JP2916252B2 - 血液凝固ＸＩＩａ因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイムノアッセイおよびこのアッセイ用の試薬
に関する。本発明はとくに、血液凝固XII因子およびそ
の活性型、XIIa因子に関する。

XII因子は正常血液中に存在する不活性チモーゲンで
ある。XII因子は、カリクレイン、高分子量キニノーゲ
ンおよび負電荷を帯びた表面の存在下、酵素的に活性な
二鎖型に容易に変換される。この80-Kdセリンプロテア
ーゼは、しばしばαXIIa因子とも呼ばれ、52-KdのＨ鎖
とこれにジスルフィド結合で連結した28-KdのＬ鎖を有
する。この因子を蛋白分解すると40-KdのペプチドがＨ
鎖から放出され、またセリンプロテアーゼ活性は維持す
るがαXIIa因子の28-Kd鎖は元の52-Kd H鎖に由来する小
ペプチドフラグメントにジスルフィド結合している生成
物、βXIIa因子を生じる。多くの場合、この小ペプチド
フラグメントは2000-dの分子量を有するが、サイズの異
なるフラグメント、たとえば800-dおよび3000-dのフラ
グメントも観察されている。

「XIIa」と略記される「XIIa因子」の語は、本明細書
においては、任意の形の活性化XII因子、すなわちセリ
ンプロテアーゼ活性を有するXII因子の任意の誘導体を
意味して用いられる。これには、XII因子からin vitro
で製造される任意の形のXIIa、およびin vivoで生成し
天然原料から得られる任意の形が包含される。これには
さらに、アミノ酸配列が改変され、たとえばアミノ酸配
列に１個もしくは２個以上のいわゆる「保存的」変化、
すなわち分子の性質とくにその免疫学的および酵素的性
質に影響しない変化（付加、欠失または置換）が生じた
天然蛋白質の任意の類縁体が包含される。この語は、天
然のXIIa因子の任意の合成コピーおよび任意の合成類縁
体を包含し、それは化学合成によって製造されたもので
は組換えDNA技術によって製造されたものでもよい。そ
れは任意の形のαXIIaおよび任意の形のβXIIaを包含す
る。「βXIIa」および「βXIIa因子」ならびに「αXII
a」および「αXIIa因子」の語は、本明細書において
は、この種類の任意の形の分子を意味して同様に使用さ
れる。

2000-dペプチドフラグメントを有するβXIIa因子の一
形態のアミノ酸配列は報告されていて（K.Fujikawa ＆
B.A.McMullen:J.Biol.Chem.258,10924〜10933、198
3）、またはその三次構造が推定されている（D.E.Cool
ら:J.Biol.Chem.260,13666〜13676、1985）。この形の
βXIIaの切断部位がさらにCoolら（J.Biol.Chem.262,13
662〜13672、1987）によって決定された。すなわち、α
XIIaはArg³⁵³‐Val³⁵⁴の間の切断によってXIIから生成
し、βXIIaはαXIIaからArg³³⁴‐Asn³³⁵,Arg³⁴³‐Leu
³⁴⁴およびArg³⁵³‐Val³⁵⁴の間の切断によって生成して
それぞれ９および243残基の２個のポリペプチド鎖が生
じる。

本発明はとくにヒトXIIa因子に関するものであるが、
それはヒト蛋白質または特定のアミノ酸配列を有するXI
I蛋白質（上記Fujikawa ＆ McMullen参照）に限定され
るものではない。

コレステロール、低密度リポ蛋白（LDL）およびアポ
リポ蛋白Ｂの血中レベルの上昇が、虚血性心疾患（IH
D）および急性心筋梗塞（AMI）による長期死亡リスクと
正の相関をすることが知られている。同様の正の相関は
高密度リポ蛋白（HDL）およびアポリポ蛋白A1の血中レ
ベルの低下にも見出されている。

しかしながら、これらのパラメーターのいずれも、各
個人のAMIのリスクの予知には有用ではない。Northwick
Park病院のMaedaら（Maedaら:Lancet,i,1050〜4;Maed
a:Haemostasis,13,178〜85、1983,MaedaらLancet,ii,53
3〜７、1986）およびFramingham研究のKannel,Wolf,Cas
telli ＆ Agostino（Kannelら:J.A.M.A.258（９）,1183
〜６、1987）は、注意深く制御された条件下には、フィ
ブリノーゲンおよびVII因子凝固活性の測定が、各種脂
質の測定よりもよくAMIの可能性を予知できることを示
している。VII因子自体は活性の低い単一鎖蛋白質であ
るが、もっと活性の高い二鎖型のVIIa因子に変換でき
る。VII因子をVIIa因子に活性化できる物質にはXa因
子、IXa因子、XIIa因子、トロンビンがある。

上に指摘したように、VII因子には、注意深く制御さ
れた条件下には、各個人のAMIの可能性の予知に有用で
あることが示されている。しかしながら、現在利用でき
るVII因子活性の測定方法は、大きな変動を生じやす
い。とくに、血液サンプルの採取に一般的に用いられる
静脈穿刺では、上述のようにVII因子の活性化の一方法
に関与する組織因子の放出量が様々に変動する。したが
がって、AMIの予知に際してのVII因子活性の利用には、
一般的に使用できるだけの信頼性がない。

本発明は、食事中の脂質レベルの増加が、XIIa因子た
とえばβXIIaの定常的濃度の上昇によってVII因子活性
を増大させるという観察に基づくものである。すなわ
ち、XIIa因子たとえばβXIIaは、高脂血症とXII因子の
間のきずなの役目をしている。

したがって、心臓疾患、とくに各個人の虚血性心疾患
および急性心筋梗塞（AMI）の可能性の予知に際し、VII
因子活性の使用と同様に、ただしVII因子のサンプルの
採取時に起こる組織因子の活性化の欠点を回避して、血
漿中のXIIa因子たとえばβXIIaのレベルの測定の利用が
提案される。

しかしながら、本発明の以前には、迅速で、選択的
で、約100g/ml以下のレベルのXIIaを正確に検知できる
感度を有し、しかも大規模な利用のために自動化が容易
なXIIa因子の検定法はなかった。

XIIa因子の測定に従来用いられている方法は、色原体
基質が加水分解される酵素アッセイである。上述の感度
が低いことに加えて、このアッセイには、色原体基質
が、Xa因子、カリクレインおよびトロンビンを含めた、
血漿中に存在する多数の他の物質によって加水分解され
るという欠点がある。したがって、この加水分解につい
ての推定および補正が必要となり、とくにXIIaレベルが
低い場合には不正確になることは避けられない。このア
ッセイは、XIIaのレベルが約10ng/ml以下の場合には、
正確な結果が得られるとは考え難い。

XIIaおよび他の凝固因子のアッセイの改良へのアプロ
ーチとしては、改良された色原体基質の供給が考慮され
ている（たとえば、EP78764-BおよびEP28500-A参照）。

他の色原体によらない種類の血液凝固因子のアッセイ
も提案されていて、たとえば、WO-8606489-Aには表面結
合フィブリノーゲンと標識フィブリノーゲンの使用が開
始されている。また、イムノアッセイも提案されてい
て、たとえばEP-325723-Aには、一般的に、血液凝固因
子に対するモノクローナル抗体で感作された微粒子担体
の使用が開始されている。

J62065693-Aにはモノクローナル抗−ヒト血液凝固XI
因子抗体が開示されている。この抗体は、活性型XI因子
ならびに血液凝固XI因子自体に強力な親和性を有すると
述べられている。このモノクローナル抗体は、様々な形
式のイムノアッセイにより、ヒト血液凝固XI因子および
活性型XI因子の定量に使用できる。

XII因子とαXIIa因子を認識できるモノクローナル抗
体も報告されているが、これはβXIIa因子を認識しない
（E.J.Smallら:Blood,65:202〜210、1985）。この著者
らは、その抗体がαXIIa因子がβXIIa因子に変換する際
に、αXIIa因子から放出される40-Kdフラグメントに対
するものであることを明らかにしていることから、それ
は驚くべきことではない。すなわち、その抗体はXII因
子およびαXIIa因子の分子の部分であるが、βXIIa分子
中には構造的に存在しない抗原決定基に対するものであ
った。

本発明は、βXIIa因子に結合し、XII因子には実質的
に結合を示さないモノクローナル抗体を提供する。本発
明のモノクローナル抗体はβXIIa因子に特異的に結合す
るか、またはαXIIa因子にも結合する。

J6206593-AおよびSmallらの場合と異なり、本発明の
モノクローナル抗体が活性化XII因子を認識できて、活
性体XIIとそのチモーゲンXII因子自体を識別できること
は驚くべきことである。

本発明は、サンプル中のXIIaまたはβXIIa因子の検出
および／または定量方法であって、抗原と抗体を相互作
用させて生成した抗体−抗原複合体を検出および／また
は定量することからなり、その抗体として本発明のモノ
クローナル抗体を使用することを特徴とする定性的また
は定量的イムノアッセイにサンプルを付す方法を提供す
る。このアッセイには一般に、βXIIa因子が標準として
使用される。

本発明はまた、液体サンプル中の抗原のイムノアッセ
イを実施する方法であって、抗原とそれに結合する抗体
を相互作用させ、既知抗原の既定量を用いて得られた結
果と比較することによってサンプル中に存在する抗原の
量を決定することからなり、その抗体として本発明のモ
ノクローナル抗体、既知抗原としてβXIIa因子を使用す
ることを特徴とする方法を提供する。

本発明のイムノアッセイは、大規模な利用のための自
動化装置の使用が容易な、迅速な定量方法を提供する。
このアッセイはまた、精度および感度が優れ、従来使用
されていた色原体アッセイの有効下限10ng/mlより低いX
IIaおよびβXIIaレベルの検出にも十分使用できる。

本発明の抗体およびイムノアッセイは、したがって、
とくに研究室または臨床検査室において多数の検定を実
施しなければならない場合の、XIIaまたはβXIIa因子の
検定に有用である。本発明の抗体およびイムノアッセイ
はとくに、疫学的研究に際し、心臓疾患、とくに各個人
の虚血性心疾患および／または急性心筋梗塞の危険の評
価に、上述のVII因子のデータと同様に使用できるデー
タを得るのに適している。

本発明はしたがって、本発明のイムノアッセイをヒト
対象から得られた血漿のサンプルについて実施し、その
対象の心臓疾患への罹病性を決定するため、検定された
サンプル中の抗原レベルについて得られた結果を、その
抗原レベルと心臓疾患への罹病性を関連づける大規模な
研究で得られた結果と比較する方法を提供する。個々の
検定と大規模な研究は同一の抗体を用いて実施するのが
好ましい。一般的にまた、同一のイムノアッセイを用い
ることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体およびイムノアッセイ
は、また、凝固系および血栓性疾患の研究に使用するこ
とができる。

特定のモノクローナル抗体がβXIIa−特異的である
か、またはαXIIaにも結合するかを知りたい場合には、
これは抗原としてαXIIa因子を用いて抗体に対するイム
ノアッセイを行うことによって可能になる。所望によ
り、イムノアッセイは定性的または定量的のいずれにす
ることもできるが、一般的には、固相アッセイよりも液
相アッセイを使用する方が好ましい。しかしながら、互
いに比較されるすべてのアッセイに同一の抗体を使用す
る限り、満足すべき結果が得られると考えられるので、
αXIIaに対する特異性を測定することは重要でないと考
えられる（本発明のアッセイの結果は一般にβXIIa標準
に対して決定されたものであり、したがってβXIIaの指
標およびβXIIa当量を表すとみなされるものであること
を銘記すべきである）。

本発明はまた、抗βXIIa因子を認識できる少なくとも
１種の抗原決定基であるかまたはそれを包含するβXIIa
のフラグメントであるペプチドに関する。βXIIaの抗原
性フラグメントはそれ自体免疫原性であるかまたは小さ
すぎて免疫原性を示さない。後者の場合には、たとえば
以下に述べるような他のペプチドに接合させることによ
って、たとえば、免疫原に変換することができる。本明
細書で用いられる「βXIIaの抗原性フラグメント」の語
は、上述のようなペプチドおよび、それがそれ自体免疫
原性でない場合には、そのようなペプチドの免疫原型の
両者を包含する。

免疫原の製造方法は、本技術分野の熟練者にはよく知
られている。これらの任意の方法が、βXIIa因子または
その抗原性フラグメントを免疫原にするかまたはその免
疫原性を改善するために使用できる。

基本的に、すべての方法は、抗原性でないかまたは十
分に抗原性ではない分子に対して、免疫処置により免疫
応答または改善された免疫応答が得られるように、大き
な蛋白質分子を付加することからなる。担体として用い
られる蛋白質分子は、たとえば、キーホールリンペット
・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロ
ブリン、およびツベルクリンの精製蛋白質誘導体であ
る。たとえば、キーホールリンペット・ヘモシアニン
（KLH）は、二官能性架橋剤たとえばマレイミド試薬た
とえば、スルホスクシンイミジル−Ｎ−マレイミドメチ
ルシクロヘキサン−１−カルボキシレートを用い、その
ペプチドのシステインのチオール基を介してシステイン
含有ペプチドにカップリングさせることができる（E.Is
hikawaら:J.Immunoassay,4:209、1983参照）。得られた
接合体はゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、凍結乾
燥することができる。

固有のチオール基をもたないペプチドは、Ｎおよび／
またはＣ−末端にシステイン残基を導入させることがで
きる。接合体は、固相たとえばプラスチック製マイクロ
タイタープレートのウエルのコーティングに使用でき
る。

βXIIa因子は、まず新鮮なまたは新たに凍結した血漿
からXII因子をたとえば、硫酸アンモニウム沈殿と陰イ
オン交換クロマトグラフィーの組合わせを用い、たとえ
ば、K.Fujikawa ＆ E.W.Davie（Methods in Enzymol.8
0:198〜211、1981）によって報告された方法に従って単
離する方法によって製造できる。XII因子をβXIIa因子
に変換し、得られた混合物からβXIIa因子を単離する方
法は、K.Fujikawa ＆ B.A.McMullen（J.Biol.Chem.258:
10924〜10933、1983）およびB.A.McMullen ＆ Fujikawa
（J.Biol.Chem.260:5328、1985）によって記載されてい
る。βXIIa因子を得るためには、XII因子をついで、一
般的には限定切断に付す。たとえば化学的または酵素的
消化により、たとえばトリプシンまたはトリプシン様酵
素を、一般的には高度に希釈した形で、たとえばトリプ
シン:XII因子のモル比1:500、たとえばトリプシン:XII
因子の重量比1:75を使用し、切断生成物は一般的にはク
ロマトグラフィーによって分離する。

XII因子のある種のプレパレーションは、見掛けの分
子量80,52および28-Kdの３個の蛋白質バンドが観察され
る場合、還元サンプルの試験から判断すると、かなりの
量のαXIIaを含んでいる。このような、XII因子プレパ
レーションはアミド分解活性も発揮する。Fujikawa ＆
Davieによれば、VII因子とαXIIa因子はベンズアミジン
−アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて分離で
きる。溶出すると２つのピークが観察され、その両者と
も血液凝固活性を有する。しかしながら、第二のピーク
のみがアミド分解活性を有する。ベンズアミジン−アガ
ロースカムラに適用された材料が、非還元SDS-PAGEゲル
の分析で測定できるβXIIaを含まないとすれば、第二の
ピークはαXIIaである。これは、還元および非還元サン
プルを、SDS-PAGEに流すことによって確認できる。

βXIIaの抗原性フラグメントはβXIIaを酵素的または
化学的手段で分解することにより製造できる。たとえ
ば、βXIIaのジスルフィド連結Ｌ鎖ペプチドは、βXIIa
の還元およびカルボキシメチル化、ついでクロマトグラ
フィーによるそのフラグメントの単離によって得られる
（K.Fujikawa ＆ B.A.McMullen:J.Biol.Chem.258,1092
4,1983）。

別法として、βXIIaの抗原性フラグメントは、そのア
ミノ酸配列が既知の場合には、βXIIaそれ自体と同様、
合成的に製造できる。ペプチド合成の多くの既知の任意
の化学的方法、とくに自動化装置を利用する方法が使用
できる。

βXIIaの抗原性フラグメントは、βXIIaそれ自体と同
様、組換えDNA技術を用いて製造できる。（Coolら,1985
および1987,前出がヒト血液凝固XII因子cDNAおよび遺伝
子を特性づけている）。これはたとえば、化学的合成ま
たは相当するm-RNAからの逆転写による遺伝子の構築、
遺伝子の適当なベクターたとえばプラスミドたとえばpB
R322への挿入、ベクターの宿主生物たとえば大腸菌への
導入、ついで宿主生物での遺伝子の発現によって達成さ
れる。このような操作は現在ではルーチンであり、とく
にベクターとしては、たとえばpBR322が市販品を入手で
きる。

Maniatisら:Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory,1982は、この分野で用いられる技術が詳細
に記載されている標準的な成書である。一般に、小さな
ペプチドでは化学的合成が好ましく、ペプチドが大きく
なるほど、化学的合成よりも組換えDNAが経済的に好ま
しくなる。

とくに指定のない限り、本明細書で用いられる「βXI
Ia因子」および「βXIIa」の語にはβXIIa分子の抗原性
フラグメントが包含される。

βXIIa因子はモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗血清の製造に使用できて、これらのモノクローナル
抗体は本発明の一部である。上述のように、本発明のモ
ノクローナル抗体はβXIIa因子に結合することが可能で
（βXIIaの抗原決定基特性を認識できる）、またXII因
子には有意な結合を示さない（βXIIa因子とXII因子を
識別できる）か、あるいはβXIIaおよびαXIIaに結合が
可能で、この場合、抗体はβXIIaおよびαXIIa因子に共
通の抗原決定基が認識できる。ポリクローナル抗血清は
βXIIaに優先的に結合する。

本明細書で用いられる「抗体」の語は、抗原、たとえ
ばFabおよびＦ（ab′）_２フラグメントに結合できる任
意の抗体フラグメントを包含する。

上述のように、本発明のモノクローナル抗体は、実質
的にXII因子には結合を示さない。診断の目的でのイム
ノアッセイに用いる場合は、XII因子との補正された交
叉反応性は一般に0.1％またはそれ以下でなければなら
ない（下記参照）。他の目的、たとえば免疫吸着剤とし
て使用する場合には、交叉反応性はもっと高くてもよ
い。本発明のモノクローナル抗体は、βXIIa因子に対し
て少なくとも10¹⁰M^-1の親和性をもつことが好ましい。

本発明の抗体のXII因子との交叉反応性の評価に際し
て考慮すべき因子は、「純粋な」XII因子プレパレーシ
ョンでも少量のXIIaが夾雑することはほとんど避けられ
ないということである（Silverberg ＆ Kaplan:Blood 6
0:64〜70、1982）。存在する少量のXIIaはほとんどの場
合、問題にはならないが、交叉反応の程度を評価する場
合には、XII因子中のXIIaの量をできる限り正確に測定
する必要があり、これを初期に測定した見掛けの交叉反
応ではなく補正された交叉反応の測定のために考慮しな
ければならない。たとえば、XII因子プレパレーション
は0.5〜0.8％の範囲のXIIaを含有することが明らかにさ
れている。この値を考慮すると、XII因子との見掛けの
交叉反応0.5％は、補正された交叉反応0.1％未満にな
る。とくに指示のない限り、本明細書においては、「交
叉反応」の語は補正交叉反応を意味して使用される。

本発明は、増殖培地中で抗体を産生できるハイブリド
ーマ細胞系を培養し、増殖培地から抗体を得ることから
なる、本発明のモノクローナル抗体の製造方法を提供す
る。

本発明はさらに、抗原を動物に投与して抗体産生細胞
を得、得られた抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合
し、得られたハイブリドーマをモノクローナル抗体の産
生についてスクリーニングし、この場合、抗原はβXIIa
因子またはその抗原性フラグメントとする、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の製
造方法を提供する。

モノクローナル抗体の製造に用いられる方法はよく知
られている（たとえば、Methods in Enzymology,H.VanV
unakis ＆ J.J.Longone編、1981、72（Ｂ）および同
誌、1983、92（Ｅ）参照）。

モノクローナル抗体は、たとえば、Kohler ＆ Milste
inの方法（G.Kohler ＆ C.Milstein:Nature 256:495、1
975）の改良法によって製造できる。すなわち、雌性Bal
b/CまたはC57/B10マウスを、βXIIaまたはβXIIaの抗原
性フラグメントたとえば10〜30μｇ、一般的にはβXIIa
20μｇまたは他の抗原の相当量の腹腔内注射によって免
疫処置する。βXIIaまたは他の抗原は、他の蛋白質分子
たとえばウシサイログロブリンまたはツベルクリンの精
製蛋白誘導体に接合させることが好ましい。接合はたと
えばカルボジイミド法または異種二官能性試薬を用いて
実施できる。免疫原は一般に、アジュバント、好ましく
は完全フロインドアジュバント中に添加する。この操作
は一般に間隔を置いて、一般には同じ抗原を同じ用量使
用して反復する。たとえば３週間隔でマウスに、完全フ
ロインドアジュバント中接合βXIIa20μｇを、適当な応
答レベルが得られるまでブースターを投与する。融合前
のブースターは、屠殺前たとえば屠殺３日前に静脈内に
行うのが好ましい。抗体応答はたとえば、¹²⁵I−放射標
識βXIIaまたはクロラミン−Ｔ法で製造した他のβXIIa
抗原を用いるRIA抗血清曲線分析によってモニタリング
する（P.J.McConahey ＆ F.J.Dixon:Int.Arch.Allergy
Appl.Immunol.29:185、1966）。純度はたとえば還元条
件下に流したSDS-PAGEゲルのオートラジオグラフィーを
用いて、たとえば確認される。

免疫マウス脾細胞をついで、ミエローマ細胞たとえば
NSOマウスミエローマ細胞と、たとえば40〜50％PGE4,00
0または50％ PEG1,500の存在下に融合させる。次に細胞
を培養プレートのウエルに播き、選択メジウム上で増殖
させる。上清を、精製βXIIaまたは他のβXIIa抗原に対
する反応性について、たとえば固相酵素イムノアッセイ
により、たとえばペルオキシダーゼ標識抗−マウスIgG
を用いて試験する。βXIIaに対して特異性を示したすべ
てのウエルを取り、一般にはさらに二次スクリーニング
に付す。二次スクリーニングは、たとえば、放射標識さ
れたβXIIaまたはβXIIa抗原性フラグメントに対する溶
液中結合についての全特異性抗体のスクリーニングであ
る。これらは好ましくは、 50％Bmaxに必要な抗体希釈を測定するために滴定され
る。コールドすなわち非標識βXIIaまたは相当するコー
ルド抗原性フラグメントに対する用量反応曲線、または
XII因子、プラスミンおよびフィブロネクチンに対する
用量反応曲線も好ましくは作成する。交叉反応の程度は
次式によって求められる。

（βXIIaのかわりに抗原性フラグメントを使用する場合
には、上記式のこれを置換する） 既定の見掛けのXII因子に対する交叉反応、好ましく
は1.5％またはそれ未満、さらに好ましくは１％または
それ未満を示す抗体を先に進める。各抗体に対する親和
性定数の値を得るために、用量反応データに対してスキ
ャッチャード分析を行ってもよい。少なくとも10¹⁰M^-1
の親和性定数を有する抗体を一般には、次のクローニン
グに進める。好結果のクローンは一般にサブタイプに分
ける。細胞をついで好ましくは限界希釈によってサブク
ローン化し、一般的には酵素イムノアッセイを用いてβ
XIIaに対する抗体の産生について再びスクリーニングす
る。各クローニングから選択されたサブクローンはま
た、ラジオイムノアッセイを用いて特異性および用量反
応について評価する。

特定の目的で、αXIIaおよびβXIIaの両者またはβXI
Iaのみに結合を示すモノクローナル抗体を産生するクロ
ーンを選択すること、あるいは選ばれたクローンによっ
て産生される抗体の結合特性を確認することを所望の場
合には、抗原としてαXIIaを用いるスクリーニング過程
をさらに適当な時点で導入できる。このようなスクリー
ニングには、Fujikawa ＆ Davieの方法（上記参照）に
従って得られるαXIIaプレパレーションを使用できる。
しかしながら、αXIIaのスクリーニングをβXIIaスクリ
ーニング後に実施する場合には、一般的にはαXIIa含有
XII因子プレパレーションを上述のベンズアミジン−ア
ガロースクロマトグラフィーに付す必要はない。一般
に、そのプレパレーションがβXIIaを含まないことを確
立すれば十分である。上述のように、固相アッセイより
も液相アッセイを用いることが一般に好ましく、たとえ
ば抗体から放射標識βXIIaのαXIIaによる置換が関与す
るアッセイが用いられる。

サブクローン化されたハイブリドーマ細胞はBalb/Cマ
ウスに腹腔内注射して腹水を生成させる。免疫グロブリ
ンは腹水から、たとえば４℃で飽和硫酸アンモニウム溶
液（等容）を用いて沈殿させることができる。沈殿は、
たとえば遠心分離し、たとえば50mM Tris-HCl緩衝液pH
7.5（最初の腹水と同じ容量）に溶解し、ついで同一の
緩衝液に対して透析することによって精製することが好
ましい。免疫グロブリン分画は次に、陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより、たとえば蛋白質溶液をMono-Q陰
イオン交換カラム（Pharmacia）に適用し、製造業者の
推奨に従って同じ緩衝液中塩勾配を用いて溶出すること
によって、さらに精製する。免疫グロブリンを含有する
分画はプールし、一般には、−20℃で凍結して保存す
る。

別法として、ハイブリドーマ細胞を抗体産生のために
培養液中で増殖させ、抗体を腹水について記載したとほ
ぼ同様にして単離する。

本明細書に記載したハイブリドーマはマウス脾細胞か
ら誘導されたが、本発明はマウスまたは部分マウス起源
のハイブリドーマに限定されるものではない。両融合パ
ートナー（脾細胞およびミエローマ）は任意の適当な動
物から得ることができる。

本発明は、βXIIaに結合するポリクローナル抗血清の
使用も包含する。

ポリクローナル抗体の製造に用いられる方法はよく知
られている（たとえば、“Practice and Theory of Enz
yme Immunoassays",P.Tijssen,Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology,R.H.Burdon
＆ P.H.Van Knippenberg編、Elsevier,1985、およびInt
roduction to Radioimmunoassay and Related Techniqu
es,T.Chard、同書第３版、1987参照）。ポリクローナル
抗血清は、たとえば、他の蛋白質に接合したβXIIa因
子、またはXII因子を抗原として使用し、ヒツジまたは
ウサギ中で産生させる。

上述のように、本発明はまた、サンプル中のXIIaまた
はβIIa因子を検出および／または定量する方法におい
て、抗原と抗体を相互作用させ、得られた抗体−抗原複
合体の検出および／または定量し、この場合、抗体は本
発明のモノクローナル抗体であることを特徴とする定性
的または定量的イムノアッセイにサンプルを付す方法を
提供する。

本発明はさらに、液体サンプル中の抗原のイムノアッ
セイを実施する方法において、アッセイは抗原とそれに
結合する抗体とを相互作用させ、既知抗原の既定量を用
いて得られた結果と比較することによってサンプル中に
存在する抗原の量を定量するものであって、この場合、
抗体は本発明のモノクローナル抗体、既知抗原はβXIIa
因子であることを特徴とする方法を提供する。

イムノアッセイを実施する方法はよく知られている
（たとえば、Methods in Enzymology,H.Vunakis ＆ J.
J.Langone編、1982、72（Ｂ）;Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays,P.Tijssen,Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology,R.J.Burde
n ＆ P.H.Van Knippenberg編、Elsevier,1985;Introduc
tion to Radioimmunoassay and Related Techniques,T.
Chard、同書、第３版、1987;ならびにMethods in Enzym
ology,H.Van Vunakis ＆ J.J.Langone編、1981、74
（Ｃ）参照）。

上述のように、イムノアッセイ技術には、定性的およ
び定量的両技術がよく知られていて、ELISA（固相酵素
免疫測定法）、ウエスタンブロッティング、流動相沈殿
アッセイ、コーティング粒子アッセイ、競合的アッセ
イ、サンドイッチアッセイさらに逆および同時サンドイ
ッチアッセイ、ならびに固相ラジオイムノアッセイ（SP
RIA）がある。

これらの中で、本発明の場合、ELISAとするSPRIAがと
くに便利である。したがって、本発明によるモノクロー
ナル抗体のサンプルは、固相支持体たとえばプラスチッ
クまたは他の重合材料の、たとえばプラスチック製マイ
クロタイマープレートのウエルに吸着させ、検討する血
漿サンプルまたは標準溶液を抗体試薬に接触させてイン
キュベートし、得られた結合XIIaまたはβXIIa因子を、
結合因子または標準にたとえばその分子上の別個のエピ
トープによって結合できる標識抗体を用いて検出する。
標識抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよ
い。標識としては、任意の適当な放射性同意元素、たと
えばβ−放出体またはα−放出体、たとえば¹²⁵I,¹³¹I,
³Hおよび¹⁴Cが使用できる。酵素標識には、基質として
フェノールフタレンを用いるたとえばアルカリホスファ
ターゼがある。酵素反応は電気化学的方法を用いて追跡
することができる。標識抗−抗体の使用に変えて、結合
XIIaまたはβXIIaは直接、色原体基質を用いて定量する
ことができる。

本発明のモノクローナル抗体を固体支持体上に吸着さ
せる代わりに、βXIIaそれ自体またはその抗原性フラグ
メントを、競合的アッセイに使用するために結合させて
もよい。さらに別法としては、標識たとえば放射標識β
XIIaまたはその抗原性フラグメントを競合的アッセイに
使用することができる。

本発明に使用されるラジオイムノアッセイの例を挙げ
れば次の通りである。すなわち、モノクローナル抗体
¹²⁵I−標識βXIIa、βXIIa標識溶液および固体支持体た
とえばSephacryl S-1000にカップリングさせた抗−マウ
スIgGを用い、以下の方法で用量−反応曲線を作成す
る。モノクローナル抗体腹水を検定緩衝液、たとえば、
0.15m NaCl、0.25％ BSA,10mM EDTA、3mM NaNおよび0.1
％ Triton含有50mM Tris-HCl pH7.4からなる緩衝液で希
釈する。二重検定チューブに、検定緩衝液中、各モノク
ローナル抗体溶液、¹²⁵I−放射標識βXIIa溶液および精
製βXIIa標準溶液を加える。標準溶液はβXIIa保存溶液
から調製する。総カウントを与える対照チューブは検定
緩衝液とトレーサー溶液を用いて調整した。すべてのチ
ューブを混合し、ついでインキュベートする。次に、各
チューブに（対照を除く）固定支持体にカップリングし
た抗−マウスIgGの至適量を含有する懸濁液のサンプル
を加えたのち、チューブを振盪しながらインキュベート
する。この工程後、好ましくはスクロース緩衝液（検定
緩衝液＋10％ w/wスクロース）をたとえば蠕動ポンプを
用いて、各チューブ（対照を除く）中の反応混合物の下
に層とする。固定支持体にカップリングした抗−マウス
IgGを沈降させ、ついで各チューブから液体を除去す
る。対照を含めた全チューブについてカウントを測定す
る。各βXIIa標準について得られたカウントを総カウン
トで除して結合率％を計算する。添加する総カウントは
たとえば10,000cpmとする。上述のラジオイムノアッセ
イにおいては、βXIIaをβXIIaの抗原性フラグメントで
置換できる。

本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体とβXI
Ia因子またはその抗原性フラグメントをそれぞれ別個の
容器に入れるかまたは他の方法で分画化してなる、本発
明のイムノアッセイを実施するためのキットを提供す
る。キットにはさらに、たとえば上述のイムノアッセイ
を実施するための構成要素を包含してもよい。本発明の
モノクローナル抗体は非標識でも標識抗体でもよい。抗
体は固体支持体上に固定化してもよい。

本発明のキットは、たとえば、 ａ）（ｉ）本発明のモノクローナル抗体、または（ii）
βXIIa因子もしくはその抗原性フラグメント、または
（iii）本発明の抗体に対する抗体、 ｂ）（ｉ）βXIIa因子に直接または間接的に反応できる
標識抗体、または（ii）標識βXIIa因子、または（ii
i）βXIIa因子に対する色原体基質、および ｃ）精製βXIIa因子またはその抗原性フラグメント、 から構成される。

構成要素（ａ）（ｉ）,a）（ii）又はａ）（iii）
は、所望により、固体支持体に結合させてもよい。

キットはさらに他の構成要素、たとえば洗浄試薬溶液
および基質溶液を、それぞれ別個の容器に包含していて
もよい。

ポリクローナル抗血清または、とくに本発明のモノク
ローナル抗体は、βXIIa因子またはその抗原性フラグメ
ントの精製における免疫吸着剤として親和性クロマトグ
ラフィーに使用することができ、本発明は、本発明のモ
ノクローナル抗体からなり、一般的には固体支持体に常
法で（下記参照）吸着または他の形で支持させた免疫吸
着体を提供し、またこのように支持された抗体（免疫吸
着体）を用いてβXIIa因子またはその抗原性フラグメン
ト精製する方法に関する。精製されたβXIIa因子または
その抗原性フラグメントは、βXIIa因子を定量するため
の本発明の方法において、対照試薬として使用できる。
逆に、本発明はまた、βXIIa因子またはその抗原性フラ
グメントからなり、一般的には常法により（下記参照）
固体支持体に吸着または他の形で支持させた免疫吸着体
に関する。

本発明はまた、このような支持された抗原（免疫吸着
体）を用いて抗−βXIIa因子抗体および抗血清をスクリ
ーニングする方法および／または精製方法を提供する。
βXIIaの抗原性フラグメントを好ましくは上述の免疫吸
着体の形で使用してモノクローナル抗体のβXIIaに対す
る特異性および／または親和性をスクリーニングするこ
とは有利である。所望により、免疫吸着体として固体支
持体上に固定化されたαXIIa因子またはその抗原性フラ
グメントを用いて、さらにスクリーニングおよび／また
は精製を実施することができる。

ポリクローナル抗体は、とくに抗−βXIIa因子抗体の
含量を増加させるために、たとえば、ポリクローナル抗
体をβXIIa因子またはその抗原性フラグメントと接触さ
せることにより精製できる。ポリクローナル抗体は、好
ましくは、固体支持体上に固定化されたβXIIaの抗原性
フラグメントと接触させ、得られた結合抗体を遊離させ
る。粗ポリクローナル抗体プレパレーションの特異性お
よび親和性はこのような方法で実質的に改善することが
可能で、したがって得られたポリクローナル抗体は市販
の検定に使用するのにさらに適当になる。

βXIIaに結合するモノクローナルマウス抗体は、製造
業者の指示に従って、CNBr−活性化Sepharose-4B（Phar
macia）に共有結合的にカップリングさせることができ
る。このようなカラムは、βXIIa抗原の単離に、たとえ
ば血漿からのβXIIaまたはXII因子消化物からのβXIIa
もしくはその抗原性フラグメントの単離に適宜使用する
ことができる。結合したβXIIa抗原はカラムから、たと
えば4Mグアニジンを用いて溶出させ、溶出中の抗原を検
出する。たとえばβXIIaはS-2302ペプチド基質（Kabi）
を用いて酵素活性により、または¹²⁵I標識βXIIaを用い
て溶出分画中に検出できる。

上述のβXIIa抗原、すなわちβXIIa自体またはその抗
原性フラグメントは、製造業者の指示に従い、固有のま
たは導入された１個または２個以上のチオール基を介し
てチオール活性化Sepharose（Pharmacia）にたとえば、
カップリングさせることができる。αXIIa因子またはそ
の抗原性フラグメントも同様にカップリングさせること
ができる。

上述のように、XIIa因子たとえばβXIIa因子の活性と
VII因子活性の間には、酵素／基質の関係が存在すると
考えられ、これはVII因子たとえばβXIIa因子活性が、V
II因子活性の代わりに、心臓疾患とくに虚血性心疾患
（IHD）および急性心筋梗塞（AMI）の危険の指標として
使用できることを示唆している。

正常またはコレステロール添加食餌が飼育したウサギ
で¹²⁵I−標識XII因子の代謝回転を検討した結果は、血
管外および血管内コンパートメントでのXII因子の半減
期およびプールサイズにはほとんど変化がなく、また分
画での異化率にはほとんど変化がないのに、コレステロ
ール添加食餌で飼育したウサギでの絶対異化率は標準食
餌で飼育したウサギの場合に比べて大きいことを示して
いる。ウサギはヒトに比べてカリクレインレベルがはる
かに低いので、XII因子の異化率の増加は、相当する環
境下でのヒトではさらに著しいものであることが期待さ
れる。XII因子の異化率の上昇の意義は、これがXII因子
活性に対して有する影響である。これらの結果は、 XIIaたとえばβXIIa因子がAMIの危険の指標として適
していることを示している。

したがって、被験者から得られた血漿サンプルについ
て実施された本発明のイムノアッセイのデータはその被
験者の心臓疾患、とくに虚血性心疾患および／または急
性心筋梗塞の危険の指標として有用であることが提起さ
れる。ある個人について得られた結果とその個人におけ
る心臓疾患たとえば虚血性心疾患およびとくに急性心筋
梗塞の危険との相関は、これらのパラメーターを、好ま
しくは他の基準によって危険があると考えられる個体お
よび危険がないと考えられる個体を含めた多数の個体で
の検討によって明らかにすることができる。検討する集
団が大きいほど、相関の正確度はよくなる。このような
疫学的研究のザデインおよび遂行についてはよく知られ
ていて、たとえば上述のNorthwick Park病院およびFram
inghamの研究が参考になる。心臓疾患たとえばAMIの個
人に対する危険の評価は、たとえば上述のような疫学的
研究で得られたデータを、個人について測定されたデー
タと比較することによって行われる。

本発明の方法および他の実施態様はまた、血液凝固に
関与する機構の検討および血栓性障害の研究にも有用で
ある。

以下の実施例2,3,5〜７および９は本発明を例示する
ものであって、いかなる意味においても本発明を限定す
るものではない。

例１ XIIおよびβXIIa因子の単離および精製 新鮮なまたは凍結したヒト血漿からのXII因子の単離
は、K.FujikawaおよびE.W.Daviesの記載（Methods Enzy
mol.80:198,1981）にほぼ従い、硫酸アンモニウム沈殿
と陰イオン交換クロマトグラフィーを組合せて用いて行
った。6.5リットルの血漿からのXII因子の収量は53mgで
あった。

XII因子から通常の消化によるβXIIa因子の製造は、
B.A.McMullen ＆ K.Fujikawa（J.Biol.Chem.260:5328,1
985）およびK.Fujikawa ＆ B.A.McMullen（J.Biol.Che
m.258:10924,1983）によって以前に報告された方法を用
いて実施した。

XII因子53mgを８リットルの50mM Tris/75mM NaCl,pH
8.0に対して４℃で一夜透析した。蛋白質溶液を37℃に
加温し、0.7mgのトリプシンを加え、37℃で15分間平衡
化した。大豆トリプシン阻害剤（SBTI）1.4mgをついで
加えて消化を停止させ、この溶液を37℃にさらに15分間
保持した。βXIIaは直ちに、DEAE-Sephacelを用いて他
の成分から分離した。カラムをTris/75mM NaCl,pH8.0
で、一部の蛋白質が洗浄除去されるまで洗浄し、ついで
50mM Tris/75mM NaCl→50mM Tris/500mM NaCl pH8.0を
用いて勾配を開始させた。勾配時に２つの蛋白質ピーク
が溶出した。βXIIaは、XII因子と異なり血液凝固活性
をもたない。溶出液中の生成物の活性は、合成基質S-23
02（Kabivitrum）および405nmにおける吸収の変化率を
用いて測定した。βXIIaは第二のピークに現れる。14mg
のβXIIaが得られた（XII因子から70％）。

添付図面の図１は、DEAE-Sephacelカラムの溶出液に
ついて、時間に対する280nmの吸収のプロットであり、
第二のピークにβXIIaを示している。

純度は、Laemmliの方法（K.V.Laemmli:Nature 227:68
0,1970）に従い、還元および非還元条件下でSDS-PAGEに
よって確認した。アクリルアミド濃度は、スペーサーゲ
ルでは３％、分離ゲルでは10％とした。蛋白質バンドは
クーマッシーブルー染色で検出した。添付図面の図2aお
よび図2bは、XIIおよびβXIIaについてそれぞれのSDS-P
AGEゲルを示す。図2aではE^1% ₂₈₀＝1.42、図2bではE^1%
₂₈₀＝1.52である。両ゲルのトラック１は、20,100;24,0
00;29,000;36,000;45,000および66,000の分子量標準に
よって形成されたバンドである。図2aのトラック1,2お
よび３は、S-Sepharoseクロマトグラフィー（これはFuj
ikawaらによって記載されたCM−セルロースクロマトグ
ラフィーに代えて使用した）上のXII因子ピークからの
３つの分画について得られたバンドを示す。図2bのトラ
ック２〜７は、DEAE-Sephacalクロマトグラフィーの溶
出液のそれぞれ32〜27の分画について得られたバンドで
ある。

例２ （ａ）マウス特異的モノクローナル抗体の製造 ヒトβXIIaに対するマウスモノクローナル抗体は、Ko
hler ＆ Milsteinの方法（C.Kohler ＆ C.Milstein:Nat
ure256:495,1975）の改良法によって製造した。

雌性Balb/Cマウスに、ａ）ウシサイログロブリンまた
はｂ）ツベリクリンの精製蛋白質誘導体に接合したβXI
Ia20μｇの腹腔内注射によって免疫処置した。接合はカ
ルボジイミド法により、または異種二官能試薬を用いて
行った。免疫原は完全フロインドアジュバント中に添加
した。３週間隔で、完全フロインドアジュバント中、接
合βXIa20μｇをマウスにブースター投与した。融合前
のブースターは屠殺の３日前に静脈内に投与した。

抗体応答は、クロラミン−Ｔ法（P.J.McConahey ＆
F.J.Dixon:Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.29:185,196
6）で製造した¹²⁵I−放射標識βXIIaを用いRIA抗血清曲
線分析によってモニタリングした。純度は、還元条件下
に行ったSDS-PAGEゲルのオートラジオグラフィーを用い
て確認した。免疫マウス脾細胞は、40〜50％ PEG4,000
の存在下にNSOマウスミエローマ細胞と融合させた。細
胞をついで培養平板のウエル中に播き、選択培地上で増
殖させた。上清について、ペルオキシダーゼ標識抗−マ
ウスIgGを用いた固相酵素イムノアッセイにより、精製
βXIIaに対する反応性を試験した。略述すると、96ウエ
ルマイクロタイタープレートのウエルを精製βXIIa（リ
ン酸緩衝食塩溶液、PBS中10μg/ml溶液100μｌ）でコー
ティングし、ついでPBS中２％ BSA（ウシ血清アルブミ
ン）を用いてブロックした。細胞培養上清をウエルに添
加し、37℃で１時間インキュベートしたのち、ウエルを
３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗−マウスIgGを至
適希釈濃度で添加した。さらに37℃で１時間インキュベ
ートしたのち、ウエルを再び洗浄し、100μｌの基質溶
液（0.1Mクエン酸塩pH5.0中6mM H₂O₂および40mM O−フ
ェニレンジアミン）を加えた。3NHClで発色を停止さ
せ、吸収を492nmで測定した。

βXIIaに対して特異性を示した全ウエルを取り、さら
に第二のスクリーニングを実施した。第二のスクリーニ
ングは、溶液中放射標識βXIIaへの結合についてのすべ
ての特異的抗体のスクリーニングからなる。これらを滴
定して50％ Bmaxに必要な抗体希釈を求めた。コールド
（非標識）βXIIa、XII因子、プラスミンおよびフィブ
リノーゲンに対する用量反応曲線を作成した。交叉反応
の程度は次式によって決定した。

XII因子に対する見掛けの交叉反応性が1.5％未満の抗
体についてさらに検討を進めた。各抗体について親和性
定数の値を得るために用量−反応データにスキャッチャ
ードの分析を行った。親和性定数が少なくとも10⁷M^-1、
好ましくは10¹⁰M^-1までの抗体についてクローニングを
進めた。好結果を示したクローンはサブタイプに分け
た。

細胞を次に限界希釈によってサブクローン化し、再び
酵素イムノアッセイを用いてβXIIaに対する抗体の産生
についてスクリーニングした。各クローニングから選択
されたクローンはまたラジオイムノアッセイを用いて、
特異性と用量反応についても評価した。βXIIaに対する
抗体を分泌するサブクローン化ハイブリドーマ細胞をBa
lbcマウスに腹腔内注射して腹水を生成させた。βXIIa
に対するモノクローナル抗体を含有する腹水を産生する
６個のクローン化ハイブリドーマが得られた。

ｂ）腹水からの免疫グロブリン分画の単離 免疫グロブリン分画を、飽和硫酸アンモニウム溶液
（等容）を用いて４℃で腹水から沈殿させた。沈殿を遠
心分離し、50mM Tris-HCl緩衝液pH7.5（最初の腹水容量
と等容）に溶解し、ついで同じ緩衝液に対して透析し
た。蛋白質溶液を次にMono-Q陰イオン交換カラム（Phar
macia）に適用し、製造業者の推奨に従って同一緩衝液
中塩勾配を用いて溶出した。免疫グロブリン含有分画を
プールし、−210℃で凍結して保存した。収量は一般的
に、腹水1mlに対して精製抗体１〜5mgであった。

ｃ）抗体の酵素標識 腹水またはポリクローナル抗血清からの精製免疫グロ
ブリンを、チオール−マレイミド法（E.Ishikawaら:J.I
mmunoassay,4:209,1983）を用いてアルカリホスファク
ターゼに接合させた。得られた接合体は、Sephacryl S-
300（Pharmacia）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーによって精製した。

例３ 親和性支持体の調製 βXIIaに対するモノクローナルマウス抗体を、CNBr活
性化Sepharose-4B（Pharmacia）に、製造業者の指示に
従って共有結合によりカップリングさせた。精製IgG5〜
10mgが非膨潤ゲル1gに結合した。このカラムは、血漿か
らまたはXII因子のトリプシン消化物からのβXIIaの単
離に使用した。結合したβXIIaのカラムからの溶出には
4Mグアニジンを用い、βXIIaは溶出分画中、S-2302ペプ
チド基質（Kabi）を使用して酵素活性により、または
¹²⁵I−標識βXIIaを用いて検出した。

例４ ポリクローナル抗血清 XIIおよびβ‐XIIaに対する抗血清は、天然XII因子お
よび接合βXIIaを用い、標準方法によってヒツジまたは
ウサギで産生させた（Methods in Enzymology,H.van Vu
natis ＆ J.J.Langone編、1981,72（Ｂ）および1983,92
（Ｅ）参照）。

例５ βXIIaのラジオイムノアッセイ 例２に記載の方法によって得られたモノクローナル抗
体202/2.6,¹²⁵I−標識βXIIa、βXIIa標準溶液およびSe
phacryl S-1000（SAM-Sephacryl）にカップリングさせ
たヒツジ抗−マウスIgGを用い、以下の方法によって用
量−反応曲線を作成した。すなわち、モノクローナル抗
体202/2.6腹水を検定緩衝液（0.15M NaCl,0.25％ BSA,1
0mM EDTA,3mM NaN₃および0.1％ Triton含有50mM Tris-H
Cl pH7.4）で1:1000に希釈した。4ml容量のポリスチレ
ン検定チューブに二重に、検定緩衝液中50μｌのモノク
ローナル抗体溶液、50μｌの放射標識βXIIa溶液および
100μｌの純粋βXIIa標準溶液を加えた。標準溶液はβX
IIa保存溶液の倍加希釈によって調製した。保存溶液の
濃度は次式：E¹ ₂₈₀＝15.2（K.Fujikawa ＆ B.A.McMulle
n:J.Biol.Chem,280,258:10924,1983）を用いて計算され
た。

総カウントを与える対照チューブには150μｌの検定
緩衝液および50μｌのトレーサー溶液を含有させた。す
べてのチューブをVortexで混合し、ついで21±１℃で19
時間インキュベートした。この期間ののち、至適量のSA
M-Sephacrylを含有する懸濁液を各チューブ（対照を除
く）に加え、ついでチューブを振盪しながら21±１℃で
１時間インキュベートした。この工程ののち、スクロー
ス緩衝液（検定緩衝液＋10％w/wスクロース）を蠕動ポ
ンプを用いて各チューブ中の反応混合物（対照を除く）
の下に層とする。SAM-Sephacrylを21±１℃で30分間沈
降させたのち、各チューブから液体を除去すると、残留
物約0.3mlが得られる。対照も含めて全チューブを多重
ウエルガンマーカウンター中で60秒間カウントした。結
果は表１および添付図面の図３に示す。後者は¹²⁵I β
XIIaの結合百分率に対するβXIIa濃度の用量−反応曲線
である。各βXIIa標準について得られたカウント数を総
カウント数で除して結合百分率とした。加えた総カウン
トは10,000cpmであった。

例６ βXIIaモノクローナル抗体の製造 ヒトβXIIaに対するマウスモノクローナル抗体はKohl
er ＆ Milsteinの一般的方法によって製造した（Kohler
＆ Milstein:Nature 256:495,1975）。

（ｉ）免疫原の調製 免疫原は、βXIIaをツベルクリンの精製蛋白質誘導体
（PPD）に、異種二官能性試薬スルホSMCCを用いて接合
させて調製した（P.J.Lachmannら:Synthetic Peptidesa
s Antigen,Ciba Foundation Symposium 119,25〜57,198
6）。

Ｎ−スクシンニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（SPDP,6mg）をエタノール（5ml）に溶解
した。PPD（Heaf試験用、Statens Serum Institut,Denm
ark）の0.1M PBS pH7.4中5mg/ml溶液を調製した。PPD溶
液（1ml）とSPDP溶液（５μｌ）の混合物を室温で30分
間インキュベートしたのち、生成物を0.1M PBS pH7.4に
対して透析した。誘導体化されたPPDをジチオスレイト
ール（50mM濃度で）と室温で30分間インキュベートし
て、遊離のチオール基を曝露させた。反応混合物をつい
で、100mM塩化ナトリウム含有0.1M酢酸ナサリウム緩衝
液pH4.5に対して透析した。

上記例１の記載に従って製造した精製βXIIaを0.1Mホ
ウ酸塩緩衝液pH8.0に対して透析し、最終濃度を5mg/ml
に調整した。スルホ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（sulpho-SMCC）の溶液を0.1Mホウ酸塩緩衝液pH8.0中に
調製した。この溶液100μｌをβXIIa溶液に、スルホ−S
MCC:βXIIaのモル比が100:1となるように添加した。混
合物を室温で30分間インキュベートしたのち、0.1M PB
S,pH7.4に対して透析した。

活性化βXIIaと活性化PPDの等重量を４℃で18時間イ
ンキュベートし、ついで混合物を0.1M PBS,pH7.4に対し
て透析した。この材料を免疫処置に使用した。

（ii）脾リンパ球の調製 雌性C57/B10またはBalb/CマウスをBCGで感作し、１日
後に、完全フロインドアジュバント中βXIIa-PPD免疫原
20μｇで免疫処置した。２週間隔でマウスに、不完全フ
ロインドアジュバント中免疫原20μｇをブースター投与
した。２回目のブースターから２週後に融合前ブースタ
ーを静脈内に投与し、３日後に動物を屠殺した。

マウスの免疫応答は、クロラミン−Ｔ法を用いて取り
込み約50〜70μCi/mgで製造した¹²⁵I−放射標識βXIIa
を用いるRIAによってモニタリングした。純度は、還元
条件下に行ったSDS-PAGEゲルのオートラジオグラフィー
を用いて確認した。

RIAの操作は次の通りである。希釈した標識βXIIa（1
5,000cpm/チューブ）100μｌに検定緩衝液II〔0.5％ w/
v Tween（商標）、１％ w/vウシ血清アルブミン（BSA）
および0.01％ w/vナトリウムアジド含有リン酸緩衝食塩
溶液〕中に希釈した抗血清100μｌを添加した。さらに1
00μｌの緩衝液を加え、混合物を20℃で20時間インキュ
ベートした。結合した標識βXIIaは第二の抗体系（６％
w/v PEGおよび50μｇの1/100正常マウス血清を含有す
る検定緩衝液II中1/100のDako抗−マウス抗体）を用い
て分離した。傾瀉したのち、上清について、ガンマーカ
ウター中、60s/チューブの読取りを行った。

（iii）融合プロトコール 抗体力価1/5,000以上、好ましくは1/20,000以上の応
答マウスから脾細胞を採取し、穏やかにホモジナイズ
し、３回洗浄し、ついでダルベッコの改良イーグル培地
（DMEM）に再懸濁した。使用したミエローマ細胞系はMR
C Laboratory of Molecular Biology,Cambridgeから入
手したNSO（非クローン化）であった。対数増殖期のミ
エローマ細胞をDMEM中で洗浄した。

脾細胞（１×10⁸）をミエローマ細胞（７×10⁷）と混
合し、遠心分離し、液体を除去した。得られた細胞ペレ
ットを37℃で水浴中の容器に取った。１分間を要して、
食塩水Hepes pH7.5中ポリエチレングリコール（PEG）15
00の50％ w/v溶液1mlを加え、混合物を穏やかに1.5分間
攪拌した。５分間を要して、無血清DMEM50mlを加え、つ
いで混合物を遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレット
を18％ウシ胎仔血清（FCS）含有DMEM10mlに再懸濁し
た。得られた細胞懸濁液の一部10μｌを標準多重ウエル
組織培養プレートの480のウエルのそれぞれに添加し
た。各ウエルは標準HAT培地（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン）2mlとBalb/C細胞のフィーダー層
５×10⁴マクロファージ／ウエル濃度を含有した。ウエ
ルを９％ CO₂大気中、湿度90％、37℃に保持した。ウ
エルについて下記のようにモノクローナル抗体の産生を
分析した。抗体産生細胞を生成したウエルから細胞を採
取し、標準限界希釈クローニング操作によってクローン
化した。

（iv）固相酵素イムノアッセイを用いるハイブリドーマ
のスクリーニング ハイブリッドを示すすべてのウエルを以下のように固
相酵素イムノアッセイ（EIA）を用いてスクリーニング
した。

96ウエルマイクロタイタープレート（Nunc Immunopla
te,Polysorbカタログ番号4-75094）を上述の例１の記載
に従って得られた精製βXIIaにより、MES−食塩溶液〔2
mM2−（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）、150mM食
塩、pH6.5）中１μg/mlの溶液100μｌを用いて一夜コー
ティングし、ついでMES−食塩溶液中１％乳蛋白質を用
いてブロックした。増強MES−食塩溶液（0.05％ w/v Tw
een,1％ w/v BSAおよび0.05％ w/vチメロサール含有MES
−食塩溶液）中1:1に希釈した細胞培養上清をウエルに
加え、37℃で１時間インキュベートしたのち、ウエルを
0.05％ w/v Tweenおよび0.05％ w/vチメロサール含有PB
Sで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗−
マウスIgG（Biored,抗−Ｈ鎖特異的）を増強MES−食塩
溶液中1:2500に希釈して添加した。さらに37℃で１時間
インキュベートしたのち、ウエルを再び洗浄し、基質溶
液（0.1Mクエン酸塩、pH5.0中6mM H₂O₂および40mM O−
フェニレンジアミン）100μｌを加えた。3N HCl 100μ
ｌで発色を停止させ、吸収を492nmで測定した。βXIIa
とXII因子の結合の間に良好な区別を示したウエルを抗
血清曲線分析で¹²⁵I−標識に対して滴定した。標識βXI
Iaの結合と力価10中１以上を示したすべてのウエルを、
用量反応およびXII因子との交叉反応の程度の式Ｉを用
いた分析に付した。

この予備的データから見掛けの交叉反応性1.5％を示
す６個のハイブリドーマを選択してクローニングを行っ
た。

各系からの代表的クローンを、XII因子（FXII）、プ
ラスミンおよびフィブロネクチンとの交叉反応性につい
て、RIAによりさらに分析した。表２には、XII因子に対
する見掛けの交叉反応性を決定するため、３個の好まし
いクローンについての用量反応曲線を示す。

用量反応曲線に対してスキャッチャード分析を行い、
親和性定数（Ka）の値を求めた。３個の好ましい細胞系
についてのデータを以下の表３に、XII因子に対して高
い交叉反応性を示す他のクローンについての一部のデー
タとともに示す。

（ｖ）XII因子との補正交叉反応性の評価 抗−βXIIa抗体とXII因子の交叉反応性の評価に際し
て考慮すべき因子は、「純粋な」XII因子であっても少
量のXIIaの夾雑はほとんど避けられないということであ
る（Silverberg ＆ Kaplan:Blood 60:64〜70,1982）。
この夾雑はほとんどの目的において重要ではないが、少
量のXIIaの存在でも、抗−βXIIa抗体のXII因子との交
叉反応性の検討結果には明らかに影響する。したがっ
て、交叉反応性の測定に使用したXII因子サンプル中の
βXIIaのレベルの評価を行うことが必要と考えられた。
＞10ng/mlのレベルの夾雑も検出できるXIIaの色原体ア
ッセイを使用した。

XII因子サンプル中のXIIa濃度の測定 「純粋な」XII因子中に存在するXIIaのアミド分解活
性は、50μｌのβXIIa標準または予めXII濃度を測定し
たXII因子サンプル（吸収係数の測定によって定量;Fuji
kawa ＆ McMullen,前出、参照）に、65mM Tris,135mM食
塩、0.01％ BSA,pH8中2mM Pro-Phe-Arg-p−ニトロアニ
リン（S2302,Kabi）200μｌを添加して測定した。室温
で60分間インキュベートしたのち、405nmの吸収の測定
により、基質の加水分解を定量した。サンプルのアミド
分解活性をβXIIa標準の場合と比較した。得られた結果
を以下の表４に示す。

XII因子のβXIIaによる夾雑％は次式によって計算し
た。

得られた結果はXII因子のXIIaによる夾雑は0.5〜0.8
％の範囲内であることを示している。

XII因子のモノクローナル抗体2/215との交叉反応性の評
価 βXIIaについてのイムノアッセイを、以下の例７に記
載のモノクローナル抗体接合体201/9および202/16.1.9
を用いて実施した。使用したβXIIa標準およびXII因子
サンプルの濃度は上述の色原体試験に記述した通りであ
った。結果は表５に示す。

見掛けの交叉反応性は0.5％の領域にあると計算され
たが、上述のようにXII因子のXIIaによる夾雑を考慮に
入れると、補正された交叉反応性は0.1％未満であるこ
とがわかった。

（vi）抗体の製造 βXIIaに対する抗体を分泌するサブクローン化ハイブ
リドーマ細胞を、Balb/Cマウスの腹腔内に注射して腹水
を産生させるか、または培養液中で増殖させた。

腹水から４℃で、等容量の飽和硫酸アンモニウム溶液
を用いて免疫グロブリン分画を沈殿させた。沈殿を遠心
分離し、最初の腹水と同じ容量の20mM Tris-HCl緩衝液p
H7.5（緩衝液Ａ）に溶解させ、ついで同一の緩衝液に対
して透析した。蛋白質溶液を次に、PharmaciaのFPLC
（商標）装置を用い、Mono-Q（商標）陰イオン交換カラ
ム（HR10/10Pharmacia）上で分画化した。溶出は緩衝液
Ａと緩衝液Ｂ（1M NaClを添加した緩衝液Ａ）の勾配を
用い、2ml/分の流速で実施した。溶出液は280nmでモニ
タリングし、1mlの分画毎に収集した。免疫グロブリン
を含有する分画をプールし、−20℃で凍結して保存し
た。

培養液からの免疫グロブリン分画の単離にも実質的に
同じ方法を使用した。

（vii）ハイブリドーマの寄託 ハイブリドーマ細胞系は以下のように、European Col
lection of Animal Cell Culture,Division of Biologi
cs,PHLS Centre for Applied Microbiology and Resear
ch,Porton Down,Salisbury SP4,OJG,Englandに寄託され
た。

2/215（BF×11a）1990年１月16日寄託、寄託番号9001
1606; 201/9（ESBT4 1.1）1990年１月18日寄託、寄託番号90
011893; 202/16.1.9（ESBT92.9）1990年１月25日寄託、寄託番
号90012512 例７ モノクローナル抗体2/215を用いたアッセイ 96ウエルマイクロタイタープレートのウエルを抗体2/
215で、コーティング緩衝液（0.1％ナトリウムアジド、
0.02％硫酸ゲンタマイシン含有0.15M食塩、0.1Mリン酸
緩衝液、pH7.4）中抗体の５μg/mlプレパレーションを
ウエルあたり100μｌ用い20〜25℃において一夜コーテ
ィングした。

ヒト血漿サンプルまたはβXIIa標準100μｌをウエル
に加え、プレートを20〜25℃で１時間インキュベートし
た。次に、各ウエルを洗浄緩衝液（10mMホウ酸塩緩衝
液、50mM食塩、0.1％ Triton-X-100、0.05％ナトリウム
アジド（pH7.4）で洗浄したのち、予めチオール−マレ
イミド法（E.Ishikawaら:J.Immunoassay 4:209,1983）
を用いてアルカリホスファターゼに接合した抗−βXIIa
モノクローナル抗体201/9および202/16.1.9（202/16.1.
9はXII因子高交叉反応性抗体である）の混合物を添加し
た。抗体接合体はそれぞれβXIIaに対して滴定して至適
希釈度を決定した。ついで接合体はこれらの希釈度で混
合した。接合体の希釈液は0.1M食塩、1mM塩化マグネシ
ウム六水和物、0.1M Tris,0.1mM塩化亜鉛、0.1％ w/vナ
トリウムアジド、0.1％ Triton-X-100および１％ BSAで
ある。20〜25℃で１時間インキュベートしたのち、各ウ
エルを再び洗浄緩衝液で洗浄した。

プレートを吸着剤パッド上に押しつけて液体を吸取っ
たのち、フェノールフタレン−リン酸基質溶液〔0.02％
Bronidox含有0.5Mジエタノールアミン、pH8.6中1.0g/
リットル フェノールフタレン−リン酸（PMP）〕100μ
ｌを添加した。プレートを20〜25℃で15分間インキュベ
ートしたのち、停止溶液（0.4M炭酸ナトリウム、0.1M 3
−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン
酸、0.1Mエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩、0.4M
水酸化ナトリウム）100μｌを加えて基質の加水分解を
停止させた。停止溶液の添加後、550nmの吸収を測定し
た。

結果を以下の表６に示す。

例８ ポリクローナル抗血清から精製した抗体を用いたアッセ
イ 抗体201/9および202/16.1.9の代わりに、例４の記載
のようにXII因子に対して産生されたポリクローナル抗
血清から得られ、ついで例６の記載のようにアルカリホ
スファターゼに接合させた抗体を用いる以外は、例７の
記載と同様にしてアッセイを行った。

例９ 色原体基質を用いたアッセイ 例７に記載したと同様に、予めモノクローナル抗体2/
215でコーティングしたマイクロタイタープレートのウ
エルに、βXIIa標準100μｌを添加した。プレートを20
〜25℃で１時間インキュベートした。次に、各ウエルを
洗浄緩衝液（例７参照）で洗浄したのち、色原体基質溶
液〔2mM S2302（Kabi Dignostica,Uxbridge）,65mM Tri
s,135mM食塩〕200μｌを添加した。37℃で１時間インキ
ュベートしたのち、各ウエルに１％酢酸50μｌを加えて
反応を停止させた。マイクロタイタープレートリーダー
を用いて405nmにおける吸収を測定した。

結果は表８に示す。

注意：このアッセイ法はβXIIa濃度約10ng/ml未満で
は正確ではなく、血漿サンプル中のβXIIaの定量に十分
な感度はない。しかしながら、もっと高い濃度のβXIIa
たとえば、単離および精製時、ならびに得られた製品バ
ッチにおけるβXIIaの評価には有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭62−65693（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．258［18 ］（1983）Ｐ．10924−10938 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．260［25 ］（1985）Ｐ．13666−13676 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】βXIIa因子及びαXIIa因子に結合し、XII
   因子との補正された交叉反応性は0.1％またはそれ未満
   であるモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】ハイブリドーマ細胞系2/215（受託番号ECA
   CC 90011606）もしくはそのリクローン、またはハイブ
   リドーマ細胞系201/9（受託番号ECACC 90011893）もし
   くはそのリクローンによって産生される請求項１記載の
   モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】検出可能な標識が付与されている請求項１
   または２記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】固定支持体に固定化された請求項１または
   ２記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】請求項１に記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ細胞系、またはそのリクローン。
6. 【請求項６】ハイブリドーマ細胞系2/215（受託番号ECA
   CC 90011606）もしくはそのリクローン、またはハイブ
   リドーマ細胞系201/9（受託番号ECACC 90011893）もし
   くはそのリクローンである請求項５記載のハイブリドー
   マ細胞系。
7. 【請求項７】請求項１または２記載のモノクローナル抗
   体を製造する方法において、その抗体を産生できるハイ
   ブリドーマ細胞系を増殖培地中で培養し、増殖培地から
   抗体を得る方法。
8. 【請求項８】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ細胞系を生成させる方法であって、
   動物に抗原を投与して抗体産生細胞を得、得られた抗体
   産生細胞をミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリ
   ドーマをモノクローナル抗体の産生についてスクリーニ
   ングし、この場合、抗原はβXIIa因子またはその抗原性
   フラグメントである方法。
9. 【請求項９】液体サンプル中の抗原のイムノアッセイを
   実施する方法であって、抗原とそれに結合する抗体との
   間で相互作用させ、既知の抗原の既定量を用いて得られ
   た結果を参照してサンプル中に存在する抗原の量を決定
   することからなるアッセイであり、この場合、抗体は請
   求項１に記載のモノクローナル抗体であり、既知抗原は
   βXIIa因子である方法。
10. 【請求項１０】サンプル中のXIIa因子を検出および／ま
    たは定量する方法であって、サンプルを、抗原と抗体の
    間で相互作用を行わせて得られた抗体−抗原複合体を検
    出および／または定量する定性的または定量的イムノア
    ッセイに付すことからなり、この場合、抗体は請求項１
    または２記載のモノクローナル抗体である方法。
11. 【請求項１１】液体サンプルはヒト被験者から得られた
    血漿サンプルであり、その被験者の心臓疾患の罹病性を
    決定するために、検定サンプル中の抗原レベルについて
    得られた結果を、検定抗原レベルと心臓疾患の罹病性の
    相関の大規模な検討で得られた結果と比較する請求項９
    または10に記載の方法。
12. 【請求項１２】請求項９〜11のいずれかに記載のイムノ
    アッセイを実施するためのキットであって、別個の容器
    内に入れるかまたは他の分画化方法によって、請求項１
    〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体、およびβ
    XIIa因子またはその抗原性フラグメントを包装したキッ
    ト。
13. 【請求項１３】請求項９〜11のいずれかに記載のイムノ
    アッセイを実施するためのキットであって、別個の容器
    内に入れるかまたは他の分画化方法によって、（Ａ）
    （ａ）（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の、所望に
    より固体支持体上に固定化されたモノクローナル抗体、 （ａ）（ii）βXIIa因子もしくはその抗原性フラグメン
    ト、 および（ａ）（iii）請求項１〜４のいずれかに記載の
    抗体に対する抗体もしくは所望により固体支持体上に固
    定化されたその抗体、からなる群より選ばれる成分、
    （Ｂ）（ｂ）（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の標
    識化されたモノクローナル抗体、または直接もしくは間
    接にβXIIa因子と反応可能な標識抗体、 （ｂ）（ii）標識βXIIa因子、 および（ｂ）（iii）βXIIa因子に対する色原体基質、
    からなる群より選ばれる成分、 および（Ｃ）精製βXIIa因子もしくはその抗原性フラグ
    メントである対照試薬である成分、 を包装したキットであって、選ばれた成分（Ａ）または
    選ばれた成分（Ｂ）は請求項１〜４のいずれかに記載の
    モノクローナル抗体を含むキット。
14. 【請求項１４】固体支持体上に固定化された請求項１〜
    ４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む免疫吸
    着剤。