JPS60501710A - カルシトニン様活性を有する新規なペプチドホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、１９８３年６月２９日に出願された係属中の米国出願第５０９，１ ２３号の部分継続出願である。

この明細書に記載される発明は、ザ・ナショナル・インスティテユート・オブ・ ヘルスからの許可のもとに行われた。

この発明は、カルシトニン様活性を示す新規なペゾチドホルモン、その医薬とし て許容される非毒性塩、このホルモンを含有する組成物、及びこのホルモンの投 与により血清カルシウムレベルを低下させる方法に関する。

カルシトニンは、小胞周縁（ｐａｒａｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　）細胞によって産 生される約３，５００ダルトンの分子量を有するペゾチドホルモンであり、これ らの細胞は哺乳動物においては甲状腺全体に分布している−が、下等動物におい ては個別の器官である先後部体（ｕｌｔｉｍｏｂｒａｎｃｈｉａｌ　ｂｏｄｙ　 ）を構成する。このホルモンは、上皮小体（ｐａｒｂｔｈｙｒｏｉｄ　）ホルモ ンの骨効果及び腎効果に対抗し、そしてカルシウムの骨吸収を阻害することによ って血清カルシウム濃度を制御し、低カルシウム血症、低燐酸血症、及び尿カル シウム濃度の低下をもたらす。従って、カルシトニンはベーゼ、ト病、上皮小体 機能弘進症、乳児の自然発生過カルシウム血症、骨溶解性骨転移の治療において 、及びビタミンＡ及びＤの過剰投与の骨溶解効果を中和するた、めに使用される 。

少なくとも７つの異る種からのカルシトニン、及びサケカルシトニンの２種類の アイソホルモンが配列決定されそして生物学的に特徴付けられ、そして多数の合 成類似体が研究されているが、構造と機能との間の明確な関連付けはほとんど行 われていない。

このホルモンの共通の形は３２個のアミノ酸から成り１位と７位のシスティン間 にジスルフィド橋を有し、そしてカルブキシ末端にグロリンアミドを有する。カ ルシトニンのすべての天然形は１５位に親水性アミノ酸、通常はアスパラギン酸 又はグルタミン酸を有する。補乳動物形はすべて１２位、１６位及び／又は１９ 位に芳香族アミノ酸を有し、先後部（ゾチドはこれを有しない。群として、哺乳 動物カルシトニンは先後部由来のカルシトニンに比べて１０観点（Ｐｅｅｌｌｅ ＋ん９編）　（Ｋｘｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉａ　＊ゾリンセトン、Ｎ、Ｊ、１９８ １）〕。種々のカルシトニンの構造は相互に顕著に異シ、ヒトカルシトニンは３ ２残基中１８個においてブタカルシトニント異る。１位及び７位のシスティンが ２−アミノオクタンジオン酸によって置換されてシスティンのジスルフィド橋が エチレン橋に変っている類似構造になることかできることが一般に認識されてい る。一般的概論についてはＭａｃＩｎｔｒｅｙｒｅ　ｅ　１．　＊　１．Ｍ、Ａ 、　Ｅｖａｎｓ　、　Ｈ，Ｈ，Ｇ。

Ｈｏｂｉｔｚ　ｅ　Ｇ、Ｆ、　Ｊｏｐｌｉｎ　＋及びＪ、Ｃ，５ｔｅｖｅｎｓｏ ｎ　＋アースリシス・アンド・リューマチスム（Ａｒｔｈ、Ｒｈｅｕｍ）２３　 ：　１１３９−１１４７　（１９８０）　：　Ｇｕｔｔｍａｎ　。

前掲、を参照のこと。

その医療的価値のため、カルシトニンは大きな需要がある。公知のカルシトニン 及びその類似体の内、３種類すなわちサケ、ブタ、及びヒトのカルシトニンが商 業的に入手できる。ブタカルシトニンはブタの器官から単離精製され非常に高価 でちゃ−他方サケ及びヒトカルシトニンは主としてイン−ビトロ合成される。サ ケカルシトニンは公知のカルシトニンの中で最も活性が強く、そしてブタカルシ トニン、は商業的に入手できる哺乳動物カルシトニン中量も活性が高い。しかし ながら、外来性カルシトニンは抗原反応を誘発する傾向があり、そしてヒトカル シトニンは活性が弱いので、カルシトニン様活性を有する改良された合成代替ペ ゾチドホルモンが必要である。

Ｍａｉｅｒ＋　Ｒ，＊　Ｂ、Ｋａｍｂｅｒ　＊　Ｂ、Ｒ１ｎ１ｋｅｒ　ｒ及びＷ 。

Ｂｉｔｔｅｌ　、クリニアル・エンドクリノロジー（Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、）５　（５ｕｐｐ１．）：　３３２−３３２（１９７６）は 、ヒトカルシトニンの１２位、１６位及び１９位の芳香族アミノ酸をロイシンで 逐次的に置き換えることによシその活性が有意に増加することを示した。しかし ながら、彼らは能力においてサケカルシトニンと同じ活性を有する類似体を得る ことができなかった。従って、これらの化合物を変形【７て、有効性を失うこと なく望ましい医薬としての特性、例えば増加した半減期又は経口活性を導入する ことができるように、活性のために要求される因子をさらに理解することが必要 である。

今や、次の式（Ｉ）ニ ーＲａ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｒ、ｏ　−Ｒ１ｌ−Ｒ１２−Ｒｌｓ　−Ｒ１４−Ｌｅ　 ｕ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｒ１７−Ｌｙ９−−Ｒ１９−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｒ２２−Ｐｒ ｏ−Ｒ２４−Ｒ２５”９６　”２７−Ｒ２８−Ｒ２９”’Ｒ１は次の基： ５ から成る群から選ばれた部分であり； Ｒ１〜Ｒ２□はアミノ酸部分であって、ここで、Ｒ２は任意部分であって、存在 する場合にはＳｅｒ及びＧｌｙから成る群から選ばれ、 Ｒ８はＬｅｕ又はＭａｌであシ、 ”１０はＧｌｎ　ｅ　Ｌｙｓ又はＧ１７であシ、”１１　’　Ｒ１４及びＲ２０ はそれぞれ独立にＧｉｎ及びＬ７ｍから成る群から選ばれ、 Ｒ１２はＬｅｕ又はＴｒｐであり、 Ｒ１３はＧｉｎ又はＳｅｒであり、 Ｒ１７はＧｌｎ又はＨｉｓであシ、 Ｒ１９はＬａｕ又はＣｙａであシ、 Ｒ２１はＧｉｎ又は’ｒｈｙであり、 Ｂ２□は任意部分であって、存在する場合にはＬｅｕ又はＴｙｒから成る群から 選ばれ； Ｒ２４〜Ｒ３１は８個の１連のアミノ酸であって、それぞれ独立にＧｌｙ　ｅ　 Ｓｅｒ　＊　Ｔｈｒ　、　Ｃｙｃ　ＩＴｙｒ　ｒ　Ａｉｎ　。

Ｇｉｎ　＃　Ａｓｐ　ｔ　Ｇｌｕ　ｅ　Ｌｙｓ　＋　Ａｒｇ　％及びＨｉｓから 成る群から選ばれ；但し、前記８個のアミノ酸の内１個以下のアミノ酸はＡｓｐ 　、　Ｇｌｕ　、　ＬｙｌＩ、　Ａｒｇ　。

及びＨｌｇから成る群から選ばれることができ；そして前記８個のアミノ酸の内 ４個以上のアミノ酸がヘリックス、β−シート、又はβ−ターン配置を自発的に 形成せず；さらにＲ１９がＣｙａである場合には”２４もＣｙＩであってジスル フィド橋を介して”１９と連結していなければならず；そしてＲ３２はグリシア ミド及びグリシンアミドから成る群から選ばれたアミノ酸アミドである、）で表 わされる化合物がイン−ビデでカルシトニン様活性を有することが見出された。

さらに、１位及び７位のジスルフィド橋によシ連結されたシスティン残基（又は これらの２個のシスティン残基に代る２−アミノオクタンジオン酸）を伴うペゾ チドのアミン末端における７−アミノ酸配列（この配列をこのペゾチドホルモン のセクション１と称することができる）に加えて、活性のために下記の特徴が必 須であることが見出された。

セクション２：　８〜２２位の１５−アミノ酸配列であり、この配列は自発的に 両親媒性ヘリ、クスを形成し、このヘリックスは親水性アミノ酸残基がこのヘリ ックスの縦軸の一方の側にそって分離さ九ておシ他方疎水性アミノ酸残基がこの ヘリックスの縦軸の他方の側にそって分離されていることを特徴とする。残基は 、Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ　ｖ　ｃ、ｔ　Ｆ、Ｊ、　Ｋｅｚｄｙ　ｅ人、Ｍ、　５ｅ ａｎｕ　ｅ及びＢ、Ｌ、５ｈｅｎ　ｅジャーナ／ｌ／−オプ・リピド・リサーチ （Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒａｍ、　）　２０　：　１４８（１９７９）によシ定義 されたそれらの疎水性パラメーターが０，５以上であれば疎水性でちると考えら れ、そしてこの／ぐラメ−ターが０．５未満であれば親水性！あると考えられる 。Ｃｈｏｕ　、　Ｐ、Ｙ、及びＧ、Ｄ。

Ｆａｓｍａｎ、　７ニユアル秦レビュー−オフ姉バイオケミストリー（Ａｎｎ、 　Ｒａｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　４７　：　２５−７６（１９７８）にょシ記 載された平均α−ヘリックス性パラメーターリ（ｔ’は１．０３よシ大でなけれ ばならす、そして親水性アミノ酸残基の半数以下が−６，０〜７．０において荷 電していることができる。

セクション３：　２３位にゾロリン残基を有しそして３２位にアミノ酸アミド残 基を有する２３−３２位の１０−アミノ酸配列（ペグチドのカルブキシ末端）。

これらの１０アミノ酸残基は親水性であり、そして１個以下がμ６．０〜７．０ において荷電することができる。これらは、「ランダム鎖」を構成して、前記の １０個のアミノ酸の内の４個以上が、ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ　を前掲、によ り定義される実験的に予想される／ぐラメ−ターに従ってヘリカル、β−シー、 ト、又はβ−ターン配置をとらないように選択される。

前記へリックスのこれらの特徴は、この発明の化合物を次の形で表現する場合、 一層容易に可視化される。

この式において、Ｒ１−Ｒ５２は前に定義した通りである。ヘリックス中の親水 １生アミノ酸には星印（ネ）が付されており、印が付されていない残基は疎水、 性である。この表示から、疎水性残基及び親水性残基がへリックスの対立する側 に分離されていることが容易にわかる。この配置は、ホルモンとそノ特異的すセ ゾタ一部位との相互作用のために必要であると信じられる。

今まで使用した、そしてこの後使用する、アミン９ してペゾチド分野の当業者により許容されている；ズ社、ニューヨーク、１９７ ５）７３−７５頁を参照のこと。すべてのアミノ酸及びその誘導体はＬ−型であ る。

好ましくは、Ｒ８はＬｅｕであシ：Ｒ１゜はＧｉｎ又はＬｙｓであり；そしてＲ １３１Ｒ１７及びＲ２，はそれぞれＧｌｎである。特に、 次の式（Ｉｔ）の化合物（“ＭＣＴ−Ｉ”と称する）ニーＧｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ” Ｔｒ　ｐ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙ　５−Ｌｅｕ　−Ｌｅ　ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ　−−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｉ＋−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ −Ｇｌｙ−８ｅｒ−次の式（至）の化合物（ＭＭＣＴ−１１１と称する）ニーＧ ｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌ ｅｕ−−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｂｒ− Ｇｌｙ−８ｅｒ−次の式（財）の化合物（“ＭＣＴ−１１”と称する）：１ −Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１Ｊｅｕ−Ｇｌ ｎ−Ｌｙｓ−−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−が好ましい。

式（Ｉ）の化合物の塩基性アミノ酸残基（リジン、アルギニン、及びヒスチジン ）はそれらの酸付加塩の形であってもよい。ヒドロクロリド、アセテート、ホス フェート、シトレート、フマレート、マレエート、サクシネート、ハモエート、 及びサルフェート酸付加塩が好ましい。アセテート塩及びヒドロクロリド塩が特 に好ましい。この発明の目的のために、式（１）のホルモンの酸付加塩は親の遊 離ペゾチドと、同等であると理解すべきである。

式（１）の化合物は、イプチド合成の分野における当業者によく知られている方 法、例えば液相合成（Ｆｉｎｎ、Ｆ、Ｍ、及びに、Ｈｏｆｍａｎｎ　＊グロテイ ンス（Ｐｒｏｔｅｌｎｓ　）　ＶｏＬ　２　＋　３版（Ｈ，Ｎｅｕｒａｔｈ及び Ｒ，Ｌ。

Ｒ１１１編）（アカデミックゾレス、ニー−ヨーク。

１９７６）１０５−２５３頁を参照のこと〕、又は１ 固相合法（Ｂａｒａｎｙ　）　Ｇ、及びＲ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　＊タ ーり、１９７９）３−２８４頁を参照のこと〕により合成することができる。好 ましくは、これらの化合物は１チのノビニルベンゼンで架橋された、ベンズヒド リルアミン置換ポリスチレン上での固相法により合成される［　Ｐｉｅｔｔａ、 　Ｐ、Ｇ、及びＧ、Ｒ，Ｍａｒａｈａｌ　１　＋ジャーナル・オシ・ケミカル・ ソシェテイ−（Ｊ−Ｃｈｅｍ、　５ｏｅ−）　Ｄ　：　６５０−６５１　（１９ ７０）　；Ｈｒｕｂｙ　＊　Ｖ、Ｊ、、　Ｄ、Ａ、　Ｕｐａｏｎ及びＮ、Ｓ、Ａ ｇａｒｗａｌ　＊ジャーナル・オシ・オーガニック−ケミストリー（Ｊ。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ）４２　：　３５５２　（１９７７）を参照のこと〕。カルブ キシ末端アミノ酸（ＡＡ３．）のα−アミノ基がまず選択的に開裂可能なＮ−末 端保護基により保護される。好ましくは、この基はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂ ＯＣ）である。これに代えて、−−ＢＯＣ保護基を有するアミノ酸はノ々ケム社 （ＢａｃｈｅｍＩｎｃ　）　＋マリナ・デル・レイ、カリホルニア、及びペニン スラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｒ サンカルロス、カリホルニアから商業的に入手することができる。次に、プロ、 りされたアミノ酸（Ｎａ−ＢＯＣ−ＡＡ３□）を、縮合剤としてのジシクロへキ シルカルぎジイミド（ＤＣＣ）と共にＮ−ヒドロキシペンゾトリアゾール（ＨＯ Ｂｔ）を用いて、樹脂に連結する。次に、強蕪水有機酸、好ましくは純トリフル オロ酢酸、又は塩化メチレン巾約２５〜７５％、（好ましくは５０チ）のトリフ ルオロ酢酸により、２０〜３０℃にて約３０〜６０分間処理することによりＮ” −ＢＯＣ基を除去する。次に反応混合物をヒンダード有機塩基、例えばジイソゾ ロビルエチルアミン又はＮ−エチルモルホリン、好ましくは塩化メチレン巾約２ 〜１０％のジイソゾロビルエチルアミンにより、約２０〜３０℃にて約２〜６分 間にわたって中和する。次に３１位のアミノ９２（ＡＡ、１）を次のようにして ＡＡ３□ＯＮ−末端アミンに付加する。

これを、塩化メチレンの存在下約２０〜３０℃にて約２０〜６０分間−−ＢＯＣ −ＡＡ３．の対称無水物又は活性エステルと反応せしめ、そして次に塩化メチレ ン中約２５〜７５チ（好ましくは５０チ）のトリフルオロ酢酸で、約２０〜３０ ℃にて約３０〜６０分間処理することによ！１１７ＶＡ６．のＮ”−ＢＯＣ保護 基を除去する。同様にして、他のアミノ酸残基を順々に付加し、セしてＣ−末端 からベゾチド鎖を形成する。但し、Ｎ”−Ｂｏ　ｃ　Ａｓ　ｎは上記のＨＯＢ　 ｔ、”ｂＣＣ法により付加する。ヤマシロ、Ｄ、及びＣ−Ｈ−Ｌ　１　ｔジャー ナル・オシ・アフリ−１ＪフーケミカＡ／ｌｌンシエテ４−　（Ｊ、　Ａｍ、　 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　）１００　：　５１７４　（１９７８）を参照のこと。

１３ ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２− ミノオクタンジオン酸のＣ−２アミノ基及びＣ−８カルボキシル基をまず保護で おき（それぞれＮｃｔ　−Ｂｏｃ、Ｏη−４−Ｂｕ　）　、成長しつつあるペプ チド鎖がＡＡ８（Ｒ８）が位置する５点に達したとき、保護された２−アミノオ クタンジオン酸のＣ−１カルゴキシをＡＡ８のα−アミン部分に結合する。次に 、ＡＡ６のα−カル？キシ基を２−アミンオクタンジオン酸のＣ−２アミンに付 加し、脱保護の後、ＡＡ５をＡＡ、６に付加し、そしてＡＡ２に達する。次に、 ２−アミノオクタンジオン酸のＣ−８カルがキシル基を活性化（ＨＯＢｔ／ＤＣ Ｃ）　してこれがＡＡ２のα−アミノ部分と反応するようにする。こうして、２ −アミンオクタンジオン酸の半分ずつのそれぞれが、エチレン橋により連結され た１位及び７位の別々のアミノ酸として機能する。２−アミノオクタンジオン酸 を適切な１位置に導入する方法の詳細はモリカワ、Ｔｏ等、エクスペリメンチア （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ　）　３２　：　１１０４−１１０６（１９７６） を参照のこと。

幾つかのアミノ酸は連結反応中に保護されなければならない反応性側鎖を含有す ることが当業者により理解される。従って、Ｎ”−ＢｏｃＡｒｇのＮ−グアニジ ニウム部分をトシル化してＮ”−ＢｏｅＡｒｇ（Ｎｇ−Ｔｏｅ）を得る。Ｎ”− ＢｏｅＣｙａのチオール基を４−メトキシベンジル部分で保護しＮＣＬ−Ｂｏｃ Ｃｙｓ（Ｓ−４−ＭｅＯＢｚｌ）を得る。Ｎ”−ＢｏｃＬｙｓを、リジンのα− アミノが２−クロロベンジルオキシカルボニル部分により保護されている一−Ｂ ｏｃＬｙｓ（ＮＥ−２−ｃｚｚ）に転換する。Ｎ”−ＢｏｃＳｅｒ及びＮ”−Ｂ ｏｅＴｈｒからそれぞれＺ−ＢｏｅＳｅｒ（ＯＢｚｔ）及びＮ”−ＢｏｃＴｈｒ （ＯＢｚｌ）を形成する。すなわち、セリン及びスレオニンのヒドロキシ基をベ ンジル部分とのエーテル結合に転換する。同様にして、Ｎ”−ＢｏｅＴｙｒのヒ ドロキシ基を２．６＝ジクロロベンジル部分とのエーテル結合に転換してＮ”− ＢｏｅＴｙｒ（０−２，６−ＣＡ２Ｂｚｌ）を得る。Ｎ”−ＢｏｃＴｒｐのイン ドール窒素を保護のためにホルミル化してＮｃｔ　−ＢｏｅＴｒｐ（Ｎ　−Ｆｏ ｒ）を得る。これらの保護されたアミノ酸は、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ　＋前掲、１６９−２５０頁に記載されている方法に従って調製すること ができ、又はこれらは例えばバケム社又はペニンスラ・ラデラトリーズから商業 的に得ることができる。

保護されたアミノ酸残基は、ＤＣＣのモル当量に対してアミノ酸２モル当量の比 率で約５〜１０℃において約１５分間、塩化メチレン中でＤＣＣと反応せしめる ことによシその対称無水物に転換する。得られた生成物はさらに単離及び精製す ることなく使用するのに適当である。この方法に代えて、保護されたアミノ酸は 、１：１：１０モル比でのＨＯＢｔ及びＤＣＣ５ との反応によシその活性エステルに転換される。

完成されたペプチドは、無水液体弗化水素酸：アニソ−”ル（７〜９　：　１　 、　ｖ／ｖ　）により０℃にて約３０〜６０分間処理することによｐ、Ｎ”−ホ ルミル以外のすべての保護基の同時的除去を伴って、樹脂から切断される。ベン ズヒドリルアミン置換ポリスチレンを使用する利点の１つは、カルブキシ末端ア ミノ酸残基（ＡＡ３□）が、切断後自発的にそのアミノ酸アミド形として得られ ることである。５〜２０チ酢酸で洗浄することによシ粗ペゾチドが樹脂から取り 出される。１０％酢酸が好ましい。

次に、粗ペゾチドを、好ましくは凍結乾燥する。

樹脂からの切断中に、幾らかの存在するシスティン残基が酸化されるであろう。

穏和な生理的緩衝液、例えば燐酸ナトリウムもしくは炭酸ナトリウム、Ｔｒｌｓ 　、　ＭＯＰＳ等中で還元剤、例えば過剰のジチオスレイトール又はβ−メルカ ゾトエタノールで処理することによシ、チオール基をその遊離形に還元する。

燐酸ナトリウム（０，０５Ｍ、ｐＨ７，０）が好ましい。

溶液を上記と同じ緩衝液中に約５１の容積に稀釈し、そしてに３Ｆｅ　（ＣＮ） ｂの０．０２Ｍ溶液（酸化剤）を、２０〜３０℃にて攪拌しながら徐々に加えて 、１位及び７位のシスティン残基間のジスルフィド橋の形成を誘導する。空気酸 化によシ酸化を達成することもできる。（例えば、薄いペプチド溶液に空気又は 酸素を泡立てることによシ行う）。

次に、ペプチドを濃縮し、当業者によシ良く知られている方法により、例えば分 子篩法、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ，蒸発、凍結乾燥等により精 製し、そしてＮｉｎ−ホルミル基を除去する。好ましくは、ペプチドを濃縮し、 そしてイオン交換カラム、例えばＣＭ−セファデックスＣ−２５（商標、ファル マシア・ファイン・ケミカルス、ビスカタウェイ、　Ｎ、Ｊ、）上に吸着し、そ して次に直線塩グラジェント、例えば架橋部分の形成に使用だのと同じ緩衝液中 ０．０〜０．３ＭのＮａＣ１で溶出することによシ精製する。ペプチドは約２． ８ＭのＮａＣＬにおいて溶出する。

これを、０．２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液−２，５巾約２０〜５０％のア七ト二ト リルの直線グラジエン、トを用いるＨＰＬＣによりさらに精製する。得られた溶 液を脱塩し、そして水性溶液中親核住棟で処理することによシ、例えばピペリジ ン、水酸化ナトリウム又はヒドラジン、好ましくは０．５Ｍ水性ピペラジンによ り、０℃にて約２０分間処理することにより　Ｈｌｎ−ホルミル保護基を定量的 に除去する。この脱保護反応は酸、好ましくは酢酸の添加により停止せしめ１７ る。この方法に代えて、Ｎ”−ホルミル基はＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ　、前掲、２２０頁に記載された方法により除去することができる。次に、 ペゾチドをＨＰＬＣによシ再度精製し、この場合０．２Ｍ燐酸す）　ＩＪウム緩 衝液ｐ［（２，５中約３５チのアセトニトリルにより溶出する。

塩基性アミノ酸残基の酸付加塩は、当業者によシ良く知られている方法により適 切な有機酸又は無機酸によシペゾチドを処理することによって調製され、あるい は適切な酸から凍結乾燥により直接得ることができる。

式（１）の化合物は、１日当シ約０．１ｎ、ｊ９−約１０ｎｇ／ＩＶ体重の範囲 の量において投与した場合、上昇した血清カルシウムレベルを有する温血動物に おいて血清カルシウムレベルを低下せしめるために有用である。

最適結果を得るだめの好ましい投与量は１日当り約０、１５　ｎｇ〜約８ｎｊｌ ｌＫＦ１体重であり、そして体重的７０に９の対象物のために合計約０．１　ｍ ９−約０．５６■の活性化合物が２４時間に投与されるように、上記のような投 与量単位が用いられる。この投与方法は、最適の療法反応が生ずるようにされ得 る。例えば、数回の分割された投与量が１日に投与され、あるいは投与量を、治 療状態の危急性によシ示されるように比例的に減少することができる。化合物は 遊離ペゾチドの形で投与することができ、又はその非毒性の医薬として許容され る塩として投与することができる。医薬として許容される塩なる語は、薬剤とし ての性質（例えば毒性、有効性等）に有意に不都合な影響を与えない親化合物の 酸付加塩でアシ、例えば医薬技術において常用されているものである。

活性成分は非経口的に、例えば皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射によシ投 与することができる。

医薬として許容される塩としてのこれらの活性化合物の溶液又は懸濁液は、ヒド ロキシゾロビルセルロースのごとき界面活性剤と適切に混合された水中に調製す ることができる。分散体も、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、及びこ れらの油中混合物中に調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下で、 これらの製品は微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有する。この発明のベ ゾチドホルモンは、ガラスに付着する自然の傾向を有し、−従ってこれらの製品 は好ましくはさらに、この傾向を競争的に防止するために、ゼラチン又はアルブ ミンのごとき医薬として許容される蛋白質を含有する。

注射用に適する医薬形には、無菌水溶液又は分散体、及び無菌注射用溶液又は分 散体を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。すべての場合に、形態は無菌 的でなければならず、そして注射器処理が９ 容易にできる程度に流動性でなければならない。これは製造及び貯蔵の条件下で 安定でなければならず、細菌及び糸状菌のごとき微生物の汚染作用に対して防腐 されななければならない。担体は、例えば水、ポリオール（例えばグリセリン、 ゾロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）及びこれらの適当な混 合物を含有する溶剤又は分散媒体であってよい。筋肉内注射又は皮下注射のため に適当な組織物はさらに、浸透圧を調整しそして−４を緩衝化するだめに少量の 塩、酸、及び塩基を含有することができる。適当な医薬として許容される緩衝剤 及び浸透圧調整剤は、当業者によシ容易に決定される。

この発明の化合物の幾つかはまた、例えば不活性稀釈剤又は資化性可食性担体と 共に経口投与するのに適当であり、あるいはこれらはハード又はソストゼラチン カプセルに収容することができ、あるいはこれらは錠剤中に含有させることがで き、あるいはこれらは治療食と共に直接導入することができる。

経口投与のためには、これらの活性化合物は助剤と共に導入され、そして摂取可 能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウ ェハース等の形で使用することができる。このような組成物及び製剤は少なくと も０．１チの活性成分を含有すべきである。組成物及び製剤のＡ−センテージは 、言うまでもなく弯えることができ、便利には約２チ〜約６０１である。このよ うな医薬として有用な組成物中の活性成分の量は、適当な投与量が得られる量で ある。この発明の好ましい組成物又は製剤は、経口投与単位形が約５〜〜２００ ■の活性化合物を含有するように調製される。

錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等はさらに、次のもの、すなわち結合剤、例え ばトラガカントノ！ム、アカシアガム、コーンスターチ又はゼラチン；助剤、例 えば燐酸二カルシウム：崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アル ギン酸等；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；を含有することができ、そ して甘味料、例えばシュークロース、ラクトース又はサッカリンを加えることが でき、あるいは香料、例えばぺ／′ｅミント、冬緑油、又はサクラ香料を加える ことができる。投与単位形がカプセルである場合、このものは上記のタイプの材 料のほかに液体担体を含有することができる。種々の他の材料が被膜として存在 することができ、あるいはこれらが投与単位の物理的形状を変えることができる 。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセルをシェラツク、糖、又はこの両者によって 被覆することができる。シロップ及びエリキシルは活性化合物、甘味料としての ２１ はグロピルーパラベン、色素及び香味料、例えばサクシ又はオレンジ香料を含有 することができる。言うまでもなく、投与単位形の製造に使用されるすべての材 料は、医薬的に純粋であり、経口使用において実質的に無毒であるべきである。

さらに、これらの活性化合物は、緩慢放出製品及び製剤に導入することができる 。

次の非限定的な例によって、この発明が一層よく理解されよう。今までの及び今 後の使用において明示的にことわらない限シすべての温度及び温度範囲は℃で示 し、そして周囲温度又は室温なる語は約２０℃を意味する。ノぐ−セント又は（ １）は重量％であり、そしてモルはグラムモルでちる。

１チのジビニルベンゼンで架橋されり、ベンズヒドリルアミン置換ポリスチレン を用いて、固相法によりＭＣＴ−Ｉを合成した。Ｃ−末端アミノ酸ＢｏｃＰｒ。

を、ＨＯＢｔ及びＤＣＣを用いて樹脂に連結した。この後、ＢｏｅＡｒｇ（Ｎｇ −Ｔｏｍ）、ＢｏｃＣｙｓ（Ｓ−４−ＭｅＯＢｚｌ）、ＢｏｃＧｌｙｓＢｏｅＬ ｅｕ　、　ＢｏｃＬｙｓ（Ｎ’−２−ＣｔＺ）、ＢｏｅＰｒｏ、ＢｏｃＳｅｒ（ ＯＢｚｌ）、ＢｏｅＴｈｒ（ＯＢｚｌ）、及びＢｏｅＴｒｐ（Ｎ”　−Ｆｏｒ） の対称無水物及び脱保護及び連結プログラムでありて、ヤマシロ及びＬｉ、前掲 、により使用されたものを用いた。但しＢｏｅＡｓｎはＨＯＢｔ／ＤＣＣ法によ り連結した。樹脂からの切断、及びＮ　１ｎ−ホルミル以外のすべての残留保護 基の除去は、無水液体弗化水素酸によりアニソール（７：１．φ）の存在下で０ ℃にて４５分間処理することにより行った。１０％酢酸で洗浄することにより樹 脂から粗ペプチドを取９出した。凍結乾燥後に残った残渣を、０．０５Ｍ燐酸緩 衝液−７，０中過剰のジチオスレイトールで処理した。ベグチド溶液を同じ緩衝 液中に５！の容量に稀釈し、そして０．０２ＭのＫｓ　Ｆｅ　（ＣＮ）ｂの溶液 を、攪拌しながら徐々に添加することに！リシステイン残基１及び７間に分子内 ジスルフィド結合を形成した。得られた希ペゾチド溶液をＣＭ−セファデックス Ｃ−２５カラムに過し、次に同じ緩衝液を用いて０，０〜０．３ＭのＮａＣｔの 直線グラジェント溶出することにより濃縮した。このカラムからの両分を、これ らをウォーターズＣｌ８（商標）半−調製用ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ・ア ン、シエーツ、ミルホオード、ＭＡ）に直接負荷し、そして次に０．２Ｍ燐酸緩 衝液−２，５中２０％〜５０チのＣＨ，ＣＮの直線グラジェントにより溶出する ことによってさらに精製した。得られた溶液を脱塩した後、０．５Ｍ水性ピペリ ジンによシＯ℃にて２０分間処理することによりＮｉｎ−ホルミル保護基を定量 的に除３ 反応混合物をウォーターズＣ４８半−調製用カラムに直接適用しそして同じ緩衝 液中３５　％　ＣＨ３ＣＮにより溶出することにより最終精製を行った。最終脱 塩段階及び凍結乾燥後の精製ＭＣＴ−１の収率は、ＢｏｅＰｒ。

のもとの置換レベルに基いて１０％であった。このベゾチドをウォーターズＣ４ ８逆相カラムから溶出溶剤として２０チ〜５０チのＣＩ（３ＯＮのグラジェント を用いて溶出した場合の２３０　ｎｍのシングルピークの観察に基いて、及び５ ．５ＭのＨＣｌで加水分解した後のアミノ酸分析から、ペゾチドは純粋であると 判定２．０９（２）　、　Ｇｌｕ　５．００（５）　、　Ｇｌｙ　３．０２（３ ）　、　Ｌｅｕ７．１４（７）、　Ｌｙｓ　２．９４（３）、　Ｐｒｏ　１．６ ３（２）、　Ｓｅｒ　１．６１（２）。

Ｔｈｒ　３．５　（４）。

Ｈｒｕｂｙ　ｖ前掲、によシ、ペックマン９９０（商標）−２ｆｆド合成機（ペ ックマンインストルメンツ）中で、１チのジビニルベンゼンで架橋されたベンズ ヒドリルアミン置換ポリスチレンを用いて固相法により、ＭＣＴ−ＩＩを合成し た。Ｃ−末端アミノ酸Ｂ。ｅＰｒ。

を、ＨＯＢｔ及びＤＣＣを用いて樹脂に連結した。この後、ＢｏｃＡｒｇ（Ｎｇ −Ｔｏｓ）、ＢｏｅＳｙｃ（Ｓ−４−ＭｅＯＢｚｌ）、Ｂ　ｏ　ｃＧ　ｌ　ｎ　 −。

ＢｏｅＧｌｙ　、　ＢｏｅＬｅｕ　、　ＢｏｃＬｙｓ（Ｎ’　２−ＣｔＺ）、Ｂ ｏｃＰｒｏ、ＢｏｅＳｅｒ（ＯＢｚｌ）、ＢｏｅＴｈｒ（ＯＢｚｌ）、及びＢｏ ｃＴｙｒ（０−２＋６−ｃｚ２Ｂｚｔ）の対称無水物を使用した。但し、Ｂｏｃ ＡｓｎはＨＯＢｔ／ＤＣＣ法により連結した。使用した脱保護及び連結プログラ ムはヤマシロ及びＬｉ、前掲、により用いられたものと同様とした。樹脂からの 切断及び残留するすべての保護基の除去は、無水液体弗化水素酸によりアニソー ル（７：　１　’＋　ｖ／ｖ　）の存在下で０℃にて４５分間処理することによ り行った。１０チ水性酢酸で洗浄することにより樹脂から粗ペノチドを取り出し た。凍結乾燥後に残留した残流の２００■部分を、５℃ノの０．０５Ｍ燐酸ナト リウム緩衝液−７，５中過剰のジチオスレイトールで処理した。ペゾチド溶液を 同じ緩衝液中に４１の容量に稀釈し、そして０．０２ＭのＫｓ　Ｆ　ｅ　（ＣＮ ）６の溶液を、攪拌しながら徐々に、持続する黄色が得られるまで添加すること により、システィン残基１及び７間の分子内ジス、ルフィド結合を形成した。得 られた希ペゾチド溶液をＣＭ−セファデックスＣ−２５カラムに通し、次に同じ 緩衝液を用いて０．０Ｍ〜０．３ＭのＮ５ＣＬの直線グラジェントにより溶出す ることによって、濃縮した。

このカラムからの両分をセファデックスＧ−１５（商ｍ）（ファルマシア・ファ イン・ケミカルス）カラム上で脱塩し、そしてこれらを２０％のＣＨ３ＣＮ２５ を含有する０、２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液−２，５で平衡化したゾルバ、クスＣ ｌ８（商標）（ＬＬデュポン・ド・ネ蕪ルス社（Ｅ、１．　ＤｕＰｏｎｔ　ｄｅ 　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｇｏ、）。

ウイルミントン、ＤＥ）半一調製用ＨＰＬＣカラムに負荷することによりさらに 精製した。同じ緩衝液中２０チ〜５０％のＣＨ３ＣＮの直線グラジェントを用い てカラムからペプチドを溶出した。）ＩＰＬＣからの両分をＣ−１５カラムを用 いて脱塩しそして凍結乾燥した。

アルテックス・ウルトラスペアＯＤＳ　（商標）（ライニン・インストルメンツ 、ウーパン２ＭＡ）分析用カラムから上記と同じグラジェント及び緩衝液を用い て溶出したペプチドを２３０　ｎｍにおいて監視した場合の１個の対称なピーク の観察に基いて、及びＨＣｔニトリフルオロ酢酸（２：１．φ）により加水分解 した後のアミノ酸分析により、ペプチドは純粋であると判定された。

５、２０　（５）　、　Ｇｌｙ　１．７５　（２）　、　Ｌｅｕ　７．００　（ ７）　、　Ｌｙｓ　３．１５ＭＣＴ−ＩＩＩのＮ一端の１−７断片を、ナカガワ 、　Ｓ、Ｍ。

及びＥ−Ｔ、　Ｋａｉｓｅｒ　、ジャーナル・オプ・オーガニック・ケミストリ ー（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）４８　：　６７８（１９８３）の方法により 、ｐ−ニトロベンジルフェノンオキシム舎樹脂上で合成した。Ｎ”−Ｂ　ｏ　ｃ −アミノオクタンジオン酸−０η−１−ブチルエステルを、ＨＯＢｔ及びＤＣＣ を用いて樹脂に連結した。次に、ＤＣＣ／’ＭＯＢｔ法によシ、Ｎ”−ＢｏｅＳ ｅｒ（ＯＢｚｌ　）Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ　）　、Ｎ”−ＢｏｃＬｅｕ　。

Ｎ”−ＢｏｃＡｓｎ　１及び−−ＢｏｅＳｅｒを順次連結した。Ｎ−末端セリン の脱保護の後、３当量のＤＣＣ及びＨＯＢｔを樹脂と共に１時間攪拌し、次に３ 当量のジインゾロビルメチルアミンを添加することによって環状ペプチドを形成 した。環状ペプチドをロイシン−１−ブチルエステルの酢酸塩３当量及び酢酸３ 当量と共に振とうすることによシ該ペグチドをオキシム樹脂から切断した。溶剤 を真空蒸発せしめた後に残留した残渣を酢酸エチルに入れた。環状ペプチドを沈 澱せしめ、そしてｒ過によυ集めた。トリフルオロ酢酸：アニソール（３：１． マｈ）の混合物で処理することによｐｔ−ジチル保護基を除去した。

Ｈｒｕｂｙ　＊前掲、に記載されているようにして、ぺ、クラン９９０ペゾチド 合成機中で、１％のジビニルベンゼンで架橋されたベンズヒドリルアミン置換ポ リスチレンを用いて、固相法によりＭＣＴ−１のＣ一端断片を合成した。Ｃ−末 端アミノ酸ＢｏｃＰｒｏを、ＨＯＢｔ及びＤＣＣを用いて樹脂に連結した。次に 、ＢｏｃＡｒｇ（Ｎａ−Ｔｏｓ）、ＢｏｅＣｙｓ（Ｓ−４−Ｍ＠Ｂｚｌ）、Ｂｏ ｅＧｌｎ　ｓ７ ＢｏｅＧｌｙ　、ＢｏｃＬｅｕ　、ＢｏｃＬｙｓ（Ｎ’−２−Ｃ２Ｚ）、Ｂｏｃ Ｐｒｏ　％ＢｏｃＴｈｒ（ＯＢｚｌ）、及びＢｏｅＴｙｒ（０−２＋６−Ｃ４２ Ｂｚｌ）の対称無水物を°用いた。脱保護及び連結ゾログラムは、ヤマシロ及び Ｌｉ、前掲、によシ使用されたものと同様とした。

Ｎ一端１−７断片を、ＤＣＣ／Ｉ（ＯＢ　を及び５０％ジメチルホルムアミド／ 塩化メチレンを用いて、ベンズヒドリルアミン樹脂上のＣ一端断片に最終的に連 結した。樹脂からの切断、及び残留するすべての保護基の除去は無水液体弗化水 素酸によりアニソール（７：　１　、　ｖ／ｖ　）の存在下で０℃にて４５分間 処理することによシ行つた。

例２と同様にして粗硬ゾチドを樹脂から取シ出し、そして精製した。例２におい てシスティン残基１及び７について記載した方法に従って、この例のシスティン 残基１９及び２４間の分子内ジスルフィド結合を形成する。

例４゜ ＭＣＴ−１の特徴付け ＭＣＴ−１及びサケカルシトニン（”５ＣＴ−１”ト称スる。アーモール・ファ ーマシェーティカルス、カンカキ−、ＩＬから入手し、さらに精製することなく 使用）の２５０　ｎｍ〜２０５　ｎｍの円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉ ｃｈｒｏｉｓｍ　ｗ　ＣＤ　）スペクトルは、２２２ｎｍ及び２０８　ｎｍにα −へリックス構造に特異的な最小を示す。ＭＣＴ−１については、２２２　ｎｍ における平均残基モル楕円率（ｍｅａｎ　ｒｅ＋５ｉｄｕ＠ｍｏｌａｒｅｌｌｉ ｐｔｉｅ口ｙ）〔θ〕２２□は−７，８００ｄｅｇ−ｃｒｎ’／ｄｍｏｌ（１０ Ｍペグチドｔｏ、０２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液、　０．１６Ｍ　ＫＣｌ　、ｐＨ ７，４）であシ、このことから、Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔ　、　Ｊ、Ｄ、　、　Ｊ、 Ｓ−に−Ｄａｖｉ＠、　Ｈ，Ｊ−Ｐｏｗｎａｌｌ。

方法に従って、α−へリックス性は３０％であると算定される（β−シート構造 によるＣＤへの寄与がないものとする）。ポリエチレングリコール（履１５に〜 ２０Ｋ）によシスペクトロメーターのセルをあらかじめ処理しておくことによっ てガラスへの結合全防止スレば、〔θ〕２□２ノ値は１０−’Ｍ　〜１０−’Ｍ のＭＣＴ−Ｉ濃度範囲にわたって変化しない。このことは、用いた濃度範囲にわ たってＭＣＴ−１はモノマーと２９ して維持されることを強く示唆してお）、これは、Ｐａ１ｌ＠ｔ　ｔ　Ｒ，Ｊ、 　％　Ｂ、Ａ、　Ｈａａｓｅ及びＭ、Ｊ、　５ｔａｎｄａｅｒｔ　。

ジャーナ・ル・オツ・ピロロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｉ ｎ　）　２５４　：　３０　（１９７９）の方法ニ従ってペックマン・スピンコ ・エアーヒュージ（ｉ標）（−（ツクマン・インストルメンツ、バークレー、　 ＣＡ　）を用いる超遠心法による１　０−’　ＭのＭＣＴ−１の濃度における約 ４．５００の分子量の測定によシ支持される結論である。同様に、同じ濃度範囲 にわたる同じ条件下での５ＣＴ−１の溶液についての〔θ〕２２２の値もまた− ４．６００　ｄｅｇ−ｃｙｒ”　／　ｄｍｏ　ｌにおいて一定に維持され、この ペプチドについて２０％α−へリックスの算定を導く。Ｂｒｅｗｅｒ　＃　Ｈ， Ｄ、及びＨ，Ｅｄｅｌｈｏｃｈ　、ジャーナル・オプ・ビオロジカル・ケミスト リー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）２４５　：　２４０２（１９７０）に よｆｉ５０％２−クロロエタノール中ブタカルシトニン（ＰＣＴ　）について見 出されたように、構造促進溶剤である５０チトリフルオロエタノチα−へリック ス性であると算定された。

表面単層の研究のため、０．１ＭのＮａＣ１を含有する０、　ＯＩ　Ｍ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ７，４の下相をガラス−蒸留水を用いて調製した。溶液中に １０分間にわたって空気を泡立て、そして次に緩衝液の表面を吸引することによ って界面活性汚染物全除去した。０．１緬ＨＣ１中ＭＣＴ−１の２．８Ｘ１０− ’Ｍ浴溶液ら不治性単層を拡けた。ラウ〆（Ｌａｕｄａ　）　（商標）フィルム バランス（プリンタマン・インストルメンツ、ノールウオーク、　ＣＴ　）　’ ｉ用いて、ＭＣＴ−１単分子層の表面圧π（ｄｙｎ／ｃｍ）を、面積Ａ（副２　 ）の関数として測定した。空気−水界面において、ＭＣＴ−１及び５ＣＴ−１は 、０．０１ＭＩ（Ｃｔ中濃厚溶液から拡けられた場合に不溶性の単層を形成する 。５〜ｌ　２　ｄｙｎ／ｃｒｎの間のカー面積（π−Ａ）曲線は、等式： ％式％ として記載され、ここでＫは単層の圧縮性を反映する定数であシ、そして島は表 面圧Ｏに外挿された限界分子面積である。２つのペプチドについて計算されたパ ラメーターは非常に近似してお、９、ＭＣＴ−１についてはＫ　＝　０．０１６ 　ｃｎＶ／ｄｙｎで１そして５ＣＴ−１については０．０２　ｃｒｒｙ’　ｄｙ ｎであシ、他方ＭＣＴ−１についてハＡＯ）　＝　３６２　Ａ　であシそして５ ＣＴ−１についてはＡＯＯ＝　３２２　Ａ　である。しかしながら、ＭＣＴ−１ の単層につｈて見出された２　４　ｄ’ｙｎ／ｃｒｎの破壊圧（ｅｏｌｌａｐｓ ｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　）は、５ＣＴ−１について観察された１　４　ｄｙｎ／ ｃｒｎの値よシ非常に高かった。

１ ＭＣＴ−１のイン−ビトロ活性 ため、Ｈｕｎｔｅｒ　、　Ｗ、Ｍ＊及びＦ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　、ネイチ ェアー（Ｎａｔｕｒｅ　）　１９４　：　４９５　（１９６２）の方法によｎ　 （１２”Ｉ、ｌｌ５ｃＴ−１を調製した。このヨウ素化ホルモン６、ｓｐ−セフ ァデックスＣ−２５（商標）（ファルマシア・ファイン・ケミカルス）上でのイ オン交換クロマトグラフィーによシ精製した。０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、 　０．１　％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）。

ＰＨ７，４緩衝液により未反応ラベル材料をカラムからまず洗浄し、次に同じ緩 衝液中０．２　Ｍ　ＮａＣｔ、　ｐＨ８によりモノヨウド化５ＣＴ−１を溶出し た。この緩衝液により溶出された１つの対称ピークからの両分を一緒にし、ｐＨ ７，５に調整し、そして小アリコートにして、使用するまで凍結した。放射性ヨ ウド化ペゾチドの比活性は約１６０μＣ１／μｍであった。ナカムラＨ８、Ｓ、 フルカワ、Ｍ、コイダ、Ｈ，ヤジマ、Ｒ，Ｃ，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ及びＲ，５ｅｈ ｌｕｅｔｅｒ　、ジャパンジャーナル・オプ・フ７−マ：Ｉ　１：１ジー（Ｊａ ｐａｎ　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　）　３１　：５３（１９８１）によシ記 載されたようにしてラット脳ホモジネートを用いて比較結合実験を行った。

この方法は、一層一般的に使用される腎結合測定（Ｍａｒｘ　、　Ｓ、Ｊ、、Ｃ ，Ｊ、　Ｗｏｏ４ｗａｒｄ及びＧ、Ｄ、　Ａｕｅｒｂａｃｈ。

２ サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　１７８　：　９９９　（１９７２）を参照の こと〕に匹敵するカルシトニン類似体についての結合曲線をもたらすことが示さ れており、そ脳顆粒画分への［１２５Ｉ］−８ＣＴ−１結合に対する５ＣＴ−１ （０）及びＭＣＴ−１（△）の競争的阻害の結果を第１図に示す。各点は３連測 定の３個の平均値を示す。

得られた結合曲線は５ＣＴ−１について約２．５ｎＭのＩＣ５ｏ値をもたらし、 これはナカムタ等、前掲、によシすでに報告されて−る値と一致し、そしてＭＣ Ｔ−１について１７　ｎＭ　ｋもたらし、これはブタカルシトニン（ＰＣＴ　） について見出された値１７　ｎＭ　（前掲）に匹敵する。

ＭＣＴ−１のインービボ活性 インービボにおけるＭＣＴ−１の生物学的活性を評価するため、３〜４週齢の雄 性Ｓｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅｙラット（チャールス・リバー・グリーディン ダ・ラボラトリーズ、ウイルマントン、　ＭＡ　）に、０．９％塩。

０．１チＢＳＡ、ｐＨ４，５中５ＣＴ−１又はＭＣＴ−１、あるいは塩溶液のみ を皮下注射した（　０．１５ｍ！／１００　？体重）。注射の１時間後、血液を 採取し、そして血漿中のカルシウム濃度を原子吸収スペクトルによシ決３３ 及びＭＣＴ−１（△）についての結果を要約している。

各点は、塩浴液のみを与えられたラットの平均血清Ｃ−濃度（１点当シ２０匹の ラット）と、ＭＣＴ−１（１点当シ１５匹のラット）又は５ＣＴ−１（１点当シ ５匹のラット）の物足の投与量を与えられたラットの平均との差を示す。結合研 究の場合と同様に、ＭＣＴ−１は８ＣＴ−１に比べて約１０倍能力が低く、又は ＰＣＴとおよそ同じ活性を示す。

０．０２Ｍ燐酸ナトリウムｐＨ７，４によシ緩衝化されておシ、そして０．１６ 　Ｍ　ＫＣｌを含有するＭＣＴ−Ｉ［の溶液の円偏光二色性スペクトル’ｌ：、 ２５０　ｎｍから２００　ｎｍまで、Ｃａｒｅｙ　６０　（商標）分光旋光計（ ハリアン・インストルメンツ、７〜ロアルト、ＣＡ）を用いて測定した。使用し た分光計のセルは濃硝酸で洗浄し、脱イオン水で十分にすすぎ、次に１チポリエ チレングリフール（Ｍｒ　１５　Ｋ〜２０Ｋ）水溶液で１時間処理し、そして使 用前に水で最終的にすすいだ。ＭＣＴ　−Ｈの２４０　ｎｍ　〜２０４　ｎｍの 円偏光二色性スペクトルから得られたモル楕円率は、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ＋Ｎ 、及びＧ、ＩＬ　Ｆａａｒｎａｎ　、パイオケミヌトリー（Ｂｉｏｅｈｅｍ、　 ）　８　：　４１０８　（１９６９）によりα−へソックス、β−シート及びラ ンダムコイル構造に３４　１１表ロＵ６ｔｌ−５０１７１０　（１１）つ込て記 載されたスペクトルから導かれる３つの異る基本関数の線形組合わせによシ適合 させられた。

とランダムコイル構造の混合として存在することを示した。β−シート構造から スペクトルへの有意な寄与が存在しないので、α−へソックス構造の変化を推定 するために我々は２２２　ｎｍにおける平均残基モル楕円率〔θ〕２２２を使用 した（　Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔ等、前掲）。

この結果を第３図に示す。各データ点は２実験からの平均を示す。〔θ〕２２２ は、モノマー／トリマー平衡と一致する４、２Ｘ１０ＭのＭＣＴ−ＩＩより上で 濃度依存降下を示した。七ツマ−についての〔θ〕２２□は−５、２００ｄｅｇ −６ｎ”／　ｄｍｏｌ　（２０％α−へソックス）であシ、そしてトリマーにつ いては−１０，４７５ｄｅｇ−一／ｄｍｏｌ　（３５％α−へソックス）であっ た。

（０）２２２対（（〔θ）２２２　［θ〕２２□モノマー／（ＭＣＴ−１１：］ ２）”’のプロット（第３図中の挿入図）は、５．０６Ｘ１０　Ｍ　のオリゴマ ーについての解離定数（Ｋｄ　）　’ｉもたらした。この解離定数は、トリマー 化についての４．５　ｋｍ／ｍｏｌのモノマー当シ安定化エネルギーに相当する 。同様の条件下で、そして同じ濃度範囲にわたって、ＭＣＴ−１及び５ＣＴ−１ の〔θ〕２□２はそれぞれ−７，８００ｄｅｇ−ｃｒｎ”／ｄｍｏｌ　、及び− ４，６００ｄ　ｅ　ｇ　−ｃｎ？／　ｄｍｏ　１において維持された。

５ ＭＣＴ−１，ＭＣＴ−ＩＩ及び５ＣＴ−１（０，０２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液ｐ Ｈ７，４中ｌＸｌ０　Ｍペプチド、　０．１６　ＭＫＣｌ及び７■／７！デキス トランＴ−４０（商標）（ファルｉシア・ファイン・ケンカルス）を含有〕の分 子量を、Ｐｅ１ｌｅｔ等、前掲、の方法に従ってベックマン・スピンコ・エアー ファージを用いて、沈降平衡によシ測定した。遠心チー−１から取シ出した１０ μｊずつの逐次アリコート中のペプチド濃度を、フルオレスカミンで誘導体にし そしてパーキン−エルマー６５０−４０（商標）螢光分光光度計（パーキン−エ ルマー・インストルメンツ、ウィルトン、　ＣＴ）を用いて螢光強度（λｆ、Ｘ ３９０　ｎｍ　＃λｅｍ　４８０　ｎｍ）を測定することによシ決定した。沈降 平衡により測定されたＭＣＴ−ＩＩの分子量は１０，０４５±６４５ｊ％／ｍｏ ｌすなわち七ツマ−の分子量３５６３　Ｐ／ｍｏｌの２．８倍であシ、そしてモ ノマー／トリマー平衡のＣＤ証拠と一致する。ＣＤ実験における自己会合はＩ　 Ｘ　１０−’　Ｍまで検出されなかったが、ＭＣＴ−１もまたＩ　Ｘ　１０−５ Ｍの濃度において分子量（Ｍｒ　）　〜１０、５６８±２１３（３，ＯＸモノマ ー）を有しトリマーとして存在するようである。このことは、ＭＣＴ−１は比較 的高濃度においてのみ集合することを示唆する。５ＣＴ−１はｌＸｌ０　Ｍにお いて、算出された分子量がモノマーの理論分子量である３４３５Ｐ／ｍｏｌに比 べて３４５６±６０　ｉ／ｍｏｌでｈＦ）、モノマーとして存在するようである 。

例４と同様にして表面単層研究を行った。ＭＣＴ−ｎは、０．０１　Ｍ　ＨＣ１ 中濃厚溶液から拡けた場合、空気−水界面において安定な単層を形成する。Ｏｄ ｙｎ／ｉｘ〜２１　ｄｙｎ／ｃｍにおけるカー面積（π−Ａ）曲線は、等式： ％式％ によって記載することができ、ここで肱は表面圧０に外挿した限界分子面積でア シ、そしてＫは単層の圧縮性を反映する定数である。全π−Ａ曲線を用いて計算 されたパラメーターけ、ＭＣＴ−Ｉ［が空気−水界面において、コンパクトで比 較的剛性の構造を有することを示している。んは、　ＭＣＴ−１については４３ ４±Ｘ２であシ、そして５ＣＴ−１については５５９±１８Ｘ２であるのに対し て、３６２±１ＯＸ２であった。５ＣＴ−１、ＭＣＴ−１、及びＭＣＴ−ＩＩの 単層は、Ｋが５ＣＴ−１については０．０３　ｃｒｎ／　ｄｙｎであシ、ＭＣＴ −１については０．０２　ｃｍ／　ｄｙｎであシ、そしてＭＣＴ−Ｉｔについて は０．０１　ｏｎ／　ｄｙｎであって、順々に圧縮性が低くなる。単層の破壊は ２２　ｄｙｎ／ｃｒｎにおいて生じ、この値はＭＣＴ−１について観察される２ 　４　ｄｙｎ／―よシわずかに低く、そしてｌ　２　ｄｙｎ／Ｉ：１ｎで破壊さ れる５ＣＴ−１単層よシ高い。

３７ Ｂａｔｚｒｔ　、　Ｓ、及びＥ、Ｄｅ　Ｋｏｒｍ　、ビオチミカ帝ビオフイジカ ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　）２９８：１０１ ５（１９７３）の方法によシ、エタノール性卵黄レシチン（アパンチ・ポーラ− ・リビズ社、バーミンガム、　ＡＬ　）浴液を０．１６　Ｍ　ＫＣ１溶液に急速 に注入することによシ、卵しシチン単二重層小胞（ＳＢＶ　）を調製し、そして フラクトグルＴＳＫ歴−７ｓ　（Ｆ　）　ｌＪ標）　（ピース・ケミカル社１口 、り７す一ド、　ＩＬ　）の２．５ａｎＸ８７ｃｒｎのカラムに通すことによっ て精製した。精製の後、Ｂａｔｚｒｉ及びＫｏｒｎ＞　、前掲、の方法により、 セファロースＣＬ　−４８（ｉｌ）（ファルマシア・ファイン・ケミカルス）の １．５　ｃｍ　Ｘ　４０６ｎのカラムでケ゛ル涙過することによ１、小胞を特徴 付けた。ストック溶液中の小胞の濃度を、Ａｍｅｎ　、　Ｂ、Ｎｏ及びり、Ｔ、 　Ｄｕｂｉｎ　、ジャーナル・オツ・ビオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ。

Ｃｈｓｍ、　）　２３５　：　７６９　（１９６０）のホスフェート測定によシ 決定した。典壓的な結合実験において、種々の濃度のペプチドを、０．１６　Ｍ 　ＫＣｔｆ：含有する０、　０２　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４中の小胞 （７Ｘ　１０−’　Ｍレジチル）と共に、全量３００！において、２１℃にて４ ５分間インキュベートした。上記の溶離剤と同じ緩衝液を用いる′セファロース ＣＬ　−６Ｂ（ｉ標）（ファルマシア・ファイン・ケミカルス）の１゜４　ａｎ 　Ｘ　６−３　ｃｒｙｔカラムによる迅速濾過により、小胞に結合したペプチド から遊離ペプチドを分離した。各画分中のペプチドの濃度を、小胞をインゾロパ ノール（２０容量チ）によシまず破壊した後にフルオレスカミンを用いて決定し た。

第４図（５ＣＴ−１は（○）、ＭＣＴ−１は（Δ）〕に示すように、ＭＣＴ−１ 及びＭＣＴ−ＩＩの両者け１〜１００μＭベゾチドの濃度におりて単二重層卵レ シチン小胞の表面に吸着する。同等のペプチド経度において及びｐＨ７，４又は ｐＨ３，０において、小胞への５ＣＴ−１の検出し得る吸着は存在しなかった。

ＭＣＴ−１及びＭＣＴ−■についてのデーターを、等式： ％式％） ス、ニューマーク、１９７６）、３８８頁：式中、Ｐｆ及びｐｂはそれぞれ遊離 の又は結合した一２ｆチドの濃度であシ、■は小胞の最初のモル濃度（小胞当Ｊ ３２００ホスホリピド）であシ、ＮはＰｆ／Ｖの上限であシ、そしてＫは解離定 数である〕に従って分９ 析した。Ｖ−Ｐｆ／’Ｐｂ対Ｐｆのプロットは直線的であシ、そしてＭＣＴ−１ についてはＮ＝５０±５と共にに＝１２．９．±４．８μＭを、そしてＭＣＴ− ＩｔについてはＮ＝６８±２と共にＫ　＝　６．７±１．７μＭを与えた。積Ａ ｏｏ・Ｎ　（ここで、脳は例７における単層研究から得られたもの）は、Ｎの観 察された値の差異を考慮して、はぼ同一である〔紐・Ｎ（ｙｃｔ−＋）　＝　２ ．２±０．２×１０４　Ｘ２、紐・Ｎ（Ｍａｙ−１）　＝　”’　５±０．　Ｉ 　Ｘ　１０’　Ｘ２）。

Ａｃｏ　”Ｎはまた、直径２３０Ｘの小胞のホスホリピドヘッド基間の利用可能 表面の推定〔１，８±０．６Ｘ１０’Ｘ２；　Ｋｕｐｆｅｒｂｅｒｇ　、　Ｊ、 Ｐ、、Ｓ、ヨコヤマ、及びＦ、Ｊ。

Ｋｅｚｄｙ　ａジャーナル・オプ・ビオロジカル、ケミスト　リ　−（Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２　５　６　：　６　２　７　４（１９８１））と合理的 に一致する。ｌＸｌ０　Ｍよシ高濃度のＭＣＴ−１又はＭＣＴ−ＩＩとのインキ −ベージフンの後の小胞の分析的セファロースＣＬ　−４１１’ルＦ、過によシ 、これらの構造が破壊され、一層低分子量の種、おそらくペゾチド／リピドミセ ル、が形成されたことを示した。

例９゜ ＭＣＴ−Ｉ［のイン−ビトロ活性 Ｈｕｎｔｅｒ及びＧｒｅｅｎｗｏｏｄ　＋前掲、の方法によシ、ニュー・イング ランド・二−−クレア社、ボストン。

ＭＡから入手したＮａ（１２５Ｉ）を用いて、［：１２５Ｉ］５ＣＴ−１０ （比活性１５０μＣ１／μ２）を調製した。ｓｐ−セファデックスＣ−２５上で のイオン交換クロマトグラフィーによショウド化ホルモンを精製し、そして約３ ００００Ｐ八Ｖμ！の５０μ！アリコートとして、必要なときまで一２０℃にて 貯蔵した。

ナカムタ等、前掲、によシ記載された方法によシ、２５０〜３００Ｆの雄性Ｓｐ ｒａｇｕｅ　−Ｄｘｗｌｅｙラット（チャールス・リバー・グリ−ディング・ラ ボラドリース）を用いて、粗ラット脳膜を調製した。膜はすぐに使用し、又は３ 日間を超えない範囲で一８０℃にて貯蔵した。　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　、　Ｋ、Ｅ 、、Ｒ，Ｃ，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ及びｌ’Ｌ　Ｍａｒｅｕｓ　ｅエンドクリノロジ ー（Ｅｎｄｏｃｒ　ｉｎｏｌｏｇ）ｒ　）１０８：８１１（１９８１）に記載さ れている方法にわずかな変更を加えて、結合研究のために使用される粗うット腎 膜及びアデニレートシクラーゼ測定を用意した。摘出された腎皮部をまずポＩＪ 　）ロン（商標）（ブリンクマン・インストルメンツ）によシ低速（１５”）に おい短時間ホモジナイズし、次にゆるやかに適合させたライ−トン・ダンス・ホ モジナイザー（アメリカン・サイエンティフィック・ゾロダクツ、マツクガウパ ーク、　ＩＬ　、乳棒１Ｂ“）によシ完全にホモジナイズした。クマッシー・ブ リリアント・ブルーＧ　−２５０［Ｓｅｄｍａｋ　、　Ｊ、Ｊ、　、及びＳ、Ｅ 、　Ｇｒｏｇｓｂｅｒｇ　、アナリティカル・ビオケミスト４１ シー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　）　８３　：　５４４（１９７７））及 び標準としての結晶化ＢＳＡ　（シグマ・ケミカル社。

セントルイス、　ＭＯ）　’ｉ用いて蛋白質濃度を決定した。

腎膜のすべての調製は４℃にて行い、そしてそしてこの膜は結合実験又はアデニ レートシクラーゼ測定のためにすぐに使用した。

脳結合研究及び腎結合研究のいずれにおいても、１セツトの１．５ゴポリエチレ ンチユーブを、まず特定濃度のＭＣＴ−Ｉｆ又は５ＣＴ−１，［Ｉ］５ＣＴ−Ｉ 　）レーサー、及び緩衝液（３５μＭバクテリオクンを含有する５　０　ｙｙ＋ Ｍ　Ｔｒｌｍ・ＨＣＬ　ｐｉ（７，４）によシ前処理した。１時間のインキュベ ーションの後混合物を吸引し、そしてすべての実験のためにこれらのチューブ、 すなわち脳膜結合実験のための１セツト及び腎膜結合実験のだめの１セツトを使 用した。実際の結合測定においては、前処理した各チューブに、膜懸濁液、１５ ．０００〜２０．００００ＰＭ　［１２５Ｉ］５ＣＴ−１、及び上記と同じ緩衝 液中Ｏ〜１μＭのコールドペプチドを、最終容量が１−となるように収容した。

インキュベーションを４℃にて３０分間（脳膜）、又は２１℃にて４０分間（腎 膜）行い、そして次にベックマン・ミクロフェージＩＩ（商ｉ）（ベックマン・ インストルメンツ）上で１３．００　Ｏｒｐｍにて５分間チューブを遠心分離す ることに゛よシ停止した。上清を吸引４２　特表口Ｈ６（１−５０１７Ｈ］　（ １３）し、そしてベレットを吸引によシガラス綿を充填し７’１ｃ２００μ！の ディスポ−サブルビペットチップに集めた。各チップ中の放射能を、ベックマン ５５００（商標）カウンター（ベックマン・インストルメンツ）を用いて定量し た。

脳膜及び腎膜の両者を用いる予備的結合実験は、プラスチックインキュベーショ ンチューブへのＭＣＴ−Ｉｔの非特異的結合によって妨害された。この非特異的 結合は３５μＭのバシトラシン、又は２チという高濃度のＢＳＴによシ阻害され なかった。しかしながら、前記のように一！！グチドで前処理したチューブを使 用することによ、９．５ＣＴ−１のそれに匹敵する、ＭＣＴ　−ＩＩによる［： 　Ｉ］５ＣＴ−１の排除曲線を得ることができた〔第５及び６図：　５ＣＴ−１ ＝　（○）、ＭＣＴ−１＝（Δ）；各点は３連測定の３個の平均を示す〕。第５ 図に示すように、脳結合実験におけるＭＣＴ−１［に関する曲線は異常な形状を 有する。独立した結合部位への単一リガントの競争的結合についての理論曲線は 、 として表わすことができ、ここでＣは競争的リガンドの非存在下でのりセプター 結合（１２５Ｉ）ＳＣＴ−１の全濃度と競争的リガンドの存在下での濃度との比 であ３ シ、そしてＰｏ及びＫｐはそれぞれ競争的リガンドの初期濃度及び解離定数であ る（第５図中点線）。この曲線は、Ｏ，’３ｎＭより高いＭＣＴ−ＩＩ濃度のデ ータ一点に適合することができた。そして、この異状はおそら（、ＭＣＴ−ｎと 膜小胞との間の強く非特異的な相互作用の人工的結果である。脳すセプターにっ 込て、データーに適合した理論曲線から計算されたＩｃ５゜は、５ＣＴ−１につ いては０．４　ｎＭであシそしてＭＣＴ　−Ｉｆについては０．６℃Ｍであった 。粗腎膜を用いる場合、５ＣＴ−１及びＭＣＴ−Ｉｆは同一の能力を用し、そし て約Ｌ　５　ｎＭのＩＣ５ｏ値を有するようであった。脳膜結合実験における５ ＣＴ−１の■Ｃ５ｏは、前処理されていないチーープ中で行われた対照実験にお いて決定されたそれ（Ｉｃ５ｏ＝　１　ｎＭ　）よシわずかに低かったが、両条 件下で腎膜を用いる実験においては変化しなかった。

粗腎皮膜中でのアデニレートシクラーゼ活性のペプチドによる刺激を、Ｍａｒｃ ｕｓ　、　Ｒ・及びＧ、Ｄ・Ａｕｒｂａｅｈ　、ビオテミカ・ビオフィジカ・ア クタ（Ｂｌｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔｓ　）　２４２　：　４１ ０　（１９７１）によシ記載されている方法を用いて測定した。反応混合物に、 １ｍＭの〔α−３２Ｐ）ＡＴＰ　（アマ−ジャム、アーリントンハイツ、　ＩＬ 　）　（比活性７０〜１０００Ｐｇ／ｐモル）、１ｒｎＭの（Ｈ）ｅＡＭＰ　（ アマ−シー？　ム）　（約４ ４０、０００　ＣＰＭ　）、１綱のＥＰＴＡ、１ｔｒＭのエチレングリコール− ビス−（β−アミノ゛エテルエーテル）−Ｎ、Ｎ、ＮＩ、Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴ Ａ　）、５ｙｎＭのＭｇＣｌ２．２５ｒｒＮＩのＴｒｉＩ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５ ）、１０〜２０ｔｔＰの膜蛋白質、ホルモン（対照チー−プを除く）、並びに２ ０躍クレアチンホスフェ−）　、　０．２　ｍ９７ｙｄクレアチンキナーゼ及び ２０μｉ／−ミオキナーゼから成るＡＴＰ再生系を全容量１００μｊ中に含有せ しめた。

膜の添加によシ反応を開始した。３７℃にて１０分間インキエベーシ四ンを継続 し、そして１０ｍＭのｃＡＭＰ　、　４０　ｍＭのＡＴＰ及びｌチのドデシル硫 酸ナトリウムを含有する溶液工ＯＯμ！を添加し、そして次に３分間煮洲するこ とによシ反応を停止した。

Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ　、　Ｌ、　％　Ｐ＋Ｃ，Ｙｏｎｇ　％　Ｍ、　Ｈｕｎｚ ｉｃｋａｒ　−Ｄａｎｎ　、　Ｊ、　Ｂｏｅｋａｅｒｔ　、及びＪ、Ｗ、　Ｄｕ ｒａｎ　、　ｘ　ンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　）　９９　 ：　１８５　（１９７６）によシ記載された方法を用いてｃＡＭＰを分離したっ ５ＣＴ−１及びＭＣＴ−１［の両者が基礎活性を超えてアデニレートシクラーゼ 活性を刺激した（第７図）。この図中Ａは、５ＣＴ−１（○）及びＭＣＴ−ＩＩ 　（△）　ｃＤａ度の増加がラット腎アデニレートシクラーゼ活性に与、する効 果を示す。アデニレートシクラーゼ活性は、５ＣＴ−１又はＭＣＴ−Ｉｆによシ 刺激された基礎活性よル上の酵素活性（正味活性）÷基礎活性よシ上の刺激さ４ ５ れた最高酵素活性（最高正味活性）Ｘ１００として表わされる。Ｂは、生成した ｃＡＭＰ　ｐ　ｍｏ　１　／ｍｆ／蛋白質／分として鋏わされた平均最大アデニ レートシクラーゼ活性である。誤差パーは標準誤差（Ｓ、Ｅ　）を示す。５ＣＴ −１はわずかに高い最大活性をもたらし、そして同じ８度範囲にわたってわずか に活性が高かった。しかしながら、膜リセゾター測定にお込て遭遇されるＭＣＴ 　−ＩＩの高い非特異的結合、並びにこれらの測定及びイン−ビデ測定において ５ＣＴ−Ｉ及びＭＣＴ−ＴＩについて観察される同一能力を考慮すれば、上記の 差は有意に大きくはない。

例１０゜ ＭＣＴ−Ｉｔのインーピボ活性 ３〜４週齢の雄性Ｓｐｒａｕｇｕｅ　−Ｄａｖｌｅｙラット（チャールス・リバ ー・ブリーディング・ラボ２トリーズ）に、０．１チＢＳＡを含有する０、　９ チ塩水中ホルモンを皮下注射することによシＭＣＴ−Ｉ［及び５ＣＴ−１９相対 カルシウム低下能力を測定した。各実験において、２５匹のラットを５匹ずつ５ 群に分け、そして各群に塩水のみ、又はホルモンを含有する塩水を投与した。注 射後１時間のエーテル麻酔したラットから心臓穿刺によシ血液サンプルを採取し た。２００μ！の血漿を５艷の５チドリクロロ酢酸−１０００ｐｐｍリチウム〔 ケムーチェク・コンサルティング社４６　特表昭ＧＯ−５０１７Ｈ１（１４）（ Ｃｈ＠ｍ　−Ｃｈ＠ｋ　Ｃｏｎ５＋ｕｌｔ１ｎｇ　Ｉｎｅ、　）　ｐサウス・バ ウンドプルーフ、　ＮＪ　：ｌ中に稀釈し、キして遠心した後、プラズマエはツ シ冒ン分光法〔ベックマン・スペクト２・スパイＩＶ（商ｉ）、ペックマン・イ ンストルメンツ〕によシカルシウム濃度を測定した。

異るラット群を用いる２つの実験において、０．１〜１０１００ｎ／１００５’ 体重の投与量範囲にわたって、ＭＣＴ−ＩＩのカルシウム低下能力は我々の５Ｃ Ｔ−１標品のそれと差異がなかった〔第８図において、５ＣＴ−１（０）及びＭ ＣＴ−１（Δ）につｂての対数（ｔｏｇ　）投与量応答曲線を示す〕。各点は、 ２個の別々の実験における、塩水のみ投与されたラットについての平均血清カル シウム濃度と特定量の５ＣＴ−１又はＭＣＴ−１１のいずれ〃≧を投与されたラ ットについての平均価との差を示す。

ＭＣＴ−１のアミノ酸の配列は、２．８．１０〜１５．１７、及び２０〜２２位 において５ＣＴ−１のそれと異るが、ＭＣＴ−１はサケカルシトニンの試験され た化学的及び生物学的性質のすべてを再現した。その」二、ＭＣＴ−１はイン− ビトロにおいて特異的に結合したリガンドをカルシトニンリセグターから排除し 、そしてラットを用いるバイオアッセイにおいて強力なカルシウム低下反応を生 じさせた。ＭＣＴ−１はそのアミノ酸配列中３２部位の内２１部位（２，８、ｌ Ｏ〜７ １５．１７〜２７．２９〜３０位）においてＰＣＴと異ル、、）：、ＭＣＴ−１ のイン−ビトロ及びインービデ活性は、最も有効な商業的に入手できるカルシト ニンであるＰＣＴのそれと同等である。

ＭＣＴ−Ｉｆは、９部位（８，１０〜工１．１３〜１５．１７、及び２０〜２１ 位）において５ＣＴ−１と異シ、そして３部位（２１，１２、及び２２位）にお いてＭＣＴ−１と異るが、しかしながらこれらを比較するために使用したすべて の測定において、ＭＣＴ−ｎは５ＣＴ−１と同様に活性でｈＤ、そしてＭＣＴ− Ｉに比べて１０倍活性が強い。

これらの例は、これらを−緒に考慮すれば、生物学的活性における因子はカルシ トニンの線状（−次）配列ではなく、むしろペゾチドの適切な三次元的二次構造 が必須であることを示している。この発明に先立って、カルシトニンのすべての 合成類似体は天然力′ルシトニンの一次配列におりる簡単な置換のみを含み、二 次構造の重要性が理解されて２らず、又はこれについて考慮されていなかった。

この結果、製造された類似体はいずれも最も有効な天然カルシトニンであるＳＣ Ｔの活性と同等な活性を有してｂなかった。

これに対して、この発明は、カルシトニンの両親媒性α−ヘリックス構造が活性 における主要な因子８ でちること、及び式（１）の化合物の残基８〜２２の領域（セクション２）が、 α−へリツクス形とカルシトニンリセゾターの両親媒性環境との相互作用におい て必須の構造的役割を演することを証明している。さらに、これらの例は、１５ 位の残水性残基（すべての天然カルシトニン中に見出される）は高い生物学的活 性のために必要ではないこと、しかしリセプター結合はα−へリックスの疎水性 表面上の立体的相互作用に対して感受性であることを示す。

カルシトニンリセグター系はリガンドとリセプターとの間の多くの複雑な相互作 用を含むようであるが、我々は、式（りに示されるような適切な構造的配置の状 態内で増幅されたα−へリツクス構造を有するように設計されたこの発明の化合 物が活性であること、及び幾つかのケースにおいてこの活性は従来知うれている いずれの合成類似体のそれよシも勝っていることを示した。

この発明の本質及び範囲内の化合物及び適用の前記以外の例は、前記の記載に基 いて当業者にとって明らかでアシ、従って、請求の範囲に表わされる限定のみが 考慮されるべきである。

浄−ニー４Ｖ、Ｈ客に変更なし） ＬＯＧ　（カルシトニン投与量）　（ｎｇ　／　１００ｇ　ＢＷ）Ｆｉｇ、　Ｉ ＬＯＧ　Ｃカルシ　トニン〕（Ｍ） Ｆｉｇ、２ ０　８　１６　２４　３２　４０　４８　５６　６４　７２　８０［ＭＣＴ−Ｉ Ｉ］×１０　（Ｍ）６ Ｆｉｇ、３ ０　０　０　０　０　０ ＬＤ　い　く　の　ゞ　− −１０，０−９，０−８，０−７，０ ＬＯＧ　［カルシトニン〕（Ｍ） Ｆｉｇ、５ ＬＯＧ　〔カルシトニン〕　（Ｍ） Ｆｉｇ、６ 生成したｃＡＭＰ　ｐｍｏｊ　／ｍｇ蛋白質／分１（Ｏｌｏ）　正味活性／最高 正味活性 手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８４１０１０２６ ２　発明の名称 カルシトニン様活性を有する新規なペプチドホルモン ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ユニバーシティ　パテンツ、インコーポレイティト４代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６　補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）図面の翻訳文 ７　補正の内容 （１）明細書及び請求の範囲の浄書（内容に変更々し） （２）図面の翻訳文の浄−Ｊ（内容に変更なし）８　添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲　各１通 （２）図面の翻訳文　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式： ％式％（１ ： から成る群から選ばれた部分であシ； Ｒ１〜Ｒ２２はアミノ酸部分であって、ここで、Ｒ２は任意部分であって、存在 する場合にはＳｅｒ及びＧｔｙから成る群から選はれ、 Ｒ８はＬｅｕ又は■ａｌでアリ、 ”１０はＧｌｎ、Ｌｙｓ又はＧ１７であシ、Ｒ１１、Ｒ１４及びＲ２０はそれぞ れ独立にＧｉｎ及びＬｙｍから成る群から選ばれ、 ”１２はＬｅａ又はＴｒｐでｓｂ、 Ｒ１３はＧｌｎ又はＳｅｒでＩｌｌ、 Ｒ１７はＧｉｎ又はＨｌｇでアシ１ Ｒ１９はＬｅｕ又はＣｙａで、ｓｂ、 Ｒ２ｆはＧｌｔｉ又は’ｒｈｙであシ、”２２は任意部分であって、存在する場 合にはＬｅｕ又はＴｙｒから成る群から選ばれ； Ｒ２４〜Ｒ５１は８個の１連のアミノ酸であって、それぞれ独立にＧｌｙ　ｓ　 Ｓｅｒ　％　Ｔｈｒ　ｓ　Ｃｙｃ　ｓ　Ｔｙｒ　ｓＡｓ＋ｎ、　Ｇｌｎ、　Ａ１ １９％　Ｇｌｕ％Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、及びＨｌｍから成る群から選ばれ；但し、 前記８個のアミノ酸の内１個以下のアミノ酸は”Ｐ　ｓ　Ｇ１１１％Ｌｙｓ　、 　Ａｒｇ　、及びＨｌｇから成る群から蓬ばれることができ：そして前記８個の アミノ酸の内４個以上のアミノ酸がヘリックス、−シート、又は−ターン配置を 自発的に形成せず；さらにＲ１９がＣｙｍでちる場合にはＲ２４もＣｙｓであっ てジスルフィド橋を介してＲ１９と連結していなければならず：そして Ｒ３２はたｌンアミド及びグリシンアミドから成る群から選ばれたアミノ酸アミ ドである、）で表わされる化合物；並びにその医薬として許容される塩。 ２、Ｒ８がｌｅｕでｌ：Ｒ１゜がＧｌｙ又はＬｙｓであ多；そしてＲ１５、Ｒ１ ７、及びＲ２１がそれぞれＧｌｎである請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、Ｒ１が、 である請求の範囲第１項記載の化合物。 でちる請求の範囲第２項記載の化合物。 である請求の範囲第１項記載の化合物。 ６、Ｒ４が、 ＣＨ２− ＋Ｈ２−ＣＨ，２−ＣＨ２、 特許請求の範囲第２項記載の化合物。 −Ｇｌ　ｎ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｌｙ　５−Ｌｅａ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　１ｎ−Ｌ ｙｓ　−Ｌｅａ−Ｌｙ８−Ｇｉｎ　−で表わされる請求の範囲第４項記載の化合 物、及びその医薬として許容される塩。 ８　次の式： ％式％ で表わされる請求の範囲第４項記載の化合物、及びその医薬として許容される塩 。 で表わされる請求の範囲第６項に記載の化合物、及びその医薬として許容される 塩。 １０、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第１項に記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効 量を投与することを含んで成る方法。 １１、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第２項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 Ｌ １２、温血動物において血清血漿カルシウムレベ１を低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第３項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １３、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法でちって 、該温血動物に請求の範囲第４項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １４、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第５項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １５、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第６項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １６、温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該瀉血動物に請求の範囲第７項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １７、温血動物において血清血漿カルシウムレベル全低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第８項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １＆　温血動物において血清血漿カルシウムレベルを低下せしめる方法であって 、該温血動物に請求の範囲第９項記載の化合物の血清血漿カルシウム低下有効量 を投与することを含んで成る方法。 １９、請求の範囲第１項記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含んで 成る組成物。 ２、特許請求の範囲第２項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含 んで成る組成物。 ２、特許請求の範囲第３項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含 んで成る組成物。 ２２、請求の範囲第４項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含ん で成る組成物。 ２３、請求の範囲第５項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含ん で成る組成物。 冴、　請求の範囲第６項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含ん で成る組成物。 ２５、請求の範囲第７項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含ん で成る組成物。 が、　請求の範囲第８項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含ん で成る組成物。 ｎ、請求の範囲第９項に記載の化合物を医薬として許容される担体と共に含んで 成る組成物。 浄書（内容に変更なＬ）　１