DK159826B

DK159826B - Monoklonalt antistof af typen igg1, og fremgangsmaade til fremstilling deraf, fremgangsmaade til bestemmelse af hba1c samt diagnostisk kit til brug derved

Info

Publication number: DK159826B
Application number: DK129986A
Authority: DK
Inventors: Jesper Zeuthen; Annette Prentoe; Viggo Kruse
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-03-29
Filing date: 1986-03-21
Publication date: 1990-12-10
Also published as: FI861358A0; AU5532186A; FI861358A; JPH0720437B2; ES8800351A1; PT82296A; ATE72052T1; AU584688B2; DK145385D0; FI89379B; PT82296B; EP0201187A1; DE3683532D1; JPS61280571A; ES553472A0; DK159826C; EP0201187B1; DK129986D0; GR860833B; DK129986A

Description

i DK 159826B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte monoklonale antistoffer af typen IgG^ hidrørende fra en gnaver, og som binder specifikt til glykeret humant hæmoglobin (HbA^) , fremgangsmåder til fremstilling af 5 sådanne antistoffer, bestemmelse af HbAlc, samt kit til bestemmelse af HbA^.

Glykerede (glycosylerede) hæmoglobiner er blevet anerkendt som et relevant index for langvarig kontrol af 10 blodsukker hos patienter med diabetes mellitus. Efterfølgende anvendes udtrykket "glykeret hæmoglobin" på kondensationsprodukter af hæmoglobin med glucose (og muligvis glucosefos-fater), som er relativt stabile sammenlignet med de mere labile hæmoglobin-glucoseaddukter, formentlig aldiminer 15 (Schiff'ske baser), begge typer opstået ved en ikke enzymatisk reaktion mellem glucose og aminogrupper i hæmoglobin. Sidstnævnte formodes at blive omdannet til den stabile (tidligere glycosylerede) type ved en Amadori omlejring (jfr.

M. Roth: Clin.Chem. 29 (1983) 1991).

20

De glykerede hæmoglobin A komponenter blev først erkendt ved elektroforese og kationbytterchromatografi af hæmoglobin A. De benævntes som hurtige hæmoglobiner (HbA^) på grund af deres højere negative ladning og, som følge deraf, 25 hurtigere elektroforetiske vandring mod katoden, sammenlignet med hæmoglobin A (HbAQ) hovedkomponenten. De hurtige hæmoglobiner udgør en mindre fraktion af hæmoglobiner, blandt hvilke bl.a. HbA. , HbAn, , HbA.. er identificerede i henhold til la lb lc deres forskellige vandringshastigheder. Af disse er Hba^c 30 tilstede i størst mængde i erythrocyter, både fra normale individer og fra diabetes patienter. Det er kendt, at Hbalc er glykeret ved hæmoglobin A β-kædens N-terminale valin.

Imidlertid har nylige undersøgelser vist, at glykering også kan forekomme ved -aminogruppen i lysin sidekæder, og at 35 alle hæmoglobiner, omfattende HbAQ og Hba^, kan indeholde

2 DK 159826 B

sådanne glykerede grupper. Ovennævnte definition af HbA^c omfatter ikke den labile (aldimin) precursor for HbA^c (som sædvanligvis benævnes "pre-HbA^c").

5 Det er nu almindeligt accepteret, at HbA^-niveauet i en blodprøve er et velegnet indeks for individets gly-kæmiske kontrol. Hos sunde voksne findes omkring 90% af det totale hæmoglobin A som HbAQ og 3 - 6% som HbAlc, idet resten består af andre hæmoglobiner, omfattende HbAla og HbA^. I 10 modsætning hertil ligger HbA^c-niveauet i patienter med type 1 (juvenil diabetes) og type 2 (aldersdiabetes) i området fra omkring 6 til omkring 15%. Bestemmelsen af HbA^c-niveauet i diabetiske patienter betragtes som et nyttigt middel til bedømmelsen af, om diabeteskontrollen er adækvat, idet 15 sådanne målinger repræsenterer gennemsnitsværdier for blodsukker i de forudgående 2-4 måneder (jfr. J.S. Schwartz et al.: Annals of Intern.Med. 101 (1984) 710 - 713).

Den ideelle laboratoriemetode til måling af HbA^c 20 bør være specifik (f.eks. upåvirket af nærværelsen af præ-HbA^c), akkurat, præcis, standardiserbar, billig og ukompliceret. De til rådighed stående metoder, såsom kationbytter-chromatografi, højtryks-væskechromatografi (HPLC), affini-tetschromatografi eller elektroforese (isoelektrisk focuse-25 ring) opfylder uheldigvis ikke samtidig alle disse kriterier. Angående en almen oversigt over disse metoder og forsøg på deres anvendelse i forbindelse med diabeteskontrol henvises til J.S. Schwartz et al., citeret ovenfor.

30 Den kendte teknik omfatter forslag til en direkte bestemmelse af glykeret hæmoglobin baseret på immunologiske metoder. I så henseende henvises til bl.a. britisk patentskrift nr. 1.580.318 og U.S. patentskrift nr. 4.478.744. Den i førstnævnte patentskrift anviste metode kræver forholdsvis 35 store mængder af human HbA^^ til immunisering, medens sidst-

3 DK 159826 B

nævnte til fremstilling af antigenet benytter et peptid, der er omstændeligt at syntetisere. I begge tilfælde udføres immunoassay med animalsk antiserum eller fraktioner deraf indeholdende såkaldte polyklonale antistoffer. Sådanne poly-5 klonale antistoffer er vanskelige at fremstille på reproducerbar måde og betragtes almindeligvis ikke som tilstrækkeligt specifikke til bestemmelse af HbA^c i en højst sammensat blanding af nært beslægtede hæmoglobinmolekyler.

10 Formålet med nærværende opfindelse er at afhjælpe manglerne ved de hidtil kendte metoder til laboratoriemålinger af glycosyleringsgraden af hæmoglobin A. Opfindelsen beror på den· overraskende iagttagelse, at det er muligt under anvendelse af egnede immuniserings-, screenings- og udvælgel-15 sesprocedurer at isolere cellelinier (hybridomer), som frembringer monoklonale antistoffer, der binder specifikt til den glykerede N-terminale valinrest i 3-kæden i den humane hæmoglobinkomponent HbA^c, hvorimod ingen væsentlige bindinger forekommer til den tilsvarende ikke-glykerede 20 aminogruppe.

Frembringelsen af antistoffer, der genkender den glykerede N-terminale valinrest i HbA^c 3-kæden er et særdeles overraskende resultat på baggrund af, at modeller af 25 hæmoglobinmolekylet på basis af røntgenkrystallografiske undersøgelser indikerer, at disse rester, i det mindste i deres ikke-glykerede tilstand, befinder sig i en centralt placeret hulhed i molekylet og derfor ville forventes at være vanskeligt tilgængelige for så store molekyler som immunglo-30 bulin antistoffer. Denne hulhed omfatter den såkaldte 2,3-diphosphoglycerat (DPG)-lomme, hvori det meget mindre DPG molekyle fastholdes mellem de N-terminale ender af de to 3-kæder af deoxyhæmoglobin. Når beta-kæderne kommer tæt på hinanden i oxyhæmoglobin, skubbes DPG molekylet ud af lommen,

, DK 159826B

4 hvori det var bundet. Der henvises til R.E. Dickerson og I.

Geis i "Hemoglobin: Structure, Function, Evolution, and Pathology" p. 40 (The Benjamin/Cummings Publ. Co., 1983).

5 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et mono- klonalt antistof af typen IgG^ hidrørende fra en gnaver, der er ejendommeligt ved, at det binder specifikt til den glykerede, N-terminale valinrest i β-kæden i den humane hæmoglobinkomponent HbA^c· 10

En stabil reklon af HEM 13F1 (med betegnelsen HEM 13F1A4) er deponeret til patenteringsformål på nedenstående dato i European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton 15 Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. ECACC, som er et under Budapesttraktaten af 1977 autoriseret deponerinsinsti-tut, tilvejebringer opretholdelse af deponering i overensstemmelse med traktatens regel 9.

20 Deponeringsdato; Depositors reference: ECACC betegnelse: 1. februar 1985 Hybridoma cellelinie 85020101 HEM 13F1A4 25

Ved en udførelsesform for opfindelsen er det ovennævnte antistof yderligere ejendommeligt ved, at det hidrører fra immunisering af en gnaver med humant HbA^c.

30 I en særlig udførelsesform for opfindelsen hidrører antistoffet fra en mus.

5 DK 159826 B

I en yderligere udførelsesform er antistoffet ejendommeligt ved, at det binder specifikt til humant HbA^c, der er adsorberet til en overflade.

5 Ved en udførelsesform for antistoffet ifølge det ovenstående er antistoffet forsynet med et sporbart mærke, fortrinsvis ved biotinylering.

10 I henhold til den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof af ovennævnte art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man: 15 a) immuniserer en gnaver, fortrinsvis mus, med humant HbA^c, b) immortaliserer antistofproducerende celler ved sammensmeltning af disse med myelomaceller til frembringelse 20 af hybridomcellelinier, c) udvælger en hybridomcellelinie, som producerer et antistof udvisende en specifik binding til den glykerede, N-terminale valinrest i β-kæden i humant HbA^c, og 25 d) dyrker den udvalgte hybridomcellelinie eller en reklon deraf enten in vitro i et medium egnet for cellekultur eller in vivo i en med væv forenelig vævsvæske, adskiller in vitro dyrkningsmediet eller in vivo vævsvæsken fra hybridomceller 30 og, om ønsket, oprenser det monoklonale antistof.

6 DK1S9826B

I en særlig udførelsesform for den omhandlede fremgangsmåde anvendes en reklon, Hem 13F1A4 (ECACC 85020101), af hybridomcellelinien HEM 13F1 til fremstilling af antistoffet ifølge opfindelsen. i 5

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til bestemmelse af HbA-^c i en prøve, der indeholder humant hæmoglobin A, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at prøven bringes i kontakt med et monoklonalt antistof ifølge 10 opfindelsen, hvorefter mængden af bundet monoklonalt antistof måles og mængden af HbA^c bestemmes.

Endelig angår opfindelsen diagnostiske kit til bestemmelse af HbA^c i humant haemoglobin A, omfattende en 15 ruminddelt bæreanordning til anbringelse af mindst tre beholdere, som er ejendommelig ved, at den første beholder omfatter et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, den anden beholder omfatter hæmoglobin med en forudbestemt koncentration af HbA^c, og den tredje beholder omfatter 2 0 hæmoglobin med en forudbestemt koncentration af HbA-^c, hvilken forudbestemte koncentration af HbA-^c i den tredje beholder er forskellig fra den forudbestemte af HbA-^c i den anden beholder.

25 Ifølge en udførelsesform kan antistoffet, der anvendes i et diagnostisk kit ifølge opfindelsen, være forsynet med et sporbart mærke, fortrinsvis ved biotinylering.

30 Tegningens Fig. 1 viser den primære screening af hybridomsupernatanter fra i alt 10 mikrotiterplader, hver med 96 brønde, for binding til oprenset HbA^c og i det væsentlige ikke-glykeret HbAQ (som defineret i det efterfølgende).

Hybridomerne blev fremstillet ved fusion af miltceller fra to 35 RNF/Dm mus med FOX-NY myelomaceller. Bindingen af antistof i

7 DK 159826B

fra hybridomerne HEM 13F1 og den uspecifikke hybridom HEM 13F9, til henholdsvis HbAlc (skraverede søjler) og HbAQ (sorte søjler) er vist.

5 Tegningens figur 2 viser bindingen af antistof fra hybridomcellelinien HEM 13F1 til de immobiliserede antigener, henholdsvis HbAlc og i det væsentlige ikke-glykeret HbAQ.

Tegningens figur 3 viser bindingen af antistof fra 10 HEM 13F1 (stiplet kurve) til immobiliserede fraktioner af hæmolysat fra diabetikere. Fraktioneringen af hæmoglobin foretoges ved kationbytter HPLC (fuldt optrukket kurve).

Tegningens figur 4 illustrerer undersøgelser angå-15 ende inhibering af bindingen af antistof HEM 13F1 til HbA·^.

Et syntetisk, glykeret heptapeptid svarendetil den N-terminale sekvens af beta-kæden af HbA. , dets tilsvarende reducere- lc' de derivat og heptapeptidet i ikke-glykerede form blev testet.

20

Udvælgelsen af monoklonale antistoffer med en tilstrækkelig præferentiel specificitet til at opfylde nærværende opfindelses formål lettes ved adgangen både til det udvalgte, glykerede, humane hæmoglobin i det væsentlige 25 befriet for den tilsvarende ikke-glykerede forbindelse, såvel som til sidstnævnte, i det væsentlige uden glykerede kontami-nanter. Humant HbA^^, glykeret i N-terminal valin i betakæden og muligvis yderligere indeholdende lysinrester, blev oprenset ved almindeligt anvendte metoder, såsom kationbyt-30 terchromatografi eller HPLC. Renset HbAQ (dvs. hæmoglobin A i det væsentlige uden glykerede N-terminale valinrester) kan også fremstilles ved sådanne metoder. Om ønsket kan kontamineringen af HbAQ med komponenter indeholdende glykerede lysinrester nedbringes til et minimum, f.eks. ved anionbyt-35 terchromatografi af et hæmolysat af erythrocyter i nærværelse !

„ DK 159826 B

O

af borat som beskrevet af R. Shapiro et al. (J.Biol.Chem. 255 (1980) pp. 3120 - 3127). I det efterfølgende betegnes det således oprensede HbAQ som i det væsentlige ikke-glykeret

HbA . ! o 5

Antistoffer mod HbA^c frembragtes i gnavere, f.eks. i mus, fra hvilke antistofproducerende celler, f.eks. miltceller, blev immortaliseret ved fusion med egnede myelomacel-ler til frembringelse af hybridomceller. Supernatanter fra i 10 sædvanligvis flere dage gamle kulturer af hybridomcellerne blev screenet for antistoffer udvisende positiv binding til det immuniserende antigen (HbA.^) og i det væsentlige ingen binding til ikke-glykeret HbAQ, f.eks. under anvendelse af enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA).

15

Microtiterplader blev coated med HbA^c fremstillet ved chromatografi på Bio-Rex® 70 (H.F. Bunn et al.: J.Clin.Invest. _57 (1976) pp. 1652 - 1659) eller med i det væsentlige ikke-glykeret HbAQ. Den anvendte ELISA-metode var 20 en modifikation af den af A. Voller og E. de Savigny (R.A.

Thompson: Techniques in Clinical Immunology, 2nd Ed. (1981) pp. 157 - 169) beskrevne metode. Microtiterplader (Immuno-plate I, NUNC, Roskilde, Danmark) blev coated ved inkubering natten over med 100 μΐ pr. brønd af en opløsning af HbA^c (5 25 μg/ml) eller HbAQ (5 μg/ml) i fosfat-pufret saltopløsning (PBS: NaH2P04,H20:8,63g; Na2HPC>4,12H20: 67,Og; NaCl 211,9g fortyndet til 25 liter med vand) ved 4°C. Pladerne tømtes og blev blokeret med PBS indeholdende 2% (vægt/volumen) bovint serumalbumin (BSA), 200 μΐ pr brønd ved 20°C i en time, 30 efterfulgt af tre skylninger med PBS-Tween 20® (0.05% volume/volume Tween®-20 i PBS). Derefter tilsattes ved 20°C den ufortyndede supernatant fra en hybridomcellekultur (50 41 pr. brønd). Efter 1 times forløb blev pladerne skyllet som beskrevet ovenfor. Aktiviteten af antistoffer mod de til 35 coatning anvendte antigener måltes kolorimetrisk ved inkube-

9 DK 159826 B

ring ved 20°C i 1 time med 100 100 μΐ pr. brønd af kanin anti-mus immunoglobulin konjugeret med peberrod peroxidase (Dakopatts, Danmark) fortyndet 1:1000 med PBS indeholdende 0,5% (vægt/volumen) BSA og efter yderligere 3 skylninger i 5 0,1 M citrat-fosfat puffer med pH 5,0, og derefter inkuberet som ovenfor beskrevet med ortho-phenylendiamin (OPD) substrat (o-phenylendiamin, 2HC1:8 mg; citrat-fosfat puffer:15 ml; H202 (30 % (vægt/volumen)): 5 μΐ). Reaktionen blev standset efter 3 minutter ved tilsætning af 150 μΐ 1 M H^O^, hvor-10 efter absorbansen ved 492 nm aflæstes på et dobbeltstråle KONTRON SLT-210 fotometer (SLT, Zurich, Schweiz) med 620 nm aflæsningen som reference.

Antistof fortyndingsforsøg 15

Til disse undersøgelser udførtes ELISA som ovenfor beskrevet, dog med den undtagelse, at stigende rumfang af supernatanterne fra udvalgte hybridomceller, fra f.eks. 5 μΐ og opefter, blev fortyndet med PBS-BSA til et totalt rumfang 20 på 100 μΐ.

Resultaterne af den primære screening af 10 plader er vist i figur 1. Et betydeligt antal (320) af supernatan-terne, eksempelvis supernatanten fra hybridomen HEM 13F9, 25 reagerede med i det væsentlige ikke-glykeret HbAQ, hvorimod kun antistof frembragt af cellerne i en brønd (betegnet HEM 13F1) reagerede præferentielt med HbA^c.

Som det fremgår af tegningernes Fig. 2, viste 30 fortyndingsforsøg med supernatanten fra hybridomen HEM 13F1 hvad angår dens binding til oprensede præparationer af henholdsvis HbA^c (prikker) og HbAQ (cirkler), at antistoffet HEM 13F1 (IgG^) udviste specificitet for HbA^.

DK 159826 B

10

Begge hybridomer blev stabiliseret på sædvanlig vis ved rekloning under begrænsende fortyndingsbetingelser med henblik på at undgå genvækst i kulturerne af cellevarianter, som ikke mere producerer antistof. Denne fremgangsmåde frem-5 mer produktionen af antistof fra den pågældende hybridom. Det i det følgende anvendte udtryk "reklon" betyder en hybridom-cellelinie, som er afledt af en stam-hybridomcellelinie ved kloning under sådanne betingelser.

10

Den specifikke binding af antistof HEM 13F1 til HbA-^c belyses yderligere i tegningernes Fig. 3. Hæmoglobin blev adskilt i dets konstituenter ved kationbytter HPLC. De opsamlede fraktioner testedes for deres indhold for antigen 15 (immobiliseret fase) med bindingsevne overfor antistof HEM 13F1 i ELISA. Den derved opnåede bindingskurve er sammenfaldende med HbA^c toppen i HPLC chromatogrammet, hvorimod ingen væsentlig bindingsevne kunne påvises for nogen af de øvrige hæmoglobin A konstituenter.

20

De i tegningernes Fig. 4 viste inkuberingsforsøg tilvejebringer overbevisende belæg for, at den af antistof HEM 13F1 genkendte epitop omfatter den glykerede N-terminale sekvens af beta-kæden i HbA. . Resultaterne viser, at medens le 25 det syntetiske glykerede N-terminale heptapeptid inhiberer bindingen af antistof HEM 13F1 til immobiliseret HbA.^, iagttages kun svag eller ingen inhibering, hverken for det tilsvarende reducerede derivat eller det ikke-glykerede heptapeptid.

30

Fremgangsmåden til bestemmelse af glykeret hæmoglobin kan udføres på en hæmoglobinkilde, som f.eks. hæmolyserede erytrocytter. Bestemmelsen kan udføres ved f.eks. kompetitiv eller immunometrisk immunassay. Eksempler 35 på sidstnævnte er radioimmunometriske (IRMA) og enzym-bundne

DK 159826B

11 immunosorbent assays (ELISA). I et kompetitivt assay er antigenet (det glykerede hæmoglobin) mærket med en sporbar markør. Prøven, der indeholder antigenet, inkuberes med det for glykeret hæmoglobin specifikke antistof og det mærkede 5 antigen, og efter dannelsen af immunkomplekserne, deres isolering og påvisning, bestemmes mængden af glykeret hæmoglobin i prøven.

I henhold til en foretrukken form for udførelsen af 10 den omhandlede fremgangsmåde til bestemmelse af HbA^ ved et immunometrisk assay bindes antigenet (omfattende det, der findes i analyseprøven) på en fast fase, f.eks. på overfladen af mikrotiterplade brønde. Antistoffet, f.eks. HEM13 F1 antistoffet eller et antigen-bindende fragment af anti-15 stoffet, er sporbart mærket. Inkubering af prøven med mærket antistof resulterer i et immobiliseret antigen-antistofkom-pleks hvori, når ubundet antistof er fraskilt, graden af mærkning er proportional med mængden af antigen.

20 I et andet immunometrisk (sandwich) assay er det ene antigen-bindende antistof sporbart mærket. Et andet antistof, der binder det samme antigen, immobiliseres på en fast fase. Inkubering af prøven med mærket og immobiliseret antistof resulterer i en sandwich, hvori mærkningsgraden er pro-25 portional med mængden af antigen under forudsætning af, at ubundet antistof forud er fraskilt. Immunometriske assays kan, afhængende af rækkefølgen for tilsætning af de bundne og/eller mærkede antistoffer, udføres som ligefremme, omvendte eller samtidige programmer.

30

Andre operationer, såsom vask, omrøring, rystning, filtrering eller ekstraktion af antigen før analysen, eller lignende operationer, kan naturligvis, hvis det er ønsket eller nødvendigt, indføjes i bestemmelsesmetoderne.

35

12 DK 159826 B

De specifikke koncentrationer, temperatur og inkubationstid såvel som andre analysebetingelser kan varieres i afhængighed af sådanne faktorer som koncentrationen af antigen i prøven, prøvens natur og lignende forhold. Den fagligt 5 kyndige vil være i stand til at fastlægge operative og optimale analysebetingelser for hver bestemmelse ved rutinemæssigt at forsøge sig frem. F.eks. kan immunbestemmelsen gennemføres ved fra 4 - 37°C, og hver inkuberingsperiode kan være op til 72 timer.

10

Antigenet eller antistoffet kan bindes til mange typer af bærestof. Velkendte bærestoffer omfatter glas, polystyren, polyprolylen, polyethylen, dextran, nylon, amyloser, naturlige og modificerede celluloseforbindelser, polyacryla-15 mider, agaroseforbindelser og magnetit. I henhold til nærværende opfindelse kan bærestoffet være delvist opløseligt eller uopløseligt. Den fagligt kyndige vil have kendskab til mange andre egnede bærestoffer og vil være i stand til at udvælge et sådant ved at forsøge sig frem på rutinemæssig 20 vis.

Afhængigt af den særlige udførelsesform for bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen kan antistoffet eller et antigen-bindende fragment af dette kobles med en sporbar 25 markør, f.eks. et enzym, en radioaktiv isotop, en fluorescerende forbindelse eller et tilsvarende metal, en kimi-luminiscerende eller bioluminiscerende forbindelse. Bindingen af disse markører til det ønskede molekyle kan udføres under anvendelse af for fagmanden velkendte fremgangsmåder.

30

En af metoderne til sporbare mærkning af antistoffet er at binde det til et enzym. Enzymet vil derefter, når det senere bringes sammen med sit substrat, reagere med substratet og derved frembringe en kemisk forbindelse, som kan 35 påvises, f.eks. ved spektrofotometriske eller fluorometriske

13 DK 159826 B

metoder (ELISA metoder). Eksempler på enzymer, der finder anvendelse som sporbare markører er peroxidase fra peberrod, malat dehydrogenase, staphylococ nuclease, delta-5-steroid isomerase, alkohol dehydrogenase fra gær, alfa-glycerophos-5 phat dehydrogenase, triosephosphat isomerase, alkalisk phosphatase, asparaginase, glucoseoxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-phosphat dehydrogenase, glucoamylase og acetylcolinesterase. Med henblik på øgning af ELISA-metodens følsomhed kan de ovennævnte frem-10 gangsmåder modificeres ved at anvende biotinyleret antistof, der reagerer med avidin konjugeret med peroxidase.

Mængden af antigen kan også bestemmes ved at mærke antistoffet med en radioaktiv isotop. Tilstedeværelsen af den 15 radioaktive isotop kan derefter bestemmes ved hjælp af f.eks. gamma- eller scintilationstæller. Særligt nyttige isotoper er 3H, 125I, 123I, 32P, 35S, 14C, 51cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59FE, 75Se, nlln, 99lV, 67Ga og 90Y.

20 Bestemmelsen af antigenet kan også udføres ved at mærke antistoffet med en fluorescerende forbindelse. Når det fluorescens-mærkede molekyle udsættes for lys af passende bølgelængde kan dets tilstedeværelse påvises på grund af farvestoffets fluorescens. Blandt det vigtigste fluorescens-25 mærkede forbindelser kan nævnes fluoresceinisothiocyanat, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyd og fluorescamin. Fluorescerende metalatomer, såsom Eu (europium) og andre lanthanider kan også bruges.

Disse kan bindes til de ønskede molekyler ved hjælp af 30 metal-chelerende grupper, såsom DTPA eller EDTA.

En anden metode til sporbar mærkning af et antistof er kobling af dette til en kemiluminiscerende forbindelse. Tilstedeværelsen af det kemiluminiscens-mærkede immunoglobu-35 lin bestemmes derefter ved påvisning af den luminiscens, der

DK 159826 B

14 opstår som følge en kemisk reaktion. Eksempler på særligt anvendelige kemiluminiscens-mærkede forbindelser er luminol, isoluminol, aromatiske acridiniumestere, imidazol, et acridi-mium salt og en oxalat ester.

5 På samme måde kan en bioluminiscerende forbindelse anvendes til mærkning. Bioluminiscens er en speciel type af kemiluminiscens, som forekommer i biologiske systemer, i hvilke et katalytisk virkende protein øger effekten af kemi-10 luminiscens-reaktionen. Tilstedeværelsen af et bioluminiscerende molekyle bestemmes ved påvisning af luminiscens. Vigtige bioluminiscerende forbindelser til mærkning er lucife-rin, luciferase og aequorin.

15 De til fremgangsmåden til bestemmelse af HbA-^c ifølge opfindelsen anvendte materialer er ideelt anvendelige til fremstilling af diagnostiske kit.

Et sådant kit ifølge opfindelsen kan omfatte en 20 bæreanordning, som er ruminddelt med henblik på at rumme mindst tre beholdere, som f.eks. ampuller, rør eller lignende, idet nævnte beholder omfatter ét af de enkelte elementer til anvendelse i en hvilken som helst af de ønskede metoder, idet én af disse beholdere til brug for 25 immunometriske bestemmelser omfatte det opløselige, eventuelt sporbart mærkede monoklonale antistof såsom HEM 13F1 i lyophiliseret tilstand eller i opløsning, samt en beholder med hæmoglobin med en forudbestemt koncentration af HbA^^, og en tredie beholder indeholdende hæmoglobin med en 30 forudbestemt koncentration af HbA^c forskellig fra koncentrationen af HbA-^c i beholder nummer to. Sidstnævnte to beholdere anvendes til fastlæggelse af en standardkurve, idet resultaterne med den prøve, der indeholder den ukendte mængde af HbAlc, opnås ved interpolation. Andre beholdere kan

15 DK 159826 E

indeholde reagenser til brug for bestemmelsen af mængden af mærket antistof og hjælpemidler, som f.eks. pufferopløsninger.

5 Udøvelsen af den foreliggende opfindelse vil nu blive yderligere illustreret i form af de efterfølgende eksempler.

Eksempel A

10

Oprensning af HbA^^

Antigenet HbA^c blev renset ved kationbytterchromatografi på en kolonne af Bio-Rex 70 (Bio-15 Rad, Richmond, CA, USA) af et hæmolysat af vaskede erythro-cytter fra diabetikere. Metoden var i det væsentlige den, der er beskrevet af H.F. Bunn et al. (J.Clin.Invest. 57 (1976) pp. 1652 - 1659). Det HbA^c, der anvendtes til primær screening af hybridomcellekulturer, til fortyndingsforsøg og 20 i de efterfølgende eksempler, stammede fra sammenhældte fraktioner repræsenterende HbAlc toppen i chromatogrammet.

Eksempel B

25 Fremstilling af i det væsentlige ikke-glykeret hæmoglobin

HbA -o I det væsentlige ikke-glykeret hæmoglobin HbAQ blev oprenset ved anionbytter chromatografi i borat puffer efter 30 den af R. Shapiro et al. (se ovenfor) udarbejdede metode, modificeret på følgende måde:

En 2,5 x 46 cm kolonne af DEAE Sepharose® CL-6B (Pharmacia) blev ækvilibreret med eluent I (5 mM/1 K2B407; pH 35 9,15) ved 4°C. Erythrocytter opsamlet fra diabetiske

16 DK 159826 B

patienter, blev vasket tre gange i isotonisk saltvand, hæmo-lyseret med tre rumfang vand og befriet for membraner ved centrifugering. Hæmolysatet (23 ml) blev fortyndet med 230 ml eluent I og 230 ml vand, pH blev justeret til 9,2 med 1 N KOH 5 og derefter tilført en kolonne ved en gennemløbshastighed på 80 ml/time. Det fortyndede hæmolysat efterfulgtes af 115 ml eluent I. Hæmoglobinet blev elueret med en gradient fra 5 (eluent I; 500 ml) til 50 mM/1 (eluent II; pH 9,15; 500 ml), efterfulgt af 1000 ml eluent II.

10

Tre hæmoglobin toppe blev målt ved 540 nm. Top nummer to, som var den største, blev elueret ved cirka 75% af den maksimale ledningsevne og blev identificeret som HbAQ.

Den forreste del af denne top bestod af i det væsentlige 15 ikke-glykeret HbAQ, dvs. ikke indeholdende glykerede lysin-rester bestemt ved furosinmetoden (Schleicher & Wieland: J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1£ (1981) pp. 81 - 87), og indeholdende HbA^c· Det ikke-glykerede HbAQ blev dialyseret frit for borat og opbevaret ved 4°C i 40 mM/1 fosfatpuffer med 20 0,002% chlorhexidingluconat ved pH 7,4.

I det væsentlige ikke-glykeret HbAQ anvendtes som det ene af reagenserne i den primære screening af hybridom-célle kulturvæske (Fig. 1) og i antistof fortyndingsforsøgene 25 (Fig. 2).

Eksempel 1

Immunisering og fusionsforsøg 30 RBF/Dn-strain mus (fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) indeholdende RB(8,12)5Bnr Robertsonian translocation kromosomet blev immuniseret tre gange med to ugers mellemrum med oprenset HbA-^. HbA^c (20μg i 100 μΐ PBS, 35 pr. mus) blev emulgeret 1:1 med Freund's ukomplette adjuvans og 200 μΐ indgivet subkutant (s.c.). Tyve dage efter den sidste s.c. immunisering blev musene boostet intravenøst

17 DK 159826 B

(i.v.) med 20 pg HbA^c i 100 μΐ PBS. Efter yderligere tre dage blev musene aflivet og deres milt fjernet med henblik på fusion med myelomaceller.

5 Miltceller fra to RBF/Dn mus (8,5 x 10^ celler) 7 blev fusioneret med 1,5 x 10 celler af FOX-NY myelomalinien, som er egnet for selektion ved at mangle de to enzym-markør loci adenosin phosphoribosyltransferase (APRT ) og hypoxan-thin phosphoribosyltransferase (HPRT ). Når cellefusionsblan-10 dingen udsættes for et medium, der kræver APRT-aktivitet (APRT selektion), vil både ufusionerede APRT myeloma og APRT hybridomer (R.T. Taggart og I.M. Samloff: Science 219 (1983) pp. 1228 - 1230) derfor blive elimineret. De fusionerede celler blev udsået på makrofag fødelag fra Balb/C-strain 15 mus på et samlet antal af 10 96-brønds-microtiterplader (NUNC, Roskilde, Danmark) i et medium bestående af RPMI-1640 (RPMI = Rosewell Park Memorial Institute) med 15 % (vægt/volumen) føtalt kalveserum (Gibco) tilsat adenin (7,5 x -5 -4 -7 10 M), hypoxanthin (8 x 10 M), aminopterin (8 x 10 M) 20 og thymidin (1,6 x 10 ^ M), (AHAT).

Kulturerne blev inkuberet i 12 dage ved 37°C i luft indeholdende 5% CC>2, før de underkastedes den primære screening.

25

Eksempel 2

Isolering af hybridomceller, der producerer monoklonalt antistof specifikt for HbA^c 30

Hybridomen HEM 13F1 (jfr. tegningens Fig. 1) blev yderligere klonet ved begrænsende fortynding i RPMI-1640 medium med 15 volumenprocent føtalt kalveserum i et medium indeholdende adenin, aminopterin og thymidin (AAT) såvel som 35 i det samme medium uden disse tilsætninger. I begge tilfælde udviste de af alle resulterende kloner frembragte antistoffer en præferentiel binding til HbAlc ved ELISA screening. Fra disse kloningseksperimenter frembragtes reklonede, stabile

18 DK 159 826 B

hybridomer af HEM 13F1. De af disse reklonede hybridomer frembragte antistoffer var identiske med de antistoffer, der frembragtes af den tilsvarende uklonede oprindelige cellelinie, HEM 13F1 og udviste følgelig dermed identiske, 5 præferentielle bindingsegenskaber over for HbA^c. Antistoffet defineredes som murint IgG^.

. . En reklon af HEM 13F1, HEM 13F1A4, udvalgtes til fremstillingen af antistof for videregående studier. Det 10 producerede antistof blev karakteriseret ved hjælp af en micro-immunodiffusions teknik mod et panel af for klasse og subklasse specifikke antisera. Forud for denne test blev antistoffet i hybridomsupernatanterne renset på Protein A-Sepharose® (Pharmacia, Sverige). Med henblik på at sikre 15 antistoffets binding blev supernatanternes pH indstillet på

8,5. Elueringen udførtes med citrat“fosfatpuffer, pH 4,5, og fraktionerne blev neutraliseret med 0,5 M fosfatpuffer, pH

7,0 og koncentreret ved ultrafiltrering til ca. 5 mg protein pr. ml. Antistof HEM 13F1 blev defineret som murint IgG-^.

20

Eksempel 3

Binding af antistof HEM 13F1 til HbA^^_ fremstillet ved fraktionering af et hæmolysat ved HPLC

25

Et hæmolysat fremstillet som beskrevet i Eksempel A blev dialyseret ved 4°G mod en 25 mM malonatpuffer med pH 6,0 (eluent A). Ca. 1 mg hæmoglobin i et rumfang på 30 μΐ blev fraktioneret på en Mono S® kationbytter kolonne (0,5 x 5 cm; 30 Pharmacia) ved hjælp af HPLC udstyr fra Spectra-Physics (Model 8100). Eluering udførtes med en gradient fremstillet af eluent A og eluent B, idet sidstnævnte bestod af eluent A tilsat 300 mmol LiCl per liter. Strømningshastigheden var 2 ml pr. minut og temperaturen 37°C. Eluatet blev målt ved 280 35 nm og fraktioner, hver på 2 ml, blev opsamlet.

19 DK 159826 B

Chromatogrammet (ubrudt kurve) er vist i tegningernes Fig. 3 sammen med resultaterne (stiplet kurve) af ELISA udført på de opsamlede fraktioner.

5 Eksempel 4

Antistof specificitet bedømt ved inhiberingsundersøgelser

Inhiberingsanalyser udførtes med microtiterplader 10 coated med HbA-^c °g blokeret som beskrevet under "primær screeningsprocedure". Inhibitorer blev tilsat i dobbelt fortynding (fra 20 μg i 50 μΐ PBS-BSA) efterfulgt af tilsætning af yderligere 50 μΐ antistof HEM 13F1 (2 μg/ml). Efter inkubering af blandingerne i 1 time ved 20°C bestemtes mæng-15 den af bundet antistof som tidligere beskrevet. Tre forbindelser blev anvendt til inhiberingsundersøgelserne, nemlig et syntetisk, glykeret heptapeptid svarende til det N-terminale område af beta-kæderne i HbA^c som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4,478,744 (tegningernes Fig. 4, øverste 20 kurve). Det tilsvarende reducerede heptapeptidderivat, hvori 1-amino-l-deoxyfructose-delen var reduceret med NaBH^ (jfr.

L.K. Curtiss og J.L. Witztum: J.Clin.Invest. 72 (1983) pp.

1427 - 1438) (midterste kurve), og det tilsvarende ikke-gly-kerede heptapeptid (underste kurve).

25

Eksempel 5

Enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) for glykeret hæmoglobin A^c (HbA^g) i hæmolysater fra patienter 30 Hæmolysater fra diabetiske og ikke-diabetiske individer blev fremstillet ved lysering af 0,5 ml erytrocytter i 3,5 ml destilleret vand. 2 μΐ af hvert hæmolysat fortyndedes yderligere til 1 ml med PBS. De fortyndede prøver (100 μΐ) 35 anbragtes i individuelle brønde på microtiterplader (Immunoplate I, NUNC, Roskilde, Danmark) og blev inkuberet natten over ved 4°C for at tillade hæmolysatet at adsorbere til overfladen. Pladerne tømtes, blev blokeret med BSA (2 %

20 DK 159826B

(vægt/volumen) i PBS) i 1 time ved stuetemperatur og derefter skyllet tre gange med PBS. Brønde indeholdende prøver blev derefter inkuberet i 1 time med antistof HEM 13F1 (oprenset IgG1, 5 μ9/πι1 i 100 μΐ PBS), skyllet tre gange med PBS, og 5 inkuberet i 1 time med 100 μΐ af anti-mus immunoglobulin, konjugeret med peberrod peroxidase (Dakopatts, Danmark, fortyndet 1:1000 i PBS). Efter yderligere 3 timers inkubering blev der skyllet med natriumcitratpuffer, pH 5,0 og inkuberet i 3 minutter med ortho-phenylendiamin (OPD) substratopløsning 10 (o-phenylendiamin, 2HC1: 8 mg; citrat-phosphatpuffer: 15 ml; H2C>2 (30 volumenprocent: 5 μΐ). Reaktionen blev standset ved tilsætning af 150 μΐ af 1 M H2S04 og absorbansen blev aflæst ved 492 nm.

15 Tilsvarende prøver af hæmolysaterne blev udtaget og analyseret ved isoelektrisk focusering (IEF) (Mortensen, H.B. og Christoffersen, C.: Biochim.Biophys.Acta 707, (1982) pp.

154 - 163). Resultaterne fra prøver i dublerede elektrofore-seforsøg er gengivet som procentdel af totalt hæmoglobin.

20

Resultaterne fra bestemmelsen af procent HbA^c ved hjælp af IEF er sammenlignet med absorbansen ved 492 nm i ELISA (Tabel 1). Korrelationskoefficienten r er 0,85.

21 DK 159826B

Tabel 1

Sammenligning mellem procent HbA^g (IEF) og værdier opnået, ved ELISA med HEM 13F1 (middeltal af dobbeltbestemmelser) 5

Prøve % HbA, (IEF) (ELISA) -1 c-4 y i- I 9,6 0,490 10 2 7,0 0,420 3 10,2 0,560 4 13,1 0,749 5 8,5 0,585 6 8,8 0,590 15 7 5,9 0,261 8 8,4 0,480 9 11,2 0,650 10 8,5 0,495 II 9,0 0,630 20 12 8,3 0,410 13 9,5 0,488 14 7,9 0,490 15 7,0 0,460 25 Middel 8,9 0,517 SD_ljJ_ 0,117_ r 0,85 30

Eksempel 6

Antistof HEM 13F1 specificitet: HbA^c vs. præ-HbA^c 35 Blod blev udtaget fra 3 ikke-diabetiske, fastende individer og tilsat ethylendiamintetraacetat (EDTA, 1,5 mg pr. ml blod). Blodceller blev skyllet ved centrifugering tre gange med 0,9% NaCl opløsning.

22 DK 159826 B

Tre 200 μΐ portioner af nedslyngede blodceller blev udtaget fra hver prøve. To af prøverne blev inkuberet med 10 ml 200 mM glucose i PBS ved henholdsvis 20°C og 30°C, medens den tredie prøve tjente som kontrol (opbevaret ved 4°C).

5 Prøverne blev inkuberet i 16 timer, hvorefter de blev hæmolyseret ved tilsætning af 1,4 ml H20 indeholdende 200 μΐ CCl^, efterfulgt af centrifugerng. Supernatanterne (fortyndet 1:5000 med PBS) blev analyseret ved ELISA under anvendelse af antistof HEM 13F1 og, parallelt dermed, ved isoelektrisk 10 focusering (IEF) i det væsentlige som beskrevet i Eksempel 5 ovenfor.

Resultaterne fra ELISA (udtrykt som A^^) er sammenlignet med resultaterne fra IEF (udtrykt som % (præ- 15 HbA, + HbA1 ). lc lc

Prøve |Kontrol (4°C) (200 mM glucose (20°C) (200 mM glucose (37°C)

_I ELISA IEF I_ELISA_IEF |_ELISA_IEF

20 1 10,57 5,8% I 0,43 13,9% | 0,54 18,4% 2 10,55 5,7% I 0,50 14,3% | 0,70 19,4% 3 10,53 6,0% I 0,45 13,7% | 0,62 20,8% 25

Stigningen i % (præ-HbA^c + HbA^c) skyldes i overvejende grad en stigning i % præ-HbAlc, A4g2-værdien i ELISA påvirkedes ikke signifikant ved inkubering af blodceller med 30 200 mM glucose. Deraf kan sluttes, at nærværende monoklonale antistof HEM 13F1 fotrinsvis binder til HbA^c og viser ringe, om overhovedet nogen krydsreaktion med præ-HbA·^·

23 DK 159826 B

Eksempel 7 ELISA for HbAlc i hæmolysater ved hjælp af biotinyleret HEM 5 13F1 antistof

Den til biotinylering af HEM 13F1 anvendte metode var i det væsentlige den, der er beskrevet af C. Kendall et al. (J.Immunological Methods 56 (1983) 329 - 339). Udgangs-10 materialet var antistoffet HEM 13F1 (IgG·^), oprenset som beskrevet i ovenstående eksempel 2. Til fremstilling af bio-tinyleringsreagenset opløstes 12 mg biotin-N-hydroxy-succini-mid (Sigma, St. Louis, USA) i 3,5 ml dimethylformadid (Merck, Darmstadt, Vesttyskland). En opløsning af HEM 13F1 (IgG^), 1 15 mg/ml, fremstilledes i 0,1 M NaHCC>3 indstillet på pH 8,5. En blanding af immunoglobulinopløsningen (1 ml) og biotinyleringsreagenset (60 μΐ) inkuberedes under omrøring i 4 timer ved stuetemperatur. Efter inkubering dialyseredes præparatet i 4, 20 og 20 timer mod tre portioner (hver på 1 liter) af 20 PBS, pH 7,2, idet den sidste portion indeholdt 0,1% NaN^. Det biotinylerede HEM 13F1 immunoglobulin opbevaredes ved 4°C.

Hæmolysater fra diabetiske og ikke-diabetiske individer fremstilledes ved hæmolyse af 0,5 ml erythrocytter i 25 3,5 ml vand og yderligere fortynding til ca 1:1000 i 0,1 M citrat-phosphatpuffer med pH 4,0. Fortyndede prøver (hver på 100 μΐ anbragtes i hver sin brønd på microtiterplader (Immunopiate I) og inkuberedes enten natten over eller i et mekanisk rysteapparat i 30 minutter, i begge tilfælde ved 30 stuetemperatur, med henblik på adsorbtion af hæmoglobin på overfladen. Pladerne blev tømt, blokeret med blokeringsreagens (0,01 M PBS; 0,145 M NaCl; 0,5 vægtprocent BSA, pH 7,2) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter skyllet tre gange med puffer (0,01 M PBS; 0,145 M NaCl; 0,05% Tween® 20).

35 Brønde med prøver inkuberedes derefter i en time med 100 μΐ af en opløsning af biotinyleret antistof HEM 13F1, ca. 1 μg/ml puffer (0,01 M PBS; 0,01 M NaCl; 0,5 vægtprocent BSA, pH 7,2) efterfulgt af skylning med puffer. Brøndene inkubere-

24 DK 159826B

des derefter med 100 μΐ af en opløsning af avidin konjugeret med peberrod peroxidase (VECTOR Laboratories, Inc., CA, USA), fortyndet 1:10.000 i 0,01 M PBS med 0,5 M NaCl; 0,5 vægtprocent BSA, pH 7,2. Brøndene blev skyllet tre gange med puffer 5 og derefter inkuberet i 5 til 10 minutter med OPD substratopløsning (Dakopatts, Danmark, Code No. 52000). Reaktionen standsedes ved tilsætning af 100 μΐ 1 M og absorbansen aflæstes ved 492 nm. Tilsvarende prøver af hæmolysater blev analyseret ved dobbeltbestemmelser ved IEF.

10

Absorbansværdierne omregnedes til procentindhold af HbA^c i totalt hæmoglobin ved hjælp af en standardkurve for absorbansen ved 492 nm af prøver med et kendt procentindhold af HbA^c bestemt ved IEF.

15

De fra bestemmelsen af procentindholdet af HbA^c opnåede resultater i 48 individer ved henholdsvis immunassay og IEF er sammenlignet i den efterfølgende tabel 2. Korrelationskoefficienten for de to analysemetoder er 0,92.

20 25

DK 159826 B

Tabel 2 % HbAlc % HbAlc % HbAlc % HbAlc

Prøve (IEF) (ELISA) Prøve (IEF) (ELISA) 5 I 976 Π72 25 10,4 10,7 2 8,9 9,6 26 10,1 10,6 3 10,4 10,5 27 12,1 13,1 4 9,2 9,6 28 11,0 11,0 5 6,3 6,8 29 11,0 11,4 10 6 7,7 8,1 30 11,0 11,6 7 8,9 9,4 31 9,7 10,3 8 10,5 9,8 32 10,2 10,0 9 12,1 12,1 33 9,3 10,7 10 11,1 13,1 34 9,1 9,4 15 11 14,3 14,9 35 10,6 11,9 12 10,6 11,9 36 10,0 10,5 13 11,0 11,9 37 10,7 10,5 14 13,6 12,9 38 8,6 8,6 15 11,9 13,6 39 10,2 10,3 20 16 11,1 10,8 40 8,4 9,2 17 6,6 6,9 41 9,9 11,2 18 9,1 10,0 42 11,0 11,3 19 7,7 7,9 43 9,8 10,9 20 9,4 9,9 44 13,4 12,7 25 21 7,2 7,8 45 9,4 9,5 22 11,6 11,9 46 9,1 10,4 23 8,5 8,5 47 9,5 10,2 24 _8^5_8,9 48_12,7_11/2

Middel ~ _ 10,1 10,5 30 SD ±1/7 ±1,7 r—— ‘ 0,921

Claims

26 DK 159826 B

1. Monoklonalt antistof af typen IgG, hidrørende fra en gnaver, kendetegnet ved, at det binder specifikt til den glykerede, N-terminale valinrest i β-kæden i den humane 5 hæmoglobinkomponent HbA1c.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det hidrører fra immunisering af en gnaver med humant HbA1c.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 1-2, 10 kendetegnet ved, at det humane HbA1c er adsorberet til en overflade.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det er sporbart mærket, fortrinsvis ved biotinylering.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af det monoklonale antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man: a) immuniserer en gnaver, fortrinsvis mus, med humant HbA1c, b) immortaliserer antistof producerende celler ved sammensmeltning af disse med myelomaceller til frembringelse 20 af hybridomcellelinier, c) udvælger en hybridomcellelinie, som producerer et antistof udvisende en specifik binding til den glykerede, N-terminale valinrest i β-kæden i humant HbAlc, og d) dyrker den udvalgte hybridomcellelinie eller en reklon 25 deraf enten in vitro i et medium egnet for cellekultur eller in vivo i en med væv forenelig vævsvæske, adskiller in vitro dyrkningsmediet eller in vivo vævsvæsken fra hybridomceller og, om ønsket, oprenser det monoklonale antistof.

27 DK 159826 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at hybridomcellelinien er reklonen HEM 13F1A4 med ECACC nummer 85020101.

7. Fremgangsmåde til bestemmelse af HbA1c i en 5 prøve, der indeholder humant hæmoglobin A, kendetegnet ved, at prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistof ifølge krav 1, 2, 3, eller 4, hvorefter mængden af bundet monoklonalt antistof måles, og mængden af HbA1c bestemmes.

8. Diagnostisk kit til bestemmelse af HbA1c i 10 humant hæmoglobin A, omfattende en ruminddelt bæreanordning til anbringelse af mindst tre beholdere, kendetegnet ved, at den første beholder omfatter det monoklonale antistof ifølge krav 1, 2 eller 3, den anden beholder omfatter hæmoglobin med en forudbestemt koncentration af HbA1c, og den tredje beholder 15 omfatter hæmoglobin med en forudbestemt koncentration af HbA1c, hvilken forudbestemte koncentration af HbA1c i den tredje beholder er forskellig fra den forudbestemte koncentration af HbA1c i den anden beholder.

9. Kit ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det 20 omfatter det monoklonale antistof ifølge krav 4.