JP3426238B2 - 高度アルコール摂取の判定における炭水化物欠乏トランスフェリンのｈｐｌｃによる定量 - Google Patents
高度アルコール摂取の判定における炭水化物欠乏トランスフェリンのｈｐｌｃによる定量Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトのアルコール摂取を判定するための炭
水化物欠乏トランスフェリン（CDT）の分離及び定量方
法に関する。
水化物欠乏トランスフェリン（CDT）の分離及び定量方
法に関する。
アルコールはアルコール犠牲者とかれらの家族に対す
る多大の損害と、アルコールに関連した罹病率及び死亡
率による社会に対する重大な費用とを生じる。早期の認
識と治療とが個人にとって有利であり、社会にとっても
費用効果的であることが判明している。種々な集団にお
ける飲酒の併発症の危険にある個人を確認するための敏
感で、特異的な、迅速で、費用のかからない方法が必要
である。重度のドリンカーを検出するように設計され
た、多くの手段がこの30年間に開発されている。例えば
γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−GT）、平均血
球容積（mean corpuscular volume）（MCV）、アスパル
テート又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（AST又
はALT）、α−リポタンパク質及びフェリチンのような
慣習的な実験室試験が、アルコール乱用の生化学的マー
カーとして多年にわたって用いられているが、これらの
試験の診断的感度及び特異性は低い。アルコール関連小
脳性振せんを有する患者の脳脊髄液及び血清中のトラン
スフェリンのイソフォーム（isoform）における質的変
化が報告されている。アルコール利用に関連するイソフ
ォームは他のイソフォームよりもシアル酸含有量が少な
いので、含有量（charge）に応じて識別されることがで
きる。イソフォームを分離する幾つかの方法が紹介され
ているが、これらの方法は一般に実験室向きであり、非
定量的であり、費用がかかる。その後に免疫固定（immu
nofixation）、ウェスターンブロット法又はゾーン免疫
電気泳動を実施する、等電点クロマトグラフィー、RIA
（ラジオイムノアッセイ）と組み合わせた使い捨て式ミ
ニカラム及び等電点電気泳動が利用可能な方法である。
る多大の損害と、アルコールに関連した罹病率及び死亡
率による社会に対する重大な費用とを生じる。早期の認
識と治療とが個人にとって有利であり、社会にとっても
費用効果的であることが判明している。種々な集団にお
ける飲酒の併発症の危険にある個人を確認するための敏
感で、特異的な、迅速で、費用のかからない方法が必要
である。重度のドリンカーを検出するように設計され
た、多くの手段がこの30年間に開発されている。例えば
γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−GT）、平均血
球容積（mean corpuscular volume）（MCV）、アスパル
テート又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（AST又
はALT）、α−リポタンパク質及びフェリチンのような
慣習的な実験室試験が、アルコール乱用の生化学的マー
カーとして多年にわたって用いられているが、これらの
試験の診断的感度及び特異性は低い。アルコール関連小
脳性振せんを有する患者の脳脊髄液及び血清中のトラン
スフェリンのイソフォーム（isoform）における質的変
化が報告されている。アルコール利用に関連するイソフ
ォームは他のイソフォームよりもシアル酸含有量が少な
いので、含有量（charge）に応じて識別されることがで
きる。イソフォームを分離する幾つかの方法が紹介され
ているが、これらの方法は一般に実験室向きであり、非
定量的であり、費用がかかる。その後に免疫固定（immu
nofixation）、ウェスターンブロット法又はゾーン免疫
電気泳動を実施する、等電点クロマトグラフィー、RIA
（ラジオイムノアッセイ）と組み合わせた使い捨て式ミ
ニカラム及び等電点電気泳動が利用可能な方法である。
トランスフェリン、血液中の鉄運搬タンパク質は、そ
れぞれ末端に２又は３個のシアル酸（Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸）を有する、２個のビー又はトリーアンテナリ
ー（bi−or tri−antennary）炭水化物鎖を有する糖タ
ンパク質である。等電点電気泳動はノルマルトランスフ
ェリンを高い分解能によって、鉄飽和度（ironsaturati
on）、シアル酸（SA）含量又はアミノ酸置換度（amino
acid substitution）に依存してイソフォームに分離す
る。完全な鉄飽和（2Fe原子／モル）後にトランスフェ
リンは通常、それらの大体の等電点（pI）に因んで、pI
5.2（５ SA）、pI 5.4（４ SA,主要画分）、pI
5.6（３ SA）及びpI 5.7（２ SA）と呼ばれる４イソ
フォームに分離する。通常の血清中にはpI 5.6及び5.7
を有する少量のトランスフェリンが存在する。アルコー
ル中毒者からの血清中で顕著に増加するイソフォームは
pI 5.7である。pI 5.7画分は通常、トランスフェリン
全体の0.8％未満であるが、重度のアルコール摂取後に1
0倍を越えて増加する可能性がある。過度の飲酒後に、
さらにpI 5.9画分（０ SA）が出現する可能性があ
る。pI5.7とpI 5.9画分は炭水化物欠乏トランスフェリ
ン（CDT）を表す。
れぞれ末端に２又は３個のシアル酸（Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸）を有する、２個のビー又はトリーアンテナリ
ー（bi−or tri−antennary）炭水化物鎖を有する糖タ
ンパク質である。等電点電気泳動はノルマルトランスフ
ェリンを高い分解能によって、鉄飽和度（ironsaturati
on）、シアル酸（SA）含量又はアミノ酸置換度（amino
acid substitution）に依存してイソフォームに分離す
る。完全な鉄飽和（2Fe原子／モル）後にトランスフェ
リンは通常、それらの大体の等電点（pI）に因んで、pI
5.2（５ SA）、pI 5.4（４ SA,主要画分）、pI
5.6（３ SA）及びpI 5.7（２ SA）と呼ばれる４イソ
フォームに分離する。通常の血清中にはpI 5.6及び5.7
を有する少量のトランスフェリンが存在する。アルコー
ル中毒者からの血清中で顕著に増加するイソフォームは
pI 5.7である。pI 5.7画分は通常、トランスフェリン
全体の0.8％未満であるが、重度のアルコール摂取後に1
0倍を越えて増加する可能性がある。過度の飲酒後に、
さらにpI 5.9画分（０ SA）が出現する可能性があ
る。pI5.7とpI 5.9画分は炭水化物欠乏トランスフェリ
ン（CDT）を表す。
本発明の目的は、ルーチンの実験室がアルコール依存
症の高い危険性にある対象を確認するために適したHPLC
（高性能液体クロマトグラフィー）方法を開発し、特定
の集団における重度のアルコール摂取の検出に関するこ
の方法の感度と特異性とを評価することである。この目
的は、臨床的標準方法に適し、先立つ数週間中の重度の
アルコール摂取に関する、適当な生化学的マーカーであ
るCDTの濃度を特異的に測定する方法を提供することで
ある。この目的は下記主要請求項に記載の方法によって
満たされる。
症の高い危険性にある対象を確認するために適したHPLC
（高性能液体クロマトグラフィー）方法を開発し、特定
の集団における重度のアルコール摂取の検出に関するこ
の方法の感度と特異性とを評価することである。この目
的は、臨床的標準方法に適し、先立つ数週間中の重度の
アルコール摂取に関する、適当な生化学的マーカーであ
るCDTの濃度を特異的に測定する方法を提供することで
ある。この目的は下記主要請求項に記載の方法によって
満たされる。
本発明の方法は幾つかの図面を用いて以下で詳述す
る。図面において、 図１は、アルコール摂取量の異なる個人から採取した
サンプルからのトランスフェリンイソフォームのクロマ
トグラムを示す； 図２は、重度のアルコール中毒（intoxicated）患者
４人に関してCDTの濃度が飲酒の終了後に如何に低下す
るかを示す； 図３は、トランスフェリンイソフォームの分離時に用
いた塩傾斜（salt gradient）を、表の形状で示す；及
び 図４は、種々のアルコール摂取した個人の血清中のCD
Tレベルを示す。
る。図面において、 図１は、アルコール摂取量の異なる個人から採取した
サンプルからのトランスフェリンイソフォームのクロマ
トグラムを示す； 図２は、重度のアルコール中毒（intoxicated）患者
４人に関してCDTの濃度が飲酒の終了後に如何に低下す
るかを示す； 図３は、トランスフェリンイソフォームの分離時に用
いた塩傾斜（salt gradient）を、表の形状で示す；及
び 図４は、種々のアルコール摂取した個人の血清中のCD
Tレベルを示す。
新鮮血清又は−20℃に６か月間未満凍結した血清を、
血清1mlにつきNaHCO325μｌ（500mmol/l）とFeCl318μ
ｌ（10mmol/l）とを添加することによって鉄で飽和させ
て、サンプルを用意した。混合し、＋８℃において一晩
貯蔵した後に、血清1mlにつき硫酸デキストラン（10％
（w/v））10μｌとCaCl2（1mol/l）50μｌとを加えるこ
とによって、リポタンパク質を沈殿させた。この混合物
を＋８℃に30〜60分間貯蔵し、次に10,000 ｘ ｇにお
いて10分間遠心分離した。上澄み液を水によって５倍に
希釈して、HPLCオートインジェクター（autoinjector）
に移した。
血清1mlにつきNaHCO325μｌ（500mmol/l）とFeCl318μ
ｌ（10mmol/l）とを添加することによって鉄で飽和させ
て、サンプルを用意した。混合し、＋８℃において一晩
貯蔵した後に、血清1mlにつき硫酸デキストラン（10％
（w/v））10μｌとCaCl2（1mol/l）50μｌとを加えるこ
とによって、リポタンパク質を沈殿させた。この混合物
を＋８℃に30〜60分間貯蔵し、次に10,000 ｘ ｇにお
いて10分間遠心分離した。上澄み液を水によって５倍に
希釈して、HPLCオートインジェクター（autoinjector）
に移した。
イオン交換カラム、Mono Ｑ（登録商標）HR5/5（Pha
rmacia Biotechnology,スウェーデン）上で、トランス
フェリンイソフォームを他の血清成分から、再生を含め
て32分間塩傾斜によって分離した。出発バッファー
（Ａ）はBis Tris 20mmol/l（pH6.2）であった。バッ
ファーＢはバッファーＡ＋同じpHのNaCl 350mmol/lで
あった。溶液Ｃ（NaCl 1mol/l）は再生のために用い
た。使用前に、全ての溶液を脱気し、0.45μｍ孔度フィ
ルターに通して濾過した。200μｍのサンプルを注入
し、流量を1ml/分に維持し、図３の表に示した傾斜プロ
フィルを用いた。
rmacia Biotechnology,スウェーデン）上で、トランス
フェリンイソフォームを他の血清成分から、再生を含め
て32分間塩傾斜によって分離した。出発バッファー
（Ａ）はBis Tris 20mmol/l（pH6.2）であった。バッ
ファーＢはバッファーＡ＋同じpHのNaCl 350mmol/lで
あった。溶液Ｃ（NaCl 1mol/l）は再生のために用い
た。使用前に、全ての溶液を脱気し、0.45μｍ孔度フィ
ルターに通して濾過した。200μｍのサンプルを注入
し、流量を1ml/分に維持し、図３の表に示した傾斜プロ
フィルを用いた。
用いたHPLC系は、タングステンランプを備え、ポンプ
No.2941（Pharmacia Biotechnology,スウェーデン）、
460nmフィルターを備えたJasco870 UV検出器及び10mm
フローセル（flow cell）から成るものであった。この
系は96サンプルに対する冷却系と共に、オートインジェ
クター、Waters WISP715を含有した。谷−谷モードに
応じてピーク面積を算出するためにShimazuCR5A積分計
を用いた。
No.2941（Pharmacia Biotechnology,スウェーデン）、
460nmフィルターを備えたJasco870 UV検出器及び10mm
フローセル（flow cell）から成るものであった。この
系は96サンプルに対する冷却系と共に、オートインジェ
クター、Waters WISP715を含有した。谷−谷モードに
応じてピーク面積を算出するためにShimazuCR5A積分計
を用いた。
トランスフェリンイソフォームは約5.2〜5.9の間にp
I:sを有する。カソードに最も引き付けられる（the mos
t cathodal）イソフォームの最適分離はpH6.2において
得られた。それにも拘わらず、6.0〜6.4のpH値を有する
バッファー溶液によっても許容される結果が得られてい
る。しかし、最良の結果を得るためには、pHは6.1〜6.3
であるべきであり、最も好ましくは、pHは6.2であるべ
きである。NaHCO3をFeCl3と共に加えると、最高に安定
な鉄飽和が得られる。リポタンパク質の沈殿は、一部の
患者において、重いβ−リポタンパク質画分の下に隠さ
れる可能性があるpI 5.9イソフォームの分離を改良す
る。低いレベルのリポタンパク質を有する絶食（faste
d）サンプルは通院規模でのアルコール中毒者の研究に
用いることができない。図１は重度、中程度及び正常の
飲酒個人からのHPLCによるクロマトグラムを示す、図に
おいてpI 5.9イソフォームも第１パターンに出現す
る。460nmにおけるFe−トランスフフェリン錯体の吸光
度は280nm吸光度の約1/10であるが、トランスフェリン
画分に高度に特異的である。CD−トランスフェリン（pI
5.7）の量は絶対禁酒者及び偶発的ドリンカーにおけ
るトランスフェリン総量の僅か0.2〜0.8％（平均値±2
S.D.）に過ぎない。この値はクロマトグラフィープロフ
ィルの積分方法にやや依存した。基底ライン積分を用い
て、やや高い値が検出されたが、谷−谷方法（velley−
valley method）の方が再現可能であった。
I:sを有する。カソードに最も引き付けられる（the mos
t cathodal）イソフォームの最適分離はpH6.2において
得られた。それにも拘わらず、6.0〜6.4のpH値を有する
バッファー溶液によっても許容される結果が得られてい
る。しかし、最良の結果を得るためには、pHは6.1〜6.3
であるべきであり、最も好ましくは、pHは6.2であるべ
きである。NaHCO3をFeCl3と共に加えると、最高に安定
な鉄飽和が得られる。リポタンパク質の沈殿は、一部の
患者において、重いβ−リポタンパク質画分の下に隠さ
れる可能性があるpI 5.9イソフォームの分離を改良す
る。低いレベルのリポタンパク質を有する絶食（faste
d）サンプルは通院規模でのアルコール中毒者の研究に
用いることができない。図１は重度、中程度及び正常の
飲酒個人からのHPLCによるクロマトグラムを示す、図に
おいてpI 5.9イソフォームも第１パターンに出現す
る。460nmにおけるFe−トランスフフェリン錯体の吸光
度は280nm吸光度の約1/10であるが、トランスフェリン
画分に高度に特異的である。CD−トランスフェリン（pI
5.7）の量は絶対禁酒者及び偶発的ドリンカーにおけ
るトランスフェリン総量の僅か0.2〜0.8％（平均値±2
S.D.）に過ぎない。この値はクロマトグラフィープロフ
ィルの積分方法にやや依存した。基底ライン積分を用い
て、やや高い値が検出されたが、谷−谷方法（velley−
valley method）の方が再現可能であった。
図１において、Ａはアルコール300g/24時間の摂取量
を有する個人からのサンプルを表し、Ｂはアルコール70
g/24時間の摂取量を有する個人からのサンプルを表し、
Ｃは正常パターンを表す。陰影領域（shadowed area）
はCDT、すなわちpI 5.7（＊）とpI 5.9（＊＊）を有
するトランスフェリンイソフォームを示す。クロマトグ
ラムの他のピークは右から、それぞれ、pI 5.2、5.4及
び5.6を表す。このクロマトグラムから、主要な画分がp
I 5.4であることが明らかである。さらに、CDTの値が
重度なアルコール摂取後に上昇することが明らかであ
る。Fe−トランスフェリン錯体の吸光度は460nmにおい
て測定された。
を有する個人からのサンプルを表し、Ｂはアルコール70
g/24時間の摂取量を有する個人からのサンプルを表し、
Ｃは正常パターンを表す。陰影領域（shadowed area）
はCDT、すなわちpI 5.7（＊）とpI 5.9（＊＊）を有
するトランスフェリンイソフォームを示す。クロマトグ
ラムの他のピークは右から、それぞれ、pI 5.2、5.4及
び5.6を表す。このクロマトグラムから、主要な画分がp
I 5.4であることが明らかである。さらに、CDTの値が
重度なアルコール摂取後に上昇することが明らかであ
る。Fe−トランスフェリン錯体の吸光度は460nmにおい
て測定された。
重度のアルコール中毒患者４人のCDT pI 5.7を15日
間の入院期間連続して測定することによって、CD−トラ
ンスフェリンの半減期を研究した、この時点においてア
ルコール乱用の再発は生じなかった。各サンプル中の総
トランスフェリン濃度（g/l）を測定し、CDTを算出し、
半対数ダイアグラム（図２）にmg/lとして示した。一部
の患者では入院期間中に総トランスフェリン濃度が時間
と共に上昇した。各曲線の半減期をその直線勾配から読
み取った。個々の患者間には小さな差異があり、平均Ｔ
1/2は9.5±１日間であると算出された。
間の入院期間連続して測定することによって、CD−トラ
ンスフェリンの半減期を研究した、この時点においてア
ルコール乱用の再発は生じなかった。各サンプル中の総
トランスフェリン濃度（g/l）を測定し、CDTを算出し、
半対数ダイアグラム（図２）にmg/lとして示した。一部
の患者では入院期間中に総トランスフェリン濃度が時間
と共に上昇した。各曲線の半減期をその直線勾配から読
み取った。個々の患者間には小さな差異があり、平均Ｔ
1/2は9.5±１日間であると算出された。
絶対禁酒者及び偶発的ドリンカー（実験室スタッフ）
からのサンプル中に検出されたCDT値は正常分布を示
し、谷−谷積分（図４）を用いると、一貫して１％未満
であった。高γ−GT値の前歴を有する、一般都市人口か
らの284人男性中で20％が40〜70g/24時間のアルコール
摂取を認めた。これらの男性では、CDTの感度（sensiti
vity）は55％であり、0.8％のカットオフレベルを用い
て、特異性は91％であった。重度アルコール中毒ドリン
カー（70〜500g/24時間）では、感度はほぼ100％であっ
た。嫌忌療法中に84％においてCDTの正常化が見られ
た。かれらの一部はかれらの基底CDTレベルにまだ達し
ていなかった。我々は、炭化カルシウム錠剤による治療
中の適度の飲酒を排除することはできない。
からのサンプル中に検出されたCDT値は正常分布を示
し、谷−谷積分（図４）を用いると、一貫して１％未満
であった。高γ−GT値の前歴を有する、一般都市人口か
らの284人男性中で20％が40〜70g/24時間のアルコール
摂取を認めた。これらの男性では、CDTの感度（sensiti
vity）は55％であり、0.8％のカットオフレベルを用い
て、特異性は91％であった。重度アルコール中毒ドリン
カー（70〜500g/24時間）では、感度はほぼ100％であっ
た。嫌忌療法中に84％においてCDTの正常化が見られ
た。かれらの一部はかれらの基底CDTレベルにまだ達し
ていなかった。我々は、炭化カルシウム錠剤による治療
中の適度の飲酒を排除することはできない。
この方法は再現可能な結果を与え、大きいサンプルシ
リーズに関しては自動化することができる。40人の患者
サンプルを24時間分析することができる。HPLCのための
投資を含めた試薬の費用は、ラジオイムノアッセイと組
合せた使い捨て式ミニカラム（Pharmacia Diagnostic
s）のための試薬費用の約30％である。この方法は２通
りにランしなければならない。HPLCの他の利点は、トラ
ンスフェリンの遺伝的変化において重要である特異的46
0nm吸光度の目視可能な資料であることである。アルコ
ール中毒者からの血清はしばしば高脂肪血症であり、一
部のリポタンパク質並びに他の血清タンパク質はpH6.2
において沈殿して、カラム圧力を徐々に上昇させる。そ
れ故、１つのカラムの再生中に分析を実施することがで
きるように、２個のカラムを用いることが便利である。
このアプローチは我々に、問題なく、１年間の経験（＞
1000サンプル）を与えている。トランスフェリンの遺伝
的変異体（genetic variant）は人口の約29％に存在す
ると推定される。これらの大部分は主要Tfc表現型のサ
ブタイプ（subtype）であり、pI:sの変化は最小であ
る。これらはクロマトグラフィーパターンに干渉しな
い。白人の（caucasian）人口において出現頻度（frequ
ency）１〜２％の、TfBCヘテロ接合体とTfCDヘテロ接合
体のみがクロマトグラフィープロフィルに干渉する。こ
れらの場合に、専門実験室において等電点電気泳動によ
って結果を確認することが重要である。
リーズに関しては自動化することができる。40人の患者
サンプルを24時間分析することができる。HPLCのための
投資を含めた試薬の費用は、ラジオイムノアッセイと組
合せた使い捨て式ミニカラム（Pharmacia Diagnostic
s）のための試薬費用の約30％である。この方法は２通
りにランしなければならない。HPLCの他の利点は、トラ
ンスフェリンの遺伝的変化において重要である特異的46
0nm吸光度の目視可能な資料であることである。アルコ
ール中毒者からの血清はしばしば高脂肪血症であり、一
部のリポタンパク質並びに他の血清タンパク質はpH6.2
において沈殿して、カラム圧力を徐々に上昇させる。そ
れ故、１つのカラムの再生中に分析を実施することがで
きるように、２個のカラムを用いることが便利である。
このアプローチは我々に、問題なく、１年間の経験（＞
1000サンプル）を与えている。トランスフェリンの遺伝
的変異体（genetic variant）は人口の約29％に存在す
ると推定される。これらの大部分は主要Tfc表現型のサ
ブタイプ（subtype）であり、pI:sの変化は最小であ
る。これらはクロマトグラフィーパターンに干渉しな
い。白人の（caucasian）人口において出現頻度（frequ
ency）１〜２％の、TfBCヘテロ接合体とTfCDヘテロ接合
体のみがクロマトグラフィープロフィルに干渉する。こ
れらの場合に、専門実験室において等電点電気泳動によ
って結果を確認することが重要である。
本発明の方法を確立するために、Blue−Sepharose
（登録商標）による前処理によって血清からアルブミン
を除去した。使い捨て式カラム（ポリプロピレン5ml,Pi
erce）に、0.2g（乾重量）に相当する膨潤Blue−Sephar
ose（登録商標）Cl−6B（Pharmacia Biotechnology,ス
ウェーデン）を充填した。製造者の指示に従ってすすぎ
洗いした後に、小型カラムをグリシン（100mmol/l）（p
H7.2）と平衡化させた。鉄飽和した、リポタンパク質を
含まない上澄み液（100μｌ）にβ−メルカプトエタノ
ール10％（v/v）（２μｌ）を混合し、室温における１
時間後にミニカラムに供給した。血清タンパク質をグリ
シン（100mmol/l）（pH7.2）によって溶出した。
（登録商標）による前処理によって血清からアルブミン
を除去した。使い捨て式カラム（ポリプロピレン5ml,Pi
erce）に、0.2g（乾重量）に相当する膨潤Blue−Sephar
ose（登録商標）Cl−6B（Pharmacia Biotechnology,ス
ウェーデン）を充填した。製造者の指示に従ってすすぎ
洗いした後に、小型カラムをグリシン（100mmol/l）（p
H7.2）と平衡化させた。鉄飽和した、リポタンパク質を
含まない上澄み液（100μｌ）にβ−メルカプトエタノ
ール10％（v/v）（２μｌ）を混合し、室温における１
時間後にミニカラムに供給した。血清タンパク質をグリ
シン（100mmol/l）（pH7.2）によって溶出した。
溶出液の最初の300μｌを捨て、次の混合800μｌの中
の40μｌを等電点電気泳動に用いた。各カラムは尿素6m
ol/lとその後のグリシン（0.1mol/l）（pH7.0）とによ
る再生後に数回使用可能である。
の40μｌを等電点電気泳動に用いた。各カラムは尿素6m
ol/lとその後のグリシン（0.1mol/l）（pH7.0）とによ
る再生後に数回使用可能である。
等電点電気泳動は、本質的にα１−アンチトリプシン
に関して述べられたように、下記修正を加えて実施し
た。両性電解質混合物はPharmalyte（登録商標）４−6.
5とPharmalyte（登録商標）５−６との等しい部から成
り、ゲル溶液30mlにつき全体で1.9mlである。同じ操作
をより小さい規模で、Phast System（Pharmacia Biot
echnology,スウェーデン）を用いて実施することができ
る。トランスフェリン抗体を含浸させた酢酸セルロース
膜を用いる免疫固定によって、トランスフェリンイソフ
ォームを検出することができる。HPLCからの全ての病的
結果（CDT＞0.8％）は今までは等電点電気泳動によって
確認されていた。
に関して述べられたように、下記修正を加えて実施し
た。両性電解質混合物はPharmalyte（登録商標）４−6.
5とPharmalyte（登録商標）５−６との等しい部から成
り、ゲル溶液30mlにつき全体で1.9mlである。同じ操作
をより小さい規模で、Phast System（Pharmacia Biot
echnology,スウェーデン）を用いて実施することができ
る。トランスフェリン抗体を含浸させた酢酸セルロース
膜を用いる免疫固定によって、トランスフェリンイソフ
ォームを検出することができる。HPLCからの全ての病的
結果（CDT＞0.8％）は今までは等電点電気泳動によって
確認されていた。
血清トランスフェリン濃度はDako（デンマーク）から
の抗血清を用いて、エレクトロイムノアッセイによって
算出した。
の抗血清を用いて、エレクトロイムノアッセイによって
算出した。
我々の方法は積分計からCDIの算出％を自動的に与
え、トランスフェリン濃度を特別に測定する必要性を除
去する。この研究における、鉄欠乏とエストロゲン投与
とによってトランスフェリン濃度が上昇した女性と重度
アルコール中毒者（highly intoxicated alcoholics）
とにおけるトランスフェリン濃度（範囲1.1〜3.6g/l）
の大きな変化の観察が、絶対量ではなくトランスフェリ
ン総量中のCDT割合を用いる動機を与える。pI 5.7イソ
フォームの約9.5日間の半減期は過去１〜３週間中のア
ルコール摂取の評価を可能にし、治療の成功を実証す
る。この結果はCDTに関して最近推定された15日間の半
減期ではなくノルマルトランスフェリンに関する８〜10
日間の発表半減期と一致する。
え、トランスフェリン濃度を特別に測定する必要性を除
去する。この研究における、鉄欠乏とエストロゲン投与
とによってトランスフェリン濃度が上昇した女性と重度
アルコール中毒者（highly intoxicated alcoholics）
とにおけるトランスフェリン濃度（範囲1.1〜3.6g/l）
の大きな変化の観察が、絶対量ではなくトランスフェリ
ン総量中のCDT割合を用いる動機を与える。pI 5.7イソ
フォームの約9.5日間の半減期は過去１〜３週間中のア
ルコール摂取の評価を可能にし、治療の成功を実証す
る。この結果はCDTに関して最近推定された15日間の半
減期ではなくノルマルトランスフェリンに関する８〜10
日間の発表半減期と一致する。
CDTが高い場合に、CDTはアルコール乱用の非常に特異
的なマーカーであり、現在利用可能な、他の生物学的マ
ーカーよりも非常に優れている。中年男性の評価した集
団では、個人を非常に徹底的に特性化し（characterize
d）、15年間にわたって追跡した。1991年の追跡調査時
に、アルコール摂取を２人の正規看護婦が評価し、同時
にCDTのために血液サンプルを採取した。40g/日より多
いアルコール摂取を報告した群において55％の感度が認
められた。しかし、70g/日より多くを摂取したアルコー
ル中毒個人の研究では、感度はほぼ100％であった。絶
対禁酒者及び偶発的ドリンカーにおける高い特異性、ほ
ぼ100％はCDTが利用可能な生物学的マーカーの中で最高
の特異性を有するという結論を可能にする。
的なマーカーであり、現在利用可能な、他の生物学的マ
ーカーよりも非常に優れている。中年男性の評価した集
団では、個人を非常に徹底的に特性化し（characterize
d）、15年間にわたって追跡した。1991年の追跡調査時
に、アルコール摂取を２人の正規看護婦が評価し、同時
にCDTのために血液サンプルを採取した。40g/日より多
いアルコール摂取を報告した群において55％の感度が認
められた。しかし、70g/日より多くを摂取したアルコー
ル中毒個人の研究では、感度はほぼ100％であった。絶
対禁酒者及び偶発的ドリンカーにおける高い特異性、ほ
ぼ100％はCDTが利用可能な生物学的マーカーの中で最高
の特異性を有するという結論を可能にする。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 30/34 Ｇ０１Ｎ 30/34 Ｅ
30/74 30/74 Ｅ
33/68 33/68
// Ｇ０１Ｎ 33/98 33/98
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 30/00 - 30/96
G01N 33/68
Claims (10)
- 【請求項１】血液血清中のCD−トランスフェリンの分離
及び定量方法であって、血液血清を鉄によって飽和し、
トランスフェリンをイオン交換カラムにおいて塩傾斜を
用いて他の血清タンパク質から分離し、高性能液体クロ
マトグラフィーを用いて、異なるpI値を有するトランス
フェリンイソフォーム間の関係を示すクロマトグラムを
展開させることを特徴とする方法。 - 【請求項２】6.0〜6.4のpH、好ましくは6.1〜6.3のpHを
有するバッファー溶液中で分離を実施することを特徴と
する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】6.2のpHを有するバッファー溶液中で分離
を実施することを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】460nmにおけるFe−トランスフェリン錯体
の選択的吸光度を特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】クロマトグラフィープロフィルを谷−谷方
法を用いて積分することを特徴とする請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】血清1mlにつきNaHCO3（500mmol/l）25μｌ
とFeCl3（10mmol/l）18μｌとを加えることによって、
鉄飽和を実施することを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】血清1mlにつき硫酸デキストラン（10％,w/
v）10μｌとCaCl2（1mol/l）50μｌとを加えることによ
って、混合及び＋８℃における一晩の貯蔵後に、リポタ
ンパク質を沈殿させることを特徴とする請求項６記載の
方法。 - 【請求項８】得られた混合物を＋８℃において30〜60分
間貯蔵してから、約10000 ｘ ｇにおいて約10分間遠
心分離することを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】遠心分離した混合物の上澄み液を水によっ
て５倍に希釈することを特徴とする請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】希釈した上澄み液をHPLCに注入すること
を特徴とする請求項９記載の方法。
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|---|---|---|---|
| SE9302573A SE501668C2 (sv) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Kvantifiering av CD-transferrin vid hög alkoholkonsumtion med HPLC |
| SE9302573-2 | 1993-08-06 | ||
| PCT/SE1994/000684 WO1995004932A1 (en) | 1993-08-06 | 1994-07-11 | Quantitation of carbohydrate deficient transferrin in high alcohol consumption by hplc |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09501496A JPH09501496A (ja) | 1997-02-10 |
| JP3426238B2 true JP3426238B2 (ja) | 2003-07-14 |
Family
ID=20390739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50637095A Expired - Fee Related JP3426238B2 (ja) | 1993-08-06 | 1994-07-11 | 高度アルコール摂取の判定における炭水化物欠乏トランスフェリンのｈｐｌｃによる定量 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5788845A (ja) |
| EP (1) | EP0712496B1 (ja) |
| JP (1) | JP3426238B2 (ja) |
| AU (1) | AU7351894A (ja) |
| CA (1) | CA2168878C (ja) |
| CZ (1) | CZ28596A3 (ja) |
| DE (1) | DE69423894T2 (ja) |
| NO (1) | NO316411B1 (ja) |
| PL (1) | PL312847A1 (ja) |
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| US5798212A (en) * | 1995-02-22 | 1998-08-25 | Axis Biochemicals Asa | CDT assay |
| SE9702020D0 (sv) * | 1997-05-29 | 1997-05-29 | Pharmacia & Upjohn Ab | An improved method for diagnosing alcohol abuse |
| GB9827411D0 (en) * | 1998-12-11 | 1999-02-03 | Axis Biochemicals Asa | Dipstick assay |
| GB9929308D0 (en) * | 1999-12-10 | 2000-02-02 | Axis Shield Plc | Assay |
| EP2006685A1 (en) | 2006-03-31 | 2008-12-24 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Immune agglutination reaction reagent kit and method of assaying antigen |
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| PL3117217T3 (pl) * | 2014-03-12 | 2018-12-31 | Università Degli Studi Di Verona | Analityczna metoda identyfikacji co najmniej jednej glikoformy białka transferyny |
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| US4448767A (en) * | 1977-10-11 | 1984-05-15 | Sumar Corporation | Preparation of monospecific male-specific antibody and the use thereof for increasing the percentage of mammalian offspring of either sex |
| SE440699B (sv) * | 1984-02-06 | 1985-08-12 | Pharmacia Ab | Sett att medelst isotransferrinbestemning uppskatta en individs alkoholkonsumtion |
| JPS61104796A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-23 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
| US4814280A (en) * | 1987-08-07 | 1989-03-21 | Peterson Charles M | Plasma and hemoglobin-associated acetaldehyde as a marker of alcohol use |
| HU215555B (hu) * | 1990-06-21 | 1999-01-28 | Axis Biochemicals Asa | Eljárás variánsok koncentrációjának meghatározására, valamint az eljárásban használható analitikai vizsgálati készlet |
| US5126271A (en) * | 1991-07-16 | 1992-06-30 | James W Harasymiw | Method for determining the consumption rate of alcohol by a human subject |
| US5460970A (en) * | 1993-05-18 | 1995-10-24 | Summa Health System | Separation of acetaldehyde-induced hemoglobin (Hb A1-AcH) |
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-
1994
- 1994-07-11 AU AU73518/94A patent/AU7351894A/en not_active Abandoned
- 1994-07-11 CZ CZ96285A patent/CZ28596A3/cs unknown
- 1994-07-11 JP JP50637095A patent/JP3426238B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-11 PL PL94312847A patent/PL312847A1/xx unknown
- 1994-07-11 CA CA002168878A patent/CA2168878C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-11 DE DE69423894T patent/DE69423894T2/de not_active Ceased
- 1994-07-11 EP EP94922398A patent/EP0712496B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-11 WO PCT/SE1994/000684 patent/WO1995004932A1/en active IP Right Grant
-
1996
- 1996-02-05 NO NO19960466A patent/NO316411B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-06-10 US US08/872,329 patent/US5788845A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| PL312847A1 (en) | 1996-05-13 |
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| CZ28596A3 (en) | 1996-06-12 |
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