyczne właściwości sekwencji najwyższej zgodności z 22 aminokwasów, która została wywiedziona z powtórzeń helikalnych ApoA-I. Nieoczekiwanie peptydy według wynalazku mają specyficzną aktywność znacząco powyżej tej, która jest podawana dla peptydów pochodzących od ApoA-I w literaturze. Zaiste, w niektórych postaciach realizacji dochodzą do 100% aktywności natywnej ApoA-I, podczas gdy opisani tu superagoniści przekraczają aktywność specyficzną ApoA-I.

Wynalazek jest ilustrowany za pomocą przykładów realizacji, które opisują budowę, preparatykę i stosowanie poszczególnych przykładowych amfipatycznych peptydów, które tworzą helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy i zwiększają aktywność LCAT. W oparciu o strukturę i aktywność podanych przykładowo postaci, twórcy wynalazku opracowali zestaw reguł, które mogą być stosowane do projektowania zmienionych lub zmutowanych form, które także są w zakresie wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano także kompozycje farmaceutyczne zawierające takich agonistów ApoA-I (albo jako peptydy albo kompleksy peptyd-lipid) jako składnik czynny, jak i sposoby wytwarzania takich kompozycji i ich zastosowanie w leczeniu chorób związanych z dyslipoproteinemią (np. choroba sercowo-naczyniowa, miażdżyca naczyń, zespół metaboliczny), restenozą lub endotoksemią (np. wstrząs septyczny).

3.1 Skróty

Stosowane tu skróty dla genetycznie kodowanych L-enancjomerów aminokwasów są konwencjonalne i są następujące:

PL 196 676 B1

Aminokwas	Symbol jednoliterowy	Popularny skrót
Alanina	A	Ala
Arginina	R	Arg
Asparagina	N	Asn
Kwas asparaginowy	D	Asp
Cysteina	C	Cys
Glutamina	Q	Gln
Kwas glutaminowy	E	Glu
Glicyna	G	Gly
Histydyna	H	His
Izoleucyna	I	Ile
Leucyna	L	Leu
Lizyna	E	Lys
Metionina	M	Met
Fenyloalanina	F	Phe
Prolina	P	Pro
Seryna	S	Ser
Treonina	T	Thr
T ryptofan	W	Trp
Tyrozyna	Y	Tyr
Walina	V	Val

Skróty stosowane do D-enancjomerów są odpowiednimi małymi literami dla symboli jednoliterowych. Np. R oznacza L-argininę a r oznacza D-argininę.

3.2. Definicje

Stosowane tu następujące określenia będą miały następujące znaczenia:

Alkil - dotyczy nasyconych rozgałęzionych, prostych łańcuchów lub cyklicznych rodników węglowodorowych. Typowe grupy alkilowe obejmują, ale bez ograniczenia, metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t-butyl, pentyl, izopentyl, heksyl, i tym podobne. W zalecanych postaciach, grupy alkilowe są (C1-C6) alkilem.

Alkenyl - dotyczy nienasyconych rozgałęzionych, o prostych łańcuchach lub cyklicznych rodników węglowodorowych mających przynajmniej jedno podwójne wiązanie węgiel-węgiel. Rodnik może być albo w konformacji cis albo trans wokół podwójnego wiązania. Typowe grupy alkilowe obejmują, ale bez ograniczenia, etenyl, propenyl, izopropenyl, butenyl, izobutenyl, tert-butenyl, pentenyl, heksenyl, i tym podobne. W zalecanych postaciach, grupa alkenylowa jest (C2-C6) alkenylem.

Alkinyl - dotyczy nienasyconych rozgałęzionych, o prostych łańcuchach lub cyklicznych rodników węglowodorowych mających przynajmniej jedno potrójne wiązanie węgiel-węgiel. Typowe grupy

PL 196 676 B1 alkinylowe obejmują, ale bez ograniczenia, etynyl, propynyl, butynyl, izobutynyl, pentynyl, heksynyl, i tym podobne. W zalecanych postaciach, grupa alkinylowa jest (C2-C6) alkinylem.

Aryl - dotyczy nienasyconego cyklicznego węglowodorowego rodnika mającego skoniugowany system elektronów π. Typowe grupy arylowe obejmują, ale bez ograniczenia, penta-2,4-dien, fenylu, naftyl, antracyl, azulenyl, chrysenyl, korolenyl, fluoroantenyl, indacenyl, indenyl, owalenyl, perylenyl, fenalenyl, fenantrenyl, picenyl, pleiadenyl, pyrenyl, pyrantrenyl, rubicenyl i tym podobne. W zalecanej postaci grupa arylowa jest (C5-C20) arylem, przy czym (C5-C10) jest szczególnie korzystne.

Alkiloaryl - dotyczy prostego łańcucha grupy alkilowej, alkenylowej lub alkinylowej, gdzie jeden z atomów wodoru połączony z końcowym węglem jest zamieniony przez resztę arylu. Typowe grupy alkiloarylowe obejmują, ale bez ograniczenia, benzyl, benzyliden, benzenobenzyl, naftenobenzyl i tym podobne. W zalecanych postaci grupa alkiloarylowa jest (C6-C26) alkiloarylem, tzn. reszta alkenylowa lub alkinylowa grupy alkiloarylowej jest (C1-C6) i reszta arylowa jest (C5-C20). W szczególnie zalecanych postaciach grupa alkiloarylowa jest (C6-C13) alkiloarylem tzn. reszta alkilowa, alkenylowa lub alkinylowa grupy alkiloarylowej jest (C1-C3) a reszta arylowa jest (C5-C10).

Heteroaryl dotyczy reszty arylowej, gdzie jeden lub więcej atomów węgla jest zastąpiony przez inny atom, taki jak N, P, O, S, As, Se, Si, Te itp. Typowe grupy heteroarylowe obejmują, ale nie są ograniczone do akrydarsyny, akrydyny, arsantrydyny, arsindolu, arsyndoliny, karbazolu, b-karboliny, chromenu, cinnoliny, furanu, imidazolu, indazolu, indolu, idolizyny, izoarsynadolu, izoarsynoliny, izobenzofuranu, izochromenu, izoindolu, izofosfoindolu, izofosfinoliny, izochinoliny, izotiazolu, izoksazolu, naftyrydyny, perimidyny, fenantrydyny, ftalazyny, pterydyny, puryny, piranu, pirazyny, pirazolu, pirydazyny, pirydyny, pirymidyny, pirolu, pirolizyny, chinazoliny, chinoliny, chinolizyny, chinoksaliny, selenofenu, tellurofenu, tiofanu i ksantenu. W zalecanych postaciach grupa heteroarylowa jest 5-10 członowym heteroarylem, szczególnie korzystny jest 5-10 członowy aryl.

Alkiloheteroaryl dotyczy grupy alkilowej, alkenylowej lub alkinylowej o prostym łańcuchu, gdzie jeden z atomów wodoru związanego z końcowym węglem jest zastąpiony przez resztę heteroarylu. W zalecanych postaciach grupa alkiloheterarylowa jest 6-26 czł onowym alkiloheteroarylem, tzn. grupa alkilowa, alkenylowa, lub alkinylowa alkiloheteroarylu jest (C1-C6) i heteroaryl jest heteroarylem 5-20 członowym. W szczególnie zalecanych postaciach alkiloheteroaryl jest 6-13 członowym alkiloheteroarylem, tzn. reszta alkilowa, alkenylowa, lub alkinylowa jest 5-10 członowym heteroarylem.

Podstawiony alkil, alkenyl, alkinyl, aryl, alkyral, heteroaryl lub alkiloheteroaryl dotyczy grupy alkilowej, alkenylowej, alkinylowej, arylowej, alkiloarylowej, heteroarylowej lub alkiloheteroarylowej, w której jeden lub wię cej atomów wodoru jest zastą pionych przez inny podstawnik. Zalecane podstawniki obejmują -OR, -SR i -NRR -NO2, -CN, fluorowiec, -C(O)R. -C(O)OR i -C(O)NR, gdzie każdy R jest niezależ nie wodorem, alkilem, alkenylem, alkinylem, arylem, alkiloarylem, heteroarylem lub alkiloheteroarylem.

4. Krótki opis figur

Figura 1A jest helikalnym schematem kołowym Schiffera-Edmundsona wyidealizowanej amfipatycznej α-helisy, w której otwarte kółka reprezentują hydrofitowe reszty aminokwasów i cieniowane kółka reprezentują hydrofobowe reszty aminokwasów.

Figura 1B jest helikalnym schematem sieciowym wyidealizowanej helisy amfipatycznej z fig. 1A.

Figura 1C jest helikalnym schematem cylindrycznym wyidealizowanej helisy amfipatycznej z fig. 1A.

Figura 2A jest helikalnym schematem kołowym Schiffera-Edmundsona rdzeniowego peptydu o strukturze (I) ilustrującym amfipatyczność helisy (otwarte kółka przedstawiają hydrofilowe reszty aminokwasów, cieniowane kółka reprezentują hydrofo bowe reszty aminokwasów i częściowo cieniowane kółka reprezentują zarówno hydrofobowe i hydrofilowe reszty aminokwasów).

Figura 2B jest helikalnym schematem sieciowym peptydu rdzeniowego o strukturze (I) przedstawiającym hydrofobową stronę helisy.

Figura 2C jest helikalnym schematem sieciowym peptydu rdzeniowego o strukturze (I) przedstawiającym hydrofilową stronę helisy.

Figura 3A jest helikalnym schematem sieciowym przedstawiającym hydrofilową powierzchnię 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta: (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75).

Figura 3B jest helikalnym schematem sieciowym przedstawiającym hydrofilową powierzchnię przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID NO:146).

PL 196 676 B1

Figura 4A jest helikalnym schematem sieciowym ilustrującym hydrofobową powierzchnię 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 4B jest helikalnym schematem sieciowym ilustrującym hydrofobową powierzchnię przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (SEQ ID NO:146).

Figura 5A jest helikalnym schematem kołowym Schiffera-Edmundsona 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 5B jest helikalnym schematem kołowym Schiffera-Edmundsona przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (SEQ ID NO:146).

Figura 6 jest modelem komputerowym dwóch peptydow 146 (SEQ ID NO:146) ułożonych w formie przeciwrównoległej, w których reszty Glu 7 i Gln-18 są wyróżnione aby zilustrować zdolność tych dwóch peptydow do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych gdy są związane z lipidami.

Figura 7A ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć trzeciorzędową.

Figura 7B ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć czwartorzędową.

Figura 7C ilustruje opisaną tu rozgałęzioną sieć mieszanego rzędu.

Figura 7D ilustruje przykładowe rozgałęzione sieci Lys-tree według wynalazku.

Figura 8A jest grafem ilustrującym różnice między obserwowanymi przesunięciami chemicznymi Ha i tabularyzowanymi przesunięciami chemicznymi Ha dla kłębka statystycznego peptydu 146 (SEQ ID NO:146) i 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 8B jest grafem ilustrującym różnice między obser wowanymi przesunięciami chemicznymi protonów amidu i tabularyzowanymi przesunięciami chemicznymi protonów amidu dla kłębka statystycznego peptydu 146 (SEQ ID NO:146) i 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 8C jest grafem porównującym wtórne przesunięcia chemiczne protonów amidu obserwowane dla peptydu 146 (SEQ ID NO:146) (*) i wyidealizowanej α-helisy (O) (w wyidealizowanej helisie reszty hydrofilowe są przedstawione jako otwarte kółka, reszty hydrofobowe jako cieniowane kółka).

Figura 9 jest grafem ilustrującym profil lipoproteinowy królika, któremu wstrzyknięto 8 mg/kg masy ciała peptydu 146 (SEQ ID NO:146) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC).

Figura 10A jest rysunkiem przedstawiającym różne stany agregacji i kompleksy peptydowolipidowe, które mogą być uzyskane z agonistami ApoA-I według wynalazku, Z lewej: Proces multimeryzacji peptydów wynikający z interakcji kilku helis peptydów i prowadzący do tworzenia oligomerów w warunkach zdefiniowanych stężeń peptydów, stężenia, pH i mocy jonowej. Środek: Interakcja peptydów (w dowolnym z tych stanów agregacji) z lipidowymi jednostkami (takimi jak SUV) prowadząca do reorganizacji lipidów. Z prawej: przez zmianę molowego stosunku można uzyskać różne rodzaje kompleksów peptyd-lipid, od komiceli lipid-peptyd przy niskich stosunkach lipid-peptyd do dyskoidalnych cząsteczek i w końcu do dużych multilamelarnych kompleksów przy wzrastających stosunkach lipid:peptyd.

Figura 10B ilustruje ogólnie akceptowany model dla kompleksów dyskoidalnych peptyd-lipid tworzonych w zdefiniowanym zakresie stosunków bliskim kontakcie ze swoimi dwoma najbliższymi sąsiadami.lipid-peptyd. Każdy peptyd otaczający brzeg dysku jest w ścisłym kontakcie ze swoimi dwoma najbliższymi sąsiadami.

5. Szczegółowy opis wynalazku

Agoniści ApoA-I według wynalazku imitują funkcje i aktywność ApoA-I. Tworzą amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy podobne do pre-b lub HDL, aktywują LCAT, zwiększają stężenie HDL w surowicy i sprzyjają wypływowi cholesterolu. Biologiczna funkcja tych peptydów koreluje z ich helikalną strukturą lub konwersją do helikalnej struktury w obecności lipidów.

Agoniści ApoA-I według wynalazku mogą być przygotowani w stabilnych postaciach masowych lub w postaci dawek jednostkowych, tzn. liofilizowanych produktów, które mogą być rekonstytuowane przed użyciem lub ponownie formułowane. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii, choroby wieńcowej serca, miażdżycy naczyń/ i innych stanów, takich jak endotoksemia powodująca wstrząs septyczny.

Wynalazek jest ilustrowany przez przykłady realizacji, które wykazują, że agoniści ApoA-I według wynalazku są niesłychanie skuteczni w aktywacji LCAT, i w ten sposób promują RCT. StosowaPL 196 676 B1 nie agonistów ApoA-I według wynalazku in vivo w modelach zwierzęcych daje zwiększenie stężenia HDL w surowicy.

Wynalazek jest przedstawiony bardziej szczegółowo w podanych niżej częściach, które opisują: skład i budowę agonistów peptydowych ApoA-I; strukturalną i funkcjonalną charakterystykę; metody przygotowania kompozycji masowych i jednostkowych i metody stosowania.

5.1 Struktura i funkcja peptydów

Agoniści ApoA-I według wynalazku są na ogól peptydami lub ich analogami, które są zdolne do tworzenia amfipatycznych α-helis w obecności lipidów, i które imitują aktywność ApoA-I. Główną cechą agonistów jest peptyd rdzeniowy, kótry może być złożony z 15 do 29 reszt aminokwasów, korzystnie 22 reszt aminokwasów.

Agoniści ApoA-I według wynalazku są oparci, częściowo, na zadziwiającym stwierdeniu twórców wynalazku, że zmiana pewnych reszt aminokwasów w pierwszorzędowej sekwencji 22-merowej sekwencji najwyższej zgodności Venkatachalapathi i wsp., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75, odtąd 22-mer najwyższej zgodności Segresta lub 22-mer najwyższej zgodności), które były uważane za krytyczne dla aktywności daje syntetyczne peptydy, które wykazują aktywności, które są zbliżone, lub w niektórych postaciach nawet przekraczają aktywność natywnej ApoA-I. W szczególności twórcy wynalazku stwierdzili, że zastąpienie trzech naładowanych reszt aminokwasów 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (Glu-5, Lys-9, Glu-13) hydrofobową resztą leucyny dostarcza peptydy, które imitują strukturalne i funkcjonalne właściwości ApoA-I w stopniu, który nie ma precedensu w dziedzinie.

Choć nie chcemy być związani jakąś szczególną teorią należy wierzyć, że helisa tworzona przez agonistów ApoA-I według wynalazku bliżej imituje strukturalne i funkcjonalne właściwości amfipatycznych regionów helikalnych natywnej ApoA-I, które są ważne dla wpływu na wiązanie lipidów, wypływ cholesterolu i aktywację LCAT niż α-helisa tworzona przez peptydy imitujące ApoA-I opisane w literaturze, w ten sposób dając peptydy, które wykazują znacząco wyższą aktywność podobną do ApoA-I niż te inne peptydy. Zaiste, podczas gdy wiele agonistów ApoA-I według wynalazku ma aktywność zbliżoną i w niektórych postaciach nawet przekraczającą aktywność ApoA-I, dotychczas najlepsze mimetyki ApoA-I opisane w literaturze - peptyd 18AM4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID NO:246) (Corinin i wsp., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:8-16; Labeur i wsp., paźdź. 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nr 186 i 187) i N-acetylowany, C-amidowany peptyd 18AM4 (SEQ NR ID:239) (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7) wykazują odpowienio mniej niż 4% i 11% aktywności ApoA-I mierzonej za pomocą tu opisanego oznaczenia aktywności LCAT.

W jednej ilustrującej postaci wynalazku peptydy rdzeniowe (lub ich analogi), które mogą tworzyć agonistów ApoA-I według wynalazku mają następujący wzór strukturalny (I):

^X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-X19^-X20^-X21^-X22 w którym:

XI jest Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 jest aminokwasem alifatycznym;

X3 jest Leu (L) lub Phe (F);

X4 jest Glu (E);

X5 jest alifatycznym aminokwasem;

X6 jest Leu (L) lub Phe (F);

X7 jest Glu (E) lub Leu (L);

X8 jest Asn (N) lub Gln (Q);

X9 jest Leu (L);

X10 jest Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII jest kwaśnym aminokwasem;

X12 jest Arg (R);

X13 jest Leu (L) lub Gly (G);

X14 jest Leu (L), Phe (P) lub Gly (G);

X15 jest Asp (D);

X16 jest Ala (A);

X17 jest Leu (L);

X18 jest Asn (N) lub Gln (Q);

PL 196 676 B1

X19 jest zasadowym aminokwasem;

X20 jest zasadowym aminokwasem;

X21 jest Leu (L); i

X22 jest zasadowym aminokwasem.

Peptydy rdzeniowe o strukturze (I) są definiowane częściowo poprzez aminokwasy określonych klas. Definicje różnych określonych klas są dostarczane powyżej w związku z opisem zmutowanych lub zmienionych postaci struktury (I).

W peptydach rdzeniowych o strukturze (I) symbol - między resztami aminokwasów Xn zazwyczaj przedstawia konstytutywną funkcję łączącą szkieletu. Tak więc symbol - zazwyczaj reprezentuje wiązanie peptydowe lub połączenie amidowe (-C(O)NH-). Należy jednak rozumieć, że niniejszy wynalazek rozważa analogi peptydów gdzie jedno lub więcej połączenie amidowe jest dowolnie zamienione na połączenie inne niż amid, dogodnie podstawiony amid lub izoster amidu. Tak więc podczas gdy różne reszty Xn w strukturze (I) są na ogół opisane w postaci aminokwasów, i zalecane postacie realizacji są podane przykładowo poprzez peptydy, specjalista rozpozna, że w postaciach mających wiązania nieamidowe, określenie aminokwas lub reszta jak jest tu stosowane dotyczy innych bifunkcjonalnych reszt niosących grupy podobne pod względem budowy do łańcuchów bocznych aminokwasów.

Podstawione amidy na ogół obejmują, ale nie ograniczają się do, związków o wzorze -C(O)NR-, gdzie R jest (C1-C6) alkilem, podstawionym (C1-C6) alkilem, (C1-C6) alkenylem, podstawionym (C1-C6) alkenylem, (C1-C6) alkinylem, podstawionym (C1-C6) alkinylem, (C5-C20) arylem, podstawionym (C5-C20) arylem, (C6-C26) alkiloarylem, podstawionym (C6-C26) alkiloarylem, podstawionym 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkiloheteroarylem i podstawionym 6-26 członowym alkilohete-roarylem.

Izostery amidu ogólnie obejmują, ale nie ograniczają się do, -CH2NH-, -CH2S2, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO. Związki mające takie nieamidowe połączenia i sposoby przygotowywania takich związków są dobrze znane w dziedzinie (zob. np. Spatola, Marzec 1983, Peptide Backbone Modifications w: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein, red., Marcel Dekker, Nowy Jork, str, 267 (przegląd ogólny); Morley, 1980, Trends Pharm, Sci. 1:463-468; Hudson i wsp., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola i wsp., 1986, Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2S-); Hann, 1982, J. Chem. Sic. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, cis i trans); Almquist i wsp., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (C(O)CH2-); Jennings-White i wsp., Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Europejskie Zgłoszenie Patentowe EP 45665 (1982) CA 97:39405 (-CH(OH)CH2-); Holladay i wsp., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); i Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH2-S-).

Dodatkowo jedno lub więcej wiązań amidowych może być zastąpione peptydomimetycznymi lub amidomimetycznymi resztami, które nie interferują w znaczący sposób ze strukturą lub aktywnością peptydów. Odpowiednie amidomimetyczne reszty są opisane np. w Olson i wsp., J. Med. Chem. 36:3039-3049.

Krytyczną cechą peptydów rdzeniowych o strukturze (I) jest ich zdolność do tworzenia amfipatycznej α-helisy w obecniści lipidów. Przez amfipatyczną rozumie się, że α-helisa ma przeciwstawne powierzchnie hydrofilowe i hydrofobowe zorientowane wzdłuż swojej długiej osi, tzn. jedna powierzchnia helisy wystawia głównie łańcuchy boczne hydrofilowe, podczas gdy druga powierzchnia wystawia głównie łańcuchy boczne hydrofobowe. Figury 1A i 1B przedstawiają dwa ilustrujące widoki przeciwstawnych powierzchni hydrofitowych i hydrofobowych przykładowej wyidealizowanej α-helisy fig. 1A jest helikalnym schematem kołowym Schiffera-Edmunsona (Schiffer i Edmundson, Biophys. J. 7:121-135). W kole długa oś helisy jest prostopadła do kartki. Rozpoczynając od N-końca, kolejne reszty aminokwasów (reprezentowane przez kółka) są promieniście rozmieszczone wokół obwodu koła w odstępach 100°. Tak więc reszta aminokwasu n+1 jest rozmieszczona 100° od reszty n, reszta n+2 jest umieszczona 100° od reszty n+1 i tak dalej. Umieszczenie 100° powoduje, że 3,6 aminokwasów przypada na skręt, co jest typowo obserwowane w idealnej α-helisie. W fig. 1A przeciwstawne hydrofitowe i hydrofobowe powierzchnie helisy są wyraźnie widoczne, hydrofilowe aminokwasy są reprezentowane jako otwarte kółka i hydrofobowe aminokwasy są reprezentowane jako cieniowane kółka.

Figura 1B przedstawia schemat helikalnej sieci dla wyidealizowanej helisy amfipatycznej fig. 1A (Lim, 1978, FEBS Lett. 89:10-14). W typowym schemacie helikalnej sieci α-helisa jest przedstawiana jako cylinder, który został przecięty wzdłuż środka swojej hydrofilowej powierzchni i spłaszczony. Tak więc środek powierzchni hydrofobowej, określany przez hydrofobowy moment helisy (Eisenberg i wsp,

PL 196 676 B1

1982, Nature 229:371-374), leży w środku figury i jest zorientowany tak by wystawał z płaszczyzny kartki. Ilustracja cylindra helikalnego przed cięciem i spłaszczeniem jest przedstawiona na fig. 1C. Przez przecięcie cylindra wzdłuż różnych płaszczyzn, można obserwować różne widoki tej samej helisy amfipatycznej, i można uzyskać różne informacje o właściwościach helisy.

Amfipatyczna natura α-helisy wytworzonej przez peptydy rdzeniowe o wzorze (I) w obecności lipidów jest przedstawiona na fig. 2. Figura 2A przedstawia helikalny schemat kołowy SchifferaEdmundsona, fig. 2B przedstawia helikalny schemat sieciowy ilustrujący hydrofobową powierzchnię i fig. 2C przedstawia helikalny schemat sieciowy ilustrujący powierzchnię hydrofilową. Na każdej z fig. 2A, 2B i 2C reszty hydrofiIowe są przedstawiane jako otwarte kółka, reszty hydrofobowe jako zacieniowane kółka, i reszty, które mogą być albo hydrofilowe albo hydrofobowe jako częściowo zacieniowane kółka. Jak będzie przedyskutowane bardziej szczegółowo poniżej w związku ze zmienionymi lub zmutowanymi postaciami peptydów o strukturze (I), pewne reszty aminokwasów mogą być zastąpione przez inne reszty aminokwasów tak, że odpowiednio hydrofilowa i hydrofobowa powierzchnia helisy tworzonej przez α-helisę może odpowiednio nie być złożona całkowicie z aminokwasów hydrofilowych i hydrofobowych. Tak więc powinno być rozumiane, że przy odniesieniu do amfipatycznej α-helisy tworzonej przez peptydy rdzenia ti opisane, określenie powierzchnia hydrofilowa dotyczy powierzchni helisy mającej ogólnie hydrofilowy charakter netto. Określenia powierzchnia hydrofobowa dotyczy powierzchni peptydu mającej ogólny charakter hydrofobowy netto.

Nie mając na celu bycie wiązanym żadną poszczególną teorią, uważa się, że pewne strukturalne i/lub fizyczne właściwości helisy amfipatycznej tworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I) są ważne dla aktywności. Te właściwości obejmują stopień amfipatyczności, ogólną hydrofobowość, średnią hydrofobowość, kąty hydrofobowe i hydrofilowe, moment hydrofobowy, średni moment hydrofobowy i ładunek netto α-helisy.

Podczas gdy helikalne schematy kołowe na fig. 2A dają wygodny sposób wizualizacji amfipatycznej natury peptydów rdzeniowych o strukturze (I), stopień amfipatyczności (stopień asymetrii hydrofobowości) może być wygodnie określony ilościowo przez wyliczenie momentu hydrofobowego (μhelisy. Metody liczenia μι_ι dla danej sekwencji peptydowej są dobrze znane w dziedzinie i są opisane np. w Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:595-623. Aktualny μι-ι uzyskany dla danego peptydu będzie zależał od całkowitej liczby reszt aminokwasów, z których składa się peptyd. Tak więc nie jest ogólnie informacyjne bezpośrednie porównanie μι-ι dla peptydów o różnej długości.

Amfipatyczności peptydów o różnych długościach mogą być bezpośrednio porównane poprzez średni moment hydrofobowy (<μπ>). średni moment hydrofobowy może być uzyskany przez podzielenie μι-ι przez liczbę reszt w helisie (tzn. (<μ,_ι>) = p^/N). Na ogół peptydy rdzeniowe, które wykazują (<μι-ι>) w zakresie 0,45 do 0,65 jak określono stosując normalizowaną skalę hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142) są uważane za będące w zakresie niniejszego wynalazku, korzystny jest (<μ_->) w zakresie od 0,50 do 0,60.

Całkowita czy totalna hydrofobowośc (Ho) peptydu może być wygodnie wyliczona przez wzięcie sumy algebraicznej hydrofobowości każdej reszty aminokwasu w peptydzie (tzn.

N

H_o = ΣH_i), gdzie N jest liczbą reszt aminokwasów w peptydzie i i =1

Hi jest hydrofobowością i-tej reszty aminokwasu. Średnia hydrofobowość (<Ho>) jest hydrofobowością podzieloną przez liczbę reszt aminokwasów (tzn. <Ho> = Ho/N). Ogólnie peptydy rdzeniowe, które wykazują średnią hydrofobowość w zakresie -0,050 do -0,070, określoną za pomocą znormalizowanej skali hydrofobowości Eisenberga (Eisenber, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142) są uważane za będące w zakresie niniejszego wynalazku, zalecana jest średnia hydrofobowość w zakresie -0,030 do -0,055.

Całkowita hydrofobowość powierzchni hydrofobowej (Ho^pho) helisy amfipatycznej może być uzyskana przez wzięcie sumy hydrofobowości hydrofobowych reszt aminokwasów, które wchodzą w kąt hydrofobowy jak zdefiniowano poniżej (np.

N

H_o = ΣH_i), gdzie H_I jest jak poprzednio zdefiniowano a N_H i =1 jest całowitą liczbą hydrofobowych aminokwasów w powierzchni hydrofobowej. Średnia hydrofobowość powierzchni hydrofobowej to <Ho^pho> wynosi Ho^pho/NH, gdzie NH jest jak zdefiniowano powyżej.

PL 196 676 B1

Ogólnie peptydy rdzeniowe, które wykazują <Ho^pho> w zakresie 0,90 do 1,2, określoną za pomocą znormalizowanej skali hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg,1984 powyżej, Eisenberg i wsp., 1982 powyżej) są uważane za będące w zakresie niniejszego wynalazku, zalecane jest <Ho^pho> w zakresie 0,940 do - 1,10.

Kąt hydrofobowy (kąt pho) jest na ogół definiowany jako kąt lub łuk pokrywany przez najdłuższy ciągły odcinek reszt hydrofobowych aminokwasów gdy peptyd jest ułożony w reprezentacji koła helikalnego Schiffera-Edmundsona (tzn. liczba ciągłych hydrofobowych reszt na kole mnożona przez 20°). Kąt hydrofilowy (kąt pni) jest różnicą między 360° i kątem pho (tzn. 360° - kąt pho). Specjaliści rozpoznają, że kąty pho i phi będą zależały częściowo od liczby aminokwasów w peptydzie. Na przykład odnosząc się do fig. 5A i 5B można zobaczyć, że tylko 18 aminokwasów mieści się dokoła jednego obrotu koła helikalnego Schiffera-Edmundsona. Mniej aminokwasów zostawia przerwę w kole, więcej aminokwasów powoduje, że niektóre pozycje na kole są zajmowane przez więcej niż jedną resztę aminokwasu.

W przypadku peptydów zawierających więcej niż 18 reszt aminokwasów, takich jak peptydy rdzeniowe o strukturze (I), ciągły odcinek reszt hydrofobowych aminokwasów ma oznaczać że przynajmniej jedna reszta aminokwasu w pozycjach na kole zajmowanych przez dwa lub więcej aminokwasów jest aminokwasem hydrofobowym. Tak więc odnosząc się do fig. 5B, kąt pho jest łukiem pokrywanym przez reszty 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 i 14 mimo występowania hydrofilowej reszty w pozycji 20, jako że reszta w pozycji 2, która zajmuje tę samą pozycję na kole jak reszta 20, jest resztą hydrofobową. Typowo peptydy rdze niowe mające kąt pho w zakresie 160° do 220° są uważane za będące w zakresie wynalazku, zalecany jest kąt pho w zakresie 180° do 200°.

Niektóre strukturalne i/lub fizyczne cechy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) są ilustrowane na fig. 3 i 4. fig. 3B przedstawia helikalny schemat sieciowy przykładowego peptydu rdzeniowego według wynalazku, peptydu 146 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID NO:146), ilustrującego dystrybucję ładunku wzdłuż hydrofilowej powierzchni helisy. Na fig. 3B, helikalny cylinder został przecięty wzdłuż środka powierzchni hydrofobowej i spłaszczony. W trzech hydrofobowych resztach Leu (L), które zastępują reszty hydrofilowe w 22-merze najwyższej zgodności Segresta (fig. 3A) są zacieniowane. Jak widać na fig. 3B, dodatnio naładowane reszty aminokwasów są skupione na ostatnim C-końcowym skręcie (skręt C-końcowy jest na górze strony). Nie chcąc być ograniczonymi żadną szczególną teorią, uważa się, że to skupienie zasadowych reszt na C-końcu (reszty 19, 20 i 22) stabilizuje helisę przez interakcje ładunek (NH3⁺)-dipol helisy. Uważa się też, że stabilizacja zachodzi poprzez hydrofobowe interakcje między bocznymi łańcuchami lizyny i rdzeniem helisy (zobacz Groebke i wsp., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4025-4029; Esposito i wsp., 1997, Biopolymers 41:27-35).

Z wyjątkiem dodatnio naładowanego skupienia C-końcowego, ładunki ujemne są rozmieszczone na reszcie powierzchni hydrofilowej, z przynajmniej jednym ujemnie naładowanym (kwaśnym) aminokwasem na skręt, co daje ciągły odcinek ujemnego ładunku wzdłuż powierzchni hydrofilowej helisy. Jeden ładunek dodatni jest umieszczony w reszcie 12, która potencjalnie wpływa na stabilność helisy poprzez tworzenie wiązania jonowego z resztą kwaśną oddaloną o jeden skręt na helisie.

Figura 4B przedstawia helikalny schemat sieciowy ilustrujący hydrofobową powierzchnię amfipatycznej helisy tworzoną przez przykładowy peptyd 146 (SEQ ID NO:146). Na fig. 4B, helikalny cylinder jest przecięty wzdłuż środka hydrofilowej powierzchni i spłaszczony. Hydrofobowa powierzchnia peptydu rdzeniowego jest złożona z dwóch reszt hydrofobowych na skręt, z wyjątkiem ostatniego skrętu C-końcowego, gdzie dominują reszty zasadowe. Badania NMR wykazują, że reszty aminokwasów 3, 6, 9 i 10 tego peptydu rdzeniowego tworzą skupienia hydrofobowe w pobliżu N-końca helisy. Phe-6 jest wypośrodkowany w tym skupieniu i uważa się, że odgrywa ważną rolę w stabilizacji hydrofobowego skupienia.

Nie chcąc być ograniczonymi żadną szczególną teorią, uważa się, że to skupienie hydrofobowe tworzone przez reszty 3, 6, 9 i 10 jest znaczące w przeprowadzaniu wiązania lipidów i aktywacji LCAT. Oczekuje się, że amfipatyczne peptydy wiążą fosfolipidy przez ukierunkowanie swoich powierzchni hydrofobowych w stronę łańcuchów alkilowych tych reszt lipidowych.

Tak więc uważa się, że to wysoce hydrofobowe skupienie wpływa na silne powinowactwa do lipidów obserwowane dla opisanych tu peptydów rdzeniowych. Ponieważ wiązanie lipidów jest wstępnym wymaganiem do aktywacji LCAT, uważa się że to hydrofobowe skupienie jest niezbędne do aktywacji LCAT.

Często stwierdza się, że reszty aminokwasów aromatycznych są ważne w zakotwiczaniu peptydów i białek do lipidów (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10:127-130; O'Neill i De Grado, 1990, Science

PL 196 676 B1

250:645-651; Blondelle i wsp., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202:331-336). Tak więc uważa się także, że Phe-6, która jest umieszczona w środku skupienia hydrofobowego może też odgrywać kluczową rolę w zakotwiczaniu peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do lipidów.

Interakcje między opisanymi tu peptydami rdzeniowymi i lipidami prowadzą do powstania kompleksów peptyd-lipid. Jak zilustrowano na fig. 10A typ uzyskanego kompleksu (komicelle, dyski, pęcherzyki lub wielowarstwowe) zależy od stosunku molowego lipid:peptyd, przy czym komicele na ogół tworzą się przy niskich stosunkach molowych lipid:peptyd a dyskowe i pęcherzykowe lub wielowarstwowe kompleksy tworzą się ze wzrastającymi stosunkami molarnymi lipid:peptyd. Ta charakterystyczna cecha była opisana dla peptydów amfipatycznych (Epand, The Amphipathic Helix, 1993) i dla ApoA-I (Jones, 1992, Structure and Function of Apolipoproteins, rozdz. 8, str. 217-250. Stosunek molowy lipid:peptyd także określa wielkość i skład kompleksów (zob. część 5.3.1, poniżej).

Długa oś α-helisy tworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I) ma ogólny kształt zakrzywiony. W typowych helisach amfipatycznych stwierdzono, że długości wiązań wodorowych hydrofilowej i hydrofobowej powierzchni są tak różne, że hydrofobowa strona helisy jest wklęsła (Barlaw i Thornton, 1988, J. Mol. Biol. 201:603-619; Zhou i wsp., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33:11174-11183; Gesell i wsp., 1987. J. Biomol. NMR 9:127-135). Nie chcąc być ograniczonymi żadną szczególną teorią, uważa się, że ogólne zakrzywienie powierzchni hydrofobowej helisy może być ważne w wiązaniu kompleksów dyskowych - zakrzywiona helisa pozwala peptydowi na lepsze dopasowanie wokół krawędzi cząsteczek dyskoidalnych, w ten sposób zwiększając stabilność kompleksu peptyd-dysk.

W ogólnie przyjętym modelu strukturalnym ApoA-I, amfipatyczne α-helisy są upakowane wokół krawędzi dyskoidalnego HDL (zob. fig. 10B). W tym modelu, zakłada się że helisy są uliniowane ze swoimi hydrofobowymi powierzchniami skierowanymi do acylowych łańcuchów lipidów (Brasseur i wsp., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043:245-252). Helisy są ułożone w formie przeciwrównoległej, i uważa się, że kooperatywny efekt między helisami wpływa na stabilność dyskoidalnego kompleksu HDL (Brasseur i wsp., powyżej). Zaproponowano, że jednym czynnikiem, który wpływa na stabilność dyskoidalnego kompleksu jest istnienie jonowych interakcji między kwaśnymi i zasadowymi resztami dając w efekcie wytworzenie międzycząsteczkowych wiązań jonowych lub wiązań wodorowych między resztami na przyległych przeciwrównoległych helisach. W tym modelu peptydów nie uważa się za jedną całość, ale za interakcję z przynajmniej dwoma sąsiadującymi cząsteczkami peptydów (fig. 10B).

Jest też ogólnie przyjmowane, że tworzenie wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego lub jonowego między kwaśnymi i zasadowymi resztami, odpowiednio, w pozycjach i oraz i+3 helisy stabilizuje strukturę helikalną (Marquee i wsp., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24): 8898-8902.

Tak więc dodatkową kluczową cechą peptydów rdzeniowych struktury (I) jest ich zdolność do tworzenia wewnątrzcząteczkowych wiązań wodorowych ze sobą, gdy są uliniowane w sposób antyrównoległy ze swoimi powierzchniami hydrofobowymi skierowanymi w tę samą stronę, co miałoby miejsce w przypadku gdy peptydy są związane z lipidami (np. między kwaśnymi resztami w pozycjach 4 i 7 i zasadowymi resztami w pozycjach 19, 20 i 22, odpowiednio), a także ich zdolności do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych lub jonowych w pobliżu N i C końców helisy.

Zdolność peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych jest z ilustrowana na fig. 6. Na fig. 6 dwie idealne α-helisy przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (SEQ ID NO:146) są uliniowane w sposób przeciwrównoległy z odpowiednimi powierzchniami hydrofobowymi skierowanymi w tę samą stronę (z płaszczyzny kartki). Interakcje wiązania H mogłyby zajść pomiędzy resztami E-7 i Q-18 (Huyghues-Despointes i wsp., 1995, Biochemistry 34 (41):13267-13271).

Co więcej, gdy są ułożone w ten sposób przeciwrównoległy, helisy są blisko upakowane; nie ma zawady sterycznej zapobiegającej bliskiemu kontaktowi między helisami. Zmiany w sekwencji peptydów rdzeniowych, które wpływają na upakowanie helis negatywnie wpływają na aktywność peptydu rdzeniowego.

Tak więc bez ograniczania się jakąkolwiek szczególną teorią, uważa się, że zdolność peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do ścisłego upakowania i interakcji jonowych z tworzeniem wewnątrz i/lub międzycząsteczkowych wiązań jonowych i/lub wodorowych gdy są związane z lipidami w sposób przeciwrównoległy jest ważną cechą peptydów rdzeniowych wynalazku.

Zdolność peptydów rdzeniowych do tworzenia uprzywilejowanych oddziaływań międzycząsteczkowych peptyd-peptyd jest też uważana za cechę istotną przy braku lipidów. Peptydy rdzeniowe tu opisane asocjują ze sobą, częściowo ze względu na ich wysoki <^> i <H_o>, i kąt hydrofobowy (Zo24

PL 196 676 B1 bacz tabela I poniżej). Zjawisko autoasocjacji zależy od warunków pH, stężenia peptydów i mocy jonowej, i może powodować kilka stanów asocjacji, od monomerycznej do kilku postaci multimerycznych (fig. 1A). Rdzeń hydrofobowy agregatów peptydowych sprzyja hydrofobowym interakcjom z lipidami. Zdolność peptydów do agregacji nawet przy bardzo niskich stężeniach może sprzyjać ich wiązaniu z lipidami. Uważ a się , ż e w rdzeniu agregatów peptydowych zachodzą też interakcje peptyd-peptyd i mogą współzawodniczyć z interakcjami lipid-peptyd.

Oprócz opisanych powyżej właściwości, inne parametry uważane są także za ważne dla aktywności, w tym całkowita liczba reszt hydrofobowych, i ładunek netto na peptydach.

Streszczenie zalecanych fizycznych i strukturalnych właściwości peptydów rdzeniowych o budowie (I) przedstawiono w tabeli I poniżej.

T a b e l a I

Fizyczne właściwości zalecanych agonistów ApoA-I o strukturze I

Właściowość	Zakres	Zalecany zakres
% hydrofobowych aminokwasów	40 - 70	50 - 60
<H0>	-0,050 do -0,070	-0,030 do -0,055
<H0^pho>	0,90 do 1,2	0,94 - 1,1
^H>	0,45 - 0,65	0,50 do 0,60
kąt pho	160° - 220°	180° - 200°
# dodatnio naładowanych aminokwasów	3 - 5	4
# ujemnie naładowanych aminokwasów	3 - 5	4
ładunek netto	-1 do +1	0
skupienie hydrofobowe	pozycje 3, 6, 9, 10 są hydrofobowymi aminokwasami
skupienie kwaśne	przynajmniej 1 kwaśny aminokwas na skręt z wyjątkiem ostatnich 5 aminokwasów C-końcowych
skupienie zasadowe	przynajmniej 3 aminokwasy zasadowe wśród 5 aminokwasów
C-końcowych

Właściwości amfipatycznych α-helis wytworzonych przez peptydy rdzeniowe tu opisane różnią się znacząco od właściwości amfipatycznych α-helis klasy A, szczególnie od α-helisy klasy A 22-meru najwyższej zgodności Segresta. Te różnice są zilustrowane przez przykładowy peptyd rdzeniowy 146 (SEQ ID NO:146) w fig. 3-5.

Odnosząc się do Figur 4A i 4B, widać że powierzchnia hydrofobowa peptydu 146 ma znacznie silniejszy charakter hydrofobowy niż powierzchnia hydrofobowa 22-meru najwyższej zgodności Segresta. W szczególności reszty 5, 9 i 13 (zacieniowany obszar fig. 4B) są hydrofobowym resztami Leu (L) w peptydzie 146 (SEQ ID NO:146) w porównaniu z naładowanymi resztanw 22-merze najwyższej zgodności (SEQ ID NO:75). Zastąpienie tych trzech naładowanych reszt w 22-merze najwyższej zgodności Segresta hydrofobowymi resztami Leu (L) prowadzi do znaczących różnic w amfipatyczności, hydrofobowości, kącie pho i innych właściwościach helisy.

Porównanie fizycznych i strukturalnych właściwości peptydu 146 (SEQ ID NO:146) i 22-meru najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75) przedstawiono w tabeli II poniżej.

PL 196 676 B1

T a b e l a II

Porównanie właściwości przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (SEQ ID NO:146) z 22-merem najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Właściowość	22-mer najwyższej zgodności	Peptyd 146
# aminokwasów	22	22
# hydrofilowych aminokwasów	13	10
# hydrofobowych aminokwasów	9	12
% hydrofobowych aminokwasów	41	55
<H0>	-0,293	-0,013
<H0^pho>	0,960	0,990
<Ph>	0,425	0,577
kąt pho	100°	200°
# dodatnio naładowanych aminokwasów	5	4
# ujemnie naładowanych aminokwasów	6	4
ładunek netto	-1	0

Szczególnie istotnie, peptydy rdzeniowe o strukturze (I) są złożone z wyższego procentu reszt hydrofobowych, mają znacząco większy <H₀> i <μ_Η> i mają dwukrotnie większy kąt pho niż 22-mer najwyższej zgodności Segresta (zobacz fig. 5A i 5B). Podczas gdy 22-mer najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75) wykazuje tylko 10% aktywacji LCAT w porównaniu z natywnym ApoA-I w opisanych tu oznaczeniach, peptyd 146 (SEQ ID NO:146) wykazuje 86% aktywacji w porównaniu z natywnym ApoA-I w tych samych oznaczeniach. Peptyd 144 PVLELFENLLERLLDALQKKLK (SEQ ID NO:144), który różni się od peptydu 146 (SEQ ID NO:146) tylko D-Pro (p) w pozycji X1, wykazuje 111% aktywacji w porównaniu z natywnym ApoA-I w tych samych oznaczeniach.

Pewne reszty aminokwasów w peptydach rdzeniowych o strukturze (I) mogą być zastąpione przez inne reszty aminokwasów bez znacząco szkodliwego wpływu na, a w wielu przypadkach nawet wzmagając aktywność peptydów. Tak więc zgodnie z wynalazkiem są także rozważane zmienione lub zmutowane postacie peptydów rdzeniowych o strukturze (I), w którym przynajmniej jedna określona reszta aminokwasu w strukturze jest zastąpiona przez inną resztę aminokwasu. Ponieważ uważa się, że jedną z krytycznych cech wpływających na aktywność peptydów rdzeniowych tu opisanych jest ich zdolność do tworzenia α-helisy w obecności lipidów, oraz właściwości amfipatyczne i inne opisane powyżej, będzie rozpoznane, że w zalecanych postaciach realizacji podstawienia aminokwasów są konserwatywne tzn. podstawiająca reszta aminokwasu ma fizyczne i chemiczne właściwości, które są podobne do zastępowanej reszty aminokwasu.

Dla celu określenia konserwatywnych podstawień aminokwasów, aminokwasy można wygodnie zaklasyfikować w dwie główne kategorie - hydrofobowe i hydrofilowe, zależne przede wszystkim od cech fizykochemicznych bocznego łańcucha aminokwasów. Te dwie kategorie główne mogą być dalej klasyfikowane w podkategorie, które bardziej jasno definiują cechy łańcuchów bocznych aminokwasów. Na przykład klasa hydrofilowych aminokwasów może być dalej podzielona na aminokwasy kwaśne, zasadowe i polarne. Klasa hydrofobowych aminokwasów może być dalej podzielona na aminokwasy niepolarne i aromatyczne. Definicje różnych kategorii aminokwasów, które definiują strukturę (I) są następujące:

Hydrofilowy aminokwas dotyczy aminokwasu wykazującego hydrofobowość mniejszą od zero według znormalizowanej skali hydrofobowości najwyższej zgodności Eisenberga i wsp., 1984, J. Mol.

PL 196 676 B1

Biol. 179:125-142. Genetycznie kodowane hydrofilowe aminokwasy obejmują Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) i Arg (R).

Kwaśny aminokwas dotyczy hydrofilowego aminokwasu mającego wartość pK łańcucha bocznego mniejszą niż 7. Kwaśne aminokwasy typowo mają ujemnie naładowane łańcuchy boczne w fizjologicznym pH ze względu na utratę jonu wodorowego. Genetycznie kodowane kwaśne aminokwasy obejmują Glu (E) i Asp (D).

Zasadowy aminokwas dotyczy hydrofilowego aminokwasu mającego wartość pK łańcucha bocznego większą niż 7. Zasadowe aminokwasy typowo mają dodatnio naładowane łańcuchy boczne w fizjologicznym pH ze względu na asocjację z jonem hydroniowym. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy obejmują His (H), Arg (R) i Lys (K).

Hydrofobowy aminokwas dotyczy aminokwasu wykazującego hydrofobowość większą niż zero według znormalizowanej skali hydrofobowości najwyższej zgodności Eisenberga i wsp., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Genetycznie kodowane hydrofobowe aminokwasy obejmują Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) i Tyr (Y).

Aromatyczny aminokwas dotyczy hydrofobowego aminokwasu z łańcuchem bocznym mającym przynajmniej jeden pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny. Pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny może zawierać jeden lub więcej podstawników takich jak -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR i tym podobne, gdzie każdy R jest niezależnie (C1-C6) alkilem, podstawionym (C1-C6) alkilem, (C1-C6) alkenylem, podstawionym (C1-C6) alkenylem, (C1-C6) alkinylem, podstawionym (C1-C6) alkinylem, (C5-C20) arylem, podstawionym (C5-C20) arylem, (C6-C26) alkiloarylem, podstawionym (C6-C26) alkiloarylem, podstawionym 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkiloheteroarylem i podstawionym 6-26 członowym alkiloheteroarylem. Genetycznie kodowane aromatyczne aminokwasy aromatyczne obejmują Phe (F), Tyr (Y) i Trp (W).

Niepolarny aminokwas dotyczy hydrofobowego aminokwasu mającego łańcuch boczny, który jest nienaładowany w fizjologicznym pH i który ma wiązania, w których para elektronów wspólnych dla dwóch atomów jest na ogół trzymana w równym stopniu przez każdy z tych dwóch atomów (tzn. łańcuch boczny nie jest polarny). Genetycznie kodowane niepolarne aminokwasy obejmują Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) i Ala (A).

Alifatyczny aminokwas dotyczy hydrofobowego aminokwasu mającego łańcuch boczny z alifatycznego węglwodoru. Genetycznie kodowane alifatyczne aminokwasy obejmują Ala (A), Val (V), Leu (L) i Ile (I).

Reszta aminokwasu Cys (C) jest niezwykła w tym, że może tworzyć mostki dwusiarczkowe z innymi Cys (C) lub innymi aminokwasami zawierającymi sulfanyl. Zdolność reszt Cys (C) (i innych aminokwasów z łańcuchami bocznymi zawierającymi -SH) do istnienia w peptydzie albo w zredukowanej wolnej postaci -SH albo w utlenionej postaci z mostkami dwusiarczkowymi wpływa na to czy reszty Cys (C) wpływają na sumaryczny charakter hydrofobowy czy hydrofilowy peptydu. Podczas gdy Cys (C) wykazuje hydrofobowość 0,29 według znormalizowanej skali Eisenberga (Eisenberg, 1984, powyżej) powinno być zrozumiane, że dla celów niniejszego wynalazku Cys (C) jest w kategorii aminokwasu hydrofilowego polarnego, niezależnie od ogólnych klasyfikacji zdefiniowanych powyżej.

Jak będzie docenione przez specjalistów, powyżej zdefiniowane kategorie nie wykluczają się nawzajem. Tak więc aminokwasy mające łańcuchy boczne wykazujące dwie lub więcej właściwości fizykochemicznych mogą być włączone do wielu kategorii.

Przykładowo, łańcuchy boczne aminokwasów posiadające aromatyczne cząstki, które są wymieniane polarnymi podstawnikami jak Tyr (Y), mogą wykazywać zarówno właściwości hydrofobowe aromatyczne jak i polarne lub właściwości hydrofilowe, a zatem mogą należeć do obu kategorii, aromatycznej i polarnej. Prawidłowe zaklasyfikowanie dowolnego aminokwasu do odpowiedniej kategorii jest oczywiste dla specjalistów, zwłaszcza w świetle dostarczanych tu szczegółowych ujawnień.

Pewne reszty aminokwasowe, nazwane aminokwasami przerywającymi helisę mają skłonność do uszkadzania struktury α-helisy wówczas, gdy umiejscowione są w wewnętrznych pozycjach helisy. Reszty aminokwasowe wykazujące właściwości przerywania helisy są dobrze znane specjalistom (patrz, np. Chou i Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276) i obejmują Pro (P), Gly (G) i potencjalnie wszystkie D-aminokwasy (gdy występują w L-peptydzie; i odwrotnie L-aminokwasy uszkadzają strukturę helikalną gdy występują w D-peptydzie). Ponieważ reszty aminokwasowe przerywające helisę należą do kategorii zdefiniowanych powyżej, z wyjątkiem Gly (G) (dyskutowane poniżej), nie powinny

PL 196 676 B1 być używane do podstawień reszt aminokwasowych w wewnętrznych pozycjach helisy - powinny być używane jedynie do podstawień reszt aminokwasowych 1-3 na N końcu i/lub C końcu peptydu.

Podczas gdy zdefiniowane powyżej kategorie przedstawione są przykładowo dla powszechnie kodowanych aminokwasów, podstawienia aminokwasów nie muszą, i w pewnych wykonaniach dogodnie nie są, ograniczone do powszechnie kodowanych aminokwasów. Rzeczywiście, wiele zalecanych peptydów o strukturze (I) zawiera nie kodowane powszechnie aminokwasy. Zatem, dodatkowo do naturalnie występujących powszechnie kodowanych aminokwasów, reszty aminokwasowe w peptydach rdzeniowych o strukturze (I) mogą być podstawiane naturalnie występującymi nie kodowanymi aminokwasami oraz aminokwasami syntetycznymi.

Pewne powszechnie spotykane aminokwasy, które dostarczają przydatnych substytucji dla peptydów rdzeniowych o strukturze (I) obejmują między innymi β-alaninę (β-Ala) i inne omega-aminokwasy, takie jak kwas 3-aminopropionowy, kwas 2,3-diaminopropionowy (Dpr), kwas 4-aminomasłowy i tak dalej; kwas α-aminoizomasłowy (Aib); kwas ε-aminoheksanowy (Aha); kwas δ-aminowalerianowy (Ava); N-metyloglicynę czy sarkozynę (MeGly); ornitynę (Orn); cytrulinę (Cit); t-butyloalaninę (t-BuA); t-butyloglicynę (T-BuG); N-metyloizoleucynę (Melle); fenyloglicynę (Phg); cykloheksyloalaninę (Cha); norleucynę (Nle); naftyloalaninę (Nal); 4-chlorofenyloalaninę (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenyloalaninę (Phe (2-F)); 3-fluorofenyloalaninę (Phe (3-F)); 4-fluorofenyloalaninę (Phe (4-F)); penicylaminę (Pen); kwas 1,2,3,4-tetrahydrochinolino-karboksylowy (Tic), β-2-tienyloalaninę (Thi); sulfotlenek metioniny (MSO); homoargininę (hArg); N-acetylolizynę (AcLys); kwas 2,4-diaminomasłowy (Dbu); kwas 2,3-diaminomasłowy (Dab); p-aminofenyloalaninę (Phe(pNH2)); N-metylowalinę (MeVal); homocysteinę (hCys), homofenyloalaninę (hPhe) i homoserynę (hSer); hydroksyprolinę (Hyp), homoprolinę, N-metylowanę aminokwasy i peptoidy (glicyny podstawione w N).

Klasyfikacja powszechnie kodowanych i powszechnych niekodowanych aminokwasów zgodnie z kategoriami zdefiniowanymi powyżej jest podsumowana w tabeli III, poniżej. Należy rozumieć, że tabela III jest jedynie zilustrowaniem propozycji i nie pokrywa pełnej listy reszt aminokwasowych, które można użyć do podstawień opisanych tu peptydów rdzeniowych. Inne nie wymienione tu reszty aminokwasowe można z łatwością zaklasyfikować na podstawie obserwowanych właściwości fizycznych i chemicznych w świetle dostarczanych tu definicji.

T a b e l a III

Klasyfikacja powszechnie spotykanych aminokwasów

Klasyfikacja	Genetycznie kodowane	Genetycznie niekodowane
Hydrofobowe
Aromatyczne	F, Y, W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe
Niepolarne	L, V, I, M, G, A, P	t-BuA, t-BuG, Melle, Nle MeVal, Cha, McGly, Aib
Alifatyczne	A, V, L, I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nle, MeVal
Hydrofilowe
Kwaśne	D, E
Zasadowe	H, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2)
Polarne	C, Q, N, S, T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
Przerywające helisę	P, G	D-Proi inne D-aminokwasy (w L-peptydach)

Mimo, że w większości przypadków aminokwasy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) będą podstawiane L-enancjomerycznymi aminokwasami, substytucje nie są ograniczone do L-anancjomerycznych aminokwasów. Zatem, objęte także definicją zmutowane lub zmienione formy dotyczą

PL 196 676 B1 tych sytuacji, gdzie co najmniej jeden L-aminokwas jest wymieniony na identyczny D-aminokwas (np. L-Arg >D-Arg) lub D-aminokwas tej samej kategorii lub podkategorii (np. L-Arg >D-Lys) i vice versa. Rzeczywiście, w pewnych zalecanych wykonaniach przeznaczonych do doustnego podawania pacjentom zwierzęcym peptydy mogą dogodnie obejmować co najmniej jeden D-enancjomeryczny aminokwas. Peptydy zawierające takie D-aminokwasy uważane są za mniej podatne na degradację w jamie ustnej, jelicie lub surowicy niż peptydy złożone wyłącznie z L-aminokwasów.

Jak wspomniano powyżej, D-aminokwasy przyczyniają się do uszkadzania struktury α-helisy, wówczas gdy znajdują się w wewnętrznych miejscach α-helikalnego peptydu. Co więcej obserwowano, że pewne zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I), które są złożone w całości z D-aminokwasów wykazują znacząco niższą aktywację LCAT w opisanym tu teście niż identyczne peptydy złożone w całości z L-aminokwasów. W konsekwencji, D-aminokwasy nie powinny być stosowane do podstawiania wewnętrznych L-aminokwasów; podstawienia D-aminokwasami powinny ograniczać się do reszt aminokwasowych 1-3 na N końcu i/lub C końcu peptydu.

Jak omawiano wcześniej Gly (G) zazwyczaj działa jako reszta przerywająca helisę wówczas gdy znajduje się w wewnętrznej pozycji peptydu. Całkiem zaskakująco, twórcy wynalazku stwierdzili, że podczas, gdy helikalna struktura peptydów rdzeniowych tu opisanych jest uszkodzona, przy braku lipidów, kiedy wewnętrzne reszty aminokwasowe są podstawione przez Gly (G), to w obecności lipidów takie peptydy zawierające Gly (G) wykazują znaczącą strukturę helikalną, jak również aktywność. Przykładowo, podczas gdy peptyd 154 (PVLELFENLLERGLDALQKKLK; SEQ ID NO:154) wykazuje jedynie w 13% strukturę helikalną w buforze, 76% struktura helikalna jest obserwowana w obecności micelli. Szereg peptydów rdzeniowych zawierających wewnętrzne reszty Gly (G) wykazuje > 38% aktywacji LCAT. Zatem, chociaż Gly (G) jest zasadniczo rozpatrywana jako reszta przerywająca helisę, aminokwas ten można stosować do podstawiania aminokwasów w wewnętrznych pozycjach peptydów rdzeniowych o strukturze (I). Dogodnie, jeśli jedynie wewnętrzne reszty położone w około ± 1 skręcie helisy z centrum peptydu (szczególnie dla peptydów składających się z parzystej liczby aminokwasów) są podstawione przez Gly (G). Dodatkowo dogodnie jeśli tylko jedna wewnętrzna reszta aminokwasowa w peptydzie jest podstawiona przez Gly (G). Zalecane wykonania agonistów ApoA-I według wynalazku zawierających wewnętrzne glicyny opisane są poniżej w Sekcji 5.1.2.

Stosując klasyfikację reszt aminokwasowych opisaną powyżej w połączeniu z prezentacją diagramową helikalnego koła Schiffer-Edmundson oraz helikalnej wypadkowej peptydów rdzeniowych o strukturze (I) wraz ze szczegółowym opisem żądanych właściwości tu dostarczanych, z łatwością można otrzymać zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I), które zasadniczo zachowują amfipatyczne i inne właściwości helisy i dlatego wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

W zalecanym wykonaniu, zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się przez określenie stałych reszt hydrofilowych i hydrofobowych stosownie do struktury (I) i podstawienie co najmniej jednej nie stałej reszty innym aminokwasem, dogodnie konserwatywne tzn. innym aminokwasem z tej samej kategorii lub podkategorii. Można także określić stałe zgrupowania reszt zasadowych i/lub hydrofobowych stosownie do struktury (I) i co najmniej jedno podstawienie nie stałej reszty, dogodnie konserwatywne.

W innym zalecanym wykonaniu, zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się przez określenie stałych reszt hydrofilowych aminokwasów położonych na hydrofilowej powierzchni helisy stosownie do struktury (I) i podstawienie co najmniej jednej reszty nie stałego aminokwasu innym aminokwasem, dogodnie inną resztą aminokwasową z tej samej kategorii lub podkategorii. Jak widać na fig. 2A reszty 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 i 22 są położone na hydrofilowej powierzchni amfipatycznej helisy utworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I). Wszystkie z tych reszt są hydrofilowe z wyjątkiem reszty 1, która może być zarówno hydrofilowa jak hydrofobowa. Zatem, w jednym z zalecanych wykonań reszty 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 i 22 są stałe stosownie do struktury (I) i co najmniej jedna z reszt 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 jest podstawiona innym aminokwasem z tej samej kategorii, dogodnie innym aminokwasem z tej samej podkategorii. Alternatywnie, reszta 1 jest także stała stosownie do struktury (I) a co najmniej jedna z reszt 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 jest podstawiona.

W szczególnie zalecanym wykonaniu położone na C końcu zasadowe zgrupowanie (reszty 19, 20 i 22) jest także stałe stosownie do struktury (I) a jedynie reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16 i/lub 17 są podstawione.

PL 196 676 B1

W innym szczególnie zalecanym wykonaniu hydrofobowe zgrupowanie jest takż e stał e a jedynie reszty 2, 5, 13, 14, 16, 17, 20 i/lub 21 są podstawione.

W jeszcze innym szczególnie zalecanym wykonaniu zarówno zasadowe jak i hydrofobowe zgrupowanie jest stałe a jedynie reszty 2, 5, 13, 14, 16 i/lub 17 są podstawione.

W innym zalecanym wykonaniu zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych tu opisanych otrzymuje się poprzez określenie stałych reszt hydrofobowych aminokwasów na powierzchni hydrofobowej helisy a podstawiana jest co najmniej jedna nie stała reszta aminokwasowa na inną resztę aminokwasową, dogodnie na inną resztę aminokwasowa z tej samej kategorii lub podkategorii.

Jak widać na fig. 2A reszty 2, 3, 5, 6, 9,10, 13, 14, 16, 17, 20 i 21 są położone na powierzchni hydrofobowej. Wszystkie z nich są hydrofobowe z wyjątkiem reszty 20, która jest hydrofilowa. Zatem w jednym z zalecanych wykonań reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, i 21 są stałe stosownie do struktury (I) i co najmniej jedna z reszt 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19, 20 i 22 jest podstawiona inną resztą aminokwasową, dogodnie innym aminokwasem z tej samej kategorii lub podkategorii.

W szczególnie zalecanym wykonaniu zasadowe zgrupowanie położ one na C koń cu (reszty 19, 20 i 22) jest także stałe i jedynie reszty 1, 4, 7, 8, 11, 12 i/lub 15 są podstawione.

W innym wykonaniu, zmienione lub zmutowane formy peptydów o strukturze (I) otrzymuje się poprzez pozostawienie stałymi wszystkie reszty aminokwasowe występujące na hydrofobowej lub hydrofilowej powierzchni helisy i podstawienie, dogodnie konserwatywne, co najmniej jednej reszty aminokwasowej występującej na drugiej powierzchni inną resztą aminokwasową. Reszty obejmujące zgrupowanie hydrofobowe i/lub zgrupowanie zasadowe mogą być fakultatywnie stałe stosownie do struktury (I) jak omówiono wcześniej.

W innym wykonaniu zmienione lub zmutowane formy struktury (I) otrzymuje się przez podstawienie co najmniej jednego aminokwasu nie konserwatywnym aminokwasem. Specjaliści wiedzą, że takie podstawienia nie powinny zasadniczo zmieniać omawianych powyżej właściwości amfipatycznych i/lub strukturalnych helisy. Zatem, w pewnych przypadkach może być pożądane podstawienie jednej lub więcej par aminokwasów w celu zachowania wypadkowej właściwości helisy. Dodatkowe informacje pozwalające na selekcjonowanie odpowiednich podstawień aminokwasowych dostarczone są poprzez sekwencje peptydowe przedstawione w tabeli X (patrz Sekcja 8.3, poniżej).

W jeszcze innym wykonaniu pierwsze reszty aminokwasowe od 1 do 4 na N koń cu i/lub C koń cu peptydów rdzeniowych o strukturze (I) podstawione są jedną lub większą liczbą reszt aminokwasowych, lub jednym lub większą liczbą segmentów peptydowych o których wiadomo, że nadają stabilność regionom drugorzędowej struktury α-helisy (reszty koniec-czapeczka lub segmenty). Reszty koniec-czapeczka lub segmenty są dobrze znane specjalistom (patrz np. Richardson i Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper i wsp., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta i Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale i wsp., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig i wsp., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou i wsp., 1994, Proteins 18:1-7; Doig i Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert i wsp., 1995 Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov i wsp.,

1996, Biochemistry 35:387-397; Doig i wsp., 1997, Protein Science 6:147-155). Alternatywnie pierwsze reszty aminokwasowe od 1 do 4 na N końcu i/lub C końcu struktury (I) można zastąpić cząstkami przypominającymi peptyd, które naśladują strukturę i/lub właściwości reszt koniec-czapeczka lub segmentów. Odpowiednie cząstki naśladujące koniec-czapeczka są dobrze znane specjalistom i zostały opisane, przykładowo, w Richardson i Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper i wsp., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta i Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale i wsp., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig i wsp., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou i wsp., 1994, Proteins 18:1-7; Doig i Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert i wsp., 1995 Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov i wsp., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig i wsp.,

1997, Protein Science 6:147-155.

Podczas gdy struktura (I) zawiera 22 określone pozycje reszt aminokwasowych powinno być zrozumiałe, że peptydy rdzeniowe tu opisane mogą zawierać mniej niż 22 reszty aminokwasowe. Rzeczywiście obcięte lub posiadające wewnętrzną delecję formy struktury (I) mogą zawierać 18 lub nawet 15 reszt aminokwasowych, które zasadniczo zachowują całkowicie cechy i właściwości charakterystyczne dla amfipatycznej helisy utworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I).

Formy obcięte peptydów o strukturze (I) otrzymuje się poprzez delecję jednego lub większej liczby aminokwasów z N i/lub C końca struktury (I). Formy o strukturze (I) posiadające wewnętrzną delecję otrzymuje się poprzez delecję jednego lub większej liczby aminokwasów z wewnętrznych po30

PL 196 676 B1 zycji w peptydzie o strukturze (I). Usunięte wewnętrzne reszty aminokwasowe mogą, ale nie muszą, być ciągiem reszt.

Specjaliści wiedzą, że taka delecja wewnętrznej reszty aminokwasowej z peptydu rdzeniowego o strukturze (I) spowoduje, że płaszczyzna hydrofilowo-hydrofobowa interfejsu helisy obróci się o 100° w punkcie delecji. Ponieważ taka rotacja może znacząco zmienić amfipatyczne właściwości otrzymanej helisy, w zalecanym wykonaniu reszty aminokwasowe są usuwane tak, że zasadniczo zachowują przyrównanie płaszczyzny hydrofilowo-hydrofobowej interfejsu wzdłuż całej długiej osi helisy.

Można to bez kłopotu osiągnąć poprzez usunięcie określonej liczby reszt aminokwasowych położonych w ciągu lub nie w taki sposób, że usunięty jest jeden pełny helikalny skręt. Idealna α-helisa zawiera 3,6 reszt na skręt. Zatem w zalecanym wykonaniu usuwane są grupy 3-4 reszt aminokwasowych ciągłych lub nie ciągłych. To czy usunięte zostaną 3 aminokwasy czy 4 będzie zależało od pozycji pierwszej reszty w helisie. Specjaliści mają możliwość określenia odpowiedniej liczby reszt aminokwasowych ciągłych lub nie ciągłych stanowiących jeden pełny helikalny skręt od dowolnego określonego punktu startu w amfipatycznej helisie.

Ze względu na przypuszczalną istotną rolę zasadowego zgrupowania, na C końcu peptydów rdzeniowych o strukturze (I), w stabilizowaniu helisy oraz wpływ hydrofobowego zgrupowania na wiązanie lipidów i aktywację LCAT, w zalecanym wykonaniu reszty obejmujące zgrupowanie zasadowe i hydrofobowe nie są usuwane. Zatem, w zalecanym wykonaniu nie są usuwane reszty 19, 20 i 22 (zgrupowanie zasadowe) oraz reszty 3, 6, 9 i 10 (zgrupowanie hydrofobowe).

Peptydy rdzeniowe o strukturze (I) można także wydłużać na jednym lub obu końcach dodatkowymi resztami aminokwasowymi, które zasadniczo nie zaburzają, a w niektórych wykonaniach nawet wzmacniają strukturalne i/lub funkcjonalne właściwości peptydów. Rzeczywiście, wydłużone peptydy rdzeniowe mogą zawierać 23, 25, 26, 29 lub nawet więcej reszt aminokwasowych. Dogodnie takie wydłużone peptydy będą zasadniczo zachowywać wypadkową amfipatyczność i inne właściwości peptydów o strukturze (I). Oczywiście, wiadomo, że dodane wewnątrz aminokwasy będą obracać płaszczyznę hydrofobowo-hydrofilowego interfejsu w punkcie insercji w podobny sposób do opisanego powyżej dla wewnętrznych delecji. Zatem, rozważania przedstawione powyżej dla wewnętrznych delecji mają także zastosowanie do wewnętrznego dodania aminokwasów.

W jednym z wykonań, peptydy rdzeniowe są wydłużane na N końcu i/lub C końcu poprzez co najmniej jeden skręt helisy. Dogodnie takie wydłużenia będą stabilizowały drugorzędową strukturę helikalną w obecności lipidów tak jak aminokwasy koniec-czapeczka lub segmenty opisane wcześniej.

W szczególnie zalecanym wykonaniu peptyd rdzeniowy o strukturze (I) jest wydłużony na C końcu przez pojedynczą resztę aminokwasu zasadowego, dogodnie Lys (K).

Zablokowane formy agonisty ApoA-I oznaczają formy agonistów ApoA-I, w których N i/lub C końce są zablokowane cząstką zdolną do oddziaływania z -NHa na N końcu lub -C(O)OH na C końcu. Odkryto, że usunięcie ładunków na N końcu i/lub C-końcu opisanych tu agonistów ApoA-I zawierających 18 lub mniej reszt aminokwasowych (poprzez syntetyzownie N-acetylowanych peptydowych amidów/estrów/hydrazydów/alkoholi i ich podstawień) daje agonistów posiadających zbliżoną, a w niektórych wykonaniach nawet przekraczającą, aktywność nie zablokowanych form agonistów. W niektórych wykonaniach zawierających 22 lub więcej aminokwasów, zablokowanie N lub C końca daje agonistów ApoA-I wykazujących niższą aktywność niż formy nie zablokowane. Jednakże, zablokowanie obu końców C i N agonistów ApoA-I złożonych z 22 lub większej liczby aminokwasów wydaje się przywracać aktywność. Zatem, w zalecanym wykonaniu zarówno N i/lub C końce (dogodnie oba końce) peptydów rdzeniowych zawierających 18 lub mniej aminokwasów są zablokowane, podczas gdy końce N i C peptydów składających się z 22 lub większej liczby aminokwasów są albo oba zablokowane lub oba nie zablokowane. Typowe grupy blokujące N koniec obejmują RC(O)-, gdzie R jest grupą H, (C1-C6) alkilową, (C1-C6) alkenylową, (C1-C6) alkinylową, (C5-C20) arylową, (C6-C26) alkiloarylową, 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkiloheteroarylem. Zalecane grupy blokujące N koniec obejmują grupy acetylowe, formylowe i dansylowe. Typowe grupy blokujące C koniec obejmują -C(O)NRR i -C(O)OR, gdzie każde R jest niezależnie zdefiniowane jak powyżej. Zalecane grupy blokujące C koniec obejmują te gdzie każy R jest niezależną grupą metylową. Choć nie jest to związane z żadną szczególną teorią uważa się, że takie grupy blokujące stabilizują α-helisę w obecności lipidów (patrz np. Venkatachelapathi i wsp., 1993, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 15:349-359).

Natywna struktura ApoA-I składa się z ośmiu helikalnych jednostek, przypuszczalnie współdziałających ze sobą w wiązaniu lipidów (Nakagawa i wsp., 1985, J. Am. chem. Soc. 107:7087-7092; AnPL 196 676 B1 antharamaiah i wsp., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10262; Vanloo i wsp., 1991, J. Lipid Res. 32:1253-1264; Mendez i wsp., 1994, J. Clin. Invest. 94:1698-1705; Palgunari i wsp., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338; Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84). Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje agonistów ApoA-I opisanych tu peptydów rdzeniowych, w postaci dimerów, trimerów, tetramerów a także polimerów wyższego rzędu (multimery). Multimery takie mogą przyjmować formę tandemowych powtórzeń, rozgałęzionych siatek lub być kombinacją obu. Peptydy rdzeniowe można bezpośrednio łączyć jeden do drugiego lub poprzez jeden lub więcej łączników.

Peptydy rdzeniowe obejmujące multimery mogą być peptydami o strukturze (I), analogami struktury (I), zmutowanymi formami struktury (I), wydłużonymi formami struktury (I) i/lub ich kombinacjami. Peptydy rdzeniowe można łączyć sposobem głowa do ogona (tzn. N koniec do C końca), głowa do głowy (tzn. N koniec do N końca), ogon do ogona (tzn. C koniec do C końca) lub ich kombinacjami.

W jednym z wykonań, multimery są tandemowymi powtórzeniami dwóch, trzech, czterech do około dziesięciu peptydów rdzeniowych. Dogodnie multimery zbudowane są z 2 do 8 peptydów rdzeniowych. Zatem, w jednym z wykonań agoniści ApoA-I według wynalazku mogą obejmować multimery posiadające następujący wzór:

(II) HH-[LLm-HH]n-LLm-HH gdzie:

każde m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1, dogodnie 1; n jest liczbą całkowitą od 0 do 10, dogodnie 0 do 8;

każdy HH niezależnie reprezentuje peptyd rdzeniowy lub peptydowy analog struktury (I) lub jego opisaną tu formę zmutowaną, obciętą, z wewnętrzną delecją lub wydłużoną;

każdy LL niezależnie reprezentuje łącznik; oraz każdy - niezależnie oznacza kowalencyjne wiązanie.

W strukturze (II), łącznik LL może być bifunkcjonalną cząsteczką zdolną do kowalencyjnego wiązania dwóch peptydów jeden do drugiego. Zatem, odpowiednie łączniki są bifunkcjonalnymi cząsteczkami, w których grupy funkcyjne są zdolne do kowalencyjnego przyłączenia do N i/lub C końca peptydu. Grupy funkcyjne odpowiednie do przyłączania do N lub C końca peptydów są dobrze znane specjalistom i istnieją odpowiednie metody chemiczne wpływające na tworzenie wiązań kowalencyjnych.

Łącznik może być elastyczny, sztywny lub półsztywny w zależności od żądanych właściwości multimera. Odpowiednie łączniki obejmują, przykładowo, reszty aminokwasowe takie jak Pro lub Gly lub segmenty peptydowe zawierające od około 2 do około 5, 10, 15 lub 20 a nawet więcej aminokwasów, bifunkcjonalne związki organiczne takie jak H2N (CH2)nCOOH, gdzie n jest liczbą całkowitą od 1 do 12 i temu podobnie. Przykłady takich łączników, jak również metody wytwarzania takich łączników i peptydów wprowadzających takie łączniki są dobrze znane specjalistom (patrz np. Hunig i wsp., 1974, Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak i wsp., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4): 301-305).

W zalecanym wykonaniu tandemowe powtórzenia są wewnętrznie przerywane przez resztę prolinową. W tym celu, w przypadkach gdzie peptydy rdzeniowe kończą się na swoich N lub C końcach proliną, tam np. gdzie X1 w strukturze (I) jest Pro (P) lub D-Pro (p), m w strukturze (II) dogodnie oznacza 0. W tych przypadkach, gdzie peptydy rdzeniowe nie zawierają Proliny na N lub C końcu, LL oznacza dogodnie Pro (P) lub D-Pro (p) i m oznacza dogodnie 1.

W pewnych wykonaniach może być pożądane wykorzystanie łącznika, który można przeciąć, co pozwala na uwolnienie jednego lub kilku helikalnych segmentów (HH) w określonych warunkach. Odpowiednie łączniki, które można przeciąć obejmują peptydy posiadające sekwencje aminokwasowe, które są rozpoznawane przez proteazy, oligonukleotydy, które są trawione przez endonukleazy i związki organiczne, które można ciąć metodami chemicznymi w kwaśnych, zasadowych lub innych warunkach. Dogodnie warunki cięcia będą relatywnie łagodne tak aby nie zdenaturować lub z drugiej strony nie doprowadzić do degradacji helikalnych segmentów i/lub nie podlegających trawieniu łączników tworzących multimerycznych agonistów ApoA-I.

Łączniki peptydowe i oligonukleotydowe, które mają być selektywnie cięte, jak również sposoby cięcia łączników są dobrze znane i oczywiste dla specjalistów. Łączniki z odpowiednich związków organicznych, które będą selektywnie cięte są znane specjalistom i obejmują te opisane przykładowo w WO 94/08051, jak również w referencjach tam zamieszczonych.

W zalecanym wykonaniu, wykorzystywane łączniki są peptydami będącymi substratami dla enzymów z układu krążenia co pozwala na selektywne cięcie multimerycznych agonistów ApoA-I in vivo.

PL 196 676 B1

Endogenne enzymy odpowiednio tnące łączniki obejmują przykładowo propeptydazę proapolipoproteiny A-I. Odpowiednie enzymy, jak również segmenty peptydowe będące substratami dla tych enzymów, są dobrze znane specjalistom (patrz np. Edelstein i wsp., 1983, J. Biol. Chem. 258:11430-11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2574-2574.).

Jak dyskutowano powyżej, kluczową cechą peptydów rdzeniowych tu opisanych jest ich zdolność do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych lub jonowych ułożonych antyrównolegle. Zatem, w zalecanym wykonaniu stosowane są łączniki o wystarczającej długości i elastyczności umożliwiające helikalnym segmentom (HH) o strukturze (II) antyrównoległe ułożenie i utworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych lub jonowych w obecności lipidów.

Łączniki o wystarczającej długości i elastyczności obejmują między innymi Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H2N-(CH2)n-C(O)OH, gdzie n jest 1 do 12, dogodnie 4 do 6; H2N-aryl-C(O)OH i węglowodany.

Alternatywnie, jako że aplipoproteiny pozwalają na kooperatywne wiązanie pomiędzy antyrównoległymi helikalnymi segmentami, do łączenia peptydów rdzeniowych można wygodnie stosować łączniki peptydowe, które odpowiadają pierwszorzędowej sekwencji segmentów peptydowych łączących przyległe helisy natywnych apolipoprotein, obejmujących przykładowo ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE i ApoJ. Sekwencje te są dobrze znane specjalistom (patrz Rosseneu i wsp., Analysis of Primary and SecondaryStructure of Apolipoproteins w: Structure and Function of Lipoproteins, Rozdz. 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).

Inne łączniki pozwalające na tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych lub jonowych pomiędzy tandemowymi powtórzeniami antyrównoległych helikalnych segmentów obejmują przeciwne skręty peptydowe, takie jak β-skręty i γ-skręty, jak również cząsteczki organiczne naśladujące struktury peptydowych β-skrętów i/lub γ-skrętów. Ogólnie, przeciwne skręty są segmentami peptydów, które odwracają kierunek łańcucha polipeptydowego pozwalając na przyjęcie przez pojedynczy łańcuch polipeptydowy regionów o strukturze antyrównoległej β-kartki lub antyrównoległej α-helisy. β-skręty zasadniczo są złożone z czterech reszt aminokwasowych a γ-skręty są zasadniczo złożone z trzech reszt aminokwasowych.

Konformacje i sekwencje wielu peptydowych β-skrętów są dobrze opisane w literaturze i obejmują przykładowo między innymi typ-I, typ-I', typ-II, typ-II', typ-III, typ-III', typ-IV, typ-V, typ-V', typ-VIa, typ-VIb, typ-VII i typ VIII (patrz Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose i wsp., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmot i wsp., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda i wsp., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontano i wsp., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).

Specyficzne konformacje krótkich skrętów peptydowych takich jak β- skręty zależą przede wszystkim od pozycji określonych reszt aminokwasowych w skręcie (przeważnie Gly, Asn lub Pro). Zazwyczaj β-skręt typu-I jest kompatybilny z dowolną resztą aminokwasową w pozycjach 1 do 4 w skręcie, z wyjątkiem tego, że Pro nie może wystąpić w pozycji 3. Gly występuje głównie w pozycji 4 a Pro występuje głównie w pozycji 2, zarówno w typie-I skrętów jak w typie -II. Reszty Asp, Asn, Ser i Cys często pojawiają się w pozycji 1, gdzie ich łańcuchy boczne często tworzą wiązania wodorowe z NH reszty 3.

W typie-II skrętów, w pozycji 3 najczęściej pojawiają się Gly i Asn, jako, że najłatwiej przyjmują wymagany kąt w łańcuchu. Idealnie typ-I' posiada Gly w pozycjach 3 i 2, a typ-II' posiada Gly w pozycji 2. Skręty typu-III zazwyczaj mogą mieć najwięcej reszt aminokwasowych, a skręty typu-III' zazwyczaj wymagają Gly w pozycjach 2 i 3. Skręty typu-VIa i VIb zazwyczaj mają wiązanie cis peptydowe i Pro jako resztę wewnętrzną. Dla przeglądu różnych typów i sekwencji β-skrętów w białkach i peptydach czytelnik jest odsyłany do Wilmot i wsp., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232.

Konformacje i sekwencje wielu peptydowych γ-skrętów są także dobrze opisane w literaturze fachowej (patrz np. Rose i wsp., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White i wsp. 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot i wsp., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda i wsp., 1989, 206:759-777; Tramantano i wsp., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394). Wszystkie typy β-skrętów i struktury γ-skrętu oraz odpowiadające im sekwencje, jak również później odkryte peptydowe β-skręty i struktury γ-skrętu są specjalnie rozważane w wynalazku.

Alternatywnie łącznik (LL) może obejmować organiczną cząsteczkę lub cząstkę przypominającą strukturę β-skrętu lub γ-skrętu. Takie cząstki przypominające β-skręt i/lub γ-skręt jak również metody syntezy peptydów zawierających takie cząstki są dobrze znane specjalistom i obejmują, pośród innych, te opisane w Giannis i Kolter, 1993 Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn i wsp., 1988, J. Molecular Recognition 1:75-79; oraz Kahn i wsp., 1987, Tetrahedron Lett. 28:1623-1626.

PL 196 676 B1

W jeszcze innym wykonaniu multimery występują w formie rozgałęzionej sieci (patrz np. fig. 7). Takie sieci można z łatwością wytwarzać poprzez użycie wielofunkcyjnych cząstek łączących pozwalających na to, że więcej niż dwie helikalne jednostki zostaną przyłączone do prostej cząstki łączącej. Zatem rozgałęzione sieci wykorzystują cząsteczki posiadające trzy, cztery lub więcej grup funkcyjnych zdolnych do kowalencyjnego przyłączania do N i/lub C końca peptydu. Odpowiednie cząstki łączące obejmują przykładowo reszty aminokwasowe posiadające łańcuchy boczne niosące hydroksylowe, sulfanylowe, aminowe, karboksylowe, amidowe i/lub estrowe grupy funkcyjne takie jak przykładowo Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Lys (K), Arg (R), Orn, Asp (D) i Glu (E); lub inne cząsteczki organiczne zawierające takie grupy funkcyjne.

Helikalne segmenty przyłączane do pojedynczej cząstki łączącej nie muszą być przyłączone poprzez takie same końce. Rzeczywiście w niektórych wykonaniach helikalne segmenty są przyłączone do pojedynczej cząstki łączącej tak, że są ułożone antyrównolegle, tzn. niektóre z helis są przyłączone przez ich N końce a inne przez ich C końce.

Helikalne segmenty można przyłączać bezpośrednio do cząstki łączącej lub można oddzielić od cząstki łączącej za pomocą jednego lub większej liczby łączników (LL) jak opisano wcześniej.

Na fig. 7A i 7B widać, że rozgałęzioną sieć można opisać przeliczywszy na liczbę węzłów jaką zawiera sieć, gdzie każda wielofunkcyjna cząstka łącząca stanowi węzeł. Na fig. 7A i 7B, helikalne segmenty (tzn. opisane tu peptydy rdzeniowe) są zilustrowane jako cylindry a wielofunkcyjne cząstki łączące (lub węzły) jako kółka (•), gdzie liczba linii wychodzących z kółka wskazuje na rzędowość (lub liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnej cząstki łączącej.

Liczba węzłów w sieci będzie ogólnie zależała od całkowitej żądanej liczby helikalnych segmentów i typowo będzie od około 1 do 2. Oczywiście szacuje się, że dla danej liczby żądanych helikalnych segmentów, sieci posiadające cząstki łączące wyższego rzędu będą posiadały mniej węzłów. Przykładowo, w odniesieniu do fig. 7A i 8B, trzeciorzędowa sieć (tzn. sieć posiadająca trifunkcyjne cząstki łączące) złożona z siedmiu helikalnych jednostek ma trzy węzły (fig. 7A), podczas gdy czwartorzędowa sieć (tzn. sieć posiadająca tetrafunkcyjne cząstki łączące) złożona z siedmiu helikalnych jednostek ma tylko dwa węzły (fig. 7B).

Sieci mogą mieć jednolitą rzędowość tzn. sieci, w których wszystkie węzły przykładowo są trifunkcyjnymi lub tetrafunkcyjnymi cząstkami łączącymi lub mogą być mieszane, przykładowo składające się z trifunkcyjnych i tetrafunkcyjnych cząstek łączących. Oczywiście jest zrozumiałe, że nawet w sieciach o jednolitej rzędowości cząstki łączące nie muszą być identyczne. Trzeciorzędowa sieć może wykorzystywać przykładowo dwie, trzy, cztery a nawet więcej różnych trifunkcyjnych cząstek łączących.

Jak w liniowych multimerach helikalne segmenty składające się z rozgałęzionych sieci mogą, lecz nie muszą, być identyczne.

Przykład takiej rozgałęzionej sieci o mieszanej rzędowości jest przedstawiony na fig. 7C. Na fig. 7C helikalne segmenty (tzn. peptydy rdzeniowe tu opisane) są przedstawione jako cylindry a wielofunkcyjne cząstki łączące jako kółka (•), gdzie liczba linii wychodzących z kółka wskazuje na rzędowość (lub liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnej cząstki łączącej. Linie łączące helikalne segmenty reprezentują bifunkcjonalne łączniki LL, jak opisano wcześniej. Helikalne segmenty obejmujące rozgałęzione sieci mogą być tandemowymi powtórzeniami peptydów rdzeniowych, jak opisano wcześniej.

W jednym ilustrującym wykonaniu rozgałęzione sieci tu opisane są opisane wzorem:

(III) X-Nya-X(ya-1)-(Nyb-X(yb-1))p gdzie:

każdy X jest niezależnie HH-[LLm-HH]n-LLm-HH;

każdy HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym o strukturze (I) lub jego analogiem lub formą zmutowaną, skróconą, z wewnętrzną delecją lub wydłużoną;

każdy LL jest niezależnie bifunkcjonalnym łącznikiem; każde m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1; każde n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8;

Nya i Nyb są każdy niezależnie wielofunkcyjną cząstką łączącą gdzie ya i yb reprezentują liczbę grup funkcyjnych odpowiednio na Nya i Nyb;

każdy ya czy yb jest niezależnie liczbą całkowitą od 3 do 8; p jest liczbą całkowitą od 0 do 7; oraz

PL 196 676 B1 każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

W zalecanym wykonaniu, rozgałęziona sieć obejmuje Lys-drzewko, tzn. sieć gdzie wielofunkcyjną cząstką łączącą jest jedna lub więcej reszt Lys (K) (patrz np. fig. 7D).

W jednym ilustrującym wykonaniu rozgałęzione sieci Lys-three według wynalazku są opisane

każdy HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym o strukturze (I) lub jak tu opisano jego formą analogiczną lub zmutowaną, obciętą, z wewnętrzną delecją lub wydłużoną;

każdy LL jest niezależnie bifunkcjonalnym łącznikiem; każde n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8; każde m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1;

R jest -OR lub NRR; oraz każde R jest niezależnie grupą -H, (C1-C6) alkilową, (C1-C6) alkenylową, (C1-C6) alkinylową, (C5-C20) arylową, (C6-C26) alkiloarylową, 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkiloheteroarylem.

5.1.1 Analiza struktury i funkcji

Strukturę i funkcję peptydów rdzeniowych lub analogów peptydów tu opisanych równie dobrze jak agonistów ApoA-I złożonych z takich peptydów rdzeniowych, włączając formy multimeryczne opisane powyżej, można badać w celu wyselekcjonowania aktywnych agonistów lub cząsteczek przypominających ApoA-I. Przykładowo, peptydy rdzeniowe lub analogi peptydów można testować pod względem ich zdolności do tworzenia α-helis w obecności lipidów, do wiązania lipidów, do tworzenia kompleksów z lipidami, do aktywowania LCAT, do ułatwiania wypływu cholesterolu itp.

Metody i testy analizy struktury i/lub funkcji peptydów są dobrze znane specjalistom. Zalecane metody są wprowadzone w przykładach realizacji poniżej. Przykładowo dichroizm kołowy (CD) i jądrowy rezonans magnetyczny (NMR) opisane poniżej w Sekcji 7 można stosować do analizowania struktury peptydów lub analogów peptydowych - szczególnie stopnia helikalności w obecności lipidów. Zdolność wiązania lipidów można określać stosując spektroskopię fluorescencyjną opisaną poniżej w Sekcji 7. Zdolność peptydów i/lub peptydowych analogów do aktywowania LCAT można łatwo określać przy użyciu aktywacji LCAT opisanej poniżej w Sekcji 8. Testy in vitro i in vivo opisane poniżej w Sekcjach 9, 10 i 11 można stosować do określenia okresu półtrwania, dystrybucji, wypływu cholesterolu i wpływu na RCT.

Zasadniczo białka rdzeniowe i/lub peptydowe analogi tu opisane uważane są za aktywne, kiedy wykazują właściwości wymienione w tabeli IV, poniżej.

PL 196 676 B1

T a b e l a IV

Właściwości aktywnych peptydów

Właściwości	Zakres	Zalecany zakres
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (peptydy z niezablokowanymi 22 resztami aminokwasowymi)	> 60%	> 80%
% helikalności w obecności lipidów (R_i=30) (peptydy z niezablokowanymi 18 resztami aminokwasowymi)	> 40%	> 60%
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (peptydy z zablokowanymi 18 resztami aminokwasowymi)	> 60%	> 80%
Wiązanie lipidów (w obecności SUV)	0,5-10 pM peptyd Ri=1-50
Aktywacja LCAT	> 38%	> 80%

RI - stosunek molarny lipid:peptyd

Jak przedstawiono w przykładach realizacji poniżej, peptydy rdzeniowe wykazujące wysoki stopień aktywacji LCAT (> 38%) zasadniczo posiadają znaczący udział struktury α-helisy w obecności małych lipidowych jednowarstwowych pęcherzyków (SUV) (> 60% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej reszt aminokwasowych i zablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej reszt aminokwasowych; > 40% w niezablokowanych peptydach zawierających 18 lub mniej reszt aminokwasowych) a peptydy, które wykazują niską lub brak aktywacji LCAT posiadają niewielką strukturę α-helisy. Jakkolwiek, w pewnych przypadkach, peptydy wykazujące znaczącą strukturę helikalną w obecności lipidów nie wpływają znacząco na LCAT.

Podobnie, podczas gdy peptydy rdzeniowe wykazujące znaczącą aktywację LCAT zazwyczaj wiążą lipidy, w pewnych przypadkach peptydy wykazujące wiązanie lipidów nie wpływają znacząco na aktywację LCAT.

W konsekwencji specjaliści uważają, że podczas gdy zdolność peptydów rdzeniowych tu opisanych do tworzenia α-helisy (w obecności lipidów) oraz wiązania lipidów jest krytyczna dla aktywności, w wielu przypadkach te właściwości nie są wystarczające. Zatem, w zalecanym wykonaniu peptydy rdzeniowe są przeszukiwane celem wyselekcjonowania peptydów rdzeniowych wykazujących znaczącą aktywność farmakologiczną.

W pierwszym etapie peptyd rdzeniowy jest przeszukiwany pod kątem zdolności do tworzenia α-helisy w obecności lipidów przy użyciu testu CD opisanego poniżej w Sekcji 7. Peptydy, które w co najmniej 40% są strukturą helikalną (nie zablokowane peptydy zawierające 18 lub mniej amninokwasów) lub w 60% są strukturą helikalną (zablokowane peptydy zawierające 18 lub mniej aminokwasów; niezablokowane peptydy zawierające 22 lub więcej aminokwasów) w obecności lipidów (w stęż. około 5 pM i stosunku molarnym lipid:peptyd około 30) są następnie przeszukiwane pod kątem zdolności do wiązania lipidów przy użyciu testu fluorescencyjnego opisanego poniżej w Sekcji 7. Oczywiście jedynie te peptydy rdzeniowe, które zawierają fluorescencyjną resztę Trp (W) lub Nal są przeszukiwane pod kątem wiązania lipidów poprzez fluorescencję. Jednakże dla peptydów niezawierających fluorescencyjnych reszt, wiązanie do lipidów jest oczywiste kiedy wzrasta stopień tworzenia struktury helikalnej w obecności lipidów.

Peptydy rdzeniowe wykazujące wiązanie lipidów w obecności SUV (0,5-10 μM peptyd; stosunek molarny lipid:peptyd w zakresie od 1 do 50) są przeszukiwane pod kątem aktywności farmakologicznej. Oczywiście przeszukiwanie na aktywność farmakologiczną będzie zależało od pożądanego użycia agonistów ApoA-I. W zalecanym wykonaniu peptydy rdzeniowe są przeszukiwane pod kątem ich zdolności do aktywowania LCAT, jako peptydy aktywujące LCAT są szczególnie przydatne w opisanych tu metodach. Zalecane są peptydy rdzeniowe wykazujące co najmniej 38% aktywację LCAT, w porównaniu z natywnym ludzkim ApoA-I (co określa się przy użyciu testu aktywacji LCAT opisanego poniżej w Sekcji 8) a peptydy wykazujące 50%, 60%, 70%, 80% lub nawet 90% lub większą aktywację LCAT są szczególnie zalecane.

PL 196 676 B1

5.1.2 Zalecane wykonania

Agonistów ApoA-I według wynalazku można dalej definiować dzięki zalecanym wykonaniom.

W jednym z zalecanych wykonań, agoniści ApoA-I są peptydami o 22 resztach aminokwasowych zgodnych ze strukturą (I), lub ich formami acetylowanymi na N końcu i/lub amidowanymi lub estryfikowanymi na C końcu.

W innym zalecanym wykonaniu agonistami ApoA-I są peptydy o 22 resztach aminokwasowych zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których:

XI jest Pro (P), Gly (G), Ala(A), Asn (N) lub D-Pro (p);

X2 jest Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X5 jest Leu (L);

X6 jest Phe (F);

XII jest Glu (E);

X19 jest Lys (K);

X20 jest Lys (K); i/lub

X₂₂ jest Lys (K), a każdy z X₃, X₄, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, i X₂₁ jest wcześniej zdefiniowany dla struktury (I).

Szczególnie zalecanymi agonistami ApoA-I zgodnie z tym aspektem według wynalazku są agoniści, w których X2 oznacza Val (V); oraz/lub X18 oznacza Gln (Q).

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu, agonistami ApoA-I są peptydy o 22 resztach aminokwasowych zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których jednym z X10, X13, lub X14 jest Gly (G) a inne niż X10, X13, lub X14 są różne od Gly (G). Kiedy X14 oznacza Gly (G), dogodnie gdy X7 oznacza Glu (E).

Szczególnie zalecanymi agonistami ApoA-I zgodnie z tym aspektem według wynalazku są peptydy wyselekcjonowane z grupy składającej się z:

peptyd 148: PVLELFENLLERLGDALQKKLK (SED ID NR 148) peptyd 151: PVLELFENLGERLLDALQKKLK (SED ID NR 151) peptyd 154: PVLELFENLLERGLDALQKKLK (SED ID NR 154) i ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu.

Wykonania zawierające wewnętrzne reszty glicynowe można z łatwością syntetyzować z wysoką wydajnością na drodze kondensacji segmentów, co jest istotną zaletą przy produkcji na dużą skalę. Kondensacja segmentów, tj. łączenie ze sobą małych elementów łańcuchów peptydowych celem wytworzenia dłuższego łańcucha peptydowego, włączając peptydy mimetykiem ApoA-I o 44 resztach aminokwasowych (patrz, np. Nakagawa i wsp., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7083; Nokihara i wsp., 1989, Peptides 1988:166-168; Kneib-Cordonnier i wsp., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:527-538), jest uważana za najbardziej efektywną ze względu na koszty metodą wydajnej syntezy ogromnej ilości peptydów rdzeniowych tu opisanych.

Zalety syntezy poprzez kondensację segmentów obejmują możliwość kondensowania przygotowanych segmentów w roztworze i łatwość oczyszczania końcowego produktu. Wadą tej metody jest niska wydajność sprzęgania i wydajność etapu kondensacji oraz niska rozpuszczalność pewnych sekwencji peptydowych.

Wydajność sprzęgania w etapie kondensacji można znacząco podnieść poprzez wydłużenie czasu sprzęgania. Zazwyczaj wydłużenie czasu sprzęgania wpływa na zwiększenie racemizacji produktu (Sieber i wsp., 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150). Jednakże ponieważ glicyna traci centrum chiralności nie podlega racemizacji (reszta prolinowa, ze względu na zawadę przestrzenną podlega niewielkiej lub nie podlega wcale racemizacji w długim czasie sprzęgania). Zatem wykonania zawierające wewnętrzne reszty glicynowe można syntetyzować w ogromnej ilości i z wysoką wydajnością dzięki kondensacji segmentów, poprzez syntetyzowanie składowych segmentów z korzyścią wynikającą z faktu że reszty glicynowe nie podlegają racemizacji. Zatem wykonania zawierające wewnętrzne reszty glicynowe dostarczają znaczącej dla syntezy korzyści dla otrzymywania na dużą skalę ogromnych ilości preparatu.

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu, agonistami ApoA-I są peptydy o 22 resztach aminokwasowych zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których każdy z X10, X13, i X14 jest różny od Gly (G).

PL 196 676 B1

W innym zalecanym wykonaniu agonistami ApoA-I są zmienione lub zmutowane formy peptydów zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których:

X4 jest różny od Asp (D);

X5 jest różny od, Phe (F);

X6 jest różny od Trp (W);

X7 jest różny od Leu (L) lub Asp (D);

X9 jest różny od Gly (G) lub Trp (T);

X12 jest różny od Lys (K);

X13 jest różny od Trp (W);

X14 jest różny od Trp (W);

X15 jest różny od Glu (E);

X16 jest różny od Trp (W) lub Leu (L); i/lub

X17 jest różny od Trp (W).

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu, agonistami ApoA-I są peptydy o 22 resztach aminokwasowych zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których gdy X7 oznacza Leu (L), X10 oznacza Trp (W), X1 jest różny od Gly (G) i/lub X14 jest różny od Gly (G). Szczególnie zalecanym peptydem zgodnie z tym aspektem jest peptyd 155 (PVLELFLNLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO:155).

W innym zalecanym wykonaniu, agonistami ApoA-I są peptydy o 22 resztach aminokwasowych lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w ktorych co najmniej jeden z X19, X20 lub X22 jest różny od Orn. Dogodniej, co najmniej dwa z X19, X20 lub X22 są różne od Orn. Najdogodniej każdy z X19, X20 lub X22 jest różny od Orn.

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu agoniści ApoA-I są wyselekcjonowani z grupy peptydów przedstawionych poniżej:

peptyd 144 peptyd 145 peptyd 146 peptyd 147 peptyd 148 peptyd 149 peptyd 150 peptyd 151 peptyd 152 peptyd 153 peptyd 154 peptyd 155 peptyd 186 peptyd 187 peptyd 188 peptyd 189 pVLELFENLLERLLDALQKKLK

GVLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERLFDALQKKLK

PVLELFENLLERLGDALQKKLK

PVLELFENLWERLLDALQKKLK

PLLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLGERLLDALQKKLK

PVFELFENLLERLLDALQKKLK

AVLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERGLDALQKKLK

PVLELFLNLWERLLDALQKKLK

PVLELFEQLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERLLDALNKKLK

PVLELFENLLDRLLDALQKKLK

DVLELFENLLERLLDALQKKLK (SEQ ID NO:144) (SEQ ID NO:145) (SEQ ID NO:146) (SEQ ID NO:147) (SEQ ID NO:148) (SEQ ID NO:149) (SEQ ID NO:150) (SEQ ID NO:151) (SEQ ID NO:152) (SEQ ID NO:153) (SEQ ID NO:154) (SEQ ID NO:155) (SEQ ID NO:186) (SEQ ID NO:187) (SEQ ID NO:188) (SEQ ID NO:189) i ich form acetylowanych na N końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na N końcu.

peptyd 144 peptyd 145 peptyd 146 peptyd 147 peptyd 148 peptyd 149 peptyd 150 peptyd 151 peptyd 152 peptyd 153 pVLELFENLLERLLDALQKKLK

GVLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERLFDALQKKLK

PVLELFENLLERLGDALQKKLK

PVLELFENLWERLLDALQKKLK

PLLELFENLLERLLDALQKKLK

PVLELFENLGERLLDALQKKLK

PVFELFENLLERLLDALQKKLK

AVLELFENLLERLLDALQKKLK (SEQ ID NO:144) (SEQ ID NO:146) (SEQ ID NO:147) (SEQ ID NO:148) (SEQ ID NO:149) (SEQ ID NO:150) (SEQ ID NO:151) (SEQ ID NO:152) (SEQ ID NO:153) (SEQ ID NO:154)

PL 196 676 B1 peptyd 154 PVLELFENLLERGLDALQKKLK (SEQ ID NO:155);

peptyd 155 PVLELFLNLWERLLDALQKKLK (SEQ ID NO:156);

i ich form acetylowanych na N końcu i/lub amidowanych lub estryfikowanych na C końcu.

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu, agonistami ApoA-I są multimeryczne formy zgodne ze strukturami II, III i/lub IV, w których każdy HH jest niezależnym peptydem zgodnym ze strukturą (I) lub jego formą acetylowaną na N końcu i/lub amidowaną lub estryfikowaną na C końcu lub dowolnym z korzystnych tu opisanych peptydów zgodnych ze strukturą (I),

W jeszcze innym zalecanym wykonaniu, peptydy rdzeniowe stanowiące agonistów ApoA-I nie są żadnym z następujących peptydów:

peptyd 75 peptyd 94 peptyd 209 peptyd 237 peptyd 238 peptyd 241 peptyd 242 peptyd 243 peptyd 244 peptyd 245 peptyd 246 peptyd 247 peptyd 248 peptyd 249 peptyd 250 peptyd 251

PVLDEFREKLNEELEALKQKLK

PVLDEFREKLNEALEALKQKLK

PVLDEFREKLNERLEALKQKLK

LDDLLQKWAEAFNQLLKK

EWLKAFYEKVLEKLKELF*

DWFKAFYDKVFEKFKEFF

GIKKFLGSIWKFIKAFVG

DWFKAFYDKVAEKFKEAF

DWLKAFYDKVAEKLKEAF

DWLKAFYDKVFEKFKEFF

EWLEAFYKKVLEKLKELF

DWFKAFYDKFFEKFKEFF

EWLKAFYEKVLEKLKELF

EWLKAEYEKVEEKLKELF*

EWLKAEYEKVLEKLKELP*

EWLKAFYKKVLEKLKELF* (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:75)

W końcowym zalecanym wykonaniu, agoniści ApoA-I nie są żadnym z peptydów podanych w tabeli X (Sekcja 8.3, poniżej), które wykazują aktywność aktywacji LCAT niższą niż 38% w porównaniu z natywną ludzką ApoA-I.

5.2. Synteza i oczyszczanie peptydowych agonistów ApoA-I

Opisane tu petydy rdzeniowe można wytwarzać przy użyciu znanych specjalistom dowolnych technik wytwarzania peptydów. Przykładowo peptydy można wytwarzać przy użyciu tradycyjnych etapowych syntez peptydów w roztworach lub w fazie stałej, lub technik rekombinowania DNA.

5.2.1 Syntezy chemiczne

Peptydy rdzeniowe można wytwarzać przy użyciu tradycyjnej etapowej syntezy w roztworach lub w fazie stałej (patrz np. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams i wsp., Wyd., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida i cytowane tam referencje; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Wyd., 1989, IRL Press, Oxford, England i cytowane tam referencje).

Alternatywnie, peptydy według wynalazku można wytwarzać na drodze kondensacji segmentów jak opisano przykładowo w Liu i wsp., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca i wsp., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tam i wsp., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Scholzer i Kent, 1992, Science 256:221-225, Liu i Tam, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu i Tam, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 916584-6588; Yamashiro i Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334. Kondensacja peptydów jest szczególnie przydatną metodą do syntetyzowania wykonań zawierających wewnętrzne reszty glicyny. Inne metody przydatne do syntetyzowania peptydów według wynalazku są opisane w Nakagawa i wsp., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092.

Agonostów ApoA-I zawierających N i/lub C końcowe grupy blokujące można wytwarzać przy użyciu standardowych technik chemii organicznej. Przykładowo metody acylacji N końca peptydu lub amidowania lub estryfikowania C końca białka są dobrze znane specjalistom. Sposoby przeprowadzania modyfikacji na N i/lub C końcu są oczywiste dla specjalistów, tak jak sposoby zabezpieczania każdej z grup funkcyjnych łańcucha bocznego jakie są konieczne w czasie przyłączania terminalnych grup blokujących.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole (przeciwjony) można dogodnie wytwarzać poprzez chromatografię jonowymienną lub innymi metodami dobrze znanymi specjalistom.

PL 196 676 B1

Związki według wynalazku, które są w formie tandemowych multimerów można dogodnie syntetyzować poprzez dodanie łącznika lub łączników do łańcucha peptydowego w odpowiednim etapie syntezy. Odpowiednie schematy zabezpieczania środki chemiczne są oczywiste dla specjalistów.

Związki według wynalazku będące w formie rozgałęzionych sieci można dogodnie syntetyzować stosując trimerowych i tetramerowych złóż i chemii opisane w Tam, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 i Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84. Modyfikowanie syntetycznych złóż i strategie syntetyzowania rozgałęzionych sieci wyższego lub niższego rzędu lub zawierających kombinacje różnych helikalnych segmentów peptydów rdzeniowych leżą w zakresie możliwości specjalistów od chemii peptydów i/lub chemii organicznej.

Tworzenie mostków dwusiarczkowych, jeśli pożądane, zazwyczaj przeprowadza się w obecności łagodnych czynników utleniających. Można stosować chemiczne czynniki utleniające lub związki można po prostu poddawać działaniu tlenu atmosferycznego celem wytworzenia tych mostków. Różne metody znane są specjalistom, włączając te opisane przykładowo przez Tam i wsp., 1979, Synthesis 955-957; Stewart i wsp., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2-gie Wyd., Pierce Chemical Company Rocford, IL; Ahmed i wsp., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482 oraz Pennington i wsp., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt i Andreu, Wyd., ESCOM Leiden, The Netherlands. Dodatkowa alternatywa opisana jest przez Kamber i wsp., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915. Metoda przeprowadzana na stałym nośniku opisana jest przez Albericio, 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97. Każdą z tych metod można zastosować do tworzenia mostków dwusiarczkowych w peptydach według wynalazku.

5.2.2. Synteza rekombinacyjna

Jeśli peptyd lub jego część składa się z aminokwasów kodowanych wyłącznie przez gen, peptyd ten lub jego stosowną część można syntetyzować przy użyciu tradycyjnych technik rekombinacji stosowanych w inżynierii genetycznej.

Celem wytwarzania rekombinacyjnego sekwencję polinukleotydową kodującą peptyd wprowadza się do odpowiedniego nośnika, tzn. wektora zawierającego elementy konieczne dla transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej lub w przypadku wirusowego wektora RNA - elementy konieczne do replikacji i translacji. Nośnik ekspresyjny jest następnie przenoszony do odpowiedniej komórki docelowej, która będzie wytwarzać peptyd. W zależności od użytego systemu ekspresyjnego wytworzony peptyd jest następnie izolowany za pomocą dobrze ustalonych procedur. Metody wytwarzania zrekombinowanego białka i peptydu są dobrze znane specjalistom (patrz np. Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; oraz Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. z których każda jest tu w całości włączona poprzez odniesienia).

Dla zwiększenia wydajności wytwarzania, polinukleotyd można tak zaprojektować aby kodował zgrupowanie jednostek peptydu oddzielonych miejscami do cięcia przez enzymy - zarówno homopolimerów (powtórzone jednostki peptydowe) lub heteropolimerów (różne peptydy razem zlepione). Otrzymany peptyd można ciąć (np. przez działanie odpowiednim enzymem) w celu odzyskania jednostek peptydowych. Będzie to podnosiło ilość peptydów wytwarzanych przy użyciu pojedynczego promotora. W zalecanym wykonaniu policistronowy polinukleotyd można tak zaprojektować, że transkrybowany jest pojedynczy mRNA kodujący zgrupowanie peptydów (tzn. homopolimery lub heteropolimery), każdy kodujący obszar jest funkcjonalnie połączony z, niezależną od czapeczki, sekwencją kontrolującą translację; np. wewnętrznym miejscem wiązania rybosomu (IRES). Użycie odpowiedniego wirusowego systemu ekspresyjnego, pozwala na to, że translacja każdego peptydu kodowanego przez mRNA zależy od sekwencji położonej wewnątrz transkryptu; np. IRES. Zatem z policystronowego konstruktu zachodzi transkrypcja pojedynczego, dużego policistronowego mRNA, który kieruje translacją zgrupowania indywidualnych peptydów. Podejście to eliminuje wytwarzanie i enzymatyczne przetwarzanie polipeptydów i może znacząco podnieść wydajność otrzymywania peptydu z pojedynczego promotora.

Różnorodne systemy gospodarz-wektor ekspresyjny można wykorzystywać do wytwarzania opisanych tu peptydów. Obejmują one między innymi mikroorganizmy, takie jak bakteria stransformowana zrekombinowanym DNA bakteriofaga lub plazmidowym DNA wektorów ekspresyjnych zawierających odpowiednią sekwencję kodującą; drożdże lub grzyby nitkowate stransformowane zrekombinowanymi drożdżowymi lub grzybowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi odpowiednią sekwencję kodującą; systemy komórek owadów infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirus) zawierającymi odpowiednią sekwencję kodującą; systemy ko40

PL 196 676 B1 mórek roślinnych infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirus mozaiki kalafiora lub wirus mozaiki tytoniu) lub transformowanych zrekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. Plazmid Ti) zawierającymi odpowiednią sekwencję kodującą; lub systemy komórek zwierzęcych.

Elementy umożliwiające ekspresję różnych systemów ekspresyjnych różnią się siłą i specyficznością. W wektorze ekspresyjnym można użyć każdego z szeregu odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych, w zależności od wykorzystywanego systemu gospodarz/wektor, włączając promotory konstytutywne i indukowalne. Przykładowo, kiedy klonuje się w systemach bakteryjnych można użyć indukowalne promotory takie jak pL bakteriofaga λ, plac, ptrp, ptac (hybrydowy promotor ptrp-lac) i im podobne; kiedy klonuje się w systemach komórek owadów można użyć promotory, takie jak promotor polihedronu bakulowirusa; kiedy klonuje się w systemach komórek roślinnych można użyć promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (np. promotory szoku cieplnego); promotor małej podjednostki RUBISCO; promotor białka wiążącego chlorofil a/b) lub z wirusów roślinnych (np. promotor 35S RNA z CaMV; promotor białka płaszcza z TMV); kiedy klonuje się w systemach komórek ssaków można użyć promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (np. promotor metalotioniny) lub wirusów ssaków (np. późny promotor adenowirusa; promotor 7.5 K wirusa krowianki); kiedy wytwarzane są linie komórkowe zawierające wiele kopii produktu ekspresji, można zastosować wektory oparte na SV40, BPV i EBV posiadające odpowiedni marker selekcyjny.

W przypadku użycia roślinnych wektorów ekspresyjnych ekspresja sekwencji kodującej peptydy według wynalazku może być kierowana przez dowolny z wielu promotorów. Przykładowo, można użyć wirusowych promotorów takich jak promotory 35S RNA i 19S RNA z CaMV (Brisson i wsp., 1984, Nature 310:511-514), lub promotor białka płaszcza TMV (Takamatsu i wsp., 1987 EMBO J. 6:307-311); alternatywnie stosuje się roślinne promotory takie jak promotory małej podjednostki RUBISCO (Coruzzi i wsp., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie i wsp., 1984, Science 224:838-843) lub szoku cieplnego np. soi hsp17.5-E lub hsp17.3-B (Gurley i wsp., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Konstrukty te można wprowadzać do komórek roślinnych przy użyciu plazmidów Ti, plazmidów Ri, wirusowych wektorów roślinnych, poprzez bezpośrednią transformację, mikroinikcję, elektroporacje itp. Dla przeglądu technik patrz np. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sekcja VIII, str. 421-463; oraz Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2-gie Wyd., Blackie, London Rozdz. 7-9.

W owadzim systemie ekspresyjnym, który można zastosować do wytwarzania peptydów według wynalazku, jako wektor do ekspresji obcych genów zastosowano wirus jądrowej polihydrozy Autographa californica (AcNPV). Wirus namnaża się w komórkach Spodoptera frugiperda. Sekwencję kodującą można klonować w regionach nieistotnych (przykładowo gen polihedronu) dla wirusa i wprowadzać pod kontrolę promotora AcNPV (przykładowo promotora polihedronu). Udane wprowadzenie sekwencji kodującej pozwoli na inaktywację genu polihedronu i wytwarzanie zrekombinowanych nie opłaszczonych wirusów (tzn. wirusów, które nie posiadają białkowego płaszcza kodowanego przez gen polihedronu). Takie zrekombinowane wirusy są następnie używane do infekcji komórek Spodoptera frugiperda, w których wprowadzony gen ulega ekspresji (np. patrz Smith i wsp., 1983, J. Virol. 46:584; Smith patent USA nr 4215051). Dalsze przykłady takich systemów ekspresyjnych można znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Ausubel i wsp., wyd., Green Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Szereg opartych na wirusach systemów ekspresyjnych można wykorzystywać w komórkach ssaczych. W przypadku użycia adenowirusa jako wektora ekspresyjnego sekwencja kodująca jest ligowana z kompleksem kontrolującym transkrypcję/translację adenowirusa, np. późnym promotorem i trzyczęściową sekwencją liderową. Taki chimerowy gen można wprowadzić do genomu adenowirusa poprzez rekombinację in vitro i in vivo. W wyniku insercji w regionie nie istotnym dla genomu wirusa (np. region E1 lub E3) powstanie zrekombinowany wirus zdolny do życia i ekspresji peptydu w zainfekowanych komórkach gospodarza, (np. patrz Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659. Alternatywnie, można użyć promotor 7.5 K krowianki (patrz, np. Mackett i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett i wsp., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).

Inne systemy ekspresyjne do wytwarzania peptydów według wynalazku są oczywiste dla specjalistów.

PL 196 676 B1

5.2.3 Oczyszczanie peptydów

Peptydy według wynalazku można oczyszczać dobrze znanymi technikami takimi jak chromatografia z odwróconą fazą, wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia jonowymienna, elektroforeza w żelu, chromatografia powinowactwa i im podobne. Określone warunki zastosowane do oczyszczania danego peptydu będą częściowo zależały od strategii syntezy i czynników takich jak ładunek wypadkowy, hydrofobowość, hydrofilowość itp. i są oczywiste dla specjalistów. Multimeryczne rozgałęzione peptydy można oczyszczać np. przez chromatografię jonowymienną lub odcinającą daną wielkość.

W oczyszczaniu poprzez chromatografię powinowactwa można zastosować dowolne przeciwciało swoiście wiążące peptyd. Dla wytwarzania przeciwciał immunizuje się, poprzez wstrzyknięcie peptydu, różnych gospodarzy zwierzęcych między innymi króliki, myszy, szczury itp. Peptyd można przyłączyć do odpowiedniego nośnika takiego jak BSA poprzez grupę funkcyjną łańcucha bocznego lub przyłączenie łącznika do grupy funkcyjnej łańcucha bocznego. Dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, w zależności od rodzaju gospodarza, można stosować różne adiuwanty między innymi adiuwant Freund'a (kompletny lub nie), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne jak lizolektyna, niejonowe poliole, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocjaninę skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie przydatne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (bacilli Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum.

Przeciwciała monoklonalne dla peptydu można wytwarzać przy użyciu technik umożliwiających wytwarzanie cząsteczek przeciwciał w hodowlach ciągłych linii komórkowych. Obejmują one między innymi technikę hodowli hybrydomy opisaną pierwotnie przez Kohler i Milstein, 1975, Nature 256:495-497 lub Kaprowski patent USA nr 4376110, który jest tu włączany poprzez referencje; technikę hybrydomy ludzkich limfocytów B) Kosbor i wsp., 1983, Immunology Today 4:72, Cote i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030); i technikę hybrydomy EBV (Cole i wsp., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., str. 77-96 (1985)). Dodatkowo można użyć technik rozwiniętych celem wytwarzania chimerowych przeciwciał Morrison i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger i wsp., 1984, Nature 312:604-608; Takeda i wsp., 1985, Nature 314:452-454, Boss, patent USA nr 4816397; Cabilly, patent USA nr 4816567; które są tu włączone poprzez referencje) poprzez złożenie genów dla cząsteczki mysiego przeciwciała o odpowiedniej swoistości z genami dla cząsteczek ludzkich przeciwciał o odpowiedniej aktywności biologicznej. Można wytwarzać humanizowane przeciwciała (patrz np. Queen, patent USA nr 5585089, który jest tu włączony poprzez referencje) Alternatywnie do wytwarzania przeciwciał złożonych z pojedynczego łańcucha, swoistych dla peptydu, można zaadaptpwać techniki opisane przy wytwarzaniu przeciwciał złożonych z pojedynczego łańcucha (patent USA nr 4946778).

Stosując techniki znane specjalistom można wytwarzać fragmenty przeciwciał zawierające delecje swoistych miejsc wiążących. Przykładowo fragmenty takie obejmują między innymi fragmenty F(ab')2, które można wytwarzać poprzez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała, a także fragmenty Fab, które można wytwarzać poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych we fragmentach F(ab')2. Alternatywnie można konstruować biblioteki eksprymujące Fab (Huse i wsp., 1989, Science 246:1275-1281) pozwalające na szybkie i łatwe identyfikowanie monoklonalnych fragmentów Fab o żądanej swoistości do białka będące go przedmiotem zainteresowania.

Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można przyłączać, przykładowo, do agarozy a kompleks przeciwciało-agaroza jest stosowany w immunochromatografii do oczyszczania peptydów według wynalazku. Patrz Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlang Nowy Jork, Inc., NY Livingstone, 1974, Methods in Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731.

5.3 Kompozycje farmaceutyczne i sposoby stosowania

Agonistów ApoA-I według wynalazku można stosować do leczenia zaburzeń u zwierząt, szczególnie ssaków włączając ludzi, u których korzystne jest podniesienie stężenia HDL w surowicy, aktywacja LCAT i umożliwienie wypływu cholesterolu i RCT. Stany takie obejmują, między innymi, hiperlipidemię, w szczególności hipercholesterolemię, oraz chorobę sercowo-naczyniową jak miażdżyca naczyń (włączając leczenie i zapobieganie miażdżycy naczyń); restenoza (np. zapobieganie i leczenie płytek miażdżycowych rozwijających się w następstwie angioplastyki balonowej) oraz inne zaburzenia, takie jak endotoksemia, która często jest następstwem szoku septycznego.

Agonistów ApoA-I można stosować pojedynczo lub w kombinacji z innymi lekami stosowanymi przy leczeniu wymienionych stanów. Terapie takie obejmują między innymi jednoczesne lub następujące po sobie podawanie wymaganych leków.

PL 196 676 B1

Przykładowo przy leczeniu hipercholesterolemii lub miażdżycy naczyń preparaty agonisty ApoA-I można stosować z jedną lub większą liczbą preparatów obniżających poziom cholesterolu stosowanych obecnie np. ze złożami z kwasami żółciowymi, niacyna i/lub statyny. Taki skojarzony tryb leczenia może dawać dogodne wyniki terapeutyczne jako, że każdy lek działa na różne etapy syntezy i transportu cholesterolu; np. złoża z kwasami żółciowymi zaburzają recykling cholesterolu, populacje chilomikronów i LDL; niacyna przede wszystkim zaburza populację VLDL i LDL; statyny hamują syntezę cholesterolu, obniżając populację LDL (i prawdopodobnie podwyższając ekspresję receptora LDL); podczas gdy agoniści ApoA-I zaburzają RCT, podwyższają HDL, podwyższają aktywność LCAT i umożliwiają wypływ cholesterolu.

W innym wykonaniu wynalazku, agonistów ApoA-I można użyć w skojarzeniu z fibratami przy leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii i choroby sercowo-naczyniowej, takiej jak miażdżyca naczyń .

W jeszcze innym wykonaniu agonistów ApoA-I według wynalazku można użyć w kombinacji z czynnikami przeciwbakteryjnymi i przeciwzapalnymi aktualnie stosowanymi przy leczeniu wstrząsu septycznego wywołanego endotoksyną.

Angonistów ApoA-I według wynalazku można preparować jako peptydy lub jako kompleksy peptydowo-lipidowe, które można podawać pacjentowi różnymi drogami, celem dostarczania agonisty ApoA-I do układu krążenia. Przykłady kompozycji i sposobów podawania opisano poniżej.

5.3.1. Agoniści ApoA-I i kompleks peptyd/lipid jako aktywne składniki

Peptydy będące agonistami ApoA-I można syntetyzować lub produkować przy użyciu technik opisanych w Sekcji 5.2 i podsekcjach. Stabilne preparaty o długim okresie trwałości można wytwarzać poprzez liofilizację peptydów - zarówno przy wytwarzaniu dużej ilości do ponownego przetworzenia lub przy wytwarzaniu indywidualnych porcji lub jednostek dawkowania, które można odtwarzać poprzez ponowne uwodnienie sterylną wodą lub odpowiednio zbuforowanym roztworem przed podaniem pacjentowi.

W pewnych wykonaniach może być zalecane wytworzenie i podanie agonisty ApoA-I w kompleksie peptydowo-lipidowym. Podejście takie ma szereg zalet, ponieważ kompleks powinien mieć przedłużony okres półtrwania w układzie krążenia, szczególnie kiedy kompleks ten ma podobną wielkość i gęstość do HDL a szczególnie do populacji HDL pre-e-1 i pre-e-2. Kompleksy peptyd - lipid można łatwo wytwarzać stosując każdą z wielu metod opisanych poniżej. Stabilne preparaty posiadające długi okres trwałości można wytwarzać poprzez liofilizację - podejściem zalecanym jest procedura koliofilizacji opisana poniżej. Zliofilizowane kompleksy można użyć do wytwarzana dużej ilości preparatu do ponownego przetworzenia lub do wytwarzania indywidualnych porcji lub jednostek dawkowania, które przed podaniem pacjentowi można odtwarzać poprzez ponowne uwodnienie sterylną wodą lub odpowiednio zbuforowanym roztworem.

Celem wytworzenia pęcherzyków lub kompleksów peptydowo - lipidowych można zastosować szereg metod znanych specjalistom. Można też zastosować wiele dostępnych technik wytwarzania liposomów lub proteoliposomów. Przykładowo dla wytworzenia kompleksów peptydy można współsonifikować (stosując łaźnię lub sondę wytwarzające ultradźwięki) z odpowiednimi lipidami. Alternatywnie peptydy można mieszać z przygotowanymi pęcherzykami lipidowymi w wyniku czego spontanicznie tworzą się kompleksy peptydowo - lipidowe. W jeszcze innym przypadku kompleksy peptydowo - lipidowe można wytwarzać metodą dializowania detergentowej np. mieszaninę peptydu, lipidu i detergentu poddaje się dializie aby usunąć detergent i odtworzyć lub wytworzyć kompleksy peptydowo - lipidowe (np. Jonas i wsp., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582).

Chociaż wszystkie wymienione podejścia są możliwe do przeprowadzenia, to z każdą z metod wiążą się jej własne szczególne problemy produkcyjne wynikające z kosztów, wydajności, odtwarzalności i bezpieczeństwa. Twórcy wynalazku opracowali nową prostą metodę wytwarzania peptydu lub kompleksów białkowo - lipidowych o cechach podobnych do HDL. Metoda ta może być stosowana do wytwarzania kompleksów peptyd ApoA-I - lipid i posiada następujące zalety: (1) Większość lub wszystkie użyte składniki tworzą pożądane kompleksy dzięki czemu unika się strat materiału wyjściowego, co jest powszechne w innych metodach. (2) Można tworzyć zliofilizowane związki, które są bardzo stabilne w czasie przechowywania. Powstające kompleksy można odtwarzać bezpośrednio przed użyciem, (3) Powstające kompleksy zazwyczaj nie wymagają dalszego oczyszczania po wytworzeniu i przed użyciem. (4) Unika się związków toksycznych, takich jak detergenty, np. cholany. Co więcej metoda produkcji może być z łatwością zastosowana na większą skalę i jest zgodna z produkcją GMP (tzn. w środowisku wolnym od endotoksyn).

PL 196 676 B1

Zgodnie z preferowaną metodą, peptyd i lipid są mieszane w układzie rozpuszczalnika, który umożliwia jednoczesne rozpuszczanie każdego składnika i który może być całkowicie usunięty poprzez liofilizację. W tym celu pary rozpuszczalników muszą być uważnie dobrane tak aby zapewnić jednoczesne rozpuszczanie amfipatycznego peptydu i lipidu. W jednym z wykonań białko lub białka albo peptyd lub peptydy, które mają być wprowadzane do cząsteczek mogą być rozpuszczone w rozpuszczalniku wodnym lub organicznym lub w mieszaninie rozpuszczalników (rozpuszczalnik 1). Składnik (fosfo)lipidowy jest rozpuszczony w rozpuszczalniku wodnym lub organicznym lub w mieszaninie rozpuszczalników (rozpuszczalnik 2), który jest mieszalny z rozpuszczalnikiem 1 i te dwa rozpuszczalniki są mieszane. Alternatywnie peptyd i lipid można wprowadzać do systemu współrozpuszczalnika, tzn. mieszaniny mieszalnych rozpuszczalników. Odpowiednia proporcja peptydu (białka) do lipidu jest na początku określana empirycznie tak, że wytworzone kompleksy posiadają odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne tzn. zazwyczaj (lecz nie koniecznie) są podobnej wielkości jak HDL. Wytworzona mieszanina jest zamrażana i liofilizowana do sucha. Czasami do mieszaniny musi być dodany dodatkowy rozpuszczalnik dla ułatwienia liofilizacji. Zliofilizowany produkt można przechowywać przez długi okres czasu i pozostaje on stabilny.

W przykładach realizacji opisanych poniżej peptyd 146 (SEQ ID NO:146) i fosfolipidy rozpuszczano oddzielnie w metanolu, łączono a następnie mieszano z ksylenem przed liofilizacją. Peptyd i lipid można razem dodać do mieszaniny dwóch rozpuszczalników. Alternatywnie roztwór peptydu rozpuszczonego w metanolu można mieszać z roztworem lipidu rozpuszczonego w ksylenie. Należy uważać, aby usunąć sól z układu rozpuszczalników tak, aby zapobiec wysalaniu peptydu. Wytworzony roztwór zawierający jednocześnie rozpuszczony peptyd i lipid w metanolu/ksylenie jest liofilizowany tak, aby powstał proszek.

Zliofilizowany produkt można odtwarzać w celu otrzymania roztworu lub zawiesiny kompleksu peptydowo - lipidowego. W tym celu zliofilizowany proszek jest uwadniany w roztworze wodnym w odpowiedniej objętości (często 5 mg peptydu /ml, co jest wygodne do podawania w dożylnych zastrzykach). W zalecanym wykonaniu zliofilizowany proszek jest uwadniany w buforowanym fosforanem roztworze soli lub roztworze soli fizjologicznej. Mieszaninę można mieszać bądź wytrząsać dla ułatwienia uwadniania i w większości przypadków etap odtwarzania powinien być prowadzony w temperaturze równej lub wyższej niż temperatura fazy przejścia składnika lipidowego kompleksów. W ciągu minut tworzy się klarowny preparat kompleksów lipidowo - białkowych.

Próbka odtworzonego preparatu może być scharakteryzowana dla potwierdzenia, że kompleksy w preparacie posiadają żądany rozdział wielkości np. rozdział wielkości HDL. W tym celu można użyć chromatografii filtracyjnej w żelu. W przykładach realizacji opisanych poniżej, stosowany jest układ chromatografii w żelu Superose 6 FPLC Pharmacia. Stosowany bufor zawiera 150 mM NaCl w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7,4. Typowa objętość próbki wynosi 20 do 200 mikrolitrów kompleksów zawierających 5 mg peptydu /ml. Przepływ przez kolumnę wynosi 0,5 ml/min. Jako standardy do kalibracji kolumny stosuje się serię białek o znanej masie cząsteczkowej i średnicy stokesowskiej jak również ludzki HDL. Białka i kompleksy lipoproteinowe monitorowane są absorbancją lub rozproszeniem promieniowania świetlnego o długości 254 lub 280 nm.

Agoniści ApoA-I według wynalazku mogą występować w kompleksach z różnymi lipidami, włączając nasycone i nienasycone, naturalne i syntetyczne lipidy i/lub fosfolipidy. Odpowiednie lipidy obejmują między innymi fosfolipidy o krótkich łańcuchach alkilowych, fosfatydylocholinę z jaja, fosfatydylocholinę z soi, dipalmitoilofosfatydylocholinę, dimirystoilofosfatydylocholinę, distearoilofosfatydylocholinę, 1-mirystoilo-2-palmitoilofosfatycholinę, 1-palmitoilo-2-mirystoilofosfatydylocholinę, 1-palmitoilo-2-stearoilofosfatydylocholinę, 1-stearoilo-2-palmitoilofosfatydylocholinę, dioleoilofosfatydylocholinę, dioleofosfatydyloetanolaminę, dilauroilofosfatydyloglicerol, fosfatydylocholinę, fosfatydyloserynę, fosfatydyloetanolaminę, fosfatydyloinozytol, sfingomielinę, sfingolipidy, fosfatydyloglicerol, difosfatydyloglicerol, dimirystoilofosfatydyloglicerol, dipalmitoilofosfatydyloglicerol, distearoilofosfatydyloglicerol, dioleoilofosfatydyloglicerol, kwas dimirystoilofosfatydowy, kwas palmitoilofosfatydowy, dimirystoilofosfatydyloetanolaminę, dipalmitoilofosfatydyloetanolaminę, dimirystoilofosfatydyloserynę, dipalmitoilofosfatydyloserynę, fosfatydyloserynę z mózgu, sfingomielinę z mózgu, dipalmitoilosfingomielinę, distearoilosfingomielinę, kwas fosfatydowy, galaktocerebrozyd, gangliozydy, cerebrozydy, dilaurylofosfatydylocholinę, (1,3)-D-mannozylo(1,3)digliceryd, aminofenyloglikozyd, 3-cholesterylo-6'-glikozylotio)heksyloeter glikolipidów oraz cholesterol i jego pochodne.

PL 196 676 B1

Twórcy wynalazku stwierdzili, że kiedy agoniści ApoA-I według wynalazku tworzą kompleks ze sfingomieliną, cały HDL jest usuwany z cząstek typu pre-β. Zgodnie z powyższym, w zalecanym wykonaniu, agonistów ApoA-I podaje się jako kompleks ze sfingomieliną.

5.3.2. Zastosowanie w leczeniu

Peptydy agonistyczne ApoA-I lub kompleksy peptydowo-lipidowe według wynalazku można podawać dowolną drogą, która zapewnia ich dostępność biologiczną w układzie krążenia. Najlepiej można to osiągnąć podając je drogą pozajelitową, obejmującą zastrzyki dożylne (IV), domięśniowe (IM), śródskórne, podskórne (SC) i dootrzewnowe (IP). Jednakże można zastosować inne drogi podawania. Przykładowo, wchłanianie z przewodu pokarmowego można uzyskać przy podawaniu drogami doustnymi (obejmującymi miedzy innymi połykanie, drogi policzkowe i podjęzykowe) przy założeniu, że stosuje się odpowiednie kompozycje (np. powłoki zabezpieczające przed strawieniem) aby uniknąć lub zminimalizować degradację składników aktywnych np. w niesprzyjającym środowisku błony śluzowej jamy ustnej, żołądka i/lub jelita cienkiego. Alternatywnie, można zastosować podawanie poprzez tkanki błony śluzowej, np. sposoby podawania dopochwowe lub doodbytnicze w celu uniknięcia lub zminimalizowania degradacji w przewodzie pokarmowym. Jeszcze inną alternatywę stanowi podawanie kompozycji według wynalazku przezskórnie (np. przez skórę właściwą) lub poprzez inhalację. Będzie oczywiste, że zalecana droga podawania może się zmieniać w zależności od stanu, wieku i zdyscyplinowania biorcy.

Konkretna dawka agonistów ApoA-I lub kompleksów peptydowo-lipidowych będzie się zmieniała w zależności od drogi podawania i powinna być doprowadzana do uzyskania stężenia w osoczu krwi od 100 mg/l do 2 g/l. Dane otrzymane w opisanych tu zwierzęcych systemach modelowych pokazują, że agoniści ApoAI według wynalazku łączą się ze składnikiem HDL, a obserwowany okres półtrwania u ludzi wynosi około pięciu dni. A zatem, według jednego z wykonań, agonistów ApoA-I można podawać w zastrzykach w dawce od 0,5 mg/kg do 100 mg/kg raz na tydzień. W innym wykonaniu, pożądany poziom w surowicy można utrzymywać poprzez wlew stały lub wlew przerywany dostarczający od około 0,5 mg/kg/godz. do 100 mg/kg/godz.

Toksyczność i skuteczność leczniczą różnych agonistów ApoA-I można określić stosując standardowe procedury farmaceutyczne w hodowli komórkowej lub zwierzęta doświadczalne do ustalenia LD50 (dawka letalna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna leczniczo dla 50% populacji). Stosunek pomiędzy efektami toksycznymi i terapeutycznymi stanowi wskaźnik terapeutyczny i może on być wyrażany jako stosunek LD50/ED50. Zalecane peptydy agonistyczne ApoA-I mają wysoki wskaźnik terapeutyczny.

5.3.3. Kompozycje farmaceutyczne

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają peptyd agonistyczny ApoA-I lub kompleks peptydo-lipidowy jako składnik aktywny w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku odpowiednim do podawania i dostarczania in vivo. Ponieważ peptydy mogą zawierać kwaśne i/lub zasadowe końce i/lub łańcuchy boczne, peptydy mogą być zawarte w kompozycjach bądź w postaci wolnych zasad lub kwasów, bądź w postaci farmaceutycznie akceptowalnych soli.

Preparaty do wstrzykiwania obejmują sterylne zawiesiny, roztwory lub emulsje składników aktywnych w nośnikach wodnych lub oleistych. Kompozycje mogą również zawierać środki do wytwarzania mieszanin, takie jak czynniki do zawieszania, stabilizujące i/lub rozpraszające. Kompozycje do zastrzyków mogą być dostarczane w postaci pojedynczej dawki np. w ampułkach lub w wieloporcjowych pojemnikach, a także mogą zawierać dodatek środków konserwujących.

Alternatywnie, kompozycje do zastrzyków mogą być dostarczane w postaci proszku, rekonstytuowanego przed użyciem w odpowiednim nośniku, obejmującym między innymi sterylną, wolną od pirogenu wodę, bufor, roztwór dekstrozy, itd. Przechowywane preparaty można stosować w postaci pojedynczej dawki, rekonstytuowanej przed zastosowaniem in vivo.

Do przedłużonego dostarczania, składnik aktywny może być przygotowany jako depot, do podawania poprzez wszczepienie; np. wstrzyknięcia podskórne, śródskórne lub domięśniowe. A zatem, przykładowo, składnik aktywny może być zmieszany z odpowiednim materiałem polimerycznym lub hydrofobowym (np. jako emulsja w akceptowalnym oleju) lub żywicy jonowymiennej, albo jako wolno rozpuszczalne pochodne; np. jako wolno rozpuszczalne sole agonisty ApoA-I.

Alternatywnie, można zastosować przezskórne systemy dostarczania wyprodukowane jako samoprzylepne krążki lub plastry, które powoli uwalniają składnik aktywny do przezskórnej absorpcji. W tym przypadku można zastosować wzmacniacze przepuszczalności dla ułatwienia penetracji przezskórnej aktywnego składnika. Szczególne korzyści można uzyskać przy włączeniu agonistów ApoA-I

PL 196 676 B1 według wynalazku lub kompleksu peptydowo-lipidowego do plastrów nitroglicerynowych przy stosowaniu u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca i hipercholesterolemią.

Przy podawaniu doustnym, kompozycja farmaceutyczna może mieć postać na przykład tabletek lub kapsułek przygotowywanych w konwencjonalny sposób z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, takim jak czynniki wiążące (np. wstępnie przekształcona w żel skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon lub metyloceluloza hydroksypropylowa); wypełniacze (np. laktoza, celuloza mikrokrystaliczna lub wodorofosforan wapnia); smary (np. stearynian magnezowy, talk lub krzemionka) środki rozpraszające (np. skrobia ziemniaczana lub sodowy glikolan skrobiowy); lub czynniki zwilżające (np. sodowy siarczan laurylowy). Tabletki mogą być powlekane metodami znanymi w tej dziedzinie. Preparaty płynne do podawania doustnie mogą mieć na przykład postać roztworów, syropów lub zawiesin albo mogą występować w postaci produktów stałych do rekonstytuowania wodą lub innym odpowiednim nośnikiem przed użyciem. Takie preparaty płynne mogą być przygotowywane konwencjonalnymi sposobami z zastosowaniem farmaceutycznie akceptowalnych dodatków, takich jak środki do zawieszania (syrop sorbitolowy, pochodne celulozy lub utwardzone tłuszcze jadalne), środki emulgujące (np. lecytyna lub akacja); nośniki nie-wodne (np. olej migdałowy, estry oleiste, alkohol etylowy lub frakcjonowane oleje roślinne) oraz środki konserwujące (np. metylo- i propylo-p-hydroksybenzoesany lub kwas sorbowy). Preparaty mogą zawierać również jeśli trzeba, sole buforujące, środki smakowe, barwiące i słodzące. Preparaty do podawania doustnego mogą być odpowiednio sporządzone do uzyskiwania kontrolowanego uwalniania się związku aktywnego.

Przy podawaniu policzkowym, kompozycje mogą mieć postać tabletek lub pastylek do ssania sporządzonych w konwencjonalny sposób. Przy podawaniu drogą doodbytniczą lub dopochwową, składnik aktywny może być przygotowany jako roztwór (do lewatyw), czopki lub maści.

Do podawania poprzez inhalację, aktywny składnik może być konwencjonalnie dostarczany w postaci aerozolu z pojemników pod ciśnieniem lub rozpylacza z zastosowaniem odpowiednich propelentów np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluorometanu, dwutlenku węgla i innych odpowiednich gazów. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem pojedyncza dawka może być określana poprzez użycie zaworu w celu dostarczenie odmierzonej ilości. Można sporządzić kapsułki lub pojemniki np. żelatynowe do zastosowania w inhalatorze lub insuflatorze zawierające sproszkowaną mieszaninę związków w odpowiednim sproszkowanym podłożu, takim jak laktoza lub skrobia.

Kompozycje mogą, jeżeli to pożądane, opakowaniu lub dozowniku, które mogą zawierać jedną lub więcej pojedynczych dawek składnika aktywnego. Opakowanie może przykładowo zawierać folię metalową lub plastykową, tak jak w standardowych opakowaniach powlekanych folią. Opakowanie lub dozownik mogą zawierać instrukcję stosowania.

5.4. Inne zastosowania

Agonistów ApoA-I według wynalazku można stosować w testach in vitro do mierzenia HDL w surowicy, np. dla celów diagnostycznych. Ponieważ agoniści ApoA-I wiążą się ze składnikiem HDL surowicy, agonistów można zastosować jako markery dla populacji HDL. Ponadto, agonistów można zastosować jako markery dla podpopulacji HDL, która jest skuteczna w RTC. W tym przypadku, agonistów można dodawać lub mieszać z próbką surowicy pacjenta; po odpowiednim czasie inkubacji, składnik HDL można testować poprzez wykrywanie włączonego agonisty ApoA-I. Można tego dokonać przy zastosowaniu wyznakowanych agonistów (np. znacznikami radioaktywnymi, znacznikami fluorescencyjnymi, znacznikami enzymatycznymi, barwnikami, itd.) lub poprzez testy immunologiczne przy zastosowaniu przeciwciał (lub fragmentów przeciwciał) swoistych wobec agonisty.

Alternatywnie, wyznakowanych agonistów można zastosować w procedurach obrazujących (np. skanach CAT, skanach MRI) do uwidaczniania układu krążenia lub śledzenia RCT albo do uwidaczniania akumulacji HDL w pręgach tłuszczowych, uszkodzeniach miażdżycowych, itd. (tam gdzie HDL powinien być aktywny w wypływie cholesterolu).

6. Przykład: Synteza peptydu agonistycznego ApoA-I

Peptydy opisane w tabeli X (Część 8.3, poniżej) zsyntetyzowano i scharakteryzowano, jak opisano w paragrafach poniżej. Peptydy analizowano również strukturalnie i funkcjonalnie, tak jak opisano w Części 7 i 8, poniżej.

6.1. Synteza peptydów rdzeniowych

Peptydy syntetyzowano na fazie stałej zgodnie z techniką Merrifield (Merrifield, 1969, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154) przy zastosowaniu 0,25 mmol złoża ρ-alkoksybenzyloalkoholowego (złoże HMP) (Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:1328-1333) i reakcji chemicznej Fmoc. Wszystkie syntezy

PL 196 676 B1 przeprowadzono w automatycznym syntetyzatorze peptydów Applied Biosystems ABI model 430A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Czasy solwatacji i aktywacji stosowane w każdym cyklu łączenia są pokazane w tabeli V poniżej:

T a b e l a V

Pojedyncze cykle aktywatora sprzęgającego

Nazwa cyklu	Zamierzone aminokwasy	Rozcieńczalnik	Czas	Czas aktywacji	Czas przenoszenia
afmc 31	Asn (trt), His (trt), Lys (Boc), Trp	-0,4 ml DCM ~1,2 ml NMP ~1,0 ml HOBt/NMP	~7 min	~51 min	1=50 sek. 2=36 sek.
afmc 32	Arg (Pmc), Gln (trt), Aib	~0,8 ml DCM ~1,2 ml NMP ~1,0ml HOBt/NMP	~32 min	~51 min	1=60 sek. 2=40 sek.
afmc 33	Ala, Asp (OtBu), Glu (OtBu), Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro	~0,4 ml DCM ~0,8 ml NMP ~0,1 ml HOBt/NMP	~4 min	~36,5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
afmc 34	Val	~0,4 ml DCM -0,8 ml NMP ~0,1 ml HOBt/NMP	~4 min	-61,5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
* 1=przeniesienie z wkładki do aktywatora. 2= przeniesienie z aktywatora do wkładki.
DCC to dicykloheksylokarbodiimid, BOC to t-butylooksykarbonyl HOBT to 1-hydroksybenzortiazol, Pmc to pentametylochromano-6-sulfonyl, NMP to N-metylopirolidon, OtBu to t-butylo ester, trt to trityl

Złoża przemywano NMP pomiędzy każdym kolejnym etapem łączenia. Protokół dla jednego cyklu syntezy jest pokazany poniżej w tabeli VI:

T a b e l a VI

Protokół łączenia dla jednego cyklu syntezy

Operacja	Czas (min)
1. Odblokowanie (10% piperydyna w NMP)	20
2. Przemywanie (NMP)	5
3. Łączenie (4 równoważniki estru Fmoc-aminokwas-HOBT w NMP, aktywowanego wstępnie przez 50 min)	61
4. Przemywanie	3
5. Próbka złoża (ewentualnie)	3
Całkowity	92

PL 196 676 B1

Wszystkie aminokwasy z wyjątkiem Fmoc-e-(1-naftylo)alaniny były dołączane w taki sposób. Fmoc-e-(1-naftylo)alanina była dołączana ręcznie. W przypadku dołączania ręcznego, 1 mmol Fmoc-β-(1 -naftylo)alaniny i 1 mmol tetrafluoroboranu 2-(1H-benzotriazolo-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego (TBTU) rozpuszczano w 5 ml NMP i mieszano z peptydem-złożem.

Następnie dodawano 2 mmol N-etylodiizopropyloaminy, mieszaninę wytrząsano przez 2 godziny i peptyd-złoże przemywano 6-krotnie 10 ml NMP. Wydajność łączenia śledzono przy zastosowaniu testu Kaiser (Kaiser, 1970, Anal. Biochem. 34:59577) i jeżeli bylo trzeba łączenie powtarzano. Po przyłączeniu naftyloalaniny, pozostałą syntezę przeprowadzano automatycznie tak, jak opisano powyżej.

6.2. Synteza amidów peptydów

Tam gdzie wskazano w tabeli X (Część 8.3, poniżej), syntetyzowano amidy peptydów przy zastosowaniu złoża amidowego Rink zawierającego ramię amidowe Fmoc-Rink 4-(2',4'-dimetylofenylo)-Fmoc-fenoksymetyl (Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787-3790) oraz protokołów syntezy opisanych w Części 6.1, powyżej).

6.3. Synteza peptydów acylowanych na końcu N

Tam gdzie wskazano w tabeli X (Część 8.3, poniżej), wytwarzano formy peptydów acylowane na końcu N poprzez poddanie peptydu związanego z żywicą, przygotowanego tak, jak opisano w Części 6.1 lub 6.2, powyżej, działaniu odpowiedniego czynnika acylującego.

W przypadku peptydów acetylowanych na końcu N, dodawano 15 ml roztworu bezwodnika octowego (10% obj./obj. w NMP) na każdy 1 g peptydu związanego ze złożem, mieszaninę wytrząsano przez 5 min i złoże odzyskiwano poprzez filtrowanie. Odzyskane złoże przemywano trzykrotnie NMP (15 ml) i trzykrotnie etanolem (15 ml).

6.4. Cięcie i odblokowywanie

Po syntezie, peptydy opisane w Częściach 6.1, 6.2 i 6.3, powyżej, odcinano od złoża i odblokowywano roztworem przeprowadzającym cięcie, zawierającym 92,5% kwas trifluorooctowy (TFA)/3,75% anisol/3,75% dodekantiol (obj./obj./obj.). Aby uzyskać cięcie, 10 ml roztworu do cięcia dodawano do 0,25 mmol peptydu na złożu i mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Złoże usuwano poprzez filtrowanie i cięty/odblokowany peptyd wytrącano eterem dietylowym, przemywano eterem i suszono pod próżnią.

Mieszanina do odcinania peptydów zawierających Trp (W), jak również amidów peptydów składała się z 86,5% TFA, 4,5% H2O, 4,5% 1,2-etylenoditiolu, 4,5% anisolu i 3% fenolu.

6.5. Oczyszczanie

Surowe, odcięte peptydy z Części 6,4 oczyszczano poprzez HPLC z odwróconymi fazami. Czystość każdego z peptydów potwierdzano przy zastosowaniu różnych technik analitycznych (analityczny HPLC, elektroforeza kapilarna). Elektroforezę kapilarną przeprowadzano w połączonych krzemionkowych kapilarach o długości 70 cm i średnicy wewnętrznej 75 μm (Thermo Separation Products). Rozdział przeprowadzono w 25°C, 15 kV, czas rozdziału 35 min, w dwóch różnych układach buforowych: Bufor 1 (20 mM Na2B4O7, pH 9,2) i Bufor 2 (10 mM Na2HPO4, pH 2,5). Rozdziały HPLC przeprowadzano na kolumnach Nucleosil 7C18 lub Nucleosil 7C4 (Macherey and Nagel, Niemcy), 250 x 21 mm, przy szybkości przepływu 8 ml/min. Zastosowano gradient wymywania przy użyciu mieszaniny 0,1% TFA w wodzie (Rozpuszczalnik A) i 0,1% TFA w acetonitrylu (Rozpuszczalnik B). Stosowane gradienty dopasowywano dla potrzeb każdego z peptydów.

6.6. Charakteryzowanie

Analizę masy i aminokwasów oczyszczonych peptydów opisanych w Części 6.5 potwierdzono, odpowiednio, poprzez spektrometrię mas i analizę aminokwasów, jak opisano poniżej. Degradację Edmana zastosowano do sekwencjonowania.

6.6.1. LC-MS

Do określenia masy zastosowano standardowy dostępny handlowo trzystopniowy kwadrupolowy spektrometr masowy (model TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA). Wytwarzaną pneumatycznie granicę faz elektorozpylania (ESI) stosowano do wprowadzania próbki do źródła jonizacji przy ciśnieniu atmosferycznym w spektrometrze masowym. Rozpryskiwacz przystawki działał przy potencjale dodatnim 4,5 kV. Temperatura kapilary stalowej była utrzymywana na poziomie 200°C, podczas gdy temperatura wydechu wynosiła 70°C. Jony dodatnie wytwarzane w tym procesie parowania jonowego wchodziły do analizatora spektrometru masowego. Wzmacniacz nastawiano na 1000 V. Przedział analizatora w spektrometrze mas był 4E-6. Wykrywanie przeprowadzano przy rozdzielczości < 1 u.

Peptydy analizowano poprzez bezpośrednie wprowadzanie oczyszczonych peptydów przy zastosowaniu systemu mikrodozownika ABI (Applied Biosystems), składającego się z pompki strzykaw48

PL 196 676 B1 kowej (model 140B), detektora UV (model 785A) i pieca/wtryskiwacza (model 112A). System rozpuszczalników składał się z wody (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B), każdy zawierający 0,1% TFA. Peptydy wprowadzano przy zastosowaniu bądź gradientu, bądź warunków izokratycznych i wymywano z kolumny Aquapore C18. Szybkość przepływu wynosiła zazwyczaj 300 μ^^ Stężenie każdego peptydu wynosiło około 0,03 mg/ml, z czego wstrzykiwano 20 μl (np. 30 pmol).

Doświadczenia z pełnym skanem MS przeprowadzono poprzez skanowanie kwadrupola 1 z m/z 500-1500 w ciągu 4 sek. Dane zbierano przy zastosowaniu stacji Alfa DEC i opracowywano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez Finnigan MAT (BIOWORKS).

6.6.2. Analiza aminokwasów

Analizę aminokwasów przeprowadzono w analizatorze aminokwasów ABI (Applied Biosystems) 420 Amino Acid Analyser. System ten składa się z trzech modułów: urządzenia do hydrolizy i otrzymywania pochodnych, HPLC z odwróconymi fazami i systemu zbierania danych. Próbkę peptydu nanoszono (3 razy w trzech powtórzeniach) na porowate szkiełko szklane, a następnie hydrolizowano w warunkach fazy gazowej (155°C, 90 min). Po usunięciu HCl, otrzymane aminokwasy przekształcano w PTCAA (fenylotiokarbamoioloaminokwasy) przy zastosowaniu PITC (fenyloizotiocyjanianu). Po przeniesieniu na pętlę do nanoszenia próbek w HPC otrzymane mieszaniny frakcjonowano na kolumnie Aquapore C18 przy zastosowaniu trybu gradientowego (Rozpuszczalnik A: 50 mmol octan amonu (NH4Ac), pH 5,4, w wodzie; Rozpuszczalnik B: 32 mmol octan sodu (NaOAc) w wodnym acetonitrylu) w warunkach kontrolowanej temperatury. Dane z HPLC przetwarzano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez Applied Biosystems. Ocenę ilościową przeprowadzono względem standardu, peptydowego dostarczonego przez Applied Biosystems.

6.7. Synteza rozgałęzionych sieci

Złoże z tetramerowym rdzeniem peptydowym i trimerowym rdzeniem peptydowym syntetyzowano tak, jak opisano w Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74-84. Tetramerową i trimerową matrycę rdzeniową nadal połączoną ze złożem benzohydryloaminowym użyto następnie jako wyjściowe złoże peptydylowe do automatycznej syntezy rdzeniowych peptydów, jak opisano wcześniej.

Rozgałęzione sieci zawierające helikalne fragmenty różnych kompozycji aminokwasowych można syntetyzować przy zastosowaniu syntezy ortogonalnej i strategii blokowania dobrze znanej w tej dziedzinie.

7. Przykład: Analiza strukturalna peptydów ApoA-I i badanie ich wiązania się z lipidami

Charakterystykę strukturalną i wiązanie się z lipidami oczyszczonych peptydów zsyntetyzowanych tak, jak opisano w Części 6, powyżej, określono poprzez dichroizm kołowy (CD), spektroskopię fluorescencyjną i jądrowy rezonans magnetyczny (NMR).

7.1. Dichroizm kołowy

Przykład ten opisuje zalecaną metodę określania stopnia helikalności rdzeniowych peptydów tu opisanych, zarówno wolnych w buforze, jak i w obecności lipidów.

7.1.1. Metoda doświadczalna

Widma dichroizmu kołowego w dalekim UV mierzono pomiędzy 190 a 260 nm (co 0,5 nm lub 0,2 nm) przy zastosowaniu spektrometru AVIV62DS (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA) wyposażonego w termoelektryczny statyw do kuwet i zmiennik próbek. Urządzenie bylo kalibrowane (+)-10-kwasem kamforowym. Dla każdej próbki wykonywano od jednego do trzech skanów przy zastosowaniu kwarcowych kuwet Suprasil o długości toru 10 cm, 5 cm, 1 cm i 0,1 cm dla stężeń peptydów, odpowiednio, od 10^-7 do 10^-4M. Szerokość pasma była ustalona na 1,5 nm, a szybkość skanowania 1 sek. na skok długości fali. Przedstawione dane stanowią średnią z co najmniej 2 lub 3 niezależnych pomiarów.

Po odjęciu tła, widma przekształcano na eliptyczność molową (θ) na resztę w stopniach cm'²-dmor¹. Stężenie peptydu oznaczano poprzez analizę aminokwasów, a także poprzez spektrometrię absorpcyjną w spektrofotometrze UV/Światło widzialne Perkin Elmer Lambda 17 wówczas, gdy peptyd zawierał chromofor (tryptofan, dansyl, naftyloalaninę).

Widma CD otrzymywano dla wolnego, niezwiązanego peptydu (5 μM w 5 mM buforze fosforanowym, pH 7,4); dla kompleksów peptyd-SUV (20:1 EPC:Chol., Ri=30 oraz Ri=50); dla kompleksów peptyd-micella (1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Ri=100); oraz dla wolnego, niezwiązanego peptydu w obecności 2,2,2-trifluoroetenolu (TFE) (5 μM peptyd, 90% obj. TFE).

PL 196 676 B1

SUV otrzymywano poprzez dyspersję lipidów (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min, a następnie sonifikację (1,5 godz.) w sonifikatorze wannowym. Homogenność preparatu sprawdzano poprzez FPLC.

Micelle otrzymywano poprzez rozproszenie lipidu (6 mM 1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Avanti Polar Lipids, AL.) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min, a następnie mieszanie na worteksie.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-SUV, SUV dodawano do peptydu (5 μM w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy stosunku molowym fosfolipid-peptyd (Ri) wynoszącym od 30 do 50.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-micella, micelle dodawano do peptydu (5 μM w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy Ri wynoszącym 100.

Wszystkie widma mierzono w 37°C.

7.1.2. Określenie helikalności

Stopień helikalności peptydów w różnych warunkach określano ze średniej eliptyczności reszt przy 222 nm (Chen i wsp., 1974, Biochemistry 13: 3350-3359) albo przez porównywanie otrzymanych widm CD z widmami odnośnikowymi dostępnymi w bazach danych) (16 odnośnikowych widm helikalnych z Provencher and Glocner, 1981, Biochemistry 20:33-37; widma odnośnikowe dla zdenaturowanych białek z Venyaminov i wsp., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24) przy zastosowaniu algorytmu dla dopasowania krzywej CONTIN wersja 2DP, zestaw CD-1 (Sierpień, 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27:213-227, 229-242). Akceptowalne dopasowanie uzyskiwano przy zastosowa niu metod statystycznych dostarczonych w algorytmie CONTIN. Błąd wszystkich metod wynosił 5% helikalności.

Peptyd 146 (SEQ ID NO:146) wykazuje bardzo duży poziom α-helikalności (86% helikalności) w buforze przy stężeniu 5 μM. Helikalność peptydu 146 (SEQ ID NO: 146) wzrastała w obecności zarówno SUV (100% helikalności), jak i micelli (100% helikalności), a także w obecności TFE (95% helikalności), będącego rozpuszczalnikiem, który dzięki znacząco niższej stałej diaelektrycznej (ε=26,7) niż woda (ε=78,4), stabilizu je α-helisy i wewnątrzpeptydowe wiązania wodorowe przy stężeniach pomiędzy 5 a 90% (obj./obj.)

Odnosząc się do tabeli X, Część 8,3, poniżej, można dostrzec, że peptydy, które wykazują wysoki poziom aktywacji LCAT (>38%) na ogół posiadają wyraźną strukturę α-helikalną w.obecności lipidów (>60% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej aminokwasów lub zablokowanych polipeptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów; > 40% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów), podczas, gdy peptydy, które wykazują niewielką albo brak aktywacji LCAT mają niewielki udział struktury α-helikalnej. Jednakże w niektórych przypadkach, peptydy, które zawierają wyraźną strukturę α-helikalną w obecności lipidów, nie wykazują znaczącej aktywacji LCAT. W konsekwencji, zdolność peptydów rdzeniowych tu opisanych do przyjmowania struktury α-helikalnej w obecności lipidów jest uważana za krytyczną właściwość peptydów rdzeniowych tu opisanych, ponieważ zdolność do tworzenia α-helisy w obecności lipidów wydaje się być niezbędna do aktywacji LCAT.

7.2. Spektroskopia fluorescencyjna

Właściwości wiązania lipidów dla peptydów syntetyzowanych w Części 6, powyżej, testowano poprzez pomiary fluorescencji przy użyciu wyznakowanych peptydów, w tym przypadku tryptofanu (Trp lub W) albo naftyloalaniny (Nal). Widma fluorescencji mierzono we Fluoromax ze Spex (JobinYvon) wyposażonym w lampę Xenon 150 W, dwa monochtromatory (wzbudzenia i emisji), fotopowielacz R-928 do wykrywania czułego na czerwień do 850 mm i termoelektryczny statyw do kuwet z mieszadłem magnetycznym. Do pomiarów w mikromolarnym zakresie stężeń stosowano kwarcowe kuwety Suprasil. Przystawka ze zmiennymi szczelinami (od 0,4 do 5 nm) umożliwia modulowanie wchodzących i emitowanych intensywności w zależności od stężenia zastosowanego peptydu. Przedstawione wartości są na ogół średnią z 2 do 4 widm. Stężenie peptydu określa się poprzez spektrometrię absorpcyjną przy użyciu Philips PU 8800 stosując pasmo absorpcji Trp (ε280 nm=5,550 M^-1cm^-1 w buforze Tris) lub Nal (ε280 nm=5,550 M^-1 cm^-1 w metanolu).

Widma fluorescencyjne peptydów mierzono w zakresie od 290 nm do 450 nm w buforze TrisHCl (20 mM, pH=7,5) w obecności lub nieobecności pęcherzyków lipidowych. Małe jednowarstwowe pęcherzyki wytwarzano po uwodnieniu zliofilizowanych fosfolipidów w buforze, rozproszeniu i sonifikacji z użyciem końcówki w strumieniu N2. Stosowanymi lipidami były PC z jaja/Chol. (20:1) bądź POPC/Chol. (20:1). Widma mierzono przy stężeniu peptydów 2 μM w temperaturze 37°C. Standardem fluorescencyjnym w przypadku Trp był N-acetylotryptofanyloamid (NATA).

PL 196 676 B1

Badania wiązania lipidów przeprowadzono dodając stopniowo pęcherzyki lipidowe do roztworu peptydu o stężeniu 2 μM (szczeliny: 5 nm dla wzbudzenia i 1,5 nm dla emisji). Efekty rozcieńczenia brano pod uwagę przy określaniu intensywności fluorescencji. Stężenia lipidów wahały się od 10 do 600 μM, a stosunek molowy lipidu do peptydu zmieniał się w zakresie od 5 do 300. Długość fali wzbudzenia ustawiano na 280 nm zarówno dla Trp, jak i Nal.

7.2.1. Analiza widm fluorescencyjnych

Dane zbierano bezpośrednio i poddawano analizie na IBM-PC połączonym ze spektrofluorometrem przy użyciu oprogramowa nia DM3000F ze Spex. Widma były korygowane poprzez odjęcie udziału rozpuszczalnika i poprzez zastosowanie współczynnika podanego przez konstruktora, uwzględniającego zróżnicowanie w odpowiedzi fotopowielacza w zależności do długości fali.

Widma fluorescencyjne peptydów charakteryzowano poprzez długość fali przy maksimum emisji fluorescencji i ich wydajność kwantową w porównaniu do NATA w przypadku peptydów wyznakowanych tryptofanem. Proces wiązania się do lipidów ana lizowano poprzez obliczenie przesunięcia długości fali przy maksimum emisji fluorescencji, (X_max), oraz różnic względnej intensywności emisji fluorescencji w zależności od stężenia lipidu. Względna intensywność fluorescencji jest zdefiniowana jako następujący stosunek: (I-Iokma_X/IoA.ma_X. Zarówno I jak i I₀ są mierzone w przy (X_max), co odpowiada wyjściowemu wolnemu stanowi peptydu, tj. bez lipidów. I odpowiada intensywności dla określonego stosunku lipidu do peptydu, a I0 jest tym samym parametrem mierzonym w nieobecności lipidów. Brak tych różnic oznacza brak oddziaływań peptydów z lipidami.

7.2.2. Wyniki i dyskusja

Właściwości wiążące lipidy peptydu 149 (PVLELFENLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO:149), którego pierwszorzędowa sekwencja jest podobna do sekwencji peptydu 146 (SEQ ID NO:146), z tą różnicą, że zawiera resztę W (Trp) w pozycji 10, są przedstawione w tabeli VII.

T a b e l a VII

Właściwości wiążące peptydu 149 (SEQ ID NO:149) do pęcherzyków lipidowych na podstawie pomiaru fluorescencji

Lipid: Peptyd Stosunek molowy (Ri)	I/Io	^(nm)
0,0	0,0	347,0
5,0	19,7	334,5
10,0	31,4	329,0
30,0	49,4	325,5
60,0	64,3	325,0
100,0	77,0	325,5
200,0	84,0	325,0

W buforze przy stężeniu 2 μm, maksimum emisji fluorescencji ^_max) dla tryptofanu w przypadku peptydu 149 (SEQ ID NO:149) wynosi 347 nm. Odpowiada to tryptofanowi, który jest względnie wystawiony na działanie środowiska wodnego w porównaniu do NATA ^_max=350 nm). Peptyd 149 (SEQ ID NO: 149) wiąże się bardzo wydajnie z małymi jednowarstwowymi pęcherzykami EPC/Chol (20:1) jak wykazano przez chowanie tryptofanu (długość fali dla maksimum emisji fluorescencji przesuwa się z 347 nm do 325 nm) i wysoką egzaltację intensywności fluorescencji (patrz tabela VII). Chowanie reszty tryptofanowej jest maksymalne przy stosunku molowym lipidu do peptydu wynoszącym około 30. Inne peptydy, które wykazywały wysoki poziom helikalności w obecności lipidów (>60% dla peptydów niezablokowanych o długości 22 aminokwasów lub peptydów zablokowanych o długości <18 aminokwasów; >40% dla peptydów niezablokowanych o długości <18 aminokwasów), co zmierzono poprzez dichroizm kołowy, jak ujawniono w Części 7.1, powyżej, również wykazywały dobre wiązanie lipidów. Oczywiście, wśród wszystkich peptydów wybranych na podstawie dichroizmu kołowego, jedynie te, dla których można bylo obserwować fluorescencję, były testowane pod kątem właściwości wiązania lipidów.

PL 196 676 B1

7.3. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)

Przykład ten opisuje metodę NMR do analizowania struktury peptydów rdzeniowych tu opisanych.

7.3.1. Przygotowanie próbek do NMR

Próbki przygotowywano poprzez rozpuszczenie 5 mg peptydu w roztworze 90% H2O/10% D2O zawierającym śladowe ilości sulfonianu 2,2-dimetylo-2-sila-5-pentanowego (DSS) będącego wewnętrznym odnośnikiem dla przesunięcia chemicznego. Niektóre próbki zawierały trifluoroetanol (TFE) (wyrażony jako % obj.). Całkowita objętość próbki wynosiła 500 gl, a stężenie peptydu wynosiło około 5 mM.

7.3.2. Spektroskopia NMR

Widma ¹H NMR zostały zebrane przy częstotliwości podstawowej 500 MHz za pomocą spektrometru Bruker DRX500, wyposażonego w jednostkę kontroli temperatury B- VT2000. Eksperymenty jedno- i dwuwymiarowe zostały wykonane z zastosowaniem standardowych sekwencji pulsów (Two Dimentional NMR Spectroscopy, Wyd. W.R. Croasmun and Carlson, 1994, VCH Publishers, New York, USA). Supresja wody została uzyskana za pomocą presaturacji niskiej mocy w przeciągu 2 sek. Eksperymenty dwuwymiarowe przeprowadzono w trybie fazoczułym, stosując inkrementację fazy proporcjonalną do czasu (TPPI) oraz szerokość widmową 6000 Hz w obydwu wymiarach. Zazwyczaj sumowano 40 skanów dla każdego z 400 przyrostów t1, zawierających po 2048 punktów danych. Przetwarzanie danych wykonano za pomocą oprogramowania Felix95 (Molecular Simulation) na stacji roboczej INDIG02 (Silicon Graphics). Dane zostały dopełnione zerami do macierzy 2K x 2K i apodyzowane za pomocą kwadratowej funkcji sinusowo-dzwonowej przesuniętej o 45 stopni.

7.3.3. Przypisanie widm NMR

Całkowite przypisanie rezonansów protonów uzyskano dzięki zastosowaniu techniki przypisania sekwencyjnego z użyciem widm DQFCOSY, TOCSY i NOESY, zgodnie z opisem literaturowym (Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986, John Wiley and Sons, New York, USA). Drugorzędowe przesunięcia chemiczne obliczono dla protonów HN i Ηα przez odjęcie stabularyzowanych przesunięć chemicznych dla kłębka statystycznego (Wishart and Sykes, 1994, Method. Enz. 239:363-392) od odpowiadających wartości eksperymentalnych.

7.3.4. Wyniki i dyskusja

Ogólne uwarunkowania. Alifatyczne helikalne peptydy mają tendencję do agregowania w roztworach wodnych w wysokich stężeniach niezbędnych do przeprowadzenia spektroskopii NMR, co utrudnia otrzymanie widma o dużej rozdzielczości. Przykładowo, widmo NMR przykładowego peptydu rdzeniowego 146 (SEQ ID NO:146) w wodzie daje bardzo szerokie linie. A zatem nie można rozdzielić rezonansów dla każdej z reszt aminokwasowych. Dodatek TFE do próbki zwiększa rozdzielczość widma. Wiadomo, że TFE solubilizuje peptydy, a ponadto stabilizuje konformację helikalną peptydów mających tendencję do przyjmowania struktury helikalnej. Obserwacje ze spektroskopii NMR są przedstawione dla peptydu 146 (SEQ ID NO:146) jako reprezentatywny przykład. 22-mer o największej zgodności wg Segresta (SEQ ID NO:75) był analizowany dla porównania.

Drugorzędowe przesunięcia chemiczne. Przesunięcia chemiczne protonów w aminokwasach zależą zarówno od typu reszty, jak i lokalnej struktury drugorzędowej w obrębie peptydu lub białka (Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443). A zatem możliwa jest identyfikacja regularnej struktury drugorzędowej poprzez porównanie przesunięć eksperymentalnych ze stabularyzowanymi wartościami dla konformacji kłębka statystycznego.

Tworzenie się α-helisy zazwyczaj prowadzi do przesunięcia w górę pola (ujemnego) dla rezonansu Ηα. Obserwacje przesunięcia w górę pola Ηα dla kilku kolejnych reszt zazwyczaj uważa się za dowód występowania struktury helikalnej. Drugorzędowe przesunięcia Ηα dla peptydu 146 (SEQ ID NO):146) w 25% TFE przy 295K wykazują ujemne przesunięcie dla reszt od 4 do 19 (fig. 8A), wskazując na wysoce helikalną konformację.

Przesunięcia chemiczne wodorów w amidzie reszt aminokwasowych występujących w regionach α-helisy są również przesunięte w górę pola w stosunku do przesunięcia chemicznego obserwowanego dla kłębka statystycznego. Ponadto, można zaobserwować periodyczność przesunięcia HN, odzwierciedlającą okres skrętów helisy. Amplituda zmian przesunięcia wzdłuż sekwencji ma związek z amfipatycznością helikalnego peptydu. Wyższy moment hydrofobowości prowadzi do zwiększonej oscylacji (Zhou i wsp., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:4320-4326). Drugorzędowe przesunięcie HN dla peptydu 146 (SEQ ID NO):146) w 25% TFE przy 295K wykazuje oscylację, co jest zgodne z amfipatyczną naturą helisy (fig. 8B).

PL 196 676 B1

Zamiana aminokwasowa prowadzi do bardziej widocznej periodyczności wzdłuż całej sekwencji (fig. 8B). Wzór wyraźnie odzwierciedla silniejszą naturę amfipatyczną peptydu 146 (SEQ ID NO:146) w porównaniu do 22-meru o największej zgodności wg Segresta (SEQ ID NO:75). Na fig. 8C, rozkład aminokwasów w idealnej α-helisie, gdzie reszty hydrofobowe są zakreskowane, a reszty hydrofilowe są przedstawione jako otwarte kółka, jest naniesiony na wykres łącznie z drugorzędowym przesunieciem chemicznym protonu amidu dla peptydu 146 (SEQ ID NO:146). Wartości doświadczalne są połączone ciągłą linią dla przejrzystości. Przesunięcia NMR wyznaczają strukturę helikalną, a obecność skrętów 5-6 może podlegać dyskusji.

Na drugorzędowe przesunięcie chemiczne protonu amidu ma wpływ długość wiązania między wodorem, a tlenem reszty karbonylowej w odległości jednego skrętu helisy. A zatem periodyczność wartości obserwowanego przesunięcia chemicznego odzwierciedla różnice w długości wiązania wodorowego. Różnica ta jest związana z zakrzywionym spiralnym kształtem szkieletu helisy. Reszty hydrofobowe są umiejscowione po stronie wklęsłej. Drugorzędowe przesunięcia chemiczne dla peptydu 146 (SEQ ID NO:146) wskazują na zakrzywioną konformację α-helikalną.

8. Przykład: Oznaczenie aktywacji LCAT

Peptydy syntetyzowane jak opisano w Części 6, powyżej, analizowano in vitro pod kątem ich zdolności do aktywacji LCAT. W teście LCAT, pęcherzyki będące substratem (małe jednowarstwowe pęcherzyki czyli SUV) złożone z fosfatydylocholiny jaja (EPC) lub 1-palmitoilo-2-oleilo-fosfatydylocholiny (POPC) i wyznakowanego radioaktywnie cholesterolu inkubowano wstępnie z równoważnymi masami każdego z peptydów lub peptydu ApoA-I (izolowanej z ludzkiego osocza). Reakcję zapoczątkowywano poprzez dodanie LCAT (oczyszczonej z ludzkiego osocza). Natywny ApoA-I, którą zastosowano jako kontrolę pozytywną, reprezentuje 100% aktywności aktywacyjnej. Aktywność specyficzną (tj. jednostki aktywności (aktywacja LCAT)/jednostki masy) peptydów można obliczyć jako stężenie peptydu, przy którym uzyskuje się maksimum aktywacji LCAT. Przykładowo, można przetestować serię stężeń peptydu (np. kolejne rozcieńczenia) w celu określenia aktywności specyficznej peptydu czyli stężenia, przy którym osiąga się maksymalną aktywację LCAT (tj. procent przekształcenia cholesterolu do estru cholesterolu) w konkretnym punkcie czasowym testu (np. 1 godz.). Po naniesieniu na wykres procentów przekształcenia cholesterolu po np. 1 godz., względem zastosowanego stężenia peptydu, można zidentyfikować aktywność specyficzną jako stężenie peptydu, przy którym uzyskuje się plateau na wykreślonej krzywej.

8.1. Otrzymywanie pęcherzyków stanowiących substrat

Pęcherzyki stosowane w teście LCAT są to SUV złożone z fosfatydylocholiny jaja (EPC) lub 1-palmitoilo-2-oleilo-fosfatydylocholiny (POPC) i cholesterolu w stosunku molowym 20:1. W celu przygotowania roztworu pęcherzyków wystarczającego na 40 testów 7,7 mg EPC (lub 7,6 mg POPC; 10 ąmoli), 78 ąg (0,2 ąmole) 4-¹⁴C-cholesterolu i 116 ąg cholesterolu (0,3 ąmoli) rozpuszcza się w 5 ml ksylenu i liofilizuje. Następnie do suchego proszku dodaje się 4 ml buforu testowego i sonifikuje w atmosferze azotu w 4°C. Warunki sonifikowania: sonifikator Branson 250, końcówka 10 mm, 6x5 minut; Bufor do testów: 10 mM Tris, 0, 14 M NaCl, 1 mmM EDTA, pH 7,4). Mieszaninę do sonifikacji wiruje się sześciokrotnie, każdorazowo przez 5 minut przy 14000 rpm (16000 x g) w celu usunięcia cząstek tytanu. Uzyskany klarowny roztwór jest stosowany w teście enzymatycznym.

8.2. Oczyszczanie LCAT

Do oczyszczania LCAT, używa się ludzkiego osocza traktowanego siarczanem dekstranu/Mg²⁺w celu uzyskania surowicy bez lipoproteiny (LPDS), którą następnie poddaje się chromatografii na złożach Phenylsepharose, Affigelblue, ConcanavalinA sepharose i chromatografii powinowactwa wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli IX, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania:

T a b e l a IX

Oczyszczanie LCAT

Frakcja	Objętość całkowita (ml)	Białko całkowite (mg)	Aktywność całkowita (nmol CE/mg*h)	Wydajność (%)	Oczyszczenie (stopień)
1	2	3	4	5	6
Osocze	550	44550	63706

PL 196 676 B1 cd. tab. IX

1	2	3	4	5	6
LPDS	500	31000	62620	98	1,4
Phenyl Sepharose	210	363	51909	82	100
Affigel Blue	95	153	25092	39	115
ConA Sepharose	43	36	11245	18	220
Powinowactwo Anty-A-I	120	3,5	5500	9	1109

8.2.1. Otrzymywanie LPDS

W celu przygotowania LPDS, 500 ml osocza dodaje się do 50 ml roztworu siarczanu dekstranu (MW=500000). Mieszać przez 20 minut. Zwirować przez 30 minut przy 3000 rpm (16000 x g) w 4°C. Użyć supernatantu (LPDS) do dalszego oczyszczania (około 500 ml).

8.2.2. Chromatografia na Phenylsepharose

Do chromatografii na Phenylsepharose użyte zostały następujące materiały i warunki, faza stała: Phenylsepharose z szybkim przepływem, o wysokiej czystości, Pharmacia kolumna: XK26/40, wysokość złoża: 33 cm, V=około 175 ml szybkość przepływu: 200 ml/godz. (próbka) przemywanie: 200 ml/ godz.(bufor) wymywanie: 80 ml/godz (woda destylowana) bufor: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7,4, 0/01% azydek sodu.

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris, dodać 29 g NaCl do 500 ml LPDS i nałożyć na kolumnę. Przemyć kilkoma objętościami buforu Tris do osiągnięcia dolnego poziomu absorpcji przy długości fali 280 nm, a następnie rozpocząć wymywanie wodą destylowaną. Frakcje zawierające białko są łączone (wielkość puli 180 ml) i użyte w chromatografii na Affigelblue.

8.2.3 Chromatografia na Affigelblue

Pulę frakcji z kolumny z Phenylsepharose dializuje się przez noc w 4°C wobec 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% azydku sodu. Objętość puli zmniejsza się poprzez ultrawirowanie (Amicon YM30) do 50-60 ml i nakłada na kolumnę Affigelblue.

faza stała: Affigelblue, Biorad, kolumna 153-7301, XK26/20, wysokość złoża: około 13 cm; objętość kolumny: około 70 ml. szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz.

przemywanie: 50 ml/godz.

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris. Nałożyć pulę frakcji z kolumny z Phenylsepharose. Równocześnie rozpocząć zbieranie frakcji. Przemyć buforem Tris. Zebrane frakcje (170 ml) użyto do chromatografii na ConA.

8.2.4. Chromatografia ConA

Objętość Puli z Affigelblue zmniejsza się przy zastosowaniu Amicon (YM30) do 30-40 ml i dializuje wobec wyjściowego buforu ConA (1 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2, 0,01% azydek sodu) przez noc w 4°C.

faza stała: ConA sepharose (Pharmacia) kolumna: XK26/20, wysokość złoża: 14 cm (75 ml) szybkość przepływu: nakładanie 40 ml/godz. przemywanie (wyjściowym buforem): 90 ml/ godz.

wymywanie: 50 ml/godz., 0,2 M metylo-a-D-mannozyd w 1 mM Tris, pH 7,4.

Frakcje białkowe wymywane mannozydem zbierano (110 ml) i objętość zmniejszano poprzez ultrafiltrację (YM30) do 44 ml. Pule ConA dzielono na porcje 2 ml, które przechowywano w -20°C.

8.2.5 Chromatografia powinowactwa anty-ApoA-I

Chromatografię powinowactwa anty-ApoA-I przeprowadzono na materiale Affigel-Hz (Biorad), do którego kowalencyjnie dołączono przeciwciała anty-ApoA-I.

kolumna: XK16/20, V=16 ml. Kolumna była zrównoważona PBS pH 7,4. Dwa ml puli ConA dializowano przez 2 godz. wobec

PL 196 676 B1

PBS przed nałożeniem na kolumnę.

Szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz., przemywanie:

(PBS) 40 ml/godz.

Zebrane frakcje białkowe (V=14 ml) użyto w testach LCAT.

Kolumnę regeneruje się 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 4,5) w celu wymycia związanej A-I (100 ml) i natychmiast po tej procedurze równoważy się ponownie PBS.

8.3 Wyniki

Wyniki testu aktywacji LCAT są przedstawione w tabeli X, poniżej.

5 « ίΜ 0 χ

«”> <η

V <η

cn os

m Γ-

m ίη

71

¢0 M?

, -g ο ^ω

rM co

ο C0

Γ- <η

ο t-

ŁH Ο

β W

ο Γ-

ο ca

ν' ΪΟ

χ; u >» ο

Ó? τ- ο -Η « S HM

ΙΛ co

ιη a

en en,

<η C0

Ό en

t* co

10 05

Ο ίο

Ω Ο Μ Ό u £ Ό

-- >, α '“‘•β *g X *

¢- r·

ο >

ο co

> &Λ

r* t-

ο ri

ο \0

Ο C

ΙΛ ΙΛ

Ό · β α φ & & υ

<Χ «οιΗ β >M^

ιΛ» Ο 03 β

Λ® ιη ο β

&> CD en.

<Λ“ η en

ο\0 ο α\

*5® O 03

«#> η C0

<»> Π co^:

•»w Γ*> co

«Λ® 05 Γ>

«6.» ri !>

Β’ί» Ω' Ι~

ϊΛ® r- «>

JP β 50

ώρ Ω 50

—; e>® 05 ιΛ

05 Ι_Π

S R5 •Μ Λί > W Μ ft Π3 ”0 . £~ι < U β ίϋ X ·η Ο sC ίΰ β Ś W > ca β . Λ5 . Η <

β ⁴δ 03 ££ ο ί£ (β < y ω εε X ω to

}£ β X θ' χ β ί\1 a β β ω 2 3 β ω χ &Μ β ά ►4 > Ck

X X β X Ο X β < to' β 3 ω ζ β 3 οι ci &4 :Ω β J> ϋ

X β X Ο Χ β 3 ω β β •μ ζ β β κι X to β Ω β > X

X β X Ο’ X β < Μ β β to 3 β W pi to β Ω β > α

X X β X Ο SĆ β < Μ β β ω § β to to β ί 0Μ

X β X o hi β < W β X to 2 β β β α a β α β > a

hi β X Ο X β < Μ β β to 2 β β Μ X κ. β § > a

X ^: β X Ο X < w β ο to Ζ β β ω to to β. Ο β > α

X β X α X , β λ; w β β β 2 C β to to to β α β :> a

X β X ο X Ν < to β β to £ β β ω to to β Ω β > a

X β X . ο X β < to β β .to σ β β to X to β Ω β >

X β X ο X ο < 9 β w •5S β β Μ X to β « β > a

Μ β X Ο X to β 0 to ζ β β to a to β Ω β > ό

Ο β Ο ο ο β < to β β to S β β ω a to 2 β > a

X. β X ο X β to β β to 2 3 β to to to β Ω β > a

X X Ο X β < to β β to 2 β β to a β β Ω > a

X β X ο X β to β β μ ο β β &ι X to β to β > a

Μ ό 2 α Η Ο w ω

{Μ 6 2 β Μ Ο ω U)

η § Ω Μ Ο w 05

*Γ § β Μ Ο to 03

m Ο _: ζ β Μ Ο to 03

ιη Ο 2 Ω w Ο to 05

Ε> § Ω β Ο Η 03

ro § Ω Μ Ο w 03

en Ο 2 Ω Μ Ο to ¢0

ο Η ό 2 Ω Η σ w 05

Η Η' g Ω w α w ta

t\ β ό 2 Ω Μ Ο to 05

Π β ό ζ Ω Η σ &α 2

T? • β ό a Ω Η Ο κι εο

ΙΛ β Ο 2 Ω Μ Ο to. to

• y> rH § Ω w α to ω

Γ β Ο 2 Ω β Ο ω 03

G >* £ &

Η

03

<η

χτ

tn

\ο

a

CC

05

Ο w

r-ł β

<S β

Ο> β

•φ β

ΙΛ β

50 β

β

PL 196 676 B1

* Μ Z 0 *· W

n σ\

F CO

o cn

O Ch

CM k£>

tn σι

0) co w

CS co

O σι

® z

ω

F

5? . — 0 H

CM CO

CS z

co σι

© z

ω <h

e* \0

ci lA

O o F

He (%) wolny

to TP

CS r-

CM CD

tn 03

σι TT

co w

0. Ot s>

in

O <n x §s £ J £-» Z.

F 00 ω

<A« CO in

«u> r* tn

Λ» Γ tn

F Μ» «1

it· sr m

<H> © tn

t» X m

t> **

F TT M*

<x> o V

<A» <7\ ©

F CO m

F TJ1 m

F m cn

F cn m

F CM n

F F F

η> b w < O z X t3 U z w ta tn

z X X o X < z X X ca z X X W O& Cd X a X > o

Z X ba o z X *ς ca X o ca z X X ca a& X X o X O Cl

Z X Z O z ►X < ca X X ca z X o ca ca Z X 2 ź

Z X z g X < ta ♦Ω X ca z X X ca « Cd X a X > a

« X z g X o ω X X ca 3 X ca ca Co X a X s> CU

z X z o z X ca X X ca σ X X ta z Cd X ca X X a

Z X Z z o X ta X X ta z X X u K Cd X a X > CU

z X z ot z X ca X z ca z X X ca a z z a X > z

z X z ot z X X ω X X ca z X X ω z z X a X > z

z X z σ z X <c w N X ω z X X ca « z X a X CU

z X z ot z X < ω s z z X X z a z X a X > z

Z X z g X u X ta Z X X w z z • X a

z X z g X w X X ω Z X X z K z X a g z

z X z σ z X < z X z z z Χ! X3 Z X z X a X > z

z X z ot z ś z X X z z X X z z z X D X > z

z X z ot z X < z X X z z g z z z X Q X > z

z X z o z X rt z X X z z X X z z z z a £ z

z X z o z X z X X z z X X z K z § X > z

z X z g ω X X z g t-3 z z X X z X X n.

cn rH ó z o w o w tn

er> fj Ó Z o w Ct ca tn

o cs O Z Q W O ca tn

rJ CS ó Z a H O ca w

cs cs Ó Z a H O ca cn

•V CS 2 z a w O ca 05

in rs g a H O Z tn •w

Ό <s ó z Q M ot ω w

Γ' CS ó Z a w O ca tn

00 CM g a w o ω cn

<n cs O Z a w O W cn

o © ó z a H O z cn

Ή ω ó z a w o z 2

ćs © 6 z o w O z (Λ

Tf m Ó Z a w o Z w

tn © ó z a H O z z

to © g a H Ot z w

Q >< H Oj W Oj

00 H

O\ F

o CS

H CS

cs CS

V CS

in cs

to CS

CS

CD CS

z CS

o tn

H cn

ts cn

© ©

w

tn ©

U? m

PL 196 676 B1

5ω tu Φ Η W

m r*

CA

CM r*

77

CA KO

KO J>

KO co

tn co

r- tn

KO r*·

m r*

co

75 1

5? . φ w κ

KO r*

rd CM

co ko

CA t>

tn o

F* <N

m CM

00 tn

CM tn

Ot ω

W CO

O, «

co

CO r*

3? — υ •Η J® S X

tn r-

CA

CA KO

CC

en f*

O

KO 00

co

KO 00

in KO

co

CM co

a w

H r

CM r*

cH> —ι Φ 0 Κ 5

m tO

tn CM

KO KO

to tO

m tn

tn H

o CM

KT CM

o m

r· tn

co KO

m KO

& ω

KO r*

co m

AKTYWNOŚĆ (%) LCAT

«*» ot CM

σι cm

<A® tn CM

Λ» tn cm

Λ» tn CM

& tn CM

λ» tn CM

<*> <y CM

«3Ρ m CM

&» ra CM

tW> fM CM

ά» CM CM

<A° rd CM

Λ» o CM

ot· O Cl

CA H

CK H

«V» CA H

£5 3 Ο a § Μ & u 2 W ω w

X 43 X o x p ω p j w 2 ♦4 CO X Cu ►4 Q 43 > CU

Si 43 X O ta § ta 4 X ca z 41 41 Cd 05 tu 41 Ω 41 > CU

X 41 X X X 41 41 43 ta ca 41 41 ta 05 Cu 41 Ω 41 > tu

X 41 X X σ 41 ca 41 41 Cd X •43 41 ca z Cu 41 Q 43 > tu

X δ o X 43 »«C ta . 41 X ca Z 43 43 ta ca z 41 s > cu

X 41 X O X 43 < ca z X ca z £ ta x 0. ca P t> tu

X 41 X O X 41 ta 41 X ta z 43 X ta x X w c 43 &

X r-t X 0* X I-I <0 4) rd X u c r-t X Φ <D Ό r-t l

X 43 X O X 43 < ta 41 X ω z P X ca 05 X ta Ω 41 > X

X P X o X 43 < W 43 X X § X X X X 41 Ω 43 > Oa

X P X o X 3 X 41 u X 2 41 41 X X X 41 Ω P > ł

X g 43 X 41 4| X Z 43 4) X X X 41 3 &

X 43 X O X 43 X 43 41 X X 41 P Z X X 43 Ω 41 > X

X 41 X O X .41 < W 41 X ta z 41 43 X X X 41 Ω 43 > X

X 41 X O X 41 < X 43 X X z P 43 X Z X 43 Ω 41 > X

X 41 X O X Ω < X 43 X X z 41 X X X X X Ω Z > X

X 41 W O X Ω < X Ω 41 X z 41 Ω X X X 43 Ω 41 r

X X o X 41 < M 41 Z X z 43 41 W X X 43 Ω 4! > X

X u X o X 41 X 41 43 X 2 41 41 X X X 43 1 j i X

Ρ» r> Ó 2 Ω M O ta w

CD n 6 2 Ω H O ca b

<r> m O Z a n σ ca w

O •CT Ó Z o w σ ta b

rH M* 6 z Ω H O> ta b

CM *p 6 2 O K O ta w

m M· 6 z Q H O ta b

tP M· O z Ω H O ta ta

tn TP Ó 2 Ω W O X B

u> a· ó 2 O t-t O ca w

r- V Ó 2 Ω H O X B

® O Z Ω w O X w

Ot a* Ó z P w Ot X CO

O tn Ó 2 Ω H O X CO

r~4 in δ z Ω w O K w

CN tn O Z Ω i-i O X w

m tn O Z P H O X B

•sp tn O Z Q I-I O X B

tn tn Ó 2 Ω I-I O X B

ο >* Η Cu W X

Γ- η

co <n

ot «η

o <*

H

CM

n •Φ

ν M*

«η *

to Μ»

r~ «*

a> •Φ

ot tP

o tn

H tn

Ci tn

<n tn

<J< tn

tn m

PL 196 676 B1

i Sm X K

xr co

70

rp στ

KO KO

d? ^r 1> W W

KO KO

στ f-

KO KO

’φ co

m στ

X w

d? ·' υ •w © B W

m ao

in co

04 00

o OT

co r*

X to

.-H ·§ ►M **

στ στ

tn w

to

r-4 CD

f’- OT

X to

AKTYWNOŚĆ (*) LCAT

·* ω Η

0* « K

<λ® ω -Η

rj

U> rH

KO H

•V» KO M

KO w

tn r~ł

Λ» tn ł-t

<λ° tn Ή

rM

<t> w» w

Λ» m : r-ł

oa w

W

«*» H H

«Μ* O rH

•Μ» o f-ł

SS O tn < s 2 ' O W s u 2 Cd :s 2 ω tn

2 2 2 Ο 2 dl < w X dl ω 2 dl dl Μ Di X dl Q dl > X

2 dl 2 O X dl 3 dl dl ω ω dl dl 2 α X dl o dl X

t dl 2 O 2 dl *C X dl 2 W 2 dl 2 X X X X Cl di > X

2 dl 2 O 2 dl < W dl dl X 2 dl dl X X X X β X δ

l t i O 2 X X X X X 2 X X X X X X α X > X

2 X 2 CM 2 X X X 2 X 2 X 2 2 X X X β X > X

2 X 2 O 2 X *x X X 2 X 2 X 2 X X 2 X β X > X

2 X 2 O> 2 X X X 2 X 2 X 2 X X X X β X > X

2 X 2 O 2 X *c X X 2 X 2 X 2 X Di X X Q X 2 X

2 X 2 O 2 X < W X 2 W 2 X 2 X X X X β X > l

2 X 2 2 O X X X X X X X X 2 X X X o dl > X

2 X 2 Ot 2 X *c X X X w 2 X X X X X X β X > ł

2 X 2 a 2 X X X 2 X 2 X X X X X X Q X > X

2' X 2 O 2 X < W dl 2 X 2 X 2 2 X X X Q >x > X

2 X 2 Oi 2 X < X dl 2 X 2 X X X X X X Q X > X

2 ►4 2 O 2 1 U < X 2 X X 2 X 2 X X X X β X > X

2 X 2 Ol 2 X < 2 dl 2 X 2 X X X X X X O X > X

2 X 2 C* 2 dl < X X 2 X 2 X 2 X 2 X X O dl > X

2 X 2 O 2 X *< X X 2 X 2 X 2 X X X 2 O X > X

to tn O 2 Q w O W OT

r tn Ϊ O W O X TO

co tn Ó 2 Cl H Ο» X OT

ot tn Ó 2 O H O X OT

o u> 6 2 O W C* X OT

ł-t to ó 2 £T t-t O X w

OT to § α w O X TO

OT to O 2 Q w Ο» X OT

tr to Ó 2 β H O X OT

tn to Ó 2 β M O X w

to to ó 2 α w Ot X OT

r to o 2 β w Ol X OT

OT to g Cl ł-t O< X OT

o r O 2 O w Ol X w

i-t r* § β M OI X OT

N t* ó 2 β H Ol X w

OT t ó 2 O w α X TO

r- Ó 2 D t-f O X TO

o 6* X ω X

KO in

r tn

CO tn

OT tn

O to

H KO

OT to

tf to

tn <O

KO to

r·» to

CO KO

στ KO

α

W

OT r~

<n o*

«* r-

PL 196 676 B1

22-mer największej zgodności

PL 196 676 B1

***>» £ w x w

m to

r-i CO

o co

co Ch

tn tn

tn to

r- r*

in

3» ·

Φ 0}

c* CN

X to

m vo

o 00

X w

ch CM

CN

W

<#> *- υ Ή ® ⁶Μ

o t-

X CO

tn CO

co 00

CM o\

X ta

σ\ n*

co Ot

X to

tn tn

£ G *Ή φ 2

co r-i

CN tn

Cl f**

m 00

01 CO

r-l CN

<h CM

X 10

co ct

« >

-w £ 2 3 S d

<Μ ιη

tn

«V» tn

tn

6Μ» Ν'

ιΑ» CM

«Λ» Ot

CM

CN

«i® CM

«Λ° r4

oM> r*i ;

Λ» r-i

& 0

0

·*> 0

tfj* —Γ

^G . 3 Ο to 1 ο ⁵ · z Μ *Ο Ο 2 W *3» - ε ω w

X d X σ X d *£ ω d X ω 2 >< d Μ Bi X ω Q d > X

X d X o X d δ 3 ω 2 d X Bi X ω o d X

X 1 σ X d δ d δ 2 d X X X X w Q d X

X d X o X d a, ω d X d 2 d d W X X d o d £ X

X r-t X ο- χ r-t « Φ X 0» c r-t r-i Φ M >M r-t Ό r-t X

1 1 t 1 i 1 X d d X 2 d d X X X d s X

X d X o X d < X d w X 2 d d X X X d Q d i> X

X > d O d X X X d 55 X 3 w 5 X o X d X

X X 0* X r-t « <U r-t Φ c r-l Φ F» r-t Ό > X

X d X Ol X d < X d X 2 2 d d X X X d o d > X

X d X X X d < X d X d 2 d d X X X d ca £ X

X d X ot X d < X d X X 2 d d X X X w 0 d > X

X δ σ X δ X d d X 2 d d 1 1 » t t 1 1 X

δ o X δ i u X X X

•X d X ot X d < X d X X X X X X d G g

X > 1-1 Ό l-ł <tt M Φ r-l r-t G Φ r-l r-t Φ 1« r-t X 0* X HI X

X d X 0 X d fC X d X X 2 d d 2 X X d Ω d > X

·—»

*-»

CM

r>

*

tn

to

t-

00

<h

o

H

IN

m

NT

tn

to

r*

00

<h

«Λ

ΟΊ

m

o\

<n

X

o

O

©

0

·♦

♦ ·

*»

·»

«»

H

r-i

w

r-l

H

o

O

o

O

0

**

“

»·

*»

♦*

♦»

2

&

O

0

O

0

O

0

ó

0

O

Q

a

2

ca

G

ca

Q

M

W

Hi

t—1

W

H

O

C3

ca

G

O

Q

G

o

Ot

ot

Ot

M

W

w

M

H

W

K

ot

Ot

Ol

O

Of

o

ω

W

w

u

ω

X

Ol

O

0

o<

Ol

0

TO

w

TO

m

ϋ

w

X

U

X

***

·**·

***'

w

TO

w

TO

05

-

****

ο

>Η

Η

ca

m

tn

to

r-

co

Ch

o

H

CM

<*>

w

to

f*·

ίΧ<

ch

en

X

m

X

ch

X

o

O

0

©

0

w Οι

rt

H

rt

H

^Aⁿ]-22-mer największej zgodności(Anantharamaiah et al. , 1990, Arteriosclerosis 10(15:95-105).

PL 196 676 B1

*Η X ® ^ΗW

58

δ w to a

m OJ

d? ' *—* ο Ή s^e

tn

X OJ

He (%} wolny

<h rt

u>

Ό r. 2δ g d i>4 H **

«ή» O

o

O

<A° O

«V» O

«> O

a)P O

oM> o

Λ» O

J* O

& o

<*» O

«Μ* O

SEKWENCJA AMINOKWASÓW/

X d hi O X d < W d tó ω 2 g W X Ul X o d > CU

X d X a X d *3! ω X X UJ 2 id X U) fti Ul UJ O d > CU

X d X d X d UJ as X ω d X UJ X Ul UJ Q d > CU

X d X o X ►3 < UJ O) X Ul 2 d X UJ X Cu UJ a d > CU

X d X o X d ω d CU UJ s X UJ X X UJ o d s* X

X d X o X d U) 2 X ω 2 d X UJ X X UJ ca d > X

X d X d X $ w d X Ul 2 d X u X X X 3 X X

X d X o X g d X UJ 2 d X X X X X ca η3 ? 0w

X d X d X s3 < X d X X 2 d X X X X X Q d X X

X d X d X d < X d X X 2 d X X X X X o d > X

£4 d X o X % X d X X 2 Ś X X X X ca d > X

X d X 0 X d X X d X X i X X X X o d > X

X d X d & d *c X d X X 2 d X X X X X o 2 X

X g o X 2 X d X X 2 d X X X X X ca id > X

X d X σ X d < X d d X 2 d d X X X d o £ o

O d O d o d «c X d d X 2 d d X O X d o d > X

X d X Ol X d X d d X 2 d d X X X d ca d

<h . O d Ϊ C5 H o w X

o r4 rH Ó 2 O H O UJ 05

rH H r-ł ó 2 O Hł σ UJ ω

ΓΊ rł t-4 Ó 2 a H4 σ UJ w

ΓΤ rH W g O w σ U) w

«r r-ł r-ł ca Hł o w 2

w r-ł t-4 ó 2 O Hi d ω w

ko H rH ί- ο M O X 2

r H rH § Q w σ X 2

m r-ł r-ł S Q M O X 0)

tn c-4 r-l ó 2 ca Hł σ X w w

o iS r-ł ó 2 ca H4 σ X w

r-ł OJ rł Ϊ O w O X w

04 04 r-ł ó 2 ca Hł O X w

n OJ T-t ó 2 ca Hł o* X w

-* O! r-ł O 2 ca t-t o X 2

m OJ r-ł O 2 ca Hł o w 2

PEPTYD

X cl σι o H

o H rH

rH rH rH

CS rH rH

m rH rH

Tt* rH H

w rt r-t

M5 rH H

r-ł r-ł

00 r-ł r-ł

X r-ł r-ł

o o H

r-ł OJ H

Oł 04 r-ł

tn N H

•o N r-ł

40 Oł 1-4

Τ3

Ο σ>

PL 196 676 B1

* Μ Cd W

in o

W»

W -

»•4 © Ol w

— tł

co

-rł

00

© 6

W

-H

Ol

«0

co

K 3

tn H

o i?

2 j

<Λ»

*

a ·*

r*

rH :

>«

xr

rH

!c ’ ć*’

«Η

'2-~

<

2

Ni

iż

Ni

2

iż

2

iż

Ni

2

O

Ni

2

* 2

2

o

X

>4

*4

♦4

»4

X

2

Ni

Ϊ4

Ni

ii

iż

ti

o

Ni

2

O

o

ta4

o

Ol

Ni

ii

O

o

O

o

O

2

§

2

iż

o

fceJ

Cd

O

2

iż

Ni

ϋ

o

iż

2

O

s .

X

►4

X

♦4

►4

X

Cd

X

o

X

b

rt

<

<SC

*c

<

*c

<

2

<

rt

<

ω

0

W

Cd

Ω

Cd

o

2

Cd

cd

bt

Cd

Cd X

Cd

W

Q

2

co

X

►4

fc-4

X

#4

X

M

►4

X

►4

>4

♦4

*4

X

CO

O

o

O

to

u

X

' 2*1

td

Cd

ω

Cd

b

2

Ω

td

• w

Cd

ω

u

Cd

Id

Cd

2

ci

Ci

2

ω

Cd

2

o

2

52

2

Cd

X

►4

X

n4

X

§

X

<

X

x4

»4

x4

X

i4

X

»4

X

1“>

w

Id

03

Ω

Cd

Di

2

Cd

Ω

Cd

2

U ►>

o:

c:

cc

2

Ni

Di

Cd

Di

iż

DC

Di

K

Di

K

ta

u.

tu

b

Ct*

ku

Cl,

Uh

b

ku

b

Ιλ

b

ω

X

♦4

X

>4

X

b

X

o

A

Ω

w

Cd

Ω

Cd

Ω

Cd

Ω

b

Ω

10

^Λ

X

3

X

4

X

»4

X

w ........

>

*ί

>

b

Α»

0«

CU

cu

CU

Cu

Ω

CU

Om

CU

(U

a

to

$**·

CO

Ot

o

H

Pi

1*1

•Φ

in

CO

r-

co

Ol

o

rH

PI

rh

(N

ΓΗ

pi

Pt

m

σι

f*t

n

rc

m

‘ rt

ΓΠ

σι

*r

H

t-4

rH

rX

X

rH

r-

rH

: T—

r*

rH

H

rH

r*¹

rH

o

O

o

O

o

O

c

O

o

c

o

2

O

Ω

c

C

Ω

C

P

Ω

C

Ω

C

O

C

Ω

H

X

H

K

w

H

X

ł*

H

W

F

H

0

o

c

» c

* C

ł c

X c

» O

c

* c

c

t c

X c

» c

X c

X o

ω

Cd

b

u

b

1 b

b

1 D

b

1 b

i b

b

(2

1 Cd

w

b

Cd

V

σ

V

i σ

Cd

V

M

«

V

1 U

) w

U

u

Ϊ W

X

>H .H

*c

r

cc

Ol

c

ir-

Ch

<*

1 M

Łf

U

» r

oc

O

t c

5 r*

P

4 r

Ί M*

(Xi

P

«

Pi

rs

r

σ

1 (*

o

1 P

σ

<*

i r

σ

P

t M

1* M

i *5

r*

8»

W

r-

r^-

r-

4 r-

r

Ί r*

r

ł <-

r-

r

t r

4 T-

ł r

i iH

Oj

PL 196 676 B1

* w X a

GO in

in o

O co

r*

O co

H to

in w

<łP .

o o

m

tn

H

ω ta a

rH

Ol

r*

00

<#> ; ~· o Ή

r-i tn

o o <-i

kO r*

Tf tn

kO r*

m r*

m CO

m in

>1 dP c

— r-l « 2 a *

m tn

r* Ch

o rH

co CS

m rH

tn kD

co to

CM

Oh <05 20

Λ» o

&>

a\°

•V»

eV>

JP

e*

<*»

(ftp

«Α»

«Μ»

&

«V» kO CS

2

o

\o

tn

m

Γ-

tn

o

σ\

tn

CO

tn

o

O

co

CO

i**

rH

co

r*

t*»

M>

tn

m

tn

s*

n

m

cn

n

m

cs

Ol

g-

i o 55 o 25 bH s' υ 25

X d X X 3 < Q d d X X d d 2 X X

X d X X o d < O d d X X d d 2 X X

X d X X o rdi < CS X d X X d d 2 X X

X d X X o d < Q O d X X d d 2 X X

X • d X X o d Q d d X X 2 d 2 X X

X d X o d < Q d d X X d Ϊ5 X X

X d X X o d < Q d d X X o d 2 X X

X d X X S c d d X X d d 2 X X

X d X X o d α d d X X d d 2 X X

X d X X o d ci d o X X d d 2 X X

X d X X o d Ω d d X X 2 d 2 d X

X d X X o d a d d X X d d 2 d X

X d X X ot d «c o d d X X d d 2 X X

X d X X o • d 2 Cl d d X X d d 2 d X

X d X X d d g d d K X d d 2 X X

X d X X 3 2 O d d X X d d 2 X X

X *a X X o d < X d d X X .3 d 2 X X

X d X X o d g d d X X d 2 2 X X

X X o d Q 2 d X X d d 2 X X d X d > X

U) W CO

*»3 W 2 o

d X d > X

d W d > X

d X d d X

d X d > X

d X X > X

d X d >

d X d > G*

d X d > X

X X d > X

d X d > X

d Q d > X

d X d > X

tn

kO

F

co

cn

O

W

O!

m

ΊΤ

tn

kO

F

co

<h

o

OJ M> rH

n to r-t

s* rH

*3· rH

T? rH

τί* rH

TT rH

in rH

tn H

tn rH

tn . rH

tn rH

to rH

*H

ó 2

s

o 2

ó 2

6 2

ó 2

Ó 2

i

ό 2

o 2

g

§

ó 2

6 2

ó 2

o 2

g

O M

Q W

O H

O M

Q H

Q W

ta H

Q w

α ł-H

Q H

O H

c H

Q M

Q H

Ω H

w

o X 2

σ X 2

O X w

σ X w

o X w

o X 2

O X 2

o w w

o X 2

o X w

o X X

o X w

O X 2

o X w

o X ω

o X 2

o X w

o X 2

Q

> F X W

tn <* rt

to XI» rt

r· Tf rH

«0 TT rH

tn * r-l

O tn rH

H tn H

Ol tn H

on tn rt

Tt* tn i rH

tn tn H

to tn H

F >n H

<x> tn w

w tn H

o to r-l

H U> H

N to H

m to

X

PL 196 676 B1

Ew b 0) W

rH KO

d? .. © W W

rH Ul

d? — o X © 6 2

KO KO

He (%) wolny

r m

o h 2 X tLf >M r-* H «*

t* <N

Λ» n CM

o\° CH CH

«A° CD rH

<Λ° Γ- X

«¥> Γ- X

<A° ł> rH

ώ* KO rH

<Ao KO r-ł

ΚΛ H

Λ· Pł X

<AP m H

«V X X

O rH

«* Ol

00

ω

Λ» co

«&» ł>

SEKWENCJA AMINOKWASOWA

2 X 2 2 O 2 Q X X ot Cd X X 2 ω b X Cd i 0.

2 X 2 2 O X X Ω X X 2 Cd X X 2 Cd b X Cd X > b

2 X 2 2 O X *c Ω X X 2 Cd X X 2 X b X ω X > b

2 X 2 2 O X Ω X X 2 Cd X O 2 td b X td X > b

2 2 o X Ω X X 2 ω X X ο Cd b X Cd X > b

2 X 2 2 O X Ω X X 2 Cd X Ss Cd b X Cd X > λ»

o X o o o X g X X o Cd X X 2 ta b X Cd X i> b

2 X 2 2 O ►d X Ω X X 2 Cd X X 2 Cd b X td X > b

2 X 2 2 O X g 3 2 td X X 3 b X Cd X > b

2 X 2 2 § Ω X X 2 Ω X *X 2 Ω b X Ω X > b

2 X 2 2 tr X © Ό X X •k © X X C © >w X © X > CU

2 X 2 2 2 X xł W X X 2 td X X 2 Cd b X Cd X > b

2 X 2 2 O X < Ω X X 2 td X X 2 W 2 X Cd X £

2 X 2 2 σ X < Ω X X 2 Cd XI X 2 X b X Cd X > O

2 X 2 2 O XI < td X X 2 Cd X X 2 Ω b X W X > b

2 X 2 2 O X < c X 2 td X X 2 Ω b łJ w X > b

3 2 2 O 3 Ω X X 2 Ω X X 2 Ω b X Cd > b

2 X 2 2 0» X < Ω X »· 2 ta ♦4 X 2 Cd b X ta X > b

2 X 2 2 O 3 ta X X 2 ca X X 2 ta b X Cd X > b

<* MO X Ó 2 O H O w CO

in MO X ó 2 Ω H O Cd co

MO MO X 6 2 Ω M O Cd CO

r·** r* co X O 2 Ω K O Cd CO

CO MO X Ó 2 Ω X O Cd co

Ol MO X ó 2 Ω K O Cd co

o C- X ó 2 Ω H O Cd CO

rH r* rH ó 2 Ω X O Cd CO «o-*

CM Γ- rH ó 2 Ω H O Cd to

pi r- X Ó 2 Ω H O Cd w

-r r- X Ó 2 Ω H O Cd W

in r~- X O 2 Ω ^w O Cd CO

MO t o 2 Ω X O Cd CO

r- i— X Ó 2 Ω X O Id co

co Γ- Γ- Ο 2 Ω X C td W

Ol r- X O 2 Ω X O ta w

o co X Ó 2 Ω X O Cd w

rH CO rH o 2 Ω w O ta co

CM CO X Ó 2 Ω X O Cd CO

PEPTYD

KO K

tn KO rH

KO KO rH

Γ- ιο X

CO KO rH

Ol MO H

o Γ- X

rH C rH

CM r* r·

r- X

'P Γ- Η

in Γ- Η

KO r* rH

r- r· fU

CC f~ X

oi Γ- Η

o n X

rH CO f

CM CO X

PL 196 676 B1

Sw z as

to tn

r* co

m ot

cn KO

σ» Γ

<*>

P

o

&

co

0) co »5

<»P „ — o

co

m

o

*rł

<o

ot

P-

r*

« β

w

>5 <*» β ''f-t

MS

co

n

tn

« o

m

n

£ Z

Ό '

<Z) H

O <

a >< E-μ jb OH

«Ν»

Λ»

»*> o

©\» o

Α»

łfto

&

.*>

oV>

Λ·

to

”0*

n

o

KO

CO

Γ

ri

o

to

in

*3<

ri

Ot

co

<0

CO

CD

co

P-

r~

P>

sr

gi

§

z

o

z

z G

o

>4

G

43

»4

G

cn

z

hi

o

Z

z

hi

Z

<

z

hi

o

Z

z

Z

*

+

*

* '

♦

ifc

o

O

o

α

z

O

o

o<

z

&

G

Z

4

43

>4

G

4

G

. G

G

43

o

«

<

id.

<

Z

z

Z

2

Q

o

G

α

G

Q

o

g

α

σ

O

o

Z

O

Ο»

W

43

G

43

4

►4

43

G

z

z G

z

ui

x;

>4

G

»>4

43

>4

G

G‘

G

43

*”f

a

Z

z

cd

z

cd

Z

Cd

ca

Z

W

ω

Bi

Z

z

pa

z

id

Cd

id

Id

O

W

c

B

ω

w

W

Z

z

Z

&3

u?

3 ’

G

»4

43 43

4

β

G

G G

G

s

43

G

43

g

r-

G

43

Z

O Cd

z

B

Z

W

ω

Z

U3

y

W

4

id

Cd

ω

o

Z

z

Z

ca

Z

Oi

z

Ϊ5

tu

Cu

Z

u.

Ui

Uł

U*

SC

G

Z

z

Uł

z

Z

U,

Pi

ω

43

g

G

»4

>4

43

Z

G

43

G

ł

w

Z

W

Cd

U3

w

W

C

G

O

«

ω

G

O

o

G

Q

ić

43

G

»4

>4

43

A

β

G

ω

43

s>

>

?>

>

t>

>

G

>

43

in

CU

Oj

CU

£U

G

z

CU

Z

z

(U

Z

u

Z

CU

r*

r-s

m

V

tn

MS

r*

: CO

0\

c

rd

Pt

m

t*

tn

to

P*

®

cn

O

Φ

CD

CO

co

CD

co

Cl

• OK

€h

σ\

ot

<h

Ch

ot

et

o

H

i-l

ri

«-4

ri

H

ri

H

ri

r-

ri

r

ri

CS

PI

o

O

o

O

ϋ

o

O

c

O

o

Z

z

52<

z

Z

z

5z

z

Z

z

G

o

c

a

o

Q

G

c

Q

G

o

Q

o

G

a

O

Q

H

w

H

W

H

w

H

hi

H

w

H

M

o

O

o

* 0

c fc

* O

O

o

c

* o

c

i c

t o

c

Of

Z

K

&

Cd

ca

Cd

1 B

B

Cd

Z

z

Cd

w

W

w

W

tn

w

<Z

W

V

i V,

W

V.

W

cn

ŁT

u

z

V

to

Sh

o

P¹

W

in

te

r~

CG

σ

c

9 r-

CS

w

te

t*

a

cr

c

ri

(U

«

«0

co

OO

09

α

o

t o

Oi

<T

o

σ

o

σ

cn

c

O

W (U

H

tH

rd

H

r~

r-

ł r*

«4

1*!

, r·

1 r^-

r·

r-

i r-

1 ri

o

Pt

PL 196 676 B1

* w U Φ ^Hw

CS to

f tn

ω u?

O f

M· kO

- £

r·

r~·

F

ko

M*

a a> ca W

kO

f

tn

c-

tn

5? .. u

F

f

F

00

F

C

to

C

<£>

« 6

W

««*·» >t

# c *“* J

•M·

o

co

CM

C*

o

tn

CS

©

in

©

® 3

z

<->. <n H

23

'z. 2 s

F

<*>

F

Λ»

F

o

KO

©

O

r*

o

a>

Γ*

kO

tn

F

CS

cn

®

tn

O

m

M*

CM

>< ŁS §-

t>

KO

kO

tn

m

s*

Tj*

SJ»

Μ¹

·*

F

CM

©

<

3

o

co €3*

*

+

*

4t

*

-*

*

♦

§

z

te

z

Z

o

z

bi

z

te

Ni O 53

4

»4

X

►4

4

X

4

te

i te

te

z

o

n

z

te

z o

te

o

σ

o

σ

O

o

a

o

rx

σ

o

a

σ

te

w

z

te

z

u:

te

z

X

z

o

O

z

4

ś’

g

łF

X

»4

#4

4

>4

»4

X

z

X

3

X

*ζ

z

U3

z

Z

z

X

Ul

Ul te

U3

z

u

z

te

W

X

4

X

»*·;

X

•χ

X

4

X

4

>4

3

>4

X

»4

X

XI

X

4

ł~)

Q

z

Z

z

w

a

z

a

z

Ul

u

te

Z

z

U3

z

o

z

Di

Ω*

PC u

2

Ul

u

z

U

>4

4

z

U<

z

Ul

z

u

z

Ul

w 3 Ni ω cn

4

X

u<

X

4

X

4

D3

a

Q

z

U

z

a

z

a

z

a X

o

a

Q

X

4

X

»4

>4

4

X

4

<

>

>4

>

<

>

t>

>

t>

>

Z

<

z

U

U*

z

Ul

0*

z

Λ

Ui

z

tn

«©«.

©

*

u>

r·

®

z

o

F

CS

F

tn

to

C'

CD

cn

o

O

o

O

o

F

r-

H

F

CM

CS

CM

CS

ts

©

CS

cm

CS

©

CM

CS

©

CM

©

Ó

o

Ó

P

Ó

ó

Ó

2

O

ό

o

O

6

ó

o

g.

Z

32*

3

te

z

Z

z

Z

z

Q

a

o

a

Q

o F

|F

H

M

H

M

K

H

F

H

w

H

M

F

o

O

o

O

o

c

O

o

σ

O

o

c

o

w

W

z

Ul

z

(i

K

z

b

ti

z

ti

z

uc

U

w

ω

co

ω

co

W

«

CT

σ

CT

M

w

CT

w

V

CO

**«

0

> H

cs

F

<*

tn

kO

Γ*·

«

Ol

O

F

CS

F

·*

tn

«

r-

CD

o

F

O

o

F

; r-

f

• r

©

T-

F

1*

CM

fij Ul

CS

CM

©

CS

Ct

CS

cs

CS

CM

W

<M

CS

cs

c

©

z

PL 196 676 B1

Sm X Φ H W

rH in

1

58

X o

#> V Oi w w

m ca

tn

o ©

<*» ' —- υ •H K

KO in

© ©

OJ €*

OT t3»

He (%) wolny

OT

o n

CM

^3*

o * 3 >+ 2*

·*» Oi rM

co

CO

_ev> co

& H

&> r-t

•K® o

<Λ» O

o\° O

«Τ* w w

στ r-ł

«Λ» r*4

SEKWENCJA AMINOKWASOWA

* 2 X 2 O 2 X X • X X X « X X o X > β

2 2 X O X X a. X X X X X X < Q X > X

2 2 X O X X X X X X < o X > X

2 X 2 O 2 X X X § X X X X β X > X

2 2 X O X X X X X X *< β X > X

2 2 X σ d X rt X o X X X X «; C i k-! > X

k 2 X 2 O 2 X X X TO X X £ X Q 5» X

k 2 X 2 O 2 X X X ►4 TO X X X X Q X > X

* 2 X 2 O 2 TO X X X X n X X X Q X > X

2 X 2 2 O X β X X łG X X X X X X > X

2 3 O X X 2 W d ►— i X X X X β X > X

♦ 2 X 2 O 2 X X X Ϊ3 X 2 X X X X X X

2 2 X X b 2 X 3 2 2 O X X β β X

* X X X 2 X 2 ω X 2 M >< X 3 X » X

k X X X 2 X 2 X g >< U, 3 Ś X

»-t OT OT Ó Z β H O X w

OT OT OT Ó 2 O H o X TO

OT OT OT 6 2 β w O X OT

OT OT Ó 2 β H O X OT

TO OT OT ó 2 β H O X OT

ot OT OT g β H O X OT

to OT OT g 2 β w O X TO

o OT OT o 2 β w o X TO

H OT OT o 2 β H O X TO

OT OT OT o 2 O w O X TO

' OT OT OT Ó 2 Q n O X w

TO OT OT O 2 O w O X TO

Q * >< H X W X

H OT OT

OT OT OT

·<* OT OT

TO OT OT

OT OT OT

« OT OT

X OT OT

O OT OT

H OT OT

OT OT OT

’Χ. W» r* m 04

*v M CO m ca

*· OT to ca

tn

JG

X)

OT ffl •M -P a α

o.

pepty<

PL 196 676 B1

* w X w	r tn				CO Ν»	ds

«*>
*- >	Ch			o		o	r-		ΓΊ
P	tn			tn	r-t	r-	NT		r-l
«> tn
w

<#> · — b	ω			Ν’	O	r*	Ν»		<n
-H	to			co	Ν’	t-	N*		N*
« β
»
—·>

	u>			o	Ch	CO	co		CO
He wo	H			H	m	H		K
Ό t. ΊΛ 5 o S S 4	tM	Λ»	tA°	Λ»	«*			t#>	<A®
ζ	H	CD	r-	tn	tn	Ν'	N*	m	n
H 3>

•aj
2
O
cn
2*	* Łu	X	O	X	IX	X	&	U«	X	* Cu	* Cu
ę .·	<	X	r*	<c	A	X	d	X	d	d	d
	ω	X	tu	X	X	X	X	X	X	X	X
	X	X	2	X	X	X	X	X	X	X	X
52	d	X	X	X	d	X	d	X	d	d	d
w	X	X	H	X	X	X	X	X	X	X	X
	ω	w	X	X	X	X	X	X	X	X	od
	*<	X	X	<	<	u*	d	Ul		X	d
	>	>	3	e	>	>	>	X	>	s>	i>
	X	X	Hi	X X	*4	X	X	X	X	X	X
B	Q	X	tn	o	X	X	X	X	X	X
o	Ϊ*			>*	X		>.	>ł	>·	jM	>1
2	u»	X	>•3 U	Ul	Cu	Uł	X	fcf	X	X	X
ω	«$				f5	·<	<	«£
X	X	X	fcd	X	X	X	X	X	X	£2
	d	X	X	Uc	d	d		Cu	d	d	d
w ω	2	2	Hi	2	2	s	g£	2	2	2	2
O	X	u	X	X	X	X	D	X	X	X
			***				*-%
	o	H	CN	m	n*	in	co	r~	GO	Ch	O
	N*	»	N	Ν’	tr	Ν’	N*	Ν’	N*	Ν'	tn
	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN
	2	2	2	O	O	O	o	o	o	o	o
	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	X	O	α	X	O	X	X	X	X	X	X
	W	M	H	W	w	Hi	H	M	H	M	H
	o	O	o	σ	o	O	O	o	0	o	O
	X	X	u	X	X	X	Cx	K	X	X	X
	tn	W	tn	tn	tn	tn	«	0)	tn	tn	tn
											>—·
o
>«			*s.		**.		*s.		•V
fi	o	H	ł- CN	cn		«η	·*	r-	H	·*	<N
X	Ν'	N*	N*		N*	UJ	Ν’	α	«h	O
w X	CN	CN	CN	CN	CN	CN	Ν’ <N	CN	N O	N CN	tn CN

u> ri
		co
		O .
		c-
		r-i
•		r-t
Γ-		d
Η		AJ
r-l		U
1			_t
m
o t-l		TO	ę>
<0		rW d X	n σι 1
W		0	ch
u	tn	•H	co r*i
-rl	tn	ca
AJ	<N		σ
ta	O
G ta	ri i	E •rl	c\
u	CD	Λ	H
	Ν’	υ
Ό	CN	0	CN
G	O	-l-ł	M> CN
ta	ri	m
G	/*·
0	CO	m	έ α>
•H	H	<h
AJ		Ch
υ G	O M)	r-t	rU U
3	CN
X		•	r-i
	B	r-t ns	0
tu u	Φ JZ	AJ
3	U	<u
AJ υ		c	*0
3	ri	-Γ-»
At	0	Ή
AJ	•H	G	co ch
W	£Q	O
		U	H	r-t
				CO
TO		..		tn
G		rt		in
-rt	X	CO		CN .
ta	in	tn	ri	\
AJ	co	tn	HJ	ΓΝ-
O	σ>	(N	U	th
M	. H		ϋ	O
X		<->	2
	*	ch O	ts c m 01 iS	«.
O	r*4	2	•
th Ch	ni		r-t TO
r-t	AJ	.
	tu	r-t		AJ
-		tO		tu
r-l	4= te	AJ	<	3
tO	Ή	tu	03	0)
	<0	r*f	G
AJ	• E	3	r—»	tu
(U	«	ta	r«	TO
	G	G	**	TO
AJ	te	<a	f-r	0
TO	JG	TO	”1	X
ω	aJ	TO	UO	*—·
d	«	0	□ Φ h:
tn (U	TO G	X	l>ł 2
tn	g		»*.	2
			<0
		Ν’		O
d		NjT	a
			rH	u
co	co	CO	a	i m
r-t	r-t	<-f
T3	Ό	Ό	ό
>1	>r	>r	>»	co
AJ	AJ	AJ	4J	H
α	0.	CU	a	[ U
ta	ta	<u	o
o.	Ou	X	a	1 <
				X.
·*.	•s.	S.	O
r*	*		«4	«Μ

^l2f AC-18AM2-C (O) NHj (Rosseneu et al., WO93/25581).

PL 196 676 B1

£ w tu
***»
<#»

υ to


#» *
~ ν
•Η
« δ
«

*c
''r—t
_m o
£’
O,
xn ij
gg
g u
5* —. h<*
<r
rij
s
O '
$	*
1*	b·
	U3		*	•		*	*	*
z~t	W	*	X	Iri	*	Ϊ4	iU	K
		Md	O	O	M	a	a	O
	Ul	U?		iU	•O	X	5ri	sa
			Ul	u	UJ	►3	Ul	Ul
Xg	W	O	W	*	fci	<	Od	fal
ri«	»4	ta	ω	w	03	ta	W	Ϊ5
	>	UJ		u	U	Ul	U	u
<	«	J	>3	P	U	Ul	t	u
	W	ta	ta	ta	«	ta	S	tx
o		«	ot	ca	κ	ta	w	ta
2	Ł	tu	tu	U.	Pu	tu	tu	(u
W	<	Ul	UJ	>4	►4	r3	U>	Ul
	2	Ω	o	C	C		c	Ω
ę·	»4	Ul		U	U	»4	u	U
	s	>	>	>	>	>	>	>
to	U]	o.	&	CU	Cu	CU	CU	Λ
					r-*
	H	fs	n		in	Ό	r-	a»
	tn	ΙΛ	ł/l	tr	m	m	Ul	tn
	(N	Ci	fS	Cl	«	Ci		. Cl

	O	O	O	o	O	O	o	O
	2	2	z	58	58	as	2	fc
	Ω	Ω	c	Ω	a	o	Ct	P
	W	w	1“	H	w	w	H	H
	O	O	c	C	a	o	O	a
	fc	W	£»	k	i*	u	u	ω
	w	«	V	Cf	tn	cc	V.	to
						«Μ	—
b
>»	m H	c	σ		Ul	u:	t*	CD
• H	r·	u	u	ł u	1 u	U	If	in
CM	U”	o	c	1 C	c	c	i c	Cł
03	C
-

PL 196 676 B1

W tabeli X, * oznacza peptydy, które są acetylowane na końcu N, a amidowane na końcu C. ^t oznacza peptydy, które są dansylowane na końcu N; sp oznacza peptydy, które wykazują problemy z rozpuszczalnością w warunkach doświadczalnych; X to Aib,; Z to Nal, O to Orm; He (%) oznacza procent helikalności, misc oznacza micelle, a ~ wskazuje na usunięte aminokwasy.

9. Przykład: farmakokinetyka agonistów ApoA-I

Następujące doświadczenia mogą posłużyć do pokazania, że agoniści ApoA-I są stabilni w układzie krążenia i wiążą się ze składnikiem HDL osocza.

9.1. Synteza wyznakowanych radioaktywnie peptydów

Wyznakowane radioaktywnie peptydy syntetyzuje się poprzez przyłączenie wyznakowanego ¹⁴C-aminokwasu jako aminokwasu N-końcowego. Syntezę przeprowadza się według Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173. Pokrótce, 250 ąM niewyznakowanego N-końcowego aminokwasu rozpuszcza się w 225 ąl roztworu 9% Na2CO3 i dodaje się do roztworu (9% Na2CO3) z 9,25 MBq (250 ąM) wyzna14 kowanego ¹⁴C N-końcowego aminokwasu. Płyn chłodzi się do 0°C, miesza z 600 ąl (202 mg) 9-fluoroenylometylo-N-sukcynimidylowęglanu (Fmoc-OSu) w 0,75 ml DMF i wytrąca się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę ekstrahuje się dietyloeterem (2x5 ml) i chloroformem (1 x 5 ml), a pozostałą fazę wodną zakwasza się 30% HCl i ekstrahuje chloroformem (5x8 ml). Fazę organiczną suszy się nad Na2SO4, odfiltrowuje i objętość zmniejsza pod strumieniem azotu do 5 ml. Czystość określa się poprzez TLC (CHCL3:MeOH:Hac, 9:1:0,1 obj./obj./obj. stacjonarna faza RPTLC żelu krzemionkowego 60, Merck, Niemcy).

Roztwór chloroformu zawierający wyznakowany ¹⁴C F-moc aminokwas używa się bezpośrednio do syntezy peptydu. Złoże peptydowe zawierające aminokwasy 2-22 syntetyzuje się automatycznie tak, jak opisano w Części 6. Sekwencje peptydu ustala się poprzez degradację Edmana. Wiązanie przeprowadza się tak, jak opisano w Części 6.1.

9.2. Farmakokinetyka u myszy

W każdym doświadczeniu 2,5 mg/kg wyznakowanego peptydu wstrzykuje się dootrzewnowo myszom, które są karmione normalnym mysim pokarmem lub miażdżycogennym zmodyfikowanym pokarmem Thomas-Harcroft (prowadzącym w rezultacie do poważnie zwiększonego poziomu cholesterolu VLVL i IDL). Próbki krwi pobiera się w wielu punktach czasowych w celu oznaczenia radioaktywności w osoczu.

9.3. Stabilność w ludzkiej surowicy

Stabilność agonistów ApoA-I według wynalazku w ludzkim osoczu wykazuje się tak, jak opisano poniżej.

9.3.1. Metody doświadczalne

100 ąl peptydu wyznakowanego ¹⁴C (otrzymanego jak opisano w Części 9.1, powyżej) miesza się z 2 ml świeżego osocza ludzkiego (w 37°C) i odtłuszcza bądź natychmiast (próbka kontrolna), bądź po 8 dniach inkubacji w 37°C (próbka testowa). Odtłuszczanie przeprowadza się poprzez ekstrakcję tłuszczów równą objętością mieszaniny chloroform:metanol 2:1 (obj./obj.).

Próbki nakłada się na kolumnę HPLC C18 z odwróconymi fazami i wymywa liniowym gradientem (25-58% przez 33 min) acetonitrylu (zawierającego 0,1% TFA). Profile elucji śledzi się poprzez pomiar absorbancji (220 nm) i radioaktywności.

9.4. Tworzenie się cząstek typu pre-β.

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do tworzenia cząstek pre-β wykazuje się tak, jak opisano poniżej.

9.4.1. Metoda doświadczalna

Ludzki HLD izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml w celu otrzymania górnej frakcji, a następnie sączenie molekularne na Superose 6 w celu oddzielenia HDL od innych lipoprotein. Izolowany HDL doprowadza się do końcowego stężenia 1,0 mg/ml roztworem soli fizjologicznej w oparciu o zawartość białek oznaczoną w teście białkowym Bradforda. Z preparatu wyizolowanego HDL pobiera się próbkę 300 ąl i inkubuje ze 100 ąl wyznakowanego ¹⁴C peptydu przez 2 godziny w 37°C. Analizuje się pięć odrębnych inkubacji, włączając w to ślepą próbę zawierającą 100 ąl soli fizjolo14 gicznej i cztery rozcieńczenia peptydu wyznakowanego ¹⁴C: (i) 0,20 ąg/nl peptyd:HDL, stosunek 1:15; (ii) 0,30 ąg/ąl peptyd:HDL, stosunek 1:10; (iii) 0,60 ąg/ąl peptyd:HDL, stosunek 1:5; oraz (iv) 1,00 ąg/ąl peptyd:HDL, stosunek 1:3. Po dwóch godzinach inkubacji 200 ąl porcje-próbek (całkowita objetość=400 ąl) nakłada się na kolumnę do sączenia molekularnego Superose 6 w celu oddzielenia i analizy lipoproteiny, a 100 ąl używa się do określenia całkowitej radioaktywności nałożonej na kolumnę.

9.5. Połączenie agonistów ApoA-I z ludzkimi lipoproteinami

9.5.1. Metody doświadczalne

PL 196 676 B1

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do łączenia się z frakcją ludzkich lipoprotein określa się poprzez inkubację peptydu wyznakowanego ¹⁴C z każdą klasą lipoprotein (HDL, LDL i VLDL) i mieszaniną rożnych klas lipoprotein.

HDL, LDL i VLDL izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml i oczyszcza poprzez FPLC na kolumnie ze złożem do sączenia molekularnego Superose 6 (chromatografię przeprowadza się przy szybkości przepływu 0,7 ml/min, w buforze 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA i 0,01% NaN3). Peptyd wyznakowany ¹⁴C inkubuje się z HDL, LDL, VLDL przy stosunku peptyd: fosfolipid 1:5 (stosunek mas) przez dwie godz. w 37°C. Wymagana ilość lipoprotein (objętość w oparciu o ilość niezbędną dla uzyskania wydajności 1000 ąg) miesza się z 0,2 ml roztworu wyjściowego peptydu (1 mg/ml) i roztwór doprowadza się do 2,2 ml przy za stosowaniu 0,9% NaCl.

Po inkubacji przez 2 godziny w 37°C, próbki (0,1 ml) pobiera się do zliczeń w ciekłym scyntylatorze w celu określenia całkowitej radioaktywności, gęstość pozostałej mieszaniny inkubacyjnej doprowadza się do 1,21 g/ml KBr i próbki zwirowywuje się przy 100000 rpm (300000 g) przez 24 godziny w 4°C w rotorze TLA 100.3 przy zastosowaniu ultrawirówki stołowej Beckman. Otrzymany supernatant frakcjonuje się, pobierając 5 frakcji po 0,3 ml próbki od góry każdej próbki i 0,05 ml każdej frakcji używa się do zliczeń w płynnym scyntylatorze. Górne dwie frakcje zawierają unoszące się lipoproteiny, inne frakcje (23-5) odpowiadają białkom/peptydom w roztworze.

9.6. Agoniści ApoA-I według wynalazku selektywnie wiążą lipidy HDL w ludzkim osoczu

9.6.1. Metoda doświadczalna

W celu wykazania, że agonoiści ApoA-I według wynalazku selektywnie wiążą białka HDL w ludzkim osoczu, 2 ml ludzkiego osocza inkubuje się z 20, 40, 60, 80 i 100 ąg peptydu wyznakowanego ¹⁴C przez 2 godz. w 37°C. Lipoproteiny wydziela się poprzez doprowadzenie gęstości do 1,21 g/ml i wirowanie w rotorze TLA 100,3 C przy 100000 rpm (300000 g) przez 36 godz. w 4°. Górne 900 ąl (jako frakcje po 300 ąl) pobiera się do analizy. W 50 ąl z każdej 300 ąl frakcji zlicza się radioaktywność i 200 ąl z każdej frakcji analizuje się poprzez FPLC (kombinacja kolumn Superose 6/Superose 12).

10. Przykład: Agoniści ApoA-I promują wypływ cholesterolu

W celu wykazania, że agoniści ApoA-I według wynalazku promują wypływ cholesterolu, komórki hepatomy HepG2 wysiewa się na płytki hodowlane z 6 studzienkami i hoduje do stadium zlewania się. Komórki znakuje się ³H-cholesterolem poprzez wysuszenie cholesterolu, a następnie dodanie 1% albuminy z surowicy wołu (BSA) w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), sonifikowanie roztworu i dodanie 0,2 ml takiego wyznakowanego roztworu i 1,8 ml pożywki hodowlanej do komórek tak, że każda kieszonka zawiera 2 ąCi radioaktywności. Komórki inkubuje się przez 24 godziny z pożywką do znakowania.

Kompleksy peptyd (lub białko): DMPC przygotowuje się w stosunku peptyd (lub białko): DMPC 1:2 (wag./wag.). W celu otrzymania kompleksów, peptyd lub natywne ludzkie. białko ApoA-I dodaje się do roztworu DMPC w PBS i inkubuje w temperaturze pokojowej przez noc, w którym to czasie następuje sklarowanie roztworu. Stężenie peptydu lub białka w końcowym roztworze wynosi około 1 mg/ml.

Pożywkę do znakowania usuwa się z komórek i komórki przemywa się PBS przed dodaniem kompleksów. Do każdej studzienki dodaje się 1,6 ml pożywki wzrostowej, a następnie kompleks peptyd (lub białko):DMPC i odpowiednią ilość PBS, aby doprowadzić do końcowej objętości 2 ml na studzienkę. Końcowe stężenie peptydu lub ApoA-I wynosi około 1, 2,5, 5 7,5 i 25 ąg/ml pożywki. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, pożywkę usuwa się, komórki przemywa 2 ml 1% BSA/PBS, a następnie dwukrotnie przemywa się 2 ml PBS. Ilość ³H-cholesterolu wypływającego do pożywki określa się poprzez zliczenia w płynnym scyntylatorze.

11. Przykład: Zastosowanie agonistów ApoA-I w zwierzęcych systemach modelowych.

Skuteczność agonistów ApoA-I według wynalazku wykazano na królikach. Wyniki pokazują, że podawanie agonistów ApoA-I zwiększa stężenie cząstek typu HLD w surowicy.

11.1. Otrzymywanie kompleksów fosfolipid/peptyd

Niewielkie dyskoidalne cząstki złożone z fosfolipidu (DPPC) i peptydu 146 (SEQ IN NO: 146) otrzymywano stosując metodę dializy cholanowej. Fosfolipid rozpuszczano w chloroformie i suszono w strumieniu azotu. Peptyd rozpuszczano w buforze (roztwór soli) w stężeniu 1-2 mg/ml. Błonę lipidową rozpuszczano ponownie w buforze zawierającym cholan (43°C) i dodawano roztwór peptydu w stosunku fosfolipid/peptyd 1-3. Mieszaninę inkubowano przez noc w 43°C, a następnie dializowano w 43°C (24 godz.), temperatura pokojowa (24 godz.) i 4°C (24 godz.) z trzema zmianami buforu (duże objętości) w temperaturze pokojowej. Kompleksy do zastrzyków sterylizowano poprzez filtrowanie (0,221) i przechowywano w 4°C.

PL 196 676 B1

11.2. Izolacja i charakteryzacja cząstek peptyd/fosfolipid

Cząstki oddzielano na kolumnach do sączenia molekularnego (Superose 6 HR). Pozycja piku zawierającego cząstki była identyfikowana poprzez mierzenie stężenia fosfolipidu w każdej frakcji. Na podstawie objętości po elucji, można określić promień Stokesa. Stężenie peptydu w kompleksie określono po przez oznaczenie zawartości fenyloalaniny (poprzez HPLC), a następnie przeprowadzono 16 godz. kwaśną hydrolizę.

11.3. Wstrzykiwanie królikom

Samcom królików New Zeland White (2,5-3 kg) wstrzykiwano dożylnie dawkę kompleksu fosfolipid/peptyd (8 mg/kg masy ciała peptydu 146 (SEQ IN NO: 146) lub 10 mg/kg masy ciała ApoA-I, wyrażone jako zawartość białka/peptydu) jako pojedynczy duży zastrzyk nie przekraczający 10-15 ml. Przed tym zabiegiem zwierzętom podawano lekki środek uspakajający. Próbki krwi (zbierane na EDTA) pobierano przed i 5, 15, 30, 60, 240 i 1440 minut po zastrzyku. Dla każdej próbki określano hematokryt. Próbki rozporcjowywano i przechowywano w -20°C przed analizą.

11.4. Analiza surowicy królika

Lipidy osocza. Całkowity cholesterol osocza, triglicerydy osocza i fosfolipidy osocza oznaczano enzymatycznie przy zastosowaniu dostępnych handlowo testów zgodnie z protokołami producentów (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy i Biomerieux, 69280, Marcy-1'etoile, Francja).

Profile lipoproteinowe. Profile lipoproteinowe osocza dla frakcji otrzymanych po rozdzieleniu osocza na frakcje lipoproteinowe określano poprzez odwirowanie w gradiencie sacharozy. Frakcje zbierano i w każdej z frakcji zmierzono enzymatycznie zawartość fosfolipidu i cholesterolu.

11.5. Wyniki

Profil lipoproteinowy dla królików, którym wstrzykiwano 8 mg/kg peptydu 146 (SEQ IN NO: 146) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC) jako funkcja czasu jest pokazany na fig. 9. Znaczący wzrost cholesterolu we frakcjach cholesterolu HDL (frakcje >1,06 mg/ml) jest widoczny po 5 minutach po wstrzyknięciu i trwa przez około 24 godziny.

Cholesterol w mieszanych frakcjach HDL, otrzymany poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, jest przedstawiony w tabeli XI, poniżej. Najwyższy wzrost cholesterolu HDL (90%) następuje po 240 min po podaniu. Po 24 godz. po podaniu wzrost wynosi nadal 71,2%.

Dane te wskazują, że podawanie kompleksów peptyd 146/DPPC (8 mg/kg) indukuje szybką i wydajną mobilizację obwodowego cholesterolu.

T a b e l a XI

Cholesterol HDL u królików po podawaniu 8 mg/kg peptydu 146 (SEQ IN NO: 146) lub 10 mg/kg natywnego ApoA-I

Czas (min)	Wzrost cholesterolu HDL (%) Natywny ApoAI	Wzrost cholesterolu HDL (%) Peptyd 146
5	19,3	31,3
15	16,0	60,4
60	15,8	42,9
240	-24,1	90,2
1440	*	71,2

* zwierzę padło przed punktem czasowym

12. Przykład: Przygotowanie kompleksu peptyd-lipid na drodze koliofilizacji Do otrzymywania kompleksów peptyd-lipid zastosowano na stępujący protokół.

Jeden mg peptydu 149 (PVLELFENLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO: 149), rozpuszczono w 250 μl metanolu do HPLC (Perkin Elmer) w 1 ml przeźroczystej kuwecie szklanej z pokrywką (Waters #WAT025054). Rozpuszczaniu się peptydu pomagano poprzez wytrząsanie od czasu do czasu na worteksie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Do tej mieszaniny dodawano porcje zawierające 3 mg dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC, Avanti Polar Lipids, 99% czystości, produkt #850355) z roztworu wyjściowego 100 mg/l w metanolu. Objętość mieszaniny doprowadzano do 400 μl dodając metanol i mieszaninę nadal wytrząsano na worteksie z przerwami przez okres 10 min w temperaturze pokojowej. Do probówki dodawano 200 μl ksylenu (Sigma-Aldrich 99% czystości, do HPLC) i probówki wytrząsano na worteksie przez 10 sekund. W wieczku probówki wykonano dwie małe dziurki igłą do strzykawki kaliber 20, probówkę zamrażano przez 15 sekund w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc pod próżnią. Do probówki dodawano 200 ml 0,9% roztworu NaCl. Probówkę wytrząsano na worteksie przez 20 sekund. W tym czasie roztwór w probówce miał mleczny wygląd. Probówkę inkubo72

PL 196 676 B1 wano następnie w łaźni wodnej przez 30 minut w 41°C. Roztwór stawał się przejrzysty (tj. wyglądający jak woda) po kilku minutach inkubacji w 41°C.

12.1. Charakteryzowanie kompleksów poprzez sączenie molekularne na Superose 6

Kompleksy peptyd-fosfolipid zawierające peptyd 149 (SEQ ID NO:149) otrzymywano poprzez koliofilizację tak, jak opisano powyżej. Preparat zawierał 1 mg peptydu i 3 mg DPPC, wagowo. Po zawieszeniu kompleksów w 200 ąl 0,9% NaCl, 20 ąl (zawierających 100 ąg peptydu 149) kompleksów nakładano na kolumnę Pharmacia Superose 6 przy zastosowaniu 0,9% NaCl jako fazy ciekłej przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. Chromatografię śledzono poprzez pomiar absorbancji lub rozpraszanie światła o długości fali 280 nm. Zbierano frakcje po 1 ml. Próbki zawierające 20 ąl frakcji testowano pod kątem zawartości fosfolipidów przy zastosowaniu zestawu bioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Większość zarówno fosfolipidów, jak i absorpcji UV, odzyskiwano razem w kilku frakcjach z pikami przy około 15,8 ml. Ta objętość elucji opowiada średnicy Stokesa 87 angstremów.

Dla porównania, odrębny rozdział chromatograficzny przeprowadzono dla 20 ąl ludzkiego HDL2 w tych samych warunkach i stosując taką samą kolumnę, jak dla kompleksów z peptydem 149. HDL2 przygotowano jak następuje: 300 ml zamrożonego ludzkiego osocza (Mannheim Blutspendzentrale #1185190) rozmrożono, doprowadzono do gęstości 1,25 stałym bromkiem pota sowym i wirowano przez 45 godzin przy 40000 rpm używając rotora Ti45 (Beckman) w 20°C. Unoszącą się warstwę zebrano, dializowano wobec wody destylowanej, doprowadzano do gęstości 1,07 stałym bromkiem potasowym i wirowano tak, jak opisano powyżej przez 70 godzin. Spodnią warstwę (na poziomie około 1 cm powyżej dna probówki) zbierano, doprowadzono do stężenia 1,01% azydku sodu i przechowywano w 4°C przez 4 dni do czasu wykonania chromatografii. Wypływ z kolumny śledzono poprzez pomiar absorbancji lub rozpraszanie światła o długości fali 254 nm. Serie białek o znanych masach cząsteczkowych i średnicy Stokesa zastosowano jako standardy do kalibracji kolumny w celu obliczenia średnicy Stokesa cząstek (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual, Pharmacia La-boratory Separation, Piscataway, NJ, skorygowano kwiecień, 1985). HDL2 wymywany przy objętości retencji 14,8 ml odpowiada średnicy Stokesa 108 nm.

13. Przykład: Otrzymywanie przeciwciał

W celu otrzymania przeciwciał wobec agonistów ApoA-I według wynalazku, peptyd łączy się hemocyjaniną ze skałoczepa (KLH, 1 mg peptydu do 10 mg KLH). Koniugat KLH (LGM) zawiesza się w kompletnym adiuwancie Freunda i wstrzykuje królikom w czasie 0, a następnie wstrzykuje się ponownie 0,25 mg koniugatu KLH po 4 tygodniach i jeszcze raz po 5 tygodniach. Krew pobraną przed immunizacją i sześć tygodni po immunizacji testuje się pod kątem miana przeciwciał wobec oryginalnego antygenu przy zastosowaniu testu ELISA.

Krew z przeciwciałami zbiera się z 2 królików i łączy. Przeciwciała skierowane jedynie wobec antygenów peptydowych izoluje się jak następuje:

1. Wolny peptyd łączy się ze złożem Sepharose 4B (Pharmacia) aktywowanym bromocyjanem według protokołu producenta.

2. Surowice odpornościowe preadsorbuje się na kolumnie z nieistotnym ludzkimi i mysimi białkami i z antygenem surowicy

3. Surowice odpornościowe poddane preadsorpcji przepuszcza się przez kolumnę z odpowiednim peptydem (patrz punkt 1).

4. Kolumny przemywa się roztworem soli buforowanym 0,1 M boranem (pH 8,2) i związane przeciwciała wymywa się przy zastosowaniu skokowego gradientu niskiego pH od pH 4,0 do pH 3,0 do pH 2,0 (0,1 M bufor glicynowy), a na koniec 0,1 M HCl.

5. Wymyty materiał neutralizuje się nadmiarem soli fizjologicznej buforowanej boranem, zatęża się poprzez ultrawirowanie (Amicon, YM30) i dializuje wobec soli fizjologicznej buforowanej boranem.

6. Stężenie białka określa się poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm.

7. Otrzymane w rezultacie przeciwciała testuje się pod kątem specyficzności gatunkowej przy zastosowaniu ludzkiej ApoA-I lub oczyszczonej mysiej ApoA-I w bezpośrednim teście wiązania ELISA.

Zakres wynalazku nie ma być ograniczony do opisanych tu konkretnych wykonań, których zamiarem jest jedynie zilustrowanie poszczególnych aspektów wynalazku, a funkcjonalnie równoważne sposoby i składniki mieszczą się w zakresie wynalazku. W rzeczywistości, różnorodne modyfikacje wynalazku, poza pokazanymi i opisanymi tutaj, będą oczywiste dla znawców w tej dziedzinie na podstawie powyższego opisu i towarzyszących mu rysunków. Takie modyfikacje winny pozostać w zakresie wyznaczonym przez dołączone zastrzeżenia.

Wszystkie cytowane tu odnośniki literaturowe są dołączone jako odniesienie dla wszelkich celów.

PL 196 676 B1

LISTA SEKWENCJI (1) OGÓLNA INFORMACJA (i) Zgłaszający: Dasseux, Jean Louis

Sekul, Renate Buttner, Klaus Metz, Gunther (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Agoniści apolipoproteiny A-I i ich zastosowanie do leczenia zaburzeń dyslipidemicznych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 254 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI (A) ADRESAT: Pennie & Edmonds LLP (B) ULICA: 1155 Avenue of the Americas (C) MIASTO: Nowy Jork (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY: 10036-2811 (v) FORMA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSEQ Version 2.0 (vi) DANE O OBECNYM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US98/20326 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28 września 1998 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE O UPRZEDNIM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/940.096 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 29 września 1997 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU/PEŁNOMOCNIKU:

(A) NAZWISKO: Coruzzi, Laura A (B) NUMER REJESTRACYJNY: 30,742 (C) NUMER REFERENCJI/SPRAWY: 9196-005-228 (vi) INFORMACJA O TELEKOMUNIKACJI:

(A) TELEFON: 650-493-4935 (B) TELEFAX: 650-493-5556 (C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy

PL 196 676 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 16 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:2 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:3 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 676 B1 (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:5 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys Lys ²⁰ , (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:7 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:8 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys /

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO:9 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:10

PL 196 676 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 17 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala Xaa Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:11:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15 /

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Gly Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:13:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 18
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJĄ:	20
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	22
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15

Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy

PL 196 676 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:16:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:16:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:17:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:17:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:18:

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:19:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:19:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:20:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa .

(ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:20:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 676 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak .

(ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

Gin Lys Leu Lys ¢2) INFORMACJA O SEQ ID NO:23:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:23:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:24:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:24:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Glu

10 15

Lys Lys Leu Lys .

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

PL 196 676 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	13
(D) INNA INFORMACJA: Xaa

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:25:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:26:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:26:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:27:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:28:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:29:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:29:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNA INFORMACJA: N-końcowy dansylowany peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:31:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:32:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:32:

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:33:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:34:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 5 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Naftyloaalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:

Pro Val Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:35:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

Pro Val Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

PL 196 676 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:36:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:37:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:38 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:38:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Trp Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:39: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy

PL 196 676 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:39:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala Leu Lys 15 10 15

Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:40:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:40:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Gin 15 10 15

Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:41:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:41:

Pro Val Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 676 B1 (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:42

Pro Val Leu Asp Glu	Phe Arg Glu Lys	Leu Asn Glu Xaa	Trp Glu Ala Leu Lys
1 5		10	15
Gin Lys Leu Lys
20
(2) INFORMACJA 0 SEQ	ID NO:43:
(i) CHARAKTERYSTYKA	SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:43:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNA INFORMACJA: Wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D (ix) CECHA:

PL 196 676 B1

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa	= Aib
) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID	NO:44:
Val	. Leu Asp Glu	Phe Arg	Glu Lys

10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa	= Aib
) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID	NO:45:
Val	Leu Asp Glu	Phe Arg	Glu Lys

10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:	Xaa	= Aib
) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ	ID	NO:46:
Val	. Leu Asp Leu	Phe	Arg	Glu Lys

10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:47:

PL 196 676 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = D-Pro (ix) CECHA:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	2
(D)	INNA INFORMACJA: Xaa

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala Leu Glu 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:	Xaa	= Aib
) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ	ID	NO:50:
Val	Leu Asp Leu	Phe	Arg	Glu Leu

10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:	Xaa	= Aib
(xi) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ	ID	NO:51:
Pro Val	Leu Asp Leu	Phe	Trp	Glu Leu

10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:52: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:52:

Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:53:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:53:

Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	13
(D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:54

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:55:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:55:

Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:56:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:56:

Gin Lys Lys Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

PL 196 676 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala Leu Glu 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA: :

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:59:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:59:

Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:60:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys

10 15

Gin (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:	; brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	13
(D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib
(xi) OPIS SEKWENCJI;	; SEQ ID NO:61

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii) TYP CZĄSTECZKI;	; brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	13
(D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys

5

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:63:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:64:

Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:65:

PL 196 676 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	12
(D)	INNA INFORMACJA: :

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:66:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:66:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala Leu Gin 15 10 15

Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

PL 196 676 B1

Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:68: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:69:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 1 5 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 676 B1 (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

<xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

Pro Val Leu. Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2} INFORMACJA O SEQ ID NO:71:

U) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	14
(D) INNA INFORMACJA: Xaa

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:71:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

100

PL 196 676 B1 (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:72:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:73:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNA INFORMACJA:

= Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

PL 196 676 B1

101

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:75:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:	; brak
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B) LOKALIZACJA:	13
(D) INNA INFORMACJA: Xaa

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

102

PL 196 676 B1 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:77:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:78:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:79:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1

103 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:80:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asp Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNA INFORMACJA: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:81:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)

DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów

TYP: aminokwas (B) (C) (D)

RODZAJ NICI: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa

104

PL 196 676 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 11 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:82:

Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:83:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) (C)

TYP: aminokwas

RODZAJ NICI: pojedyncza

PL 196 676 B1

105 (D)

TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:84:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:85:

Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala 15 10 15

106

PL 196 676 B1

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:87:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

PL 196 676 B1

107

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu rp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 10 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

108

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) (B) (C) (D)

DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy TYP: aminokwas RODZAJ NICI: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (A) (B)

RODZAJ NICI: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix) CECHY:

(A) (B)

NAZWA/KLUCZ: Inne

LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 196 676 B1

109 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:92:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (A) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:93:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:94;

110

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:95:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:95:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:96:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D

PL 196 676 B1

111 (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:96:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 15 10 15 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:98:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

112

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:95:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:100:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:101:

PL 196 676 B1

113 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:101:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(C)	LOKALIZACJA:	13
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa =	= Aib

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

114

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:104:

Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak

PL 196 676 B1

115 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:105:

Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Gin Lys Ala Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15 .

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

116

PL 196 676 B1

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:108:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:109:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:109:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1

117 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:110:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13

118

PL 196 676 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:111:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:112:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

119 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:113:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:114:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:114:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13

120

PL 196 676 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi, OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:115:

Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (ix, CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SĘKWENCJI: SEQ ID NO:116:

Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:117:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

121 (A) (C) (D)

NAZWA/KLUCZ: Inne

LOKALIZACJA: 13

INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:117:

Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:118:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:119:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

122

PL 196 676 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:119:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 676 B1

123 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:121:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:122:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys .

(2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:123:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

124

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:124 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 18
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(C)	LOKALIZACJA:	20
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:124: ,

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

125 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:125:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:126:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:127:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

126

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:128:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:129:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:129:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:130:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas

PL 196 676 B1

127 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:130:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:131:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Arg Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala

128

PL 196 676 B1

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:133:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas ' (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:133:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gin Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:134:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Asn Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:135:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 676 B1

129 (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:135:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:136:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

130

PL 196 676 B1 (C) LOKALIZACJA: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:138:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:139:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:139:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 196 676 B1

131 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:140:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne
(C) (D)	LOKALIZACJA: 18 INNE INFORMACJE: Xaa = Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ: Inne
(C)	LOKALIZACJA: 20
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa = Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ: Inne
(C)	LOKALIZACJA: 22
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa = Orn

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:140:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:141:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

132

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:141:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:142:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: peptyd acetylowany na N końcu i amidowa ny na C końcu (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:143:

PL 196 676 B1

133

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:144:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (C) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:144:

Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:145:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:145:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

134

PL 196 676 B1 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:146:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:146:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:147:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:147:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:148:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

PL 196 676 B1

135 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:148:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:149:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:149:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:150:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:150:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

136

PL 196 676 B1

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:151:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:151:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:152:

Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:153:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas

PL 196 676 B1

137 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:153:

Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:154:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:155:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:155:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala

138

PL 196 676 B1

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:156:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:157:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:157:

Pro Val Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:158:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 196 676 B1

139 (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:158:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:159:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:159:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:160:

140

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:161:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:161:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:162:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

141 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:163:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:164:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:164:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:165:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:165:

142

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:166:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:166:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:167:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:167:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NO:168:

PL 196 676 B1

143 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:168:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) Informacje dla SEQ ID NO: 169:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	brak
(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	170:
Pro Val	Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Lys	Leu Leu Asp Ala
1	5		10	15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) Informacje dla SEQ ID NO: 170:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

144

PL 196 676 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa=Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa=Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa=Orn (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa=Orn

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa

2) Informacje dla SEQ ID NO: 171:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 171:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu

PL 196 676 B1

145

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 172:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	172:
Pro	Val Leu Glu Leu Phe	Leu Asn Leu	Leu Glu Arg	Leu Gly Asp Ala
1	5		10	15
Leu	Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 173:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 173:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Ans Lys Lys Leu Lys (2) Informacje dla SEQ ID NO: 174:

146

PL 196 676 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

(ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: Inne
(B) LOKALIZACJA: 1...	.22
(D) INNE INFORMACJE:	Wszystkie aminokwasy są w	konfiguracj i

D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 174:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 175:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	175:
Pro	Val	Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu Glu Leu
1		5		10	15
Leu	Ans	Lys Lys Leu Lys

PL 196 676 B1

147

2) Informacje dla SEQ ID NO: 176:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA;	; liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI;	; brak
	(xi) OPIS SEKWENCJI;	: SEQ ID NO:	176:
Pro	Val Leu Glu Leu Trp	Glu Asn Leu	Leu Glu Arg	Leu Leu Asp Ala
1	5		10	15
Leu	Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 177 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:	177:
Gly 1	Val	Leu Glu Leu Phe 5	Leu Asn Leu	Leu Glu Arg 10	Leu Leu Asp Ala 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20

2) Informacje dla SEQ ID NO: 178:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

148

PL 196 676 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 178:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg

2) Informacje dla SEQ ID NO: 179:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	; liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	179:
Pro	Val	Leu Glu Leu Phe	Asp Asn Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu Asp Ala
1		5		10	15
Leu	Gin	Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 180:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 180:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala

PL 196 676 B1

149

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 181:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	181:
Pro	Val Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Arg Trp	Leu Asp Ala
1	5		10	15
Leu	Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 182:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii:	1 TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	i OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	182:
Pro	Val	Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Lys	Leu Leu Glu Ala
1		5		10	15
Leu	Gin	Lys Lys Leu Lys

150

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 183:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	183:
Pro	Val Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Lys	Leu Leu Asp Ala
1	5		10	15
Leu	Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 184:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:	184:
Pro	Val	Leu Glu Leu Phe	Leu Asn Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu Asp Ala
1		5		10	15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys 20

2) Informacje dla SEQ ID NO: 185:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa

PL 196 676 B1

151 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

CECHY:
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	19
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	20
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=0rn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	22

(ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 185:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa

2) Informacje dla SEQ ID NO: 186:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	186:
Pro	Val	Leu Glu Leu Phe	Glu Gin Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu Asp Ala
1		5		10	15
Leu	Gin	Lys Lys Leu Lys

152

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 187:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	187:
Pro	Val Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Arg	Leu Leu Asp Ala
1	5		10	15
Leu	Asn Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 188:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 188:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 189:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

153 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:	189:
Asp	Val	Leu Glu Leu Phe	Glu Asn Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu Asp Ala
1		5		10	15
Leu	Gin	Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 190:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	190:
Pro	Val	Leu Glu Phe Trp	Asp Asn Leu	Leu Asp Lys	Leu Leu Asp Ala
1		5		10	15
Leu	Gin	Lys Lys Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 191:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

154

PL 196 676 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 191:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 192:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 193:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa

PL 196 676 B1

155 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza <D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 193:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 194:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 194:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

156

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 195:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 195:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 196:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 196:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys

10 15

Leu Lys

PL 196 676 B1

157

2) Informacje dla SEQ ID NO: 197:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 197:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 198:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 198:

158

PL 196 676 B1

Gin Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 199:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 199:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 200:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18

PL 196 676 B1

159 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 200:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 201:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 201:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 202:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne

160

PL 196 676 B1 (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 202:

Pro Ala Leu Gin Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Arg

2) Informacje dla SEQ ID NO: 203:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 203:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 204:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 196 676 B1

161 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 204:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys ¹ 5 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 205:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 205:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu trp Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 206:

162

PL 196 676 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 206:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 207:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 207:

Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

PL 196 676 B1

163

2) Informacje dla SEQ ID NO: 208:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 208:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 209:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 209:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 210

164

PL 196 676 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	210:
Pro	Val	Leu Asp Leu Phe	Arg Glu Leu	Leu Glu Glu	Leu Leu Gin Lys
1		5		10	15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 211:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 14
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	16
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	18
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn

PL 196 676 B1

165 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 211:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 15 10 15

Leu Xaa

2) Informacje dla SEQ ID NO: 212:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	7
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	14
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn
(A)	NAZWA/KLUCZ:	Inne
(B)	LOKALIZACJA:	16
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa=Orn

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 212:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 15 10 15

Leu Xaa

166

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 213:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 213:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 214:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1 (D) INNE INFORMACJE: Pro w konfiguracji D

PL 196 676 B1

167 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 214:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 215:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 215:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gin Gin 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 216:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 216:

168

PL 196 676 B1

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 217:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	217:
Pro	Val	Leu Asp Leu Phe	Arg Glu Leu	Leu Glu Leu	Leu Lys Gin Lys
1		5		10	15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 218:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 218:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

PL 196 676 B1

169

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 219:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	219:
Pro	Val	Leu Asp Leu Phe	Arg Glu Leu	Leu Asn Glu	Leu Trp Gin Lys
1		5		10	15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 220:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	; liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	220:
Pro 1	Val	Leu Asp Leu Phe 5	Arg Glu Leu	Leu Glu Glu 10	Leu Gin Lys Lys 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 221:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa

170

PL 196 676 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 221:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 222:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	222:
Pro	Val	Leu Asp Ala Phe	Arg Glu Leu	Leu Glu Ala	Leu Leu Gin Leu
1		5		10	15

Lyu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 223:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

171 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 223:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gin Les 15 10 15

Lys Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 224:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
	(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	224:
Pro 1	Val	Leu Asp Leu Phe 5	Arg Glu Gly	Trp Glu Glu Leu Lys 10	Gin Lys 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 225:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	225:
Pro	Val	Leu Asp Ala Phe	Arg Glu Leu	Ala Glu Ala	Leu Ala Gin Leu
1		5		10	15

Lys Lys

172

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 226:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	226:
Pro	Val	Leu Asp Ala Phe	Arg Glu Leu	Gly Glu Ala Leu	Leu Gin Leu
1		5		10	15

Lys Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 227:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 227:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 228:

PL 196 676 B1

173 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń· cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 228:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 229:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 229:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

174

PL 196 676 B1

2) Informacje dla SEQ ID NO: 230:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	230:
Pro 1	Val	Leu Glu Leu Phe 5	Glu Arg Leu	Leu Glu Asp 10	Leu Gin Lys Lys 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 231:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	231:
Pro	Val	Leu Asp Leu Phe	Arg Glu Leu	Leu Glu Lys	Leu Glu Gin Lys
1		5		10	15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 232:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

175 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 232:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

2) Informacje dla SEQ ID NO: 233:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 233

Ta sekwencja została pominięta celowo

2) Informacje dla SEQ ID NO: 234:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

176

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 234:

Ta sekwencja została pominięta celowo

2) Informacje dla SEQ ID NO: 235:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 235:

Ta sekwencja została pominięta celowo

2) Informacje dla SEQ ID NO: 236:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) RODZAJ NICI:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 236:

Ta sekwencja została pominięta celowo

2) Informacje dla SEQ ID NO: 237:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa

PL 196 676 B1

177 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

	(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	237 :
Leu	Asp	Asp Leu Leu Gin	Lys Trp Ala	Glu Ala	Phe Asn Gin Les Leu
1		5		10	15

Lys Leu

2) Informacje dla SEQ ID NO: 238:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 238:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 239:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

178

PL 196 676 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 239:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 240:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 240:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 241:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów

PL 196 676 B1

179 (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza

		(D) TOPOLOGIA:	: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	241:
Asp 1	Trp	Phe Lys Ala Phe 5	Tyr Asp Lys	Val Phe Glu Lys 10	Phe Lys Glu 15

Phr Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 242:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	242:
Gly	Ile	Lys Lys Phe Leu	Gly Ser Ile	Trp Lys	Phe Ile Lys Ala Phe
1		5		10	15

Val Gly

2) Informacje dla SEQ ID NO: 243:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 243:

180

PL 196 676 B1

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Ala Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 244:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	; brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	; SEQ ID NO:	244 :
Asp	Trp	Leu Lys Ala Phe	Tyr Asp Lys	Val Ala Glu Lys	Leu Lys Glu
1		5		10	15

Ala Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 245:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 245:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 246:

PL 196 676 B1

181 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	<xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	246:
Glu	Trp	Leu Glu Ala Phe	Tyr Lys Lys	Val Leu Glu Lys	Leu Lys Glu
1		5		10	15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 247:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:	247:
Asp 1	Trp	Phe Lys Ala Phe 5	Tyr Asp Lys	Phe Phe Glu Lys 10	Phe Lys Glu 15

Phe Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 248:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

182

PL 196 676 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 248:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 249:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 249:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 250:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18

PL 196 676 B1

183 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 250:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 251:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 251:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe

2) Informacje dla SEQ ID NO: 252:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

184

PL 196 676 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...15 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 252:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gin Lys Leu Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 253:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 253:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 254:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

PL 196 676 B1

185 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 254:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gin Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 255:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...15 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 255:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gin Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 256:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

186

PL 196 676 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na końcu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 256:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 257:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 257:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gin Lys 15 10 15

2) Informacje dla SEQ ID NO: 258:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 196 676 B1

187 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Inne (B) LOKALIZACJA: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: Acetylowana na końcu N i amidowana na koń cu C (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 258:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji

LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i obejmuje:

(i) 22 do 23 reszt peptydu lub jego analogu, który tworzy amfipatyczną α-helisę w obecności lipidów i który obejmuje wzór strukturalny (I):

^Z1^-X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-X19^-X20^-X21^-X22^-X23^-Z2 lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól, przy czym:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) lub D-Pro (p);

X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza resztę alifatyczną;

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Glu (E) lub Leu (L);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza resztę kwaśną;

X12 oznacza Arg (R);

X13 jest Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza resztę zasadową;

X20 oznacza resztę zasadową;

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza resztę zasadową;

X23 jest nieobecny lub oznacza resztę zasadową;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza C(O)NRR, -C(O)OR lub -C(O)OH lub ich sól;

każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkiloaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl lub 1 do 7 resztowy peptyd lub jego analog;

188

PL 196 676 B1 każdy - między resztami X1 - X23 niezależnie oznacza połączenie amidowe, połączenie amidowe podstawione -C(O)NR, gdzie R oznacza (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, ewentualnie aryl, izoster amidu, gdzie izoster oznacza -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis i trans), -C(O)CH2-, -CH(OH)CH2 lub -CH2SO-; albo (ii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I), w której przynajmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X₅, X₆, X₇, X₈, X_9, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂ lub X₂₃ jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.
2. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi zmienioną postać wzoru strukturalnego (I).
3. Agonista ApoA-I według zastrz. 2, znamienny tym, że reszty hydrofobowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) a przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.
4. Agonista ApoA-I według zastrz. 3, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G), Asn (N) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X21 oznacza Leu (L); i przynajmniej jedna z X4, X7, X8, X11, X12, X15, X18, X19, X22 i X23 są konserwatywnie podstawione inną resztą.
5. Agonista ApoA-I według zastrz. 2, znamienny tym, że reszty hydrofilowe są ustalone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) a przynajmniej jedna nieustalona reszta jest konserwatywnie podstawiona przez inną resztę.
6. Agonista ApoA-I według zastrz. 5, znamienny tym, że:

X4 oznacza Glu (E);

X7 oznacza Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X11 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X15 oznacza Asp (D);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X22 oznacza Lys (K);.

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K); i przynajmniej jeden z X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiony inną resztą.
7. Agonista ApoA-I według zastrz. 5, znamienny tym, że X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L), X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G) i przynajmniej jedną z reszt X1, X2, X5, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą .
8. Agonista ApoA-I według zastrz. 4 albo 6, znamienny tym, że reszta podstawiająca jest klasyfikowana w tej samej podkategorii jak reszta podstawiana.
9. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi peptyd lub analog peptydu o 22-23 resztach, o wzorze strukturalnym (I).
10. Agonista ApoA-I według zastrz. 9, znamienny tym, że: - między resztami oznacza

-C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; i Z2 oznacza -C(O)OH lub jego sól.
11. Agonista ApoA-I według zastrz. 10, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Asp (D), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

PL 196 676 B1

189

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Glu (E);

X5 oznacza Leu (L);

X6 oznacza Phe (F);

X7 oznacza Leu (L) lub Glu (E);

X8 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznacza Glu (E);

X12 oznacza Arg (R);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D);

X16 oznacza Ala (A);

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K);

X23 jest nieobecny lub oznacza Lys (K).
12. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że X23 jest nieobecny.
13. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że każdy z X10, X13 i X14 jest inny niż

Gly (G).
14. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, znamienny tym, że każdy z X10, X13 i X14 oznacza Gly (G) a pozostałe reszty są inne niż Gly (G).
15. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy złożonej z:

i.SEO ID HO: 144) i SEQ ID HO;· 14 5) i SEQ ID NO:146) i CEO ID HO: 14··’!

(SEQ ID HO:148) < SSQ TO HO:14θ) (SSQ TO HO;150) (SSQ ID HO: 151) (SEQ ID HO;153) (SSQ ID KO:i53 5 (SEQ IO HO:154) (SEQ ID KO :155) pyDEbEEKŁDEREI.DAlOKKDK; GVDEbFEHDDEREHDAlQKKI.K; RVDEEFEK1.DERDDDALQKKDK; FVDEDPEHI,5ERLFDAI.CKHDX; PVLEŁEEKI,bERLGDALQKKbK; PVbEDFEKLWEKLbDAX.QKKL,K ; PLLELFEKŁŁERŁLDAXQKKl.K; PVLEE?EKLGSRŁLDALQKKLK: : P V _?EL FENLLERLWALOKKLK ; AVbEL?EHLLSRLWALQKKbK ; PVLEbF3KLLERCWM-QXXLK; PVLSl»?LfłVWSRLLDAEQXXI.X:

i acylowane na N-końcu i/lub amidowane na C-koń cu lub ich zestryfikowane postacie.
16. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (II):

(II) HH-{LLm-HH}nLLm-HH lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól, przy czym każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 10; każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1; każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; i każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.
17. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (III):

190

PL 196 676 B1 (III) X-Nya-X(ya-1)-(Nyb-X(yb-1))p lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól, przy czym każdy X oznacza niezależnie HH-(LLm-HH)nLLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1;

każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik;

każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8;

Nya i Nyb oznacza każdy niezależnie multifunkcyjną cząsteczkę łącznika, gdzie ya i yb oznacza liczbę grup funkcyjnych odpowiednio na Nya i Nyb; każdy ya lub yb oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 3 do 8; p oznacza liczbę całkowitą od 0 do 7; i każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.
18. Multimeryczny agonista ApoA-I, znamienny tym, że wykazuje przynajmniej około 38% aktywności aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i ma wzór strukturalny (IV) lub (V):

lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól, przy czym każdy X oznacza niezależnie HH-(LLm-HH)nLLm-HH;

każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 1;

każdy LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik;

każdy n oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1;

każdy m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 8;

R1 oznacza -OR lub -NRR; i każdy R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinyl, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkiloaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkiloheteroaryl.
19. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że bifunkcjonalny łącznik może ulegać cięciu.
20. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że n oznacza 0.
21. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 19, znamienny tym, że m oznacza 0.
22. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 10.
23. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 11.
24. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że każdy HH oznacza niezależnie peptyd jak określono w zastrz. 15.
25. Kompleks agonista ApoA-I-lipid obejmujący agonistę ApoA-I i lipid, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 1, multimeryczny agonista ApoA-I jak okrePL 196 676 B1

191 ślono w zastrz. 16, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 17, lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 18.
26. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 9.
27. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 10.
28. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 11.
29. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 15.
30. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że lipid stanowi sfingomielina.
31. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że lipid jest w postaci liofilizowanego proszku.
32. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 25, znamienny tym, że ma postać roztworu.
33. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik, przy czym agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 1, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 16, multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 17, lub multimeryczny agonista ApoA-I jak określono w zastrz. 18.
34. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 9.
35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 10.
36. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 11.
37. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak określono w zastrz. 15.
38. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 33 albo 34, albo 35, albo 36, albo 37, znamienna tym, że agonista ApoA-I ma postać kompleksu agonista ApoA-I-lipid zawierającego agonistę ApoA-I i lipid.
39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 38, znamienna tym, że agonista ApoA-I-lipid ma postać liofilizowanego proszku.
40. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia zaburzenia związanego z dyslipidemią, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I jak określono w zastrz. 1 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalanik.
41. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że agonista ApoA-I jest w postaci kompozycji farmaceutycznej, przy czym wymieniona kompozycja zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.
42. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym wymieniony kompleks zawiera agonistę ApoA-I i lipid.
43. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi hipercholesterolemia.
44. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi choroba sercowo-naczyniowa.
45. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi miażdżyca tętnic.
46. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi ponowne zwężenie.
47. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi niedobór HDL lub ApoA-I.
48. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi hipertriglicerydemia.
49. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zaburzenie związane z dyslipidemią stanowi zespół metaboliczny.

192

PL 196 676 B1
50. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia wstrząsu septycznego, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I jak określono w zastrz. 1 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, zaróbkę lub rozcieńczalnik.
51. Kompozycja według zastrz. 40 albo 50, znamienna tym, że wytwarzany lek przeznaczony jest do leczenia ludzi.
52. Kompozycja według zastrz. 40 albo 50, znamienna tym, że wytwarzany lek przeznaczony jest do podawania w dawce około 0,5 mg/kg do około 100 mg/kg agonisty ApoA-I.
53. Zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono w zastrz. 16 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.
54. Zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono w zastrz. 17 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.
55. Zastosowanie multimerycznego agonisty ApoA-I jak określono w zastrz. 18 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dyslipidemii i/lub wstrząsu septycznego.