CZ28596A3 - Separation and quantification of cd-transferin in blood serum - Google Patents

Separation and quantification of cd-transferin in blood serum Download PDF

Info

Publication number
CZ28596A3
CZ28596A3 CZ96285A CZ28596A CZ28596A3 CZ 28596 A3 CZ28596 A3 CZ 28596A3 CZ 96285 A CZ96285 A CZ 96285A CZ 28596 A CZ28596 A CZ 28596A CZ 28596 A3 CZ28596 A3 CZ 28596A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
transferrin
separation
cdt
serum
isoforms
Prior art date
Application number
CZ96285A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan Olof Jeppsson
Original Assignee
Biolin Medical Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20390739&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ28596(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biolin Medical Ab filed Critical Biolin Medical Ab
Publication of CZ28596A3 publication Critical patent/CZ28596A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/203332—Hydroxyl containing
    • Y10T436/204165—Ethanol

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

ZP0SOB ODDĚLENÍ a KVANTOVÁNÍ CDj-TR^NSEERljNU « KREVNlfFSERuj
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu oddělení a kvantování transferinu s nedostatkem karbohydrátu (CDT) v krevním seru.
Dosavadní stav techniky
Alkohol způsobuje rozsáhlé škody svým obětem a jejich rodinám a významné peněžité ztráty společnosti s ním spojenou morbiditou a mortalitou. Dříve prováděné úvahy a práce ukázaly, že jsou dobré pro jednotlivce a účinné co do nákladů pro společnost. Byly žádány citlivé, specifické, rychlé a levné způsoby identifikace komplikací při pití alkoholu u jednotlivců různých populací. Během minulých třiceti let byly vyvinuty četné postupy detekce těžkých pijáků. Po mnoho let byly používány obvyklé laboratorní zkoušky používající látky jako je gamraa-glutamyltransferáza, střední objem tělísek, aspartát nebo alaninaminotransferázy, alfa-lipoproteiny a ferritin, jako biochemické indikátory nadužívání alkoholu, avšak tyto způsoby měly nízkou diagnostickou citlivost a specificitu. Byla popsána kvalitativní změna v izoformách transferinu v cerebrospinální tekutimě a seru pacientů s cerebralním tremorem ve vztahu k alkoholu. Izoformy ve vztahu k nadužívání alkoholu obsahovaly méně kyseliny sialové než jiné izoformy a mohou tedy být rozlišeny podle náboje. Bylo zavedeno něko-. lik technik separace izoforem, tyto jsou však obecně pracné, nekvantitativní a nákladné. Použitelné techniky jsou chromatofokusace, použitelný minisloupec, kombinovaný s radioimunozkouškou a elektrofokusací následovanou imunofixací, odsávání typu Vestern nebo pásmová imunoelektroforeza.
Transferin, protein přenášející železo v krvi, je glykoprotein se dvěma bi- nebo tri-valentními uhlovodíkovými řetězci, z nichž každý je zakončen dvěma nebo třemi sialovými kyselinami (kyselina N-acetylneuraminová). Izoelektrická fokusace oddělí normálně transferin s vysokým rozlišením do
-2ízoforem v závislosti na sycení železem, obsahu kyseliny sialové a nebo substitucí aminokyselin. Po úplném nasycení železem (2 atomy Fe na 1 molekulu) se transferin normálně rozdělí ve čtyři izoformy pojmenované podle jejich přibližného izoelektrického bodu pl 5,2 (5 SA), pl 5,4 (4 SA), (hlavní frakce), pl 5,6 (3 SA) a pl 5,7 (2 SA). Malá množství transferinu s pl 5,6 a 5,7 jsou přítomna v normálním seru. Izoforma, která významné přibývá v seru alkoholiků je pl 5,7. Frakce pl 5,7, která je normálně nižší než 0,8% celkového množství transferinu, se může zvýšit více než desetkrát po značné konzumaci alkoholu. Po nadměrném pití se může objevit přídavně frakce pl 5,9 (0 SA). Frakce pl 5.7 a pl 5,9 představují transferin deficitní na karbohydráty.
Úkolem předloženého vynálezu je vyvinout způsob vysoce účinné kapalinové chromatografie vhodný pro rutinní laboratoře pro identifikaci subjektů s vysokým nebezpečím závislosti na alkoholu a vyhodnocení jejich citlivosti a specificity pro zjištění vysoké konzumace alkoholu ve vymezených populacích. Úkolem je vytvořit způsob vhodný pro standardní klinické postupy, a který zejména měří koncentraci CDT, což je vhodný biochemický indikátor velké konzumace alkoholu v uplynulých týdnech
Podstata vvnálezu
Vynález řeší úkol tím, že vytváří způsob oddělení a kvantování CD-transferinu v krevním seru, jehož podstata spočívá v tom, že se krevní sérum nasytí železem a izoformy transferinu se oddělí od jiných proteinů sera ve sloupci výměny. iontů použitím solného gradientu, vytvoří se chromatogram vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií, kterýžto chromatogram ukazuje vztah mezi izoformami transferinu s různými hodnotami pl. . ’
Podle výhodného provedení předloženého vynálezu se oddělení provádí v roztoku pufru majícím pH od 6,0 do 6,4, s výhodou od 6,1 do 6,3.
-3Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu se oddělení provádí v roztoku pufru majícím pH rovné 6,2.
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu se způsob vyznačuje selektivní pohltivostí komplexu fe-transferinu při 460 nm.
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu se chromatografický profil integruje použitím způsobu sedlo-sedlo.
Podle dalšího výhodného prove.dení předloženého vynálezu 'se“ nasycení železem provádí-přidáním—~25*ju-l- NaHCOy (500 mmol/1.)— _ a 18 yul FeCl^ (10 mmol/1) na 1 ml sera. .
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu se lipoproteiny vysrážejí po smíchání a uložení přes noc při 18°C přidáním 10 yul Dextransulfátu (10% h/o) a 50 yul' CaCl2 * (1 mol/l) na 1 ml sera.
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu získaná směs se uloží na dobu 30-60 minut při 18°C a potom se odstřeďuje při 10000 x g po dobu 10 minut.
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu supernatant odstředěné směsi se zředí vodou v poměru 1:5.
Podle dalšího výhodného provedení předloženého vynálezu zředěný supernatant se vstřikuje do vysoce výkonného kapalir nového chromatografu.
Přehled obrázků na výkresech ' ’ . ' ~ : - Vynález je znázorněn na výkresech, kde obr.l znázorňuje chromatogramy izofořem transferinu ve vzorcích od jednotlivců s různou konzumací alkoholu, obr.2 znázorňuje končentrácl snížení CDT po dokončeném pití pro čtyři těžce intoxikované pacienty', ‘ obr (3 znázorňuje ‘tabulku-solného gradientu užitého— při rozdělování izofořem transferinu a obr.4 znázorňuje hladiny CDT v šerech jednotlivců s různou konzumací alkoholu.
Příklady provedení vvnálezu - ......... .......
Vzorky byly připraveny tak, že čerstvé sérum nebo sérum
-4ochlazované po dobu 6 měsíců, při teplotě -18°C bylo nasyceno železem přidáním 25 ^íil NaHCO-j (500 mmol/1) a 18 ul FeCl-j (10 mmol/1) na 1 ml sera. Po míchání a uložení přes noc při +8°C byly vysráženy lipoproteiny přidáním 10 ul Dextransulfátu (10 % (h/o)) a 50 fil CaCl2 (1 mol/1) na 1 ml sera. Směs byla uložena po dobu 30-60 minut při teplotě +8^C a potom odstředěna při 10000 x g po dobu 10 minut. Supernatant byl zředěn vodou v poměru 1:5 a převeden do autoinjektoru vysoce výkonné kapalinové chromatografie.
Izoformy transferinu byly odděleny na sloupci výměny iontů. Mono Q(Š) HR 5/5 (Pharmacia Biotechnology, Švédsko) z jiných proteinů sera se solným gradientem po 32 minut včetně regenerace. Výchozí pufr (A) byl Bis Tris 20 mraol/1 pH=6,2. Pufr B byl pufr A plus NaCl (350 mmol/1) při stejném použit roztok C, NaCl (1 mol/1). použitím odplyněny a přefiltrovány filtrem o velikosti pórů 0,45 /um. Vzorky o velikosti 200 um byly vstřikovány, proud byl udržován na hodnotě 1 ml/min k vytvoření průběhu gradientu znázorněného v tabulce na obr.3.
pH; Pro regeneraci , byl Všechny roztoky byly před
Použitý systém vysoce výkonné kapalinové chromatografie sestával z čerpadla č. 2941 společnosti Pharmacia Biotechnology, Švédsko, z detektoru ultrafialového záření Jasco 870 opatřeného filtrem na 460 nm a proudovou buňkou 10 mm s wolframovou lampou. Systém obsahoval autoxnjektor Vaters VISP 715, s chladicím systémem pro 96 vzorků. Byl použit integrátor Schumazu CR 51 pro výpočet vrcholových oblastí podle modu sedlo-sedlo.
Izoformy transferinu mají pl:s asi od 5,2 do 5,9. Optimální oddělení nejvíce kathodických izoforem bylo dosaženo při pH=6,2. Nicméně přijatelné výsledky byly také dosaženy při pufrových roztocích majících pH od 6,0 do 6,4. Pro nejlepší výsledek by však pH mělo být od 6,1 do 6,3, a nejvýhodněj i 6,2. Přidání NaHCO-j spolu s FeCL^ dává optimálně stabilní nasycení železem. Vysrážení lipoproteinů zlepší oddělení
-5izoformy pí 5,9, která může být skryta u některých pacientů pod těžkými frakcemi beta-lipoproteinu. Zachované vzorky s nižšími hladinami lipoproteinu nemohou být použity při práci s alkoholiky na ambulantní bázi. Obr.l znázorňuje chroraatogramy po vysoce výkonné kapalinové chromatografií od jednotlivců pijících těžce, středné a normálně, kde izoforma pí 5,9 se také objevuje 'v prvním vzoru. Pohltivost komplexu Fe-transferinu při 460 nm je asi 1/10 pohltivosti 280 nm, je však vysoce specifická pro frakce transferínu. Množství ČD-transferinu pí 5,7 představuje pouze 0,2-0,8 -(-střed +2
S.D.) celkového množství transferínu u abstinentů a příležitostných pijáků. Tato hodnota byla nepatrně závislá na způsobu integrace chromatografického profilu. Nepatrně vyšší hodnoty byly nalezeny použitím integrace od základní čáry, avšak metoda sedlo-sedlo byla více reprodukovatelná.
V obr.l A představuje vzorek od jednotlivce konzumujícího 300 g alkoholu za 24 hodiny, B představuje vzorek od jednotlivce konzumujícího 70 g alkoholu za 24 hodiny a C před§ stavuje normální vzor.
Stínované oblasti označují CDT, to je izoformy transfexinu mající pí 5,7 (») a pí 5,9 (*·)- Jiné vrcholy chromatogramu představují od pravé strany pí 5,2, pí 5,4 a pí 5,6. Z chromatogramů je zřejmé, že dominantní frakce je pí 5,4. Dále je zřejmé, že hodnoty CDT jsou zvýšeny po těžké konzumaci alkoholu. Pohltivost komplexu Fe-transferinu bylá měřena při 460 nm.
Poločas. CD-transferínu byl zjišťován měřením CDT pí 5,7 čtyř těžce intoxikovaných pacientů postupně při 15-denni hospitalizaci, při které nebylo přerušeno nadužívání alkoholu. V každém vzorku byla měřena koncentrace transferínu (g/l) a CDT bylo vypočteno a vyneseno jako mg/1 v serailogaritmickém diagramu v obr.2. Totální koncentrace transferínu se u některých pacientů během hospitalizace zvyšovala. Poločas každé křivky bul zjišťován ž jejího lineárního sklonu. Rozdíl mezi jednotlivými pacienty byl malý a střední hodnota Tl/2 byla
-6odhadnuta 9,5+1 den.
Hodnoty CDT nalezené ve vzorcích abstinentů a příležitostných pijáků (osazenstvo laboratoře) ukazovaly normální rozdělení a byly stále pod 1% při užití integrace způsobem sedlo-sedlo, viz obr.4. Mezi 284 muži z obecné městské populace s předběžným záznamem vysokých hodnot gamma-GT 20% ohlásilo konzumaci alkoholu 40-70 g .za 24 hodin. U těchto lidí byla citlivost na CDT rovna 55% a specificita 91% při užití výběrové úrovně 0,8 %. Mezi těžce intoxikovanými pijáky (konzumujícími 70-550 g alkoholu za 24 hodiny) byla citlivost téměř 100%. Normalizace CDT byla patrna u 84% během averžní terapie. Někteří z nich ještě nsdosáhli své základní hladiny CDT. Není možné vyloučit mírné pití během léčení tabletami karbidu vápníku.
Způsob dává reprodukovatelné výsledky a může být pro velké serie vzorků automatizován. Vzorek 40 pacientů může být r ;
analyzován během 24 hodin. Náklady na reagencie včetně η investic za zařízení pro vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii činí asi 30% nákladů na reagencie pro použitelné minisloupce v kombinaci s radioimunozkouškou (Pharmacia Diagnostic). Tato technika má být provozována v duplikátech. Ji- * nou výhodou vysoce výkonné kapalinové chromatografie je vidi-- - xí telný dokument pohltivosti při 460 nm, který má význam v geT netícké variaci transferinu. Sérum alkoholiků je někdy lipemické a některé lipoproteiny jakož i jiné proteiny sera se mohou srážet při pH=6,2, což způsobuje postupné zvyšování tlaku ve sloupci. Je tedy výhodné použít dvou sloupců, takže analýzy mohou být prováděny během regenerace jednoho sloupce.
Tento způsob zajistil rok bezproblémových zkušeností při zpracování více než 1000 vzorků. Přítomnost genetických variant transferinu byla odhadnuta asi u 29% populace. Většina z nich představuje podtypy majoritního TfC fenotypu s malými změnami pl:s. Neinterferuji s chromatografickým vzorem. Pouze TfBC heterozygoty a TfCD heterozygoty o frekvenci 1 až 2 o/oo v kavkazské populaci budou interferovat s chromatogra-7fickým profilem. V těchto případech je nutno ověřit výsledky izoelektrickou fokusací ve specializované laboratoři.
Pro ověření způsobu podle vynálezu byl ze sera odstraněn albumin předběžným zpracováním s látkou Blue-Sepharose. -Použitelné sloupce (polypropylen 5 ml, Pierce) byly opatřeny nabobtnalou látkou Blue-Sepharos^ C1-6B (Pharmacia Biotechnology, Švédsko) odpovídající 0,2 g suché hmotnosti. Po opláchnutí podle instrukce výrobce byl malý sloupec vyvážen glycinem, 100 mmol/1, pH=7,2.· 100 ^ul supernatantu nasyceného železem a prostého lipopróteinu bylo slníčháno ” se* 2“jUl beta-merkaptoethanolu 10% (o/o) a po stání po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti zavedeno do minisloupce. Proteiny sera.byly vyplaveny glycinem, 100 roniol/1, pH=7,2. Prvních 300jul výluhu bylo odstraněno, 40 ^Lil z dalších 800 Jhl bylo užito pro izoelektrickou fokusací. Každý sloupec může být použit ně§ kolikrát po regeneraci močovinou 6 mol/1 a potom glycinem 0,1 mol/1, pH=7,0.
Izoelektrická fokusace byla provedena v podstatě způsobem popsaným pro alfa-antitrypsin s dalšími modifikacemi. Směs amfolytu sestávala ze stejných dílů látky Pharmalyt^
4-6,5 a látky pharmalytc^ 5-6, celkem 1,9 ml na 30 ml gelového roztoku. Stejný postup může být proveden v menším měřítku použitím látky Phast System (Pharmacia Biotechnology, Švédsko) .Izoformy transferinu mohou být ověřeny imunofixací při použití membrán z acetátu celulózy impregnovaných protilátkami transferinu. Všechny patologické výsledky vysoce výkonné -kapalinové-- chromatORrafie _ ,(CD,T_ Ó_,8%). by_ly. .ověřeny izoelektrickou fokusací.
Koncentrace transferinu v seru byla zjišťena elektroimunozkouškou použitím antiser společnosti Dako (Dánsko).
Způsob podle předloženého vynálezu dává automaticky vypočtený procentní podíl CDT z integrátoru a vylučuje potřebu specifického určení koncentrace transferinu. Pozorování velkého kolísání celkové koncentrace”tráňšferinu u'žen'se. zvyšováním následkem nedostatku železa a podávání oestrogenu u vy-8soce intoxikovaných osob (rozsah 1,1 - 3,5 g/1) v této práci motivuje použití percentuálního podílu CDT celkového množství transferinu spíše než absolutních možství. Poločas rovný asi
9,5 dnů pro izoformu pl 5,7 umožňuje vyhodnocení konzumace alkoholu během minulých 1 až 3 týdnů nebo ověřuje úspěšné léčení. Výsledek je v souhlase s uveřejněným poločasem 8-10 dnů pro normální transferin spíše než dříve.odhadnutá hodnota 15 dnů pro CDT.
Zvýšené CDT je zvláštní specifický příznak nadužívání alkoholu a vysoce nadřazený jiným běžně použitelným biologickým příznakům. U vyhodnocené populace samců středního věku byli jednotlivci velmi pečlivě charakterizováni a sledováni po 15 roků. Při sledování v roce 1991 byla provedena konzumace alkoholu u dvou školených ošetřovatelek a při tom vzorkována krev na CDT. Byla zjištěna citlivost· 55% ve skupině, která užívala alkohol v množství větším než 40 g za den. Nicméně u intoxikovaných jednotlivců konzumujících více než 70 g za den byla citlivost blízká 100%. Vysoká specificita u abstitnentů a příležitostných pijáků, blízká 100%, dovoluje učinit závěr, že CDT má nejvyšší specificitu z použitelných biologických indikátorů.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Způsob oddělení a kvantování CD-transferinu v krevním.seru, vyznačující se tím, že se krevní ~sérum nasytí železem a izoformy transferinu se oddělí od jiných proteinů sera ve sloupci výměny iontů použitím solného gradientu, vytvoří se chromatogram vysoce výkonnou kapalinovou chromatografíí, kterýžto chromatogram ukazuje vztah mezi izoformami transferinu s různými hodnotami pl.
    '27~Způsob—podle nároku 1,,__vyznačuj.icJL_se.jtj.m_, že oddělení se provádí v roztoku pufru majícím pH od 6,0 do 6,4, s výhodou od 6,1 do 6,3.
  2. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se oddělení provádí v roztoku pufru majícím pH rovné 6,2.
  3. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se selektivní pohltivostí komplexu fe-transferinu při 460 nm.
  4. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že chromatografický profil se integruje použitím způsobu sedlo-sedlo.
  5. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nasycení železem se provádí přidáním 25 yul NaHCO^ (500 mmol/1) a 18 jul FeClj (10 mmol/1) na 1 ml sera.
  6. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se lipopróteiny vysrážejí po smíchání a uložení přes noc při 18°C přidáním 10 yul Dextransulfátu (10% h/o) a 50 jjl CaCl2 (1 mol/1) na 1 ml sera. - ; ..... r . -..............
  7. 8. Způsob podle nároku 7; vyznačující se tím, že získaná směs sé uloží na dobu 30-60 minut při 18°C a potom se odstřeďuje při 10000 x g po dobu lTTŮňinuť.' ·-····-=--
  8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že supernatant odstředěné směsi se-zředí vodou-v. poměru 1: 5 . .
  9. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zředěný supernatant se vstřikuje do vysoce výkonného kapalinového chromatograf u.
CZ96285A 1993-08-06 1994-07-11 Separation and quantification of cd-transferin in blood serum CZ28596A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9302573A SE501668C2 (sv) 1993-08-06 1993-08-06 Kvantifiering av CD-transferrin vid hög alkoholkonsumtion med HPLC

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ28596A3 true CZ28596A3 (en) 1996-06-12

Family

ID=20390739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ96285A CZ28596A3 (en) 1993-08-06 1994-07-11 Separation and quantification of cd-transferin in blood serum

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5788845A (cs)
EP (1) EP0712496B1 (cs)
JP (1) JP3426238B2 (cs)
AU (1) AU7351894A (cs)
CA (1) CA2168878C (cs)
CZ (1) CZ28596A3 (cs)
DE (1) DE69423894T2 (cs)
NO (1) NO316411B1 (cs)
PL (1) PL312847A1 (cs)
SE (1) SE501668C2 (cs)
WO (1) WO1995004932A1 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5798212A (en) * 1995-02-22 1998-08-25 Axis Biochemicals Asa CDT assay
JPH11500227A (ja) * 1995-02-22 1999-01-06 アクシス バイオケミカルズ エイエスエイ 炭水化物不足トランスフェリンアッセイ
SE9702020D0 (sv) * 1997-05-29 1997-05-29 Pharmacia & Upjohn Ab An improved method for diagnosing alcohol abuse
GB9827411D0 (en) * 1998-12-11 1999-02-03 Axis Biochemicals Asa Dipstick assay
GB9929308D0 (en) * 1999-12-10 2000-02-02 Axis Shield Plc Assay
US20090117668A1 (en) 2006-03-31 2009-05-07 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Immune Agglutination Reagent Kit and Method of Measuring Antigen
US8304248B2 (en) * 2009-11-16 2012-11-06 Torres Anthony R Protein separation via ion-exchange chromatography and associated methods, systems, and devices
WO2015135900A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Universita' Degli Studi Di Verona Analytical method for the identification of at least one glycoform of the transferrin protein

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2606991A1 (de) * 1976-02-20 1977-08-25 Nils Dr Med Kaiser Geraet zur bestimmung des gehaltes von stoffwechselprodukten im blut
US4448767A (en) * 1977-10-11 1984-05-15 Sumar Corporation Preparation of monospecific male-specific antibody and the use thereof for increasing the percentage of mammalian offspring of either sex
SE440699B (sv) * 1984-02-06 1985-08-12 Pharmacia Ab Sett att medelst isotransferrinbestemning uppskatta en individs alkoholkonsumtion
JPS61104796A (ja) * 1984-10-26 1986-05-23 Chemo Sero Therapeut Res Inst モノクロ−ナル抗体の製造方法
US4814280A (en) * 1987-08-07 1989-03-21 Peterson Charles M Plasma and hemoglobin-associated acetaldehyde as a marker of alcohol use
US5352616A (en) * 1990-06-21 1994-10-04 Axis Biochemicals As Analyte variant analysis
US5126271A (en) * 1991-07-16 1992-06-30 James W Harasymiw Method for determining the consumption rate of alcohol by a human subject
US5460970A (en) * 1993-05-18 1995-10-24 Summa Health System Separation of acetaldehyde-induced hemoglobin (Hb A1-AcH)

Also Published As

Publication number Publication date
CA2168878C (en) 2000-02-29
DE69423894T2 (de) 2000-12-07
NO316411B1 (no) 2004-01-19
NO960466D0 (no) 1996-02-05
CA2168878A1 (en) 1995-02-16
JP3426238B2 (ja) 2003-07-14
JPH09501496A (ja) 1997-02-10
US5788845A (en) 1998-08-04
NO960466L (no) 1996-02-05
EP0712496B1 (en) 2000-04-05
DE69423894D1 (de) 2000-05-11
PL312847A1 (en) 1996-05-13
WO1995004932A1 (en) 1995-02-16
AU7351894A (en) 1995-02-28
SE9302573L (sv) 1995-02-07
SE501668C2 (sv) 1995-04-10
SE9302573D0 (sv) 1993-08-06
EP0712496A1 (en) 1996-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jeppsson et al. Carbohydrate-deficient transferrin quantified by HPLC to determine heavy consumption of alcohol
Fagerhol et al. Immunological studies on human antithrombin III: Influence of age, sex and use of oral contraceptives on serum concentration
John Haemoglobin A1c: analysis and standardisation
Eross et al. Colorimetric measurement of glycosylated protein in whole blood, red blood cells, plasma and dried blood
Jung et al. Cystatin C: a promising marker of glomerular filtration rate to replace creatinine
Bernard et al. Effect of renal insufficiency on the concentration of free retinol-binding protein in urine and serum
McLemore et al. Rapid automated determination of lipid hydroperoxide concentrations and total antioxidant status of serum samples from patients infected with HIV: elevated lipid hydroperoxide concentrations and depleted total antioxidant capacity of serum samples
Yatscoff et al. Quantification of nonenzymically glycated albumin and total serum protein by affinity chromatography.
HU215181B (hu) Eljárás és vizsgálókészlet glükozilált hemoglobin kimutatására
Elson Quantitative determination of serum haptoglobin: a simple and rapid method
Chang et al. Evaluation and interference study of hemoglobin A1c measured by turbidimetric inhibition immunoassay
Corso et al. Assessment of renal function in patients with multiple myeloma: the role of urinary proteins
CZ28596A3 (en) Separation and quantification of cd-transferin in blood serum
Ziegler et al. Increased erythrocyte aggregation in insulin-dependent diabetes mellitus and its relationship to plasma factors: a multivariate analysis
Mashiba et al. Measurement of glycated albumin by the nitroblue tetrazolium colorimetric method
Scott et al. Effects of azotemia on results of the boronate-agarose affinity and ion-exchange methods for glycated hemoglobin.
Harmoinen et al. Determination of creatinine in serum and urine by cation-exchange high-pressure liquid chromatography
EP0770875B1 (en) Marker and reagent for diabetes mellitus and diabetes mellitus complication
Suhonen et al. Correlation of HbA1C, glycated serum proteins and albumin, and fructosamine with the 24-h glucose profile of insulin-dependent pregnant diabetics.
Sillanaukee et al. Effect of acetaldehyde on hemoglobin: HbA1ach as a potential marker of heavy drinking
Shipe et al. High performance liquid chromatographic separation and fluorescence detection of polyamines in plasma and erythrocytes
Hjemdahl et al. A new assay for β-thromboglobulin in urine
Nguyen et al. Modification of hemoglobin by acetaldehyde: A time course study by high pressure liquid chromatography
Kratz et al. The plasma protein
Simonnet et al. Review of factors susceptible of influencing post-mortem carbohydrate-deficient transferrin