WO2004051275A1 - Verfahren und vorrichtung zum transport bzw. zur bindungspezifischen trennung elektrisch geladener moleküle - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum transport bzw. zur bindungspezifischen trennung elektrisch geladener moleküle Download PDF

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WO2004051275A1
WO2004051275A1 PCT/DE2003/003938 DE0303938W WO2004051275A1 WO 2004051275 A1 WO2004051275 A1 WO 2004051275A1 DE 0303938 W DE0303938 W DE 0303938W WO 2004051275 A1 WO2004051275 A1 WO 2004051275A1
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molecules
electrodes
dna
electrode
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PCT/DE2003/003938
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Heike Barlag
Walter Gumbrecht
Manfred Stanzel
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
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    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry

Definitions

  • the invention relates to a method for transporting or for the binding-specific separation of electrically charged molecules in an aqueous solution, in particular when operating a DNA sensor with a redox cycling process between two measuring electrodes.
  • the invention relates to the associated devices.
  • the rate of migration v of the charged particles in the liquid medium is proportional to the field strength E and the ion charge Q and inversely proportional to the particle radius r and the viscosity ⁇ of the suspension.
  • electrophoresis for example, biomolecules, ie above all proteins and DNA, which differ in their size and / or charge, are separated from one another.
  • electrophoretic separation eg isoelectric focusing
  • Amino acids that have their isoelectric point at the desired pH are therefore often used as buffers. This means that at the set pH value, the buffer molecules themselves have no net charge and are therefore not subject to migration.
  • Electric fields are also used when transporting charged molecules, for example to increase or decrease the concentration at a certain location.
  • the sensitivity can be increased if the DNA fragments to be detected (target molecules) are concentrated at the location of the capture molecules (sensor surface).
  • the number of scavenger / target molecule bonds increases.
  • such a reaction does not only form catcher / target molecule pairs that match each other exactly, but also those whose sequences do not correspond exactly with each other at some points (mismatches).
  • the prerequisite for the transport of charged particles in the electric field is a field gradient that is strictly monotonous within the electrolyte or the transport route. This means that the field gradient must not change its sign and not become zero.
  • the application of any voltage is not necessarily sufficient for aqueous systems. In the absence of a chemical reaction in front of the electrodes, the voltage across the electrochemical double layer drops and the field gradient between the electrodes becomes zero. However, if a reduction or oxidation reaction takes place at the electrodes, the double layer in front of the electrodes is depolarized and the electric field is strictly monotonous within the electrolyte. The consequence is an ion transport in the aqueous electrolyte.
  • a frequently used method for generating such electric fields in aqueous systems is the application of the decomposition voltage of water.
  • Oxygen is developed on the anode and hydrogen on the cathode.
  • care must be taken to ensure that the gases and, in particular, their radical precursors do not come into contact with the molecules to be investigated, since they would otherwise be chemically changed.
  • this is done by separating the electrolyte spaces directly in front of the electrodes from the electrolyte space between the electrodes, for example by means of diaphragms. This solution is problematic for microsensors since diaphragms are not practical.
  • the charge transport in the permeation layer is carried out by smaller ions.
  • the object of the invention is therefore to specify a suitable method for transporting the charged molecules by means of an electric field, in which no hydrogen or oxygen development occurs at the electrode.
  • a corresponding device is to be created which can make do with standard materials and layers of chip production.
  • the method according to the invention according to claim 1 or the method according to the invention according to claim 12 can optionally be carried out with the same structure. It is also advantageously possible to combine the two methods with one another, for example cyclically.
  • the invention makes use of the fact that other reactions besides the electrolysis of water can also be used to generate the electric field in the analyte solution.
  • a metal / metal ion complex e.g. Copper / copper histidine complex
  • the metal ion remains stable in solution. Because e.g. the Kufer-histidine complex is very stable, the concentration of free copper ions remains very small and almost constant. This prevents the copper ions from influencing DNA hybridization.
  • the electrode be negatively polarized, e.g. to increase the selectivity of the capture / target binding
  • the metal ions are reduced in the presence of a metal ion complex of a sufficiently noble metal, for example copper, and thereby on the electrodes (in this case the measurement Electrodes).
  • a metal ion complex of a sufficiently noble metal for example copper
  • the copper deposited on the measuring electrodes can be removed in a washing step by applying negative potential again. A repulsion of the target molecules is prevented by using a washing solution with a high ionic strength, so that only, for example, copper in the form of Cu 2+ ions is removed, but the target DNA is not moved.
  • Copper is already used for conductor tracks today and can be used in the future as an electrode material for sensor applications or microsystem applications such as micro-electrophoresis. In the manufacture of such a micro system, it is therefore possible to use inexpensive standard semiconductor technology processes.
  • FIG. 1 shows a basic structure for carrying out the method according to the invention
  • FIGS. 2 to 4 cross sections of differently designed arrangements, 5a and 5b in the case of arrangements according to FIG. 3, the process of enriching target molecules from low to high concentration,
  • FIG. 7 shows the electrode process when using a sacrificial electrode and a complexing agent
  • FIG. 8 to 10 plan views of different measuring electrode configurations
  • FIG. 11 shows a measuring arrangement with measuring positions arranged next to one another in cross section
  • FIG. 12 one from individual positions corresponding to FIG
  • Figure 8 formed array arrangement in plan view.
  • FIG. 1 denotes a planar substrate, for example made of silicon, on which a thin insulator layer 2, for example made of silicon oxide (SiO 2 ), is applied.
  • a thin insulator layer 2 for example made of silicon oxide (SiO 2 )
  • two measuring electrodes 20 and 30, which preferably consist of precious metal, in particular gold.
  • the entire measuring arrangement is in contact with an aqueous solution 15.
  • the negatively charged molecules are to be transported to the measuring electrodes 20, 30 and are also referred to below as target molecules.
  • the target molecules are the DNA to be examined.
  • the target DNA can be attached in the vicinity of the electrodes 20, 30 for the purpose of measurement by means of capture molecules which can be immobilized, for example, in a hydrogel layer 35.
  • the material is a metal / metal ion (Me / Me + ) combination, for example Cu / Cu 2+ .
  • metal / metal ion (Me / Me + ) combination for example Cu / Cu 2+ .
  • a copper electrode as sacrificial anode 40 can go into solution by applying a positive potential as Cu 2+ .
  • the negative target molecules 200 are moved there to the copper electrode 40 and accumulate in the vicinity thereof and thus also in the area of the measuring electrodes 20, 30.
  • FIGS. 5a to 6b it is above the measuring electrodes 20 and 30 which sensor surfaces 21 and 31 ha ben, each applied a hydrogel layer 35, in which capture molecules 100 for target molecules 200, which are located outside the hydrogel layer 35, are enclosed. It is essential that the capture molecules 100 capture or bind the target molecules 200 and thus conduct the analysis on the sensor surface 21 or 31.
  • this methodology reference is made, for example, to the applicant's earlier application PCT / DE 02/01982.
  • the capture molecules 100 can be, for example, special thiol-modified oligonucleotides.
  • Target molecules 200 that are to be bound by the capture molecules 100 are the DNAs to be analyzed.
  • DNA enrichment is achieved. Good measurement results can be achieved in this state.
  • DNA fragments 200 which are not completely complementary also bind to the catcher DNA in addition to the complementary target DNA 200.
  • a stringency treatment selectively removes unspecifically bound DNA by applying suitable potentials to the electrodes. The non-specifically bound DNA is then rejected due to its weaker binding forces.
  • auxiliary electrode 40 made of base metal, for example copper, is selected for this purpose and a positive potential is applied to the auxiliary electrode 40.
  • base metal for example copper
  • FIG. 7 The latter process is essentially illustrated by FIG. 7.
  • the copper ion brought into solution is complexed, for which histidine molecules 70 are used.
  • the measuring electrodes 20 30 and auxiliary electrodes 40, 45 are negatively polarized, the auxiliary electrodes positively. If the entire arrangement is in an aqueous solution which contains copper (II) ions (Cu 2+ ), these are reduced to metallic copper (Cu °) on the measuring electrodes 20, 30. This creates a field gradient and the negatively charged, not completely complementary DNA is rejected.
  • Target molecules are enriched and then selected. However, only one selection can be made.
  • FIGS. 2 to 4 Different variants of sensor arrangements are shown in FIGS. 2 to 4.
  • the measuring electrodes 20, 30 formed from gold have free gold sensor surfaces 21,
  • FIG. 4 An arrangement is shown specifically in FIG. 4, in which, in addition to the actual measuring electrodes 20 and 30, there is also a free reaction surface 50 made of gold, to which the capture DNA 100 are bound in a dense arrangement. This has the advantage of a high density of Capture DNA.
  • the measuring electrodes 20, 30 must first be covered by copper or the like in order to prevent the capture DNA 100 from being deposited there.
  • copper layers 22 and 32 are present in FIG. In all arrangements according to FIGS.
  • the sacrificial electrode 40 is arranged in the vicinity of the measuring electrodes 20 and 30 in order to build up the field gradient by dissolving copper and thus the enrichment of the target DNA 200 in the vicinity of the measuring electrodes 20 and 30 to effect. As a result, the measurement accuracy can be significantly improved.
  • FIGS. 8 to 10 show the different variants of measuring sensors according to FIGS. 2 to 4 in a top view.
  • a measuring sensor 80 which consists of two comb electrodes 82 and 83 with interdigitated electrode fingers, a single sacrificial electrode 84 being arranged in a ring around the comb electrodes.
  • Arrays having n rows and m columns can be designed from the individual sensors according to FIGS. 8 to 10. From Figures 11 and 12 is a complete arrangement with a
  • each individual position has a ring-like copper sacrificial anode 84.
  • the auxiliary electrode 185 is arranged as a further ring around the entire mn arrangement with the individual positions.
  • the complete arrangement 180 is located in a container, for example a flow channel 150, with a cover 120, an inflow 121 and an outflow 122.

Abstract

Zur Schaffung eines DNA-Sensors müssen elektrisch geladene Moleküle transportiert werden. Gemäss der Erfindung erfolgen folgende Massnahmen: Es werden unedle Metalle als positives Ion in Lösung gebracht, wodurch negativ geladene Moleküle in die entgegengesetzte Richtung transportiert und in der Nähe der Messelektroden angereichert werden. Durch Ausbildung von Metallschichten auf den Messelektroden durch Anlagern der Metallionen aus der Lösung lässt sich bei Vorgabe eines geeigneten Potenzials eine bindungsspezifische Trennung der geladenen Moleküle erreichen. Insbesondere können somit Ziel-DNA in die Nähe von Fänger-Molekülen an den Messelektroden gebracht und auch unspezifisch gebundene DNA entfernt werden. Bei der zugehörigen Vorrichtung ist der Elektrodenanordnung (20, 30) eine Opferanode (40) aus unedlerem Metall als das Material der Messelektroden (20, 30) zugeordnet. Die Messelektroden (20, 30) bestehen insbesondere aus Edelmetall, vorzugsweise Gold, und die Opferanode (40) aus Kupfer.

Description

i Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zum Transport bzw. zur bindungspezifischen Trennung elektrisch geladener Moleküle
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transport bzw. zur bindungspezifischen Trennung elektrisch geladener Moleküle in einer wässrigen Lösung, insbesondere beim Betrieb eines DNA-Sensors mit einem Redox-Cycling-Prozess zwischen zwei Messelektroden. Daneben bezieht sich die Erfindung auf die zugehörigen Vorrichtungen.
Bei zahlreichen Verfahren der Molekularbiologie spielt der
Transport von geladenen Teilchen im elektrischen Feld (Migration) eine wichtige Rolle. Die Wanderungsgeschwindigkeit v der geladenen Teilchen im flüssigen Medium ist dabei proportional der Feldstärke E und der Ionenladung Q und umgekehrt proportional dem Teilchenradius r und der Viskosität η der Suspension. Es ergibt sich für die Geschwindigkeit v: v = QE/6πrη (1)
Bei der Elektrophorese z.B. werden Biomoleküle, d.h. vor allem Proteine und DNA, die sich bezüglich ihrer Größe und/ oder Ladung unterscheiden, voneinander getrennt. Die Anwesenheit von anderen beweglichen, geladenen Teilchen ist bei bestimmten Formen der elektrophoretischen Trennung (z.B. isoelektrische Fokussierung) zu vermeiden, da sonst der Ladungstransport teilweise oder ganz von diesen und nicht von den zu trennenden Molekülen übernommen wird. Als Puffer werden daher oft Aminosäuren verwendet, die ihren isoelektrischen Punkt beim gewünschten pH-Wert haben. Das heißt, beim eingestellten pH-Wert haben die Puffermoleküle selbst keine Nettoladung und unterliegen daher nicht der Migration. Auch beim Transport von geladenen Molekülen, z.B. um die Konzentration an einem bestimmten Ort zu erhöhen oder zu erniedrigen, werden elektrische Felder eingesetzt. Insbesondere bei Mikrosensoren, z.B. zur DNA-Analyse, kann die Empfindlichkeit gesteigert werden, wenn die zu detektierenden DNA-Fragmente (Zielmoleküle) am Ort der Fängermoleküle (Sensoroberfläche) konzentriert werden. Gemäß dem Massenwirkungsgesetz steigt damit die Zahl der Fänger-/Zielmolekülbindungen. In jedem Fall werden bei einer solchen Reaktion aber nicht nur Fänger- /Zielmolekülpaare gebildet, die exakt zueinander passen, sondern auch solche, deren Sequenz an einigen Stellen nicht exakt miteinander korrespondieren (Mismatches) .
Da die Größe der Bindungsenergie mit der Zahl der nicht kor- respondierenden Basen abnimmt, können durch die Anwendung entsprechender Kräfte selektiv solche Bindungen wieder getrennt werden, die eine bestimmt Zahl von Mismatches besitzen (Stringenzbehandlung) . Als Kraft kann hier ein elektrisches Feld wirksam werden, das im Gegensatz zum ersten Prozess, dem Konzentrieren der Moleküle, eine entgegengesetzte Polarität aufweist.
Vorraussetzung für den Transport von geladenen Teilchen im elektrischen Feld ist ein Feldgradient, der innerhalb des Elektrolyten bzw. der Transportstrecke, streng monoton verläuft. Das heißt, der Feldgradient darf sein Vorzeichen nicht ändern und nicht zu Null werden. Das Anlegen einer beliebigen Spannung ist dazu für wässrige Systeme nicht zwangläufig ausreichend. In Abwesenheit einer chemischen Reaktion vor den Elektroden fällt die Spannung über die elektrochemische Doppelschicht ab und der Feldgradient zwischen den Elektroden wird zu Null. Wenn allerdings eine Reduktions- bzw. Oxidati- onsreaktion an den Elektroden stattfindet, wird die Doppelschicht vor den Elektroden depolarisiert und das elektrische Feld verläuft streng monoton innerhalb des Elektrolyten. Ein Ionentransport im wässrigen Elektrolyten ist die Folge. Ein häufig angewendetes Verfahren zur Erzeugung solcher elektrischer Felder in wässrigen Systemen ist das Anlegen der Zersetzungsspannung von Wasser. Dabei wird an der Anode Sauerstoff und an der Kathode Wasserstoff entwickelt. Bei der experimentelle Durchführung muss darauf geachtet werden, dass die Gase und insbesondere ihre radikalischen Vorstufen nicht mit den zu untersuchenden Molekülen in Kontakt kommen, da diese sonst chemisch verändert würden. In makroskopischen Systemen geschieht dies durch Trennung der Elektrolyträume direkt vor den Elektroden vom Elektrolytraum zwischen den Elektroden, z.B. durch Diaphragmen. Für Mikrosensoren ist diese Lösung problematisch, da Diaphragmen nicht praktikabel sind.
Eine Möglichkeit zur Elektrophorese in Mikrosystemen besteht darin, dass sogenannte Permeationslayer aus hydrophilem Polymer vor den Elektroden eingeführt werden, wozu auf die US 5 605 662 A verwiesen wird. Die Beweglichkeit von Reaktionsprodukten der Wasserelektrolyse und der zu transportieren- den DNA ist in dieser Schicht stark gehemmt, so dass eine
Durchmischung quasi nicht stattfindet. Der Ladungstransport im Permeationslayer wird von kleineren Ionen übernommen.
Obwohl das bekannte Verfahren praktikabel ist, wird durch die Einführung neuer Polymer-Schichten die Herstellung des Mikro- sensorschips deutlich aufwändiger und damit teurer.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein geeignetes Verfahren zum Transport der geladenen Moleküle mittels eines elektri- sehen Feldes anzugeben, bei denen an der Elektrode keine Wasserstoff- bzw. Sauerstoffentwicklung eintritt. Insbesondere soll unter Ausnutzung des Elektrophoreseverfahrens eine entsprechende Vorrichtung geschaffen werden, welche mit Standard-Materialien und Schichten der Chipherstellung auskommen.
Die Aufgabe ist bezüglich des Verfahrens durch die Merkmale alternativ des Patentanspruches 1 oder des Patentanspruches 12 gelöst. Eine zugehörige Vorrichtung ist im Patentanspruch 15 angegeben. Weiterbildungen des Verfahrens bzw. der Vorrichtung sind Gegenstand der jeweils abhängigen Ansprüche.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung können mit einem prinzipiell gleichen Aufbau fakultativ das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Patentanspruch 1 oder das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Patentanspruch 12 ausgeführt werden. Dabei ist es auch vorteilhafterweise möglich, beide Verfahren miteinan- der zu kombinieren, beispielsweise zyklisch.
Die Erfindung macht sich bei der Anwendung des Elektrophoreseverfahrens zunutze, dass zur Erzeugung des elektrischen Feldes in der Analytlösung außer der Elektrolyse von Wasser auch andere Reaktionen eingesetzt werden können. Gemäß der Erfindung wird ein Metall/Metallionkomplex, z.B. Kupfer/ Kupferhistidinkomplex, als Depolarisator vor den Elektroden vorgeschlagen. Bei positiver Polarisierung einer mit Kupfer beschichteten Elektrode zwecks Auf onzentrierung negativ ge- ladener Ionen wird dann nicht Sauerstoff entwickelt, statt dessen geht das Kupfer als Ion in Lösung. Ist dort ein Komplexbildner für das Metall, z.B. Histidin für Kupfer, vorhanden, so bleibt das Metallion stabil in Lösung. Da z.B. der Kufer-Histidin-Ko plex sehr stabil ist, bleibt die Konzentra- tion der freien Kupferionen sehr klein und nahezu konstant. Ein Einfluss der Kupferionen auf die DNA-Hybridisierung wird dadurch vermieden.
Soll die Elektrode negativ polarisiert werden, um z.B. die Selektivität der Fänger-/Zielmolekülbindung zu erhöhen
(Stringenzbehandlung) , d.h. unspezifisch gebundene, nichtkomplementäre Proben-DNA von der Fänger-DNA zu entfernen, werden bei Anwesenheit eines Metallionenkomplexes eines hinreichend edlen Metalls, z.B. Kupfer, die Metallionen redu- ziert und dabei auf den Elektroden (in diesem Fall den Mess- Elektroden) abgeschieden. Eine Wasserstoffentwicklung wird dadurch vermieden. Der Komplexbildner für das Metallion kann u.U. auch gleichzeitig als Puffer dienen. Histidin wird beispielsweise als Puffer bei pH = 7 eingesetzt. Das auf den Mess-Elektroden abgeschiedene Kupfer kann in einem Wasch- Schritt durch erneutes Anlegen von negativem Potenzial ent- fernt werden. Ein Abstoßen der Zielmoleküle wird dadurch verhindert, dass eine Waschlösung mit hoher Ionenstärke eingesetzt wird, so dass nur z.B. Kupfer in Form von Cu2+-Ionen entfernt wird, die Ziel-DNA jedoch nicht bewegt wird.
Der Vorteil eines auf Metall/Metallionkomplex basierenden Elektrophoreseverfahrens liegt in der geringeren Spannung, die zur Erzeugung des elektrischen Feldes notwendig ist. Sie ist niedriger als die Elektrolysespannung von Wasser, so dass die aggressiven Produkte der Wasserelektrolyse nicht entste- hen können. Damit wird eine Trennung von Elektrolyse- und
Elektrophoreseraum unnötig. Trotzdem reicht das erzeugte Feld aus, um die gewünschten Moleküle im Analyten zu transportieren.
Kupfer wird bereits heute für Leiterbahnen verwendet und kann künftig als Elektrodenmaterial für Sensoranwendungen bzw. mikrosystemtechnische Anwendungen wie Mikro-Elektrophorese eingesetzt werden. Bei der Herstellung eines solchen Mikro- systems kann daher auf kostengünstige Standardverfahren der Halbleitertechnik zurückgegriffen werden.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei- spielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentan- Sprüchen. Es zeigen
Figur 1 einen prinzipiellen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, Figuren 2 bis 4 Querschnitte unterschiedlich ausgebildeter Anordnungen , Figur 5a und 5b bei Anordnungen gemäß Figur 3 verfahrensmäßig das Anreichern von Zielmolekülen von geringer zu hoher Konzentration,
Figur βa und 6b verfahrensmäßig eine Situation gemäß Figur
5b, bei der jedoch auch unspezifische, d.h. nicht-komplementäre Proben-DNA vorliegen, die einer sogenannten Stringenz-Behandlung unterliegen,
Figur 7 den Elektroden-Prozess bei der erfindungsgemäßen Verwendung einer Opferelektrode, sowie eines Komplexbildners,
Figuren 8 bis 10 Draufsichten auf unterschiedliche Messelektroden-Konfigurationen
Figur 11 eine Messanordnung mit nebeneinander angeordneten Messpositionen im Querschnitt und
Figur 12 eine aus Einzelpositionen entsprechend der
Figur 8 gebildete Arrayanordnung in der Draufsicht .
Die Figuren werden teilweise gemeinsam beschrieben.
Aus Figur 1 ist der prinzipielle Aufbau einer allgemeinen Anordnung zur Durchführung von biochemischen Messungen ersichtlich. Mit 1 ist ein planares Substrat, z.B. aus Silicium, be- zeichnet, auf dem eine dünne Isolatorschicht 2, z.B. aus Si- liciumoxid (Si02) aufgebracht ist. Auf dieser Anordnung befinden sich zwei Messelektroden 20 und 30, die vorzugsweise aus Edelmetall, insbesondere Gold, bestehen. Die gesamte Messanordnung befindet sich in Kontakt mit einer wässrigen Lösung 15.
In der wässrigen Lösung 15 befinden sich negativ geladene Makro-Moleküle, was in Figur 1 durch die Knäuel-Struktur verdeutlicht wird, und die weiter unten in Figur 5 im Einzelnen mit 200, 200 λ beziffert sind. Die negativ geladenen Moleküle sollen zu den Messelektroden 20, 30 transportiert werden und werden nachfolgend auch als Zielmoleküle bezeichnet. Im Falle einer DNA-Analyse sind die Zielmoleküle die zu untersuchende DNA. Über Fängermoleküle, die z.B. in einer Hydrogelschicht 35 immobilisierbar sind, kann die Ziel-DNA zwecks Messung in der Nähe der Elektroden 20, 30 angelagert werden.
In der wässrigen Lösung 15 ist weiterhin ein Material vorhanden, das in der wässrigen Lösung beständig und unedler als das Metall der Messelektroden ist. Im allgemeinsten Fall ist das Material eine Metall/Metallion (Me/Me+) -Kombination, bei- spielsweise Cu/Cu2+. Dies bedeutet, dass entsprechend den vorgegebenen Potenzialverhältnissen entweder metallisches Kupfer Cu° unter Abgabe von zwei Elektronen aufgelöst wird oder Kupfer (II) -Ionen Cu2+ unter Aufnahme von zwei Elektronen abgeschieden werden können, wobei gilt:
Cu° > Cu+++ 2e (2)
Bei der Anordnung gemäß Figur 5 kann bei einer Kupferelektrode als Opfer-Anode 40 durch Anlegen eines positiven Potenzi- als Cu2+ in Lösung gehen. Dadurch werden dort die negativen Zielmoleküle 200 zur Kupferelektrode 40 bewegt und reichern sich in deren Nähe und damit auch im Bereich der Messelektroden 20, 30 an.
Sofern bei Anwesenheit von Cu2+-Ionen in der wässrigen Lösung an die Messelektroden 20,30 gemäß Figur 6ein geeignetes negatives Potenzial angelegt wird, lösen sich diejenigen Fängermolekül/Ziel-DNA-Bindungen, die aufgrund nicht vollständiger Komplementär!tat eine verminderte Bindungsstärke aufweisen. Dabei werden gleichzeitig Kupfer (II) -Ionen (Cu2+) an den Messelektroden zu metallischem Kupfer (Cu°) reduziert.
Anhand der Figuren 5a, 5b einerseits und 6a, 6b andererseits sowie Figur 7 werden die methodischen Prozesse gemäß den in Figur 1 nur prinzipiell aufgezeigten Alternativen verdeutlicht. Speziell in den Figuren 5a bis 6b ist über den Messelektroden 20 und 30, welche Sensoroberflächen 21 und 31 ha- ben, jeweils eine Hydrogelschicht 35 aufgebracht, in welcher Fängermoleküle 100 für Zielmoleküle 200, die sich außerhalb der Hydrogelschicht 35 befinden, eingeschlossen sind. Wesentlich ist dabei, dass die Fängermoleküle 100 die Zielmoleküle 200 einfangen bzw. binden und damit der Analyse an der Sensorfläche 21 bzw. 31 zuführen. Zu dieser Methodik wird beispielsweise auf die ältere Anmeldung PCT/DE 02/01982 der Anmelderin verwiesen.
Die Fänger-Moleküle 100 können beispielsweise spezielle thi- olmodifizierte Oligonukleotide sein. Ziel-Moleküle 200, die von den Fänger-Molekülen 100 gebunden werden sollen, sind die zu analysierenden DNA's.
Im Allgemeinen liegt bei einer bekannten Messanordnung ein Zustand gemäß Figur 5a vor, bei dem die Ziel-DNA nur in geringer Konzentration über der Fänger-DNA vorliegt. Hier ist es schwierig, zu sicheren Messergebnissen zu kommen. Bei einer Anordnung gemäß Figur 5b liegt dagegen die Ziel-DNA in hoher Konzentration über der Fänger-DNA vor, was durch eine
DNA-Anreicherung erreicht wird. In diesem Zustand können gute Messergebnisse erzielt werden.
An der Fänger-DNA binden entsprechend der Figur 6a außer der komplementären Ziel-DNA 200 auch nicht vollständig komplementäre DNA-Fragmente 200 . Durch eine Stringenz-Behandlung lässt sich unspezifisch gebundene DNA durch Beaufschlagen der Elektroden mit jeweils geeigneten Potentialen selektiv entfernen. Die unspezifisch gebundene DNA wird dann aufgrund ih- rer schwächeren Bindungskräfte abgestoßen.
Aus der Figur 1 sowie den Teilfiguren 5a und 5b ist ersichtlich, dass durch Anlegen spezifischer Potenziale an die Hilfselektrode 40 eine gewünschte Anreicherung der Ziel-DNA erreicht wird. Im Einzelnen wird dazu eine Hilfselektrode 40 aus unedlem Metall, beispielsweise Kupfer, gewählt und an die Hilfselektrode 40 ein positives Potential angelegt. Sofern sich die gesamte Anordnung in einer wässrigen Lösung befindet, gehen Cu2+-Ionen in Lösung. Dadurch entsteht ein Feldgradient und die negativ geladenen DNA-Moleküle werden angezogen.
Letzterer Prozess wird im Wesentlichen durch Figur 7 verdeutlicht. Insbesondere ist hier ersichtlich, dass das in Lösung gebrachte Kupfer-Ion komplexiert wird, wozu Histidin-Moleküle 70 verwendet werden.
Aus der Figur 1 sowie den Teilfiguren 6a und 6b ist ersichtlich, dass durch Anlegen spezifischer Potenziale an die Messelektroden 20 30 und Hilfselektroden 40, 45 eine gewünschte Selektion der DNA erreicht wird. Im Einzelnen werden die Messelektroden negativ, die Hilfselektroden positiv polarisiert. Sofern sich die gesamte Anordnung in einer wässrigen Lösung befindet, die Kupfer (II) -Ionen (Cu2+) enthält, werden diese auf den Messelektroden 20,30 zu metallischem Kupfer (Cu°) reduziert. Dadurch entsteht ein Feldgradient und die negativ geladene, nicht vollständig komplementäre DNA wird abgestoßen.
Beide Alternativen können separat oder aber kombiniert ablaufen. Zunächst werden Zielmoleküle angereichert und dann se- lektiert. Es kann aber auch nur eine Selektion vorgenommen werde .
In den Figuren 2 bis 4 sind unterschiedliche Varianten von Sensoranordnungen dargestellt. In Figur 2 haben die aus Gold gebildeten Messelektroden 20, 30 freie Gold-Sensorflächen 21,
31, an die die Fänger-DNA 100 gebunden sind. Alternativ ist in Figur 3 ein Hydrogel 35 vorhanden, welches Fänger-DNA 100 enthält. Speziell in Figur 4 ist eine Anordnung dargestellt, bei der neben den eigentlichen Messelektroden 20 und 30 wei- terhin eine freie Reaktionsfläche 50 aus Gold vorhanden ist, an welcher die Fänger-DNA 100 in einer dichten Anordnung gebunden sind. Dies hat den Vorteil einer großen Dichte von Fänger-DNA. Allerdings müssen bei der Herstellung der Reaktionsfläche 50 zunächst die Messelektroden 20, 30 durch Kupfer oder dergleichen abgedeckt werden, , um dort eine Anlagerung der Fänger-DNA 100 zu verhindern. In Figur 4 sind dafür Kup- fer-Schichten 22 bzw. 32 vorhanden. Bei allen Anordnungen gemäß den Figuren 2 bis 4 ist jeweils die Opferelektrode 40 in der Nähe der Messelektroden 20 und 30 angeordnet, um durch das Inlösunggehen von Kupfer den Feldgradienten aufzubauen und damit die Anreicherung der Ziel-DNA 200 in der Nähe der Messelektroden 20 und 30 zu bewirken. Im Ergebnis kann somit die Messgenauigkeit erheblich verbessert werden.
In den Figuren 8 bis 10 sind die verschiedene Varianten von Messsensoren gemäß den Figuren 2 bis 4 in der Draufsicht dar- gestellt. Speziell in Figur 8 ist ein Messsensor 80 vorhanden, der aus zwei Kammelektroden 82 und 83 mit ineinander greifenden Elektrodenfingern besteht, wobei eine einzige Opferelektrode 84 ringartig um die Kammelektroden angeordnet sind.
Entsprechendes ergibt sich aus Figur 9, wobei hier der Bereich der Kammelektroden mit der Hydrogelschicht 85 abgedeckt ist. Eine derartige Hydrogelschicht kann sich über der gesamte Messanordnung befinden. Speziell in Figur 10 sind zusätz- lieh noch Reaktionsflächen 86 zum Anlagern von Fängermolekülen vorhanden.
Aus den Einzelsensoren gemäß den Figuren 8 bis 10 können Ar- rays konzipiert werden, die n-Zeilen und m-Spalten haben. Aus den Figuren 11 und 12 ist eine Komplettanordnung mit einer
Vielzahl von Messsensoren 80, 80v,... die das n-m-Array darstellen. Dabei ist es prinzipiell möglich, das Array mit Einzelpositionen entsprechend einer der Figuren 8 bis 10 aufzubauen, bei der jede Einzelposition eine ringartige Kupfer- Opferanode 84 hat. Um die gesamte m-n-Anordnung mit den Einzelpositionen ist dabei als weiterer Ring die Hilfselektrode 185 angeordnet . Gemäß Figur 11 befindet sich die Komplettanordnung 180 in einem Behälter, z.B. einem Durchflusskanal 150, mit einem Deckel 120, einem Zufluss 121 und einem Abfluss 122.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Transport elektrisch geladener Moleküle in einer wässrigen Lösung, insbesondere beim Betrieb eines DNA- Sensors mit einem Redox-Cycling-Prozess zwischen zwei Messelektroden, g e k e n n z e i c h n e t durch folgende Maßnahmen: in der Nähe der Messelektroden wird ein metallisches Material, das im wässrigen Elektrolyten beständig und unedler als das der Messelektrode ist, als potenzialbeaufschlagbare Elektrode angeordnet, durch Anlegen eines positiven Potenzials an die Elektrode wird das metallische Material als positiv Ionen in Lösung gebracht, - wodurch negativ geladene Moleküle als Zielmoleküle in die entgegengesetzte Richtung transportiert und an den Messelektroden angereichert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n - z e i c h n e t , dass die in Lösung gehende Metallionen durch die Anwesenheit eines Komplexbildners komplexiert werden, wodurch ihre Konzentration gering und nahezu konstant gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass als metallisches Material Kupfer verwendet wird, welches eine Kupfer-Opfer-Anode bildet.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, d a du r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass als Komplexbildner zur Kom- plexierung des Kupfer-Ions Histidin verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a - d u r c h k e n n z e i c h n e t , dass zum Detektieren der Zielmoleküle Fängermoleküle an einer Elektrodenoberfläche verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, d a du r c h g e k e nn z e i c h n e t , dass als Fängermoleküle thiolmodifizierte Fängermoleküle verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass als Fängermoleküle hydrogelgebundene Fängermoleküle verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass ein Elektrophoreseverfahren ausgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruch, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass eine DNA- Analyse von DNA-Fragmenten erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass bei der DNA-Analyse die an- gereicherten Moleküle als Zielmoleküle detektiert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, d a du r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass durch Polarisation der für die Elektrophorese bzw. DNA- nalyse verwendeten Elektroden die Selektivität des Prozesses erhöht wird.
12. Verfahren zur bindungsspezifischen Trennung elektrisch geladener Moleküle in einer wässrigen Lösung, insbesondere beim Betrieb eines DNA-Sensors mit einem Redox-Cycling-Pro- zess zwischen zwei Messelektroden, g e k e n n z e i c h e t durch folgende Maßnahmen: in der wässrigen Lösung befinden sich Metallionen durch Anlegen eines negativen Potenzials an die Messelektroden wird das Metallion an den Messelektroden als Metall abgeschieden,
- wodurch negativ geladene, in der Nähe der Messelektroden gebundene Moleküle als Zielmoleküle mit einer hinreichend niedrigen Bindungsenergie von den Messelektroden wegtransportiert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass als Metallionen Kupfer und als Messelektroden Gold verwendet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die von den Messelektroden wegtransportierten Moleküle solche Zielmoleküle sind, die bei der DNA-Analyse nicht detektiert werden sollen.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 10 bzw. zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12 oder einem der Ansprüche 13, 14, mit einer Anordnung aus Mess-Elektroden (20, 30) zur elektrochemischen Messung in einer wässrigen Lösung (15) , wobei in der wässrigen Lösung Metallionen bzw. Häufungen (40) von Metall aus unedlerem Material als das der Messelektroden (20, 30), wobei das Material in wässriger Lösung (15) beständig ist, vorhanden sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Messelektroden (20, 30) aus Edelmetall, insbesondere Gold, bestehen.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Metall Kupfer ist und eine Opferelektrode (40) bildet.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Messelektroden aus Gold eine Sensoroberfläche (21, 31) aufweisen, an der Fängermoleküle für die Ziel-DNA (200) gebunden sind.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 18 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Messelektroden (20, 30) eine Interdigitalstruktur aus Kammelektroden (82, 83) mit ineinander greifenden Elektrodenfingern bilden.
20. Vorrichtung nach Anspruch 17, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Opferelektrode (84) ringartig um die Kammelektroden (82, 83) angeordnet ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 15, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass auf den Messelektroden (20, 30) eine Hydrogelschicht (35) zum Binden der Fängermoleküle (100) angeordnet ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 15, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass den Messelektroden (20, 30) separate Reaktionsflächen (50) zum Anlagern der Fängermoleküle (100) zugeordnet ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 19, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass von einzelnen Interdigital- strukturen (80, 80 , ...) mit Opferelektrode (84) ein Array (80) mit m Zeilen und n Spalten gebildet ist.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass eine Hilfselektrode (185) zu den einzelnen Operelektroden (84) ringartig um das m-n-Array (180) verläuft.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5157806B2 (ja) * 2008-10-08 2013-03-06 富士通株式会社 電解溶液中の作用電極電位印加方法および作用電極の電位制御装置
US9604765B2 (en) 2013-03-14 2017-03-28 Ahhmigo, Llc Locking cap device and methods
CN109084856B (zh) * 2018-07-19 2021-06-04 中国神华能源股份有限公司 开式循环水系统的流量测定方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4589958A (en) * 1983-04-13 1986-05-20 Unisearch Limited Method of potentiometric detection of copper-complexing agents
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002063041A1 (en) * 2001-02-06 2002-08-15 Mitocon Ltd. Mixed intercalator and electrochemical detection of dna using same

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