JPH0232030A - 肝癌診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、肝癌の診断に用いられる肝癌診断薬に関す
る。

［従来の技術］ 従来より、肝癌の体外での臨床検査方法としては、γ−
グルタミントランスペプチダーゼやα−フェトプロティ
ン（ＡＦＰ）等のいわゆる腫瘍マーカーを、これらと特
異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体を用いて検出する方法が実用化されている。しかし
ながら、一般にＩ１１瘍マーカーとは腫瘍細胞により生
合成される腫瘍との関係の深い物質（ｃａｎｃｅｒａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｌとして位置付
けられており、腫瘍部位のみで産生され正常組織に存在
しない腫瘍特異物質又は腫瘍特異抗原は未だ見出されて
いない、従って、腫瘍マーカーを利用した肝癌の検出方
法はその信頼性において十分満足することができない。

一方、糖タンパク質の糖鎖の癌性変化が多くの糖タンパ
ク質で解明されている。このようなりンバク質の例とし
て、上記Ａ　）’　ｐ　（Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　４０４２７６°８０、　Ｙａｍａｓｈ
ｉｔａら、同４３．４６９１　’８３１．上記γ−グル
タミルトランスペプチダーゼ、ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（木幡陽、Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ　１４巻軟骨、７７
〜８８．１９８５）　、　ａ　−アンチトリプシン及び
ｄｅｓ−γ−カルボキシプロトロンビンを挙げることが
できる。特定の糖鎖と特異的に結合するものとして抗体
の他にレクチンがある。各レクチンの識別する糖鎖構造
の分析、解明が進むにつれ、一部のレクチンを癌性変化
糖鎖の識別に利用し得ることが示された。肝癌に関して
は、肝細胞由来ＡＦＰはレンズマメレクチンには結合性
を有するが、良性肝疾患由来ＡＦＰはレンズマメレクチ
ンに非結合性を示すことが見出された（青柳層ら、「肝
胆膵」、１５巻、３号、３３９−３４６．１９８７１　
、青柳らはこのＡＦＰの癌性変化をレンズマメレクチン
の反応性から糖鎖のフコシル化としてとらえ、癌化の指
標としてフコシル化率を患者血清で調べている。すなわ
ち、レクチンとの反応性の測定は高感度レクチン吸着交
叉免疫電気泳動法（ｃｒｏｓｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｆ
ｆｉｎｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｌを用いて
肝細胞癌２７０例と各種画像診断で肝細胞癌が否定され
た良性肝疾患１２５例（急性肝炎１４例、慢性肝炎４８
例、肝硬変６３例）のＡＦＰのフコシル化率（総ＡＦＰ
に対するフコシル化ＡＦＰの割合）を測定している。そ
して、肝細胞癌全体のフコシル化率（４２±３１％、平
均値上標準偏差）は良性疾患（４±７％）に比較して有
意（ｐ　＜　０．００１１な差を認めている。

しかしながら、レンズマメレクチンとＡＦＰとの結合を
利用した肝癌の診断方法はその感度において十分満足す
ることができない、すなわち、この方法によるフコシル
化率測定で、早期の肝細胞癌と考えられたＡＦＰ値１０
００　ｎｇ／■１の５４例を見てみると、Ａ　Ｆ　Ｐ　
（１１０００ｎｇ／ｍｌ以下でかつ最大径が３ｃｍ未満
の２９例、　４００　ｎｇ／ｍｌ以下で３ｃｍ未満の１
７例並びに４００　ｎｇ／■ｌ以下で２Ｃ■未満の８例
でフコシル化率はそれぞれ２７±３０％、３０±３０％
、２７±２７％となり良性疾患との判別が困難になる傾
向が見られる。この原因の１つは、レンズマメレクチン
に結合される肝癌性糖鎖は、いくつかの肝癌性糖鎖の一
部に過ぎないためであると考えられる。すなわち、レン
ズマメレクチンカラムへの結合には、アスパラギンに結
合したＧｌｃＮＡｃ残基のＣ−６位と結合したα−Ｆｕ
ｃの存在と同時に２モルのＣ−２のα−Ｍａｎ又はＣ−
２及びＣ−２，６分岐した２モルのα−Ｍａｎを必要と
し、従って、複合型糖鎖のＣ−２，６分岐したα−Ｍａ
ｎ残基を有する３本鎖はレンズマメレクチンカラムに保
持されるが、Ｃ−２，４分岐した３本鎖はカラムに保持
されず、これがために検出感度が満足できないものと考
えられる。

［発明が解決しようとする問題点］ この発明の目的は、信頼性及び感度の高い肝癌の体外に
おける診断に用いられる肝癌診断薬を提供することであ
る。

［問題点を解決するための手段］ 本願抛萌者らは、鋭意研究の結果、肝癌患者においては
トランスフェリンの糖鎖が癌性変化しており、その結果
、ＡＡＬレクチン及びＤＳＡレクチンに特異的に結合す
ることを見出し本発明を完成した。

すなわち、この発明は、ＡＡＬレクチンから成る肝癌診
断薬を提供する。

さらにまた、この発明は、ＤＳＡレクチンから成る肝癌
診断薬な提供する。

［発明の効果］ この発明により、トランスフェリンの癌性変化に基づく
、全く新規な原理を用いる肝癌診断薬が提供された。こ
の発明の肝癌診断薬を用いた肝癌の診断は信頼性及び感
度が高い、特にＡＡＬレクチン及びＤＳＡレクチンの両
者を組み合わせると非常に感度の高い診断が可能になる
。また、この発明の肝癌診断薬を用いた肝癌の診断は、
カラムクロマトグラフィー又は免疫分析を利用した方法
により簡便に行なうことができる。

上述のように１本願発明者らは、肝癌患者においては、
血液中のトランスフェリンの糖鎖が癌性変化しているこ
とを見出した。トランスフェリンは、ジテロフィリン又
は鉄結合性グロブリンとも呼ばれる分子量８万の糖タン
パク質であり、ヘモグロビンの合成に関与するものであ
る。肝癌患者においては、トランスフェリンの糖鎖構造
が変化し、その癌性変化したトランスフェリンの糖鎖構
造の主なものは下記式［Ｉ］ないし［ｍｌで示される。

これらは正常人のトランスフェリン中にはほとんど検出
されないものである。

上記式［１］及び［１１］で示される糖鎖はＡＡＬレク
チン（Ａｌｅｕｒｉａ　ａｕｒａｎｔｉａ　１ｅｃｔｉ
ｎ、Ｎ。

Ｋｏｃｈｉｂｅ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｆｕｒｕｋａｗａ、　
”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　ｌ　９巻ｐｐ、　２
８４１−２８４６）と特異的に結合するのでＡＡＬレク
チンを用いて検出することができる。また、式［Ｉｌｌ
　］で示される糖鎖はＤＳＡレクチン（Ｄａｔｕｒａ　
５ｔｒａｓｔｏｎｉｕｓ　１ｅｃｔｉｎ、文献：　（：
ｒｏｖｌｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
８３巻）と特異的に結合するのでＤＳＡレクチンを用い
て検出することができる。ＡＡＬレクチンは２種類の肝
癌性変化糖鎖を検出できるのでレンズマメレクチンより
高感度な診断が可能になる。

本発明は、この原理を利用したものであり、本発明の肝
癌診断薬は、ＡＡＬレクチン又はＤＳＡレクチンから成
る。ＡＡＬレクチン及びＤＳＡレクチンは共に公知であ
り、その調製方法及び性質も公知であって上記文献にそ
れぞれ記載されている。

本発明の肝癌診断薬は、種々の態様で用いることができ
るが、第１の態様として１本発明の肝癌診断薬をカラム
中に充填したものを挙げることができる。カラムには、
ＡＡＬレクチン又はＤＳＡレクチンを適当な担体に結合
して固相化したものを充填することができる。レクチン
の固相化方法は周知であり、例えばＹａｍａｓｈｉｔａ
、　Ｋｏｃｈｉｂｅ。

０ｈｋｕｒａ、　Ｕｅｄａ　ａｎｄ　Ｋｏｂａｔａ、　
”Ｊ、　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　
、　　ｖｏｌ、　　２６０．　　ｐｐ、　　４６８８−
４６９３　　ｆ１９８５１に記載されている。好ましい
担体としてはセファロースビーズ、アガロースビーズ、
セルロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ等を挙げ
ることができ、固相化するレクチンの濃度は通常２０ｍ
ｇ／ａｌないしｌ　ｍｇ／ｍｌ　、好ましくは約３　ｍ
ｇ／ｍｌ程度である。また、カラムに充填する固相化レ
クチンの量（担体を含む）は特に限定されないが約１ｍ
ｌで十分である。

本発明の肝癌診断薬を含有するカラムを用いた肝癌の診
断は、血清（希釈若しくは無希釈）又は血清から単離し
たトランスフェリン（トランスフェリンの単離方法は公
知であり、例えば日本生化学線、「続生化学実験講座」
８巻、血液（上）４６２−４６４に記載されている）を
含む溶液のような検体なカラムに流通させ、緩衝液で洗
浄後、溶離液で溶出させ、溶出された液中のトランスフ
ェリンを定量することにより行なうことができる。溶出
液としては、ＡＡＬレクチンの場合には例えば５０雪Ｍ
のフコースを含む緩衝液を挙げることができ、ＤＳＡレ
クチンの場合には例えば１％のＮ−アセチル−グルコサ
ミンオリゴマー又は０．ＩＮ酢酸を含む緩衝液を挙げる
ことができる。トランスフェリンの定量は血清の場合公
知の免疫分析法により行なうことができ、また血清から
単離したトランスフェリンの場合は例えば公知の方法、
例えばロウジー法（文献二日本生化学会編、「生化学実
験講座」５巻、酵素研究法（上）２７〜２８）により行
なうことができる。

正常人の場合には本発明の肝癌診断薬に結合されるトラ
ンスフェリンは全トランスフェリンの３〜４％程度であ
るのに対し、肝癌患者の場合には３５〜６５％程度に達
するので、上記カラムに吸着されたトランスフェリンの
量と、吸着されずに緩衝液洗浄により流出したトランス
フェリンの量とを比較することにより、患者が肝癌に罹
患しているか否かを容易に知ることができる。

本発明の肝癌診断薬を用いる別の態様として、免疫分析
と組み合わせた系を挙げることができる。この系は、肝
癌性変化糖鎖を有するトランスフェリンと本発明肝癌診
断薬とを反応させて結合させ、レクチン−トランスフェ
リン結合体量、を免疫分析により測定するものである。

免疫分析法自体は公知のいずれの方法であってもよく、
すなわち、競合法でもサンドイツチ法でもよく、また、
酵素免疫分析、放射免疫分析、ラテックス凝集免疫分析
その他の免疫分析のいずれをも採用することができる。

これらのうち、ペルオキシダーゼ等の酵素標識を利用す
る酵素免疫分析が好ましい、この酵素免疫分析は、酵素
標識したＡＡＬ又はＤＳＡレクチンを用いる直接法によ
っても行なうことができるし、酵素標識抗ＡＡＬ又はＤ
ＳＡレクチン抗体を用いる間接法によっても行なうこと
ができる０間接法による酵素免疫分析（ＥＩＡ）は例え
ば以下のようにして行なうことができる。すなわち、α
−ト→ンスフエリン抗体をイムノプレートに吸着させて
固相化し、血清中のトランスフェリンをトラップさせる
。この−次免疫反応によって一定量の血清から定量的に
回収したトランスフェリンのうち、癌性変化糖鎖をＡＡ
Ｌレクチン又はＤＳＡレクチンと反応させ定量的に呈色
反応を利用して測定する。呈色反応にはペルオキシダー
ゼを用いることができる。より具体的なプロトコールの
１例を下記に示す。

４℃、１晩放置 ↓ 室温で２時間反応 ＰＢＳで３回洗浄 ↓ 室温で２時間反応 ＰＢＳで３回洗浄 五 室温で２時間反応 ↓ ＰＢＳで３回洗浄 ↓ 室温で２時間反応 ＰＢＳで５回洗浄 ＡＢＴＳ　＋　ＨＩＯＩ　（ペルオキシダーゼの基質）
を添加（１００μｌ）　　　　　　　１ ４０５　ｎｓの吸光度測定 この発明の肝癌診断薬の使用態様は、上記したカラム及
び免疫分析試薬に限定されるものではなく、例えば後述
の実施例２におけるような、レクチン吸着交叉免疫電気
泳動法等、癌性変化トランスフェリン糖鎖とＡＡＬ又は
ＤＳＡレクチンとの結合を利用するあらゆる態様で用い
ることができる。

〔実施例］ 以下、この発明を実施例に基づきより具体的に説明する
０本発明は下記実施例に限定されるものではない。

宜１ｕ１１ ＡＡＬレクチンを用いた肝癌患者血清中のフコシルトラ
ンスフェリンの定量 ＡＡＬレクチンをＹａｎ＋ａｓｈｉｔａ、　Ｋｏｃｈｉ
ｂｅ。

０ｈｋｕｒａ、　　Ｕｅｄａ　ａｎｄ　Ｋｏｂａｔａ、
’Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（：ｈｅｍｉｓｔｒｙ　
、　ｖｏｌ、　２６０．　ｐｐ、　４６８８−４６９３
１１９８５１に記載された方法に従い、３　Ｂ／ｍｌの
濃度でセファロースビーズに固相化した。固相化したＡ
ＡＬレクチン１ｍｌをカラムに充填し、これに肝癌患者
及び対照として正常人血清５＋ｎｌから単離したトラン
スフェリンを通し、ＰＢＳで洗浄し、レクチンカラムに
吸着した画分を、５０ｎ＋Ｍフコース含有ＰＢＳで溶出
し、２ｍｌ毎に溶出液を分画した１分画液中のトランス
フェリン量をロウツー法で測定した。結果を第１図に示
す。

第１図に示すように、正常人血清ではＡＡＬレクチンに
結合したトランスフェリンが３％であったのに対し、肝
癌患者血清では４６％であった。従って１本発明の肝癌
診断薬を含有するカラムを用いて肝癌の診断を行なうこ
とが可能であることが明らかになった。

叉１０九１ ＡＡＬレクチン吸着交叉免疫電気泳動法１．０　ｍｇ／
ｍｌのＡＡＬレクチンを加えた１％アガロースゲル（ｐ
Ｈ８，６１にトランスフェリンをスポットしてｌ　５　
Ｖ／ｃｍで電気泳動し、展開後、横方向に抗トランスフ
ェリン抗体を含む１％アガロースゲルに３　Ｖ／ｃ―で
電気泳動した。泳動後。

濡れたろ紙を重ねて常法によりプロッティング及びタン
パク染色を行なった。結果を第２図に示す。

第２図中、（１）及び（２）は正常人血清から単離した
トランスフェリンについての結果を、（３）ないしく５
）は肝癌患者血清から単離したトランスフェリンについ
ての結果を示し１図中の丸印がトランスフェリンをスポ
ットした位置を示す、第２図に示されるように、正常人
血清と肝細胞症血清では明らかな泳動バクーンの差があ
り、ＡＡＬと結合したトランスフェリンの存在が示され
た。

１直五旦 実施例２に記載したＡＡＬレクチン吸着交叉免疫電気泳
動法で各種肝疾患の血清について分析した。結果を第３
図に示す。

第３図中、ＨＣＣは肝細胞癌患者血清、ＡＨは急性肝炎
血清、ＣＨは慢性肝炎血清、ＬＣは肝硬変血清、ＭＥＴ
Ａは肝臓癌以外の癌が肝臓に転移した患者の血清につい
ての結果を示す。

第３図から明らかなように、ＡＡＬレクチンに結合する
トランスフェリンの割合は、肝細胞癌患者血清中のトラ
ンスフェリンが他の肝疾患患者の血清中のトランスフェ
リンに比べて有意に高（、従って、本発明の診断試薬を
用いて肝細胞症を他の肝疾患から識別することができる
ことが分かる。

叉」Ｕ九Ａ ＤＳＡレクチンを用いた肝癌患者血清トランスフェリン
の分割 ＡＡＬレクチンと同様にセファロースビーズに固相化し
たＤＳＡレクチン１Ｉ１１をカラムに充填し、これに肝
癌患者血清から単離したトランスフェリンｌｕｇを０．
１％ウシ血清アルブミン含有ＩＯ！ＩＩＭトリス−ＨＣ
ｌ　ｊｌｌ液液ｐＨ７，４１５ｍｌとカラムに通した後
（２℃）、室温で１％Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ
マーを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液、さらに、０．　ＩＮ
酢酸で溶出した。各溶出フラクションはｌ＋ｗｌずつと
し、トランスフェリン量をＥＩＡで定量した。結果を図
４に示す。

図４の３本のピークのうち最初のものは正常トランスフ
ェリン、２番目のピークは、Ｃ−２，４分枝構造を有す
る癌性トランスフェリンであり、３番目のピークは、　
Ｃ−２，６分枝構造を有する癌性トランスフェリンであ
る。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の肝癌診断薬を含有するカラムを用いた、
正常人血清由来トランスフェリン及び肝癌患者血清由来
トランスフェリンの吸着クロマトグラフィーの結果を示
す図。 図２は本発明の肝癌診断薬を用いた、正常人血清由来ト
ランスフェリン及び肝癌患者血清由来トランスフェリン
のレクチン吸着交叉免疫電気泳動法の結果を示す図、 図３は本発明の肝癌診断薬であるＡＡＬレクチンを用い
て、肝癌患者血清由来、正常人血清由来、及び種々の肝
疾患患者由来のトランスフェリンについて行なったＡＡ
Ｌレクチン吸着交叉免疫電気泳動によるＡＡＬ結合性ト
ランスフェリンの割合を示す図、 図４は本発明の肝癌診断薬であるＤＳＡレクチンを用い
て肝癌患血清からのトランスフェリンを分離したアフィ
ニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。 口２ 仔画 口１ 囚３

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＡＡＬレクチンから成る肝癌診断薬。
2. （２）ＤＳＡレクチンから成る肝癌診断薬。