DE112015003450B4

DE112015003450B4 - Vorrichtung und System für die Analyse von Biopolymeren

Info

Publication number: DE112015003450B4
Application number: DE112015003450.1T
Authority: DE
Inventors: Yusuke Goto; Takanobu Haga
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2024-05-02
Anticipated expiration: 2035-07-07
Also published as: JP2016057263A; GB2549187A; CN106605141B; JP6259741B2; US11275074B2; GB201703320D0; GB2549187B; DE112015003450T5; CN106605141A; WO2016038998A1; US20180217123A1

Abstract

Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109), mitzwei Wannen (101a, 101b), in denen ein Biopolymer (109) und eine Lösung (102), die ein Elektrolyt beinhaltet, aufbewahrt werden,einem Paar Elektroden (105a, 105b), die jeweils an den beiden Wannen (101a, 101b) angeordnet sind,einem Dünnfilm (104), der eine Nanopore (106) aufweist und zwischen den beiden Wannen (101a, 101b) so angeordnet ist, dass die beiden Wannen (101a, 101b) über die Nanopore (106) in Kontakt stehen, undeinem auf dem Dünnfilm (104) angeordneten dreidimensionalen Strukturkörper (103), der aus mehreren Partikeln (111) gebildet ist, die auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe (110) aufweisen, die das Biopolymer (109) adsorbieren kann,wobeider dreidimensionale Strukturkörper (103) einen Hohlraum (108) aufweist,der Hohlraum (108) einen Strömungsweg (112) bildet, der die Lösung (102) von der Nanopore (106) bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper (103) führt und die Oberfläche des Strömungsweges (112) die funktionelle Gruppe (110) aufweist, die das Biopolymer (109) adsorbieren kann,dadurch gekennzeichnet, dassder aus den mehreren Partikeln (111) gebildete dreidimensionale Strukturkörper (103) dadurch hergestellt ist, dass nach dem Auftragen der in einem Lösungsmittel dispergierten Partikel (111) auf den Dünnfilm (104) nur das Lösungsmittel thermisch verdampft wird, wobei durch geeignete Auswahl der Materialeigenschaften der Partikel (111) dabei die jeweiligen Partikel (111) nicht-sphärisch verformt werden, und, wenn an das Paar Elektroden (105a, 105b) eine Spannung angelegt wird, der dreidimensionale Strukturkörper (103) in der Lösung (102) nicht redispergiert.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Analyse von Biopolymeren mittels Poren, die in einen Dünnfilm eingebettet sind, insbesondere ein Verfahren für die Analyse von DNA und Proteinen.
Technischer Hintergrund
Wenn ein Molekül eines Biopolymers eine in einen Dünnfilm einer Dicke von etwa mehreren Å bis mehreren Dutzend nm eingebettete Pore mit einem Durchmesser von etwa 0,9 nm bis einigen nm (im Folgenden als Nanopore bezeichnet) passiert, verändern sich entsprechend dem Muster der Monomersequenzen des Biopolymers die elektrischen Eigenschaften in der Umgebung der Nanopore musterförmig. Dies nutzend, sind in den letzten Jahren intensiv Verfahren für die Durchführung einer Analyse von Monomersequenzen eines Biopolymers erforscht. Nanoporen werden häufig in der Form verwendet, in der eine elektrolythaltige Lösung auf beiden Seiten eines Dünnfilms vorgesehen wird. Indem an die Ober- und Unterseite des Dünnfilms eine Spannung angelegt und eine Potentialdifferenz erzeugt wird, ist es möglich, dass die elektrolythaltige Lösung die Nanopore passiert. Als höchst vielversprechend erweist sich dabei ein Verfahren, wobei sich auf den zu diesem Zeitpunkt entstehenden Ionenstrom als elektrische Eigenschaft konzentrierend, es sich um das Prinzip handelt, in dem die Änderungsmenge des Ionenstroms, der zu beobachten ist, wenn das Biopolymer die Nanopore passiert, je nach Art des Monomers verschieden ist (2). Abgesehen von dem Ionenstrom, ist ein Verfahren allgemein bekannt, wobei es sich um das Prinzip handelt, in dem an dem Nanoporenteil ein Elektrodenpaar gebildet und der zwischen den Elektroden fließende Tunnelstrom nutzend, die Tunnelstromgröße, die zu beobachten ist, wenn das Biopolymer die Nanopore passiert, je nach Art des Monomers verschieden ist. Bei beiden Verfahren kann das Biopolymer direkt ausgelesen werden, ohne dass wie bisher eine chemische Behandlung, die eine Fragmentierung des Biopolymers mit sich bringt, erforderlich ist. Erwartet wird jeweils ein System, bei dem es sich um ein Analysesystem der Basensequenzen der DNA der nächsten Generation handelt, wenn das Biopolymer eine DNA ist, und ein System, bei dem es sich um ein Analysesystem der Aminosäuresequenzen handelt, wenn das Biopolymer ein Protein ist, als ein System, das erheblich längere Sequenzlängen auslesen kann als bisher.
Es gibt zwei Arten von Nanoporenvorrichtungen: Bioporen mittels Proteinen, die in eine Lipiddoppelschicht eingebettet sind und im Zentrum Poren aufweisen, und solide Poren, bei denen in einem mittels eines Halbleiterbearbeitungsprozesses gebildeten Isolationsdünnfilm Poren eingearbeitet werden. Bei Bioporen wird die Änderungsmenge des Ionenstroms mit den Poren (Durchmesser 1,2 nm, Dicke 0,6 nm) von in eine Lipiddoppelschicht eingebetteten rekombinanten Proteinen (Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) usw.) als Biopolymer-Nachweisteilen gemessen. Da jedoch diese Dicke der Poren größer ist als eine Moleküleinheit der Monomere (der Abstand angrenzender Nukleinsäuren, bei denen es sich um die Monomere der DNA handelt, beträgt 0,34 nm), werden in der Änderungsmenge des Ionenstroms die Informationen mehrerer Moleküle der Monomere vermischt. Zusätzlich zu diesem Mangel an Raumauflösung wird aufgrund der Nutzung der Proteine durch die Lösungsbedingungen und Milieubedingungen das Porenteil der Proteine denaturiert, sodass die Vorrichtung degeneriert. Unter dem Aspekt der Stabilität und Lebensdauer besteht daher das Problem einer geringen Robustheit der Vorrichtung. Andererseits kann bei der soliden Pore ein Dünnfilm aus einer monomolekularen Schicht wie Graphenen oder Molybdändisulfid gebildet werden. Mit der Dicke von diesen kann eine zum Auslesen einer Moleküleinheit der Monomere hinreichende Raumauflösung sichergestellt werden. Anders als bei Proteinen, ist ferner das Material unter verschiedenen Lösungsbedingungen und Milieubedingungen stabil, sodass die Vorrichtung den Vorteil einer hohen Robustheit hat. Zusätzlich ist im Prozess der Halbleiterbearbeitung eine parallele Anordnung des Nanoporenteils möglich, sodass man sich hierauf aufgrund der vorstehenden Vorteile als bessere Vorrichtung als die Biopore konzentriert.
Als Mittel um die DNA-Kette, bei der es sich um das Biopolymer handelt, bis zur Nanopore zu transportieren, ist die Verwendung eines Verfahrens, bei dem die Potentialdifferenz, die den Ionenstrom erzeugt, so als Antriebskraft die Elektrophorese des Biopolymers bewirkt, am weitesten verbreitet. Wie in 3 dargestellt, kann jedoch nur ein Signalwert erzielt wird, bei dem die Signale mehrerer Moleküle der Monomere vermischt sind, da die Geschwindigkeit, mit der die DNA-Kette aufgrund der Elektrophorese die Nanopore passiert, ausgesprochen schnell ist, sodass zur Realisierung der Sequenzanalyse eine Technik erforderlich ist, mit der die Geschwindigkeit des Passierens verzögert wird. Konkret ist es bevorzugt, wenn die Geschwindigkeit des Passierens bis 100 µs/l Moleküleinheit der Monomere oder mehr verzögert werden kann, während tatsächlich die Geschwindigkeit des Passierens 0,01 bis 1 µs/l Moleküleinheit der Monomere beträgt, sodass die Realisierung einer Verzögerung der Geschwindigkeit um mindestens das etwa 100-fache bis 10.000-fache erforderlich ist. Wenn eine solche Verzögerung der Geschwindigkeit des Passierens gelingt, ist das Erzielen des Signals nur eines Moleküls der Monomere möglich.
Um diese Aufgabe zu lösen, wurden verschiedene Ansätze vorgeschlagen. Verschiedene Arten von Verfahren zur Modifizierung der Eigenschaften der Materie der Lösung wurden untersucht, wobei z. B. ein Verfahren zur Verzögerung der Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore ausprobiert wurde, indem z. B. durch den Zusatz einer hohen Konzentration an Glycerin die Viskosität der Lösung gesteigert und die Reibungskraft in der zu der Zugkraft der DNA-Kette bei der Elektrophorese entgegengesetzten Richtung vergrößert wird (Nichtpatentliteratur 1). Ferner wurde ein Verfahren zur Verzögerung der Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore nachgewiesen, bei dem in die Lösung Lithiumionen zugesetzt werden, wodurch die negative elektrische Ladung der DNA-Kette dem Anschein nach reduziert und dadurch die Zugkraft bei der Elektrophorese verkleinert wird (Nichtpatentliteratur 2).
Abgesehen von dem Verfahren zur Modifizierung der Eigenschaften der Materie der Lösung, wurden auch Verfahren zur Ausbildung auf Seiten der Vorrichtung untersucht. Es wurde z. B. ein Verfahren zur Ausbildung der Nanopore selbst nachgewiesen. Als einfaches Verfahren ist ein Verfahren zur Verzögerung der Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore bekannt, bei dem der Durchmesser der Nanopore verkleinert wird, sodass die Reibungskraft zunimmt, wenn die DNA-Kette die Nanopore passiert (Nichtpatentliteratur 3). Ferner wurde ein Verfahren untersucht, bei dem an der Vorrichtung ein neues Strukturteil angeordnet wird. In der Patentliteratur 1 ist ein Verfahren offenbart, bei dem bei einer Nanoporenvorrichtung, die aus einem zweidimensionalen Strömungsweg besteht, Hindernisse einer zweidimensionalen Form errichtet werden. In der vorstehenden Patentliteratur 1 ist eine Struktur offenbart, bei der auf beiden Seiten eines Dünnfilms, in dem die Nanopore gefertigt wurde, ein Cluster von Nano-Hindernissen (z. B. Säulen) in regelmäßigen Abständen beabstandet angeordnet wird. Als ein anderes Beispiel für ein Hindernis ist ein Gelmaterial offenbart, das aus einem Polymer oder Harz, einer anorganischen porösen Substanz oder Perlen besteht. Es wurde erwähnt, dass bei der Elektrophorese das Biopolymer mit dem Hindernis zusammenstößt, und Reibungskräfte in einer die Phorese behindernden Richtung somit entstehen, sodass die Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore reduziert wird. In der Nichtpatentliteratur 4 ist eine Struktur offenbart, bei der als anderes Mittel zur Realisierung eines Hindernisses auf der Oberlaufseite der Nanopore ein Nanodrahtcluster eines willkürlich mehrlagig aufgeschichteten Harzmaterials vorgesehen ist. Es wurde erwähnt, dass mit Hilfe von Reibungskräften aufgrund des Zusammenstoßens des Biopolymer mit dem Nanodraht bei der Elektrophorese die Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore reduziert wird.
Zitatliste
Patentliteratur
Patentliteratur 1: JP 2014-074599 A
Nichtpatentliteratur

Nichtpatentliteratur 1: D. Fologea, et al. Nano Lett., 2005, 5(9), 1734.
Nichtpatentliteratur 2: S. W. Kowalczyk, et al. Nano Lett., 2012, 12(2), 1038.
Nichtpatentliteratur 3: R. Akahori, et al. Nanotechnology, 2014, 25, 275501.
Nichtpatentliteratur 4: A. H. Squires, et al. J. A. C. S., 2013, 135(44), 16304.

Kurzfassung der Erfindung
Technisches Problem
Es besteht das Problem, dass die Verzögerungswirkung durch die herkömmlichen Verfahren unzureichend ist.
Bei dem vorstehenden Ansatz zur Modifizierung der durch die Viskosität repräsentierten Eigenschaften der Materie der Lösung, indem z. B. Glycerin zugesetzt wird, ist z. B. der Fall offenbart, bei dem der Gegenstand eine doppelsträngige DNA als Biopolymer ist, wobei vor und nach dem Zusetzen die Zeit des Passierens im besten Fall beschränkt ist auf eine etwa 5-fache Verzögerung. Da außerdem beim Passieren des Biopolymers gleichzeitig auch Additive passieren, verkleinert sich der Signalwertunterschied der Monomerklassifizierung für eine Moleküleinheit der Monomere, sodass es ferner das Problem gibt, dass eine Feststellung der Monomerart erschwert wird. Auch bei dem Verfahren des Zusatzes von Lithiumionen ist z. B. der Fall offenbart, bei dem der Gegenstand eine einsträngige DNA als Biopolymer ist, wobei vor und nach dem Zusetzen die Verzögerungswirkung etwa das 10-fache beträgt.
Bei dem herkömmlichen Verfahren, bei dem die Geschwindigkeit, mit der ein Biopolymer eine Nanopore passiert, mit Hilfe von Hindernissen verzögert wird, ist z. B. der Fall offenbart, bei dem der Gegenstand eine doppelsträngige DNA als Biopolymer ist, wobei die Verzögerungswirkung auf etwa das 15-fache beschränkt ist. Aus diesem Grund ist auch bei dem Ansatz mit dem Prinzip des Aufpralls des Biopolymers auf ein Hindernis die Verzögerungswirkung unzureichend.
Folglich gelingt mit keinem der Ansätze eine ausreichende Verzögerung der Geschwindigkeit, mit der ein Biopolymer eine Nanopore passiert, bis auf oder niedriger als eine Geschwindigkeit, bei der eine Sequenzanalyse der Monomere möglich wird, sodass der Wunsch nach der Entwicklung eines anderen Mittels besteht.
Die vorliegende Erfindung erfolgte angesichts des vorstehenden Problems und beabsichtigt die Bereitstellung eines Systems für die Analyse von Biopolymeren, bei dem durch die Einführung eines neuen Verzögerungsprinzips die Geschwindigkeit, mit der ein Biopolymer eine Nanopore passiert, in großem Umfang verzögert wird, sodass die Sequenzanalyse von Monomeren in einem Biopolymer stabil durchgeführt werden kann.
Lösung des Problems
Eine stellvertretende Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren, die mit zwei Wannen, in denen ein Biopolymer und eine Lösung, die ein Elektrolyt beinhaltet, aufbewahrt werden können, einem Paar Elektroden, die jeweils an den beiden Wannen angeordnet sind, einem Dünnfilm, der eine Nanopore aufweist und zwischen den beiden Wannen so angeordnet ist, dass die beiden Wannen über die Nanopore in Kontakt stehen, und einem auf dem Dünnfilm angeordneten dreidimensionalen Strukturkörper ausgestattet ist, wobei der dreidimensionale Strukturkörper einen Hohlraum aufweist, der Hohlraum einen Strömungsweg bildet, der die Lösung von der Nanopore bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper führt, die Oberfläche des Strömungsweges eine funktionelle Gruppe aufweist, die das Biopolymer adsorbieren kann, und der dreidimensionale Strukturkörper in der Lösung zumindest im Bereich einer Hemisphäre mit der Nanopore im Zentrum und der Länge der Fänger des Biopolymers als Radius nicht redispergiert, wenn an das Paar Elektroden eine Spannung angelegt wird.
Bei der vorliegenden Beschreibung ist das Nicht-Redispergieren dadurch definiert, dass sich unter der Bedingung eines Kontakts mit der Lösung kein Teil des dreidimensionalen Strukturkörpers z. B. aufgrund einer Solvatisierung, einer Brown'schen Bewegung oder einer Elektrophorese beim Anlegen einer Spannung ablöst.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Dadurch, dass gemäß der vorliegenden Erfindung auf der Oberfläche des Strömungsweges in dem dreidimensionalen Strukturkörper eine funktionelle Gruppe vorliegt, die das Biopolymer adsorbiert, wird für den Fall, dass sich das Biopolymer aufgrund der Elektrophorese oder eines Diffusionsphänomens bis in die Nähe der Oberfläche des Strömungsweges angenähert hat, das Biopolymer von der Oberfläche des Strömungsweges thermodynamisch adsorbiert. Es kommt zu dem Zustand des Adsorbierens, da das Biopolymer in der Lösung hinsichtlich der freien Energie stabiler ist als im Zustand der freien Diffusion durch die Solvatisierung oder Ionisierung. Die Adsorptionskraft wirkt zu diesem Zeitpunkt als in die entgegengesetzte Richtung zu der Zugkraft zu dem Biopolymer zum Zeitpunkt der Elektrophorese arbeitende Kraft. Die Stärke und Schwäche der Adsorptionskraft kann durch die Art der funktionellen Gruppe, mit der die Oberfläche des Strömungsweges modifiziert wurde, und das Einstellen der Lösungsbedingungen beliebig gesteuert werden, sodass die Geschwindigkeit, mit der das Biopolymer die Nanopore passiert, auf den Geschwindigkeitsbereich eingestellt werden kann, in dem eine Sequenzanalyse der Monomere möglich wird.
Ferner redispergiert der die Adsorptionskraft bereitstellende Strukturkörper selbst beim Anlegen einer Spannung nicht in der Lösung. Dadurch kann eine stabile Form des Strömungsweges aufrechterhalten werden, und die Bereitstellung einer Vorrichtung für die Analyse eines Biopolymers mit einer hohen Robustheit, die für verschiedene Lösungsbedingungen und Milieubedingungen geeignet ist, wird ermöglicht.
Aus der folgenden Erläuterung der Ausführungsformen ergeben sich die anderen Aufgaben, Strukturen und Wirkungen als den vorstehend beschriebenen.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen

1 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren zeigt.
2 ist eine konzeptionelle Darstellung eines Verfahrens zur Sequenzanalyse eines Biopolymers gemäß dem Prinzip, bei dem die Änderungsmenge des Ionenstroms sich je nach Art der Monomere ändert.
3 ist eine konzeptionelle Darstellung, die die Problematik aufgrund der zu hohen Geschwindigkeit, mit der das Biopolymer die Nanopore passiert, zeigt.
4 ist eine schematische Darstellung, die den Verlauf der Adsorption des Biopolymers zeigt.
5 ist eine erläuternde Darstellung der Fanglänge des Biopolymers.
6 ist eine schematische Darstellung eines Querschnitts in der Nähe der Nanopore, die eine andere Ausgestaltung einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren zeigt.
7 ist eine Darstellung des dreidimensionalen Strukturkörpers in der Vorrichtung aus der Vogelperspektive.
8 ist eine schematische Schrägansicht des Teils der Umgebung der Nanopore, der den dreidimensionalen Strukturkörper in der Vorrichtung zeigt.
9 ist ein schematischer Querschnitt des Teils der Umgebung der Nanopore, der den dreidimensionalen Strukturkörper in der Vorrichtung zeigt.
10 ist ein schematischer Querschnitt des Teils der Umgebung der Nanopore, in dem der Strömungsweg in dem dreidimensionalen Strukturkörper hervorgehoben dargestellt ist.
11 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
12 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
13 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
14 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
15 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
16 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
17 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
18 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
19 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
20 ist ein schematischer Querschnitt, der das Teil der Umgebung der Nanopore eines anderen dreidimensionalen Strukturkörpers zeigt.
21 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel eines Systems für die Analyse von Biopolymeren zeigt.
22 ist ein schematischer Querschnitt des Dünnfilms vor der Einbringung der Nanopore.
23 ist ein schematischer Querschnitt des Dünnfilms vor der Einbringung der Nanopore.
24 ist eine Darstellung, die ein Beispiel eines Analyseprotokolls zeigt, bei dem die Probengewinnung und die Verzögerung der Geschwindigkeit integriert wurden.
25 ist eine schematische Darstellung, die ein Analyseprotokolls zeigt, bei dem die Probengewinnung und die Verzögerung der Geschwindigkeit integriert wurden.
26 ist eine Darstellung eines typischen Beispiels für die Feststellung eines Biopolymers.

Beschreibung von Ausführungsformen
Im Folgenden werden anhand der Zeichnungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erläutert.
1 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die vorliegende Vorrichtung weist zwei Wannen 101a, 101b, in denen eine Lösung 102 aufbewahrt werden kann, einen Dünnfilm 104, der mit einer Nanopore 106 (konkret ab 5 angegeben) ausgestattet ist, einen dreidimensionalen Strukturkörper 103, der auf dem Dünnfilm angeordnet ist, und ein Paar Elektroden 105a, 105b auf. Die in den beiden Wannen aufbewahrte Lösung umfasst einen Elektrolyten, wobei es genügt, wenn die Lösung in zumindest einer der Wannen ein Biopolymer 109 umfasst. Der Dünnfilm 104 ist zwischen den beiden Wannen 101a, 101b so angeordnet, dass die beiden Wannen 101a, 101b über die Nanopore 106 in Kontakt stehen. Bevorzugt ist es dabei, wenn die beiden Wannen, wie in 1 dargestellt, mit Lösungseinfüllöffnungen 107a, 107b zum Einführen der Lösung ausgestattet sind. Wenn es keine Lösungseinfüllöffnungen gibt, ist es auch möglich, die Lösung von der Oberfläche der Vorrichtung einzuträufeln und im geöffneten Zustand die Messung des Biopolymers durchzuführen. Der dreidimensionale Strukturkörper ist mit einem Hohlraum 108 (konkret ab 7 angegeben) ausgestattet, wobei dieser Hohlraum zu einem Strömungsweg wird, der die Lösung von der Nanopore bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper führen kann. Wie in 4 dargestellt, ist die Oberfläche des Strömungsweges mit einer funktionellen Gruppe 110 ausgestattet, die das Biopolymer adsorbieren kann. Ferner weist der dreidimensionale Strukturkörper beim Anlegen einer Spannung im Bereich einer Hemisphäre mit der Nanopore als Zentrum eine in die Lösung nicht redispergierende, starre Charakteristik auf. Der Radius der Hemisphäre ist die wie folgt definierte Länge r der Fänger des Biopolymers.
$r = \frac{d^{2} μ}{8 LD} Δ V$

d:: Durchmesser der Nanopore
µ:: Mobilität der Elektrophorese des Biopolymers
L:: Dicke des Dünnfilms
D:: Diffusionskoeffizient des Biopolymers
ΔV:: zwischen den beiden Elektroden entstehende elektrische Spannungsdifferenz

Als Biopolymere handelt es sich um aus Nukleinsäuren als Monomere bestehende einsträngige DNA, zweisträngige DNA, RNA, Oligonuklotide usw. sowie aus Aminosäuren als Monomere bestehende Polypeptide usw. Beim Messen ist die Form eines unverzweigten Hochpolymers mit gelösten Strukturen einer höheren Ordnung bevorzugt. Im Folgenden wird die Form dargestellt für den Fall der Verwendung einer einsträngigen DNA als Biopolymer, wobei jedoch auch andere der vorstehenden Biopolymere verwendbar sind. Als Lösungsmittel der Lösung ist am bevorzugtesten Wasser, das das Biopolymer stabil auflösen kann. Beispiele für den in dem vorstehenden Lösungsmittel enthaltenen Elektrolyten schließen Kaliumionen, Natriumionen, Lithiumionen, Kalziumionen, Magnesiumionen, Fluorid-Ionen, Chloridionen, Bromidionen, Jodidionen, Schwefelsäureionen, Kohlensäureionen, Nitrationen, Ferrizyanid-Ionen, Ferrozyanid-Ionen usw. ein. Beispiele für das Material der Elektrode schließt Kohlenstoff, Gold, Platin, Silber-Silberchlorid usw. ein, wobei keine besondere Beschränkung besteht, solange es sich um eine Elektrode handelt, die für elektrochemische Messungen verwendet werden kann.
Als Nanopore 106 genügt eine minimale Größe mit einem Durchmesser von etwa 0,9 nm bis 10 nm, die eine einsträngige DNA passieren kann und bei der Dicke des Dünnfilms genügen etwa einige Å bis einige Dutzend nm. Als Material für den Dünnfilm genügt ein Material, das mittels einer Technologie zur Mikrobearbeitung von Halbleitern gestaltet werden kann, wobei es typischerweise genügt, wenn es sich um Siliziumnitrid, Siliziumdioxid, Hafniumoxid, Molibdändisulfid, Graphen usw. handelt. Die Nanopore kann durch die Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder durch das Verfahren zum Anlegen einer Impulsspannung gebildet werden. Solche Verfahren sind in der Literatur (M. Wanunu, Physics of Life Reviews, 2012, 9, 125.) und der Literatur (I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.) konkret offenbart.
Beispiele für die funktionelle Gruppe 110, die das Biopolymer adsorbieren kann, schließen z. B. für den Fall, dass es sich um den Gegenstand von DNA, RNA oder Oligonukliotide usw. handelt, Silanolgruppen ein. Es ist allgemein bekannt, dass Nukleinsäure durch die chaotrope Wirkung gegenüber Silanolgruppen adsorbiert wird, wobei ein stellvertretendes Beispiel mittels Glases, das auf der Oberfläche eine Silanolgruppe aufweist, in der Literatur (B. Volgenstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615.) konkret offenbart ist. Zur Derivation der Adsorbierung aufgrund der chaotropen Wirkung reicht es aus, wenn die wässrige Lösung Moleküle umfasst, die die chaotrope Wirkung herbeiführen. Bevorzugte Beispiele für die chaotrope Wirkung herbeiführende Moleküle sind z. B. Thiocyansäure-Ionen (SCN^-), Dihydrogenphosphat-Ionen (H₂PO₄ ^-), Schwefelwasserstoff-Ionen (HSO₄ ^-), Hydrogenkarbonat-Ionen (HCO₃ ^-), Jodid-Ionen (I^-), Chlorid-Ionen (Cl^-), Nitrat-Ionen (NO₃ ^-), Ammonium-Ionen (NH₄ ⁺), Cäsium-Ionen (Cs⁺), Kalium-Ionen (K⁺), Guanidin-Ionen und Tetramethylammonium-lonen. Es ist bekannt, dass die chaotrope Wirkung umso stärker hervortritt, je saurer die Bedingungen sind, wobei die Lösungsbedingungen bevorzugt zwischen einem pH-Wert von 1 oder mehr, bei dem die chaotrope Wirkung ausreichend hervorgetreten ist, und einem pH-Wert von 10 oder weniger, bei dem die chaotrope Wirkung hervorzutreten anfängt, eingestellt werden. Ferner ist bekannt, dass die chaotrope Wirkung umso stärker hervortritt, je mehr die Ionenintensität zunimmt, wobei für den Fall des Beispiels von Chlorid-Ionen die Lösungsbedingungen bevorzugt zwischen 10 mM oder mehr, bei dem die chaotrope Wirkung hervorzutreten anfängt, und der Ionenintensität einer gesättigten Kaliumchloridlösung (ca. 3,4 M) oder weniger, bei dem die chaotrope Wirkung ausreichend hervorgetreten ist, eingestellt werden. Diese Lösungsbedingungen sind z B. in der Literatur (P. E. Vandeventer, et al., J. Phys. Chem. B, 2012, 116(19), 5661.) angegeben.
Andere Beispiele für funktionelle Gruppen, die ein Biopolymer adsorbieren können, schließen funktionelle Gruppen ein, die zu Kationen ionisieren. Es ist bekannt, dass die Nukleinsäuren von z. B. DNA oder RNA dadurch, dass in der wässrigen Lösung eine negative Ladung vorliegt, durch die elektrostatische Wechselwirkung mit den positiv geladenen Kationmolekülen adsorbieren. Als Beispiele für zu Kationen ionisierende funktionelle Gruppen sind z. B. primäre Aminogruppen, sekundäre Aminogruppen, tertiäre Aminogruppen, quartäre Aminogruppen, Pyridingruppen, Iminogruppen, Imidazolgruppen, Pyrazolgruppen, Triazolgruppen bevorzugt. Es gibt verschiedene zu Kationen ionisierende funktionelle Gruppen, wobei es jedoch bevorzugt ist, wenn diese in der wässrigen Lösung eine stabile Form beibehalten, und außerdem keine chemische Reaktivität mit dem Biopolymer aufweisen. Wird eine zu Kationen ionisierende funktionelle Gruppe benutzt, ist es bevorzugt, wenn der pH-Wert der Lösung kleiner ist als der pKs-Wert der zu Kationen ionisierenden funktionellen Gruppe, sodass sie stabil zu Kationen ionisiert wird. Zum Beispiel liegt der pKs-Wert einer primären Aminogruppe im Bereich von 9 bis 11 vor, und der pKs-Wert von Ethylamin, bei dem es sich um ein stellvertretendes primäres Amin handelt, bei 10,5. Durch die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 10,5 oder weniger, wird daher Ethylamin vollständig zu Kationen ionisiert, sodass z. B. DNA sicher auf der Oberfläche des Strömungsweges adsorbiert werden kann.
Dadurch, dass die vorstehende Oberfläche des Strömungsweges mit der vorstehenden funktionellen Gruppe ausgestattet ist, wird für den Fall, dass sich das Biopolymer aufgrund der Elektrophorese oder eines Diffusionsphänomens, wie in 4 dargestellt, bis in die Nähe der Oberfläche des Strömungsweges angenähert hat, das Biopolymer von der Oberfläche des Strömungsweges thermodynamisch adsorbiert. Es kommt zu dem Zustand des Adsorbierens, da das Biopolymer in der Lösung hinsichtlich der freien Energie stabiler ist als im Zustand der freien Diffusion durch die Solvatisierung oder Ionisierung. Die Adsorptionskraft zu diesem Zeitpunkt wirkt als in die entgegengesetzte Richtung zu der Zugkraft zu dem Biopolymer zum Zeitpunkt der Elektrophorese arbeitende Kraft. Durch die Adsorptionskraft nimmt die Zugkraft zu dem Biopolymer zum Zeitpunkt der Elektrophorese ab, sodass eine Verzögerung der Geschwindigkeit beim Passieren der Nanopore möglich wird. Die Stärke und Schwäche der Adsorptionskraft kann durch die Art der funktionellen Gruppe, mit der die Oberfläche des Strömungsweges modifiziert wurde, und das Einstellen der Lösungsbedingungen beliebig gesteuert werden, sodass die Geschwindigkeit, mit der das Biopolymer die Nanopore passiert, auf den Geschwindigkeitsbereich leicht eingestellt werden kann, in dem eine Sequenzanalyse der Monomere möglich wird. Die Zugkraft zur DNA durch das in der Umgebung der Nanopore entstehende Potentialgefälle ist in der Literatur (U. F. Keyser, et al., Nature Physics, 2006, 2, 473.) konkret angegeben, wobei bekannt ist, dass diese 0,24 pN/mV beträgt. Bezüglich der Adsorptionskraft zu dem Biopolymer ist andererseits in der Literatur (F. Kühner, Langmuir, 2006, 22, 11180.) angegeben, dass z. B. gemäß einer Untersuchung mittels eines Rasterkraftmikroskops die Adsorptionskraft zu einer Silanolgruppe der DNA etwa 55 pN beträgt. Ferner ist in der Literatur (M. Erdmann, et al., Nature Nanotechnology, 2010, 5, 154.) angegeben, dass die Adsorptionskraft zu einer Kationengruppe (ionisierte primäre Aminogruppe) der DNA gemäß der gleichen Untersuchung etwa 200 pN beträgt. Durch das beliebige Einstellen der Zugkraft und der Adsorptionskraft ist es folglich möglich, die gewünschte Geschwindigkeit, mit der das Biopolymer die Nanopore passiert, zu realisieren.
Die Länge r der Fänger des Biopolymers ist der Wirkungsabstand, in dem das in der Nanoporenumgebung (Hemisphärenbereich des Radius r) entstehende Potentialgefälle als Antriebskraft, wie in 5 dargestellt, das Biopolymer in der Elektrophorese transportieren kann. Die Länge der Fänger des Biopolymers ist in Formel 1 definiert. In der Literatur (M. Wanunu, et al., Nature Nanotechnology, 2010, 5, 160.) ist die Länge der Fänger eines Biopolymers konkret offenbart. Zu dem Zeitpunkt, wenn sich das Biopolymer 109 im Diffusionsprozeß bis in die Nähe der Hemisphäre mit der Nanopore 106 im Zentrum und der Länge der Fänger des Biopolymers als Radius angenähert hat, entsteht bei dem Biopolymer aufgrund der Elektrophorese eine zur Nanopore gerichtete Zugkraft. Um die Geschwindigkeit des Passierens des Biopolymers zu verzögern, ist es daher erforderlich, dass in dem vorstehenden Bereich der Hemisphäre der vorstehende Strömungsweg vorliegt, der mit einer funktionellen Gruppe ausgestattet ist, die das Biopolymer adsorbieren kann. Außerdem ist es zur Realisierung einer stabilen Biopolymer-Feststellung erforderlich, dass beim Anlegen einer Spannung der vorstehende Strukturkörper in dem vorstehenden Bereich der Hemisphäre mit einer nicht in die Lösung redispergierenden Charakteristik ausgestattet ist. Anders herum, handelt es sich außerhalb des vorstehenden Bereichs der Hemisphäre um einen Bereich, der nicht zur Verzögerung der Geschwindigkeit des Biopolymers beiträgt, sodass eine Verbesserung, z. B. in einer Erhöhung der Fängereffizienz des Biopolymers möglich wird, indem man den Bereich des Strukturkörpers begrenzt, wie später erläutert wird.
Damit zumindest das Biopolymer passieren kann, ist es erforderlich, dass der minimale Wirkungsquerschnitt des vorstehenden Strömungsweges gleich dem oder größer als der Wirkungsquerschnitt der Moleküle des Biopolymers ist und der maximale Wirkungsquerschnitt des vorstehenden Strömungweges gleich dem maximalen oder kleiner als der maximale Wirkungsquerschnitt des Hohlraumabstands ist. In der Literatur (K. Venta, et al., ACS Nano, 2013, 7(5), 4629.) ist angegeben, dass der minimale Durchmesser einer Nanopore, die eine einsträngige DNA passieren kann, 0,9 nm beträgt. Folglich beträgt der Wirkungsquerschnitt der Moleküle in diesem Fall 0,81 nm². Damit das Biopolymer effektiv in die Oberfläche des Strömungsweges adsorbiert werden kann, ist es ferner bevorzugt, wenn der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges kleiner ist, als der durch den im in Formel 2 definierten mittleren freien Weglänge S (mit dem Abstand als Dimension) gebildete Wirkungsquerschnitt des Biopolymers.
$S = \sqrt{Dt}$
Dabei ist D der Diffusionskoeffizient des Biopolymers und t ist die mittlere Verweildauer in der Nähe der Nanopore.
Zum Beispiel ist in der Literatur (Q. Wang, et al., ACS Nano, 2011, 5(7), 5792.) angegeben, dass bei einer einsträngigen DNA (Poly-Thymin mit 30 Basen) der Diffusionskoeffizient 118 µm²/s beträgt, und in der Literatur (G. Ando, et al., ACS Nano, 2012, 6(11), 10090.) ist angegeben, dass die mittlere Verweildauer in der Nähe der Nanopore 700 ms beträgt. Gemäß Formel 2 beträgt der mittlere freie Weglänge einer einsträngigen DNA in diesem Fall 9 µm. Folglich beträgt vor dem Eintreten der einsträngigen DNA in die Nanopore der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges zum Adsorbieren zumindest einmal mit der funktionellen Gruppe 110 81 µm². In diesem Fall ist es daher bevorzugt, dass der Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges zwischen 0,81 nm² und 81 µm² liegt. Hierbei wurde ein Beispiel des bevorzugten Bereichs des Wirkungsquerschnitts für eine einsträngige DNA als Biopolymer angeführt. Der Bereich des Wirkungsquerschnitts verändert sich mit dem Biopolymer, den Ionenbestandteilen der Lösung, der Viskosität usw., sodass auch außerhalb des vorstehenden Bereichs die Wirkungen der vorliegenden Erfindung ausreichend erzielt werden können.
Als Obergrenze des Wirkungsquerschnitts des vorstehenden Strömungsweges ist noch bevorzugter die Fläche eines Kreises mit der Länge der Fänger des Biopolymers als Radius oder kleiner. Indem der Bereich des Strömungsweges, der das Biopolymer adsorbiert, auf innerhalb des Bereichs der Länge der Fänger des Biopolymers beschränkt wird, verbessert sich die Feststellungsfrequenz des Biopolymers, und eine Verkürzung der Analysedauer sowie eine Biopolymeranalyse einer geringen Konzentration wird möglich.
Handelt es sich bei dem festzustellenden Biopolymer um DNA, können dadurch, dass die Obergrenze des Wirkungsquerschnitts des vorstehenden Strömungsweges auf den oder kleiner als der Wirkungsquerschnitt der Moleküle von DNA-Polymerasen, DNA-Helicasen oder Exosomen (Größe: Einige nm bis einige dutzend nm) bestimmt wird, weitere Effekte erzielt werden. Bei aus tatsächlichen Proben extrahierter DNA besteht die Möglichkeit, dass vorstehende Proteine oder Strukturkörper anhaften oder als fremde Bestandteile vermischt sind. Wird die Analyse mittels Nanoporen durchgeführt, die kleiner als die Größe dieser Substanzen sind, kann es vorkommen, dass diese, wenn sie an der DNA anhaften, beim Passieren der DNA in der Nanopore steckenbleiben und die Analyse nicht fortgesetzt werden kann. Daher werden durch die Begrenzung des maximalen Wirkungsquerschnitts des vorstehenden Strömungsweges diese Substanzen ausgemustert, oder es kann nur DNA passieren, an der solche Substanzen nicht anhaften, wodurch bewirkt wird, dass eine reibungslose Analyse durchgeführt werden kann.
Ferner können dadurch, dass die Obergrenze des Wirkungsquerschnitts des vorstehenden Strömungsweges auf den oder unterhalb des Wirkungsquerschnitts einer Struktur höherer Ordnung der DNA eingestellt wird, die gleichen Wirkungen erzielt werden. Im Fall von DNA ist bekannt, dass z. B. aufeinanderfolgende Sequenzen von Guanin eine Struktur höherer Ordnung (Tetramer, Größe: zwischen 2,6 nm und 10 nm) bilden. Durch das Einstellen der vorstehenden Beschränkung kann daher dadurch, dass eine DNA, die Strukturen höherer Ordnung bildet, in unverzweigte Ketten geöffnet wird, oder nur DNA der Monomere durchgelassen wird, eine reibungslose Analyse durchgeführt werden.
6 ist eine schematische Darstellung des Querschnitts in der Nähe einer Nanopore, die eine andere Ausgestaltung einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt. 6 ist dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Nanoporen parallel angeordnet sind. Wie in 1 dargestellt, genügt für den Fall des Aufbaus einer Vorrichtung mittels nur einer einzelnen Nanopore, die Ausstattung mit einem dreidimensionalen Strukturkörper und einem Paar von zwei Elektroden für eine Nanopore. Andererseits ist es für den Fall der Verwendung als Vorrichtung, bei der, wie in 6 dargestellt, mehrere Nanoporen parallel angeordnet werden, erforderlich, dass für die jeweiligen Nanoporen 106 auf dem Dünnfilm 104, der die Nanopore aufweist, ein dreidimensionaler Strukturkörper 103 angeordnet wird. Dabei ist es von Vorteil, wenn die auf der einen Seite in die Lösung eingetauchte Elektrode (typischerweise geerdete Elektrode) 105a als gemeinsame Elektrode verwendet wird, und auf der anderen Seite der Lösung eine unabhängige Elektrode 105b für die jeweiligen Nanoporen vorgesehen werden. Erforderlich ist dabei, dass es sich bei der Lösung 102a auf der Seite der gemeinsamen Elektrode, um eine gemeinsame Lösung für die jeweiligen Nanoporen 106 handelt, und bei der Lösung 102b auf der gegenüberliegenden Seite der gemeinsamen Elektrode eine unabhängige Lösung für die jeweiligen Nanoporen 106 vorgesehen ist. Im Übrigen ist es bevorzugt, wenn es sich bei den Abtrennungen zur Sicherung der Unabhängigkeit der jeweiligen Lösungen um ein isolierendes Material handelt, wobei z. B. Polydimethylsiloxan, Siliziumdioxid usw. bevorzugt sind. Durch einen derartigen Aufbau kann eine unabhängige Analyse des Biopolymers durchgeführt werden, ohne dass die jeweiligen Nanoporen miteinander elektrochemisch interferieren, was dazu führt, dass der Durchsatz der Analyse des Biopolymers verbessert werden kann.
[Erstes Ausführungsbeispiel]
Als eine Ausgestaltung einer mit den vorstehenden Charakteristiken ausgestatteten, einen dreidimensionalen Strukturkörper realisierenden Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren, zeigt 7 eine das Teil der Umgebung der Nanopore von oben vertikal zu der Vorrichtung betrachtende Darstellung. Ferner ist 8 eine schematische Schrägansicht der an dem Querschnitt A von 7 durchtrennten Umgebung der Nanopore, und 9 ist eine schematische Darstellung des Querschnitts der Umgebung der Nanopore.
Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist dadurch gekennzeichnet, dass der dreidimensionale Strukturkörper eine Form auf, bei der auf einem Dünnfilm 104 mehrere Partikel 111 zu einer Schicht angehäuft sind. Dabei ist in 9 der schraffiert dargestellte Bereich der Querschnittteil der geformten Partikel, die an dem Querschnitt A durchtrennt wurden, und der grau dargestellte ringförmige Bereich ist ein Abschnitt der Partikel nach dem Formen, der auf der Rückseite des Hohlraums positioniert ist. Der Hohlraum 108 zwischen diesen Partikeln bildet einen Strömungsweg 112, den die Lösung, die das Biopolymer und den Elektrolyten beinhaltet, bis zur Nanopore passiert. In 10 ist der Strömungsweg 112 mit dicken Linien hervorgehoben dargestellt. Dabei entsteht das Potentialgefälle nur im Bereich einer Hemisphäre 113 mit der Nanopore 106 im Zentrum und der Länge r der Fänger des Biopolymers als Radius. Aus diesem Grund können von den vielen in dem Strukturkörper vorliegenden Hohlräumen nur die Hohlräume, die im Bereich der vorstehenden Hemisphäre 113 vorliegen und bis zur Nanopore 106 verkettet sind, zum vorstehenden Strömungsweg werden. Die Oberfläche der vorstehenden Partikel ist mit einer funktionellen Gruppe modifiziert, die das Biopolymer adsorbieren kann. Die vorstehenden mehreren Partikeln nach dem Formen nehmen eine nicht-sphärische Form an, sodass sie sich zumindest innerhalb des Bereichs der vorstehenden Hemisphäre beim Anlegen einer Spannung bei der Elektrophorese nicht von der Oberfläche des Dünnfilms ablösen und in die Lösung redispergieren. Ein Vorteil dieser Form besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, mit der das Biopolymer in die Oberfläche des vorstehenden Strömungsweges adsorbiert wird, erhöht werden kann. Dies liegt daran, dass durch das Formen des dreidimensionalen Strukturkörpers mit Partikeln, eine ausreichend große spezifische Oberfläche bereitgestellt werden kann. Je kleiner der durchschnittliche Durchmesser der Partikel gewählt wird, desto kleiner werden die Hohlräume, sodass die Wahrscheinlichkeit des Adsorbierens des Biopolymers erhöht werden kann. Andererseits steigt der Widerstandswert beim Passieren der Ionen, je kleiner die Hohlräume werden, sodass der erzielte Ionenstrom geringer wird und die Signalwerte an sich nicht mehr erzielt werden können. Daher stehen die Wahrscheinlichkeit des Adsorbierens des Biopolymers und der Widerstandswert in einer Wechselbeziehung zueinander. Der durchschnittliche Durchmesser der Partikel beträgt bevorzugt zwischen 10 nm und 1.000 nm. Im Übrigen besteht zwar die Möglichkeit, dass die Partikel die Nanoporen verschließen, da hierzu jedoch ein Punktkontakt der Partikel mit den Nanoporen nötig wäre, ist eine solche Wahrscheinlichkeit ausgesprochen gering, sodass dies praktisch kein Problem darstellt. Für den Fall, dass es eventuell eine Nanopore gibt, die durch ein Partikel verschlossen wurde, wird diese Nanopore für die Analyse nicht verwendet.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass eine Herstellung mittels Partikeln einfach ist. Ein aus Partikeln geformter dreidimensionaler Strukturkörper kann hergestellt werden, indem eine Lösung, in der die Partikel dispergiert sind, auf einen Dünnfilm aufgetragen und nur das Lösungsmittel mittels Evaporation beseitigt wird. Als Verfahren zum Auftragen der Lösung können z. B. das Tauchlackieren, das Rotationsbeschichten oder ein Beschichten mittels Elektrophorese verwendet werden. Insbesondere das Tauchlackieren ist ein bevorzugtes Verfahren, nicht nur, weil es einfach und praktisch ist, sondern auch, weil sich die Partikel aufgrund der Oberflächenspannung des Lösungsmittels auf der Oberfläche des Dünnfilms selbst anordnen und dicht positionieren können. Ein derartiges Verfahren ist z. B. in der Literatur (X. Ye, et al., Nano Today, 2011, 6, 608.) offenbart. Als Verfahren, um nach dem Auftragen das Lösungsmittel mittels Evaporation zu beseitigen, ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem ein thermisches Verdampfen erfolgt. Durch die geeignete Auswahl der Materialeigenschaften der Partikel können dabei die jeweiligen Partikel verformt werden. Ein derartiges Verfahren ist z. B. in der Literatur (A. Kosiorek, et al., Small, 2005, 1, 439.) offenbart. Vor der Verformung handelt es sich um einen instabilen Strukturkörper, bei dem die Partikel untereinander auf einen Punktkontakt beschränkt sind und durch das Anlegen einer Spannung einer Elektrophorese unterliegen, sodass das Ausführen der Verformungsverarbeitung erforderlich ist. Im Verlauf der Verformungsverarbeitung werden die ursprünglich sphärischen Partikel gegeneinandergedrückt und wie in 9 dargestellt, nicht-sphärisch verformt, sodass die Partikel untereinander Flächenkontakt erhalten. Dies hat die Wirkung, dass dadurch ein stabiler Strukturkörper gebildet werden kann, der auch der Zugkraft auf die Partikel beim Anlegen einer Spannung widerstehen kann. Dabei ist es wünschenswert, wenn die Form der Partikel zu diesem Zeitpunkt zu einem Polyeder wird, sodass die benachbarten Partikel untereinander in festem Kontakt aufeinandertreffen können. Ein derartiger Polyeder wird durch thermisches Pressen erzielt und ist z. B. in der Literatur (Z. Q. Sun, et al., Langmuir, 2005, 21(20), 8987.) angegeben.
Die Partikel zum Realisieren des vorstehenden dreidimensionalen Strukturkörpers sind unter den beiden Aspekten der Formbarkeit und des Lösungsdispersionsvermögens auszuwählen. Unter dem Gesichtspunkt der Formbarkeit ist ein verformbares Material wünschenswert, wobei z. B. ein Harz wie Polystyrol oder Polymilchsäure, eine Keramik, wie Siliziumdioxid oder Titanoxid oder ein Metall wie Gold oder Silber bevorzugt ist. Unter dem Gesichtspunkt des Lösungsdispersionsvermögens ist es bevorzugt, wenn ein hoher Zetapotentialwert vorliegt, sodass die Partikel untereinander eine ausreichende Abstoßungskraft erzielen. Ein insbesondere wünschenswertes Material ist das vorstehend beschriebene Siliziumdioxid, dessen Oberfläche mit einer negativ elektrisch geladenen Silanolgruppe überzogen wird, da ein ausreichender Zetapotentialwert realisiert werden kann, damit die Partikel in Wasser selbständig dispergieren.
Es ist erforderlich, dass die Oberfläche der Partikel mit einer funktionellen Gruppe versehen ist, die das Biopolymer adsorbieren kann, wobei die Vorsehung auf der Oberfläche der Partikel sowohl vor der Auftragung auf den Dünnfilm als auch nach dem Auftragen durch eine chemische Reaktionsbearbeitung erfolgen kann.
Ein Beispiel eines weiteren Vorteils der Verwendung eines mittels Partikeln geformten dreidimensionalen Strukturkörpers beinhaltet, dass ein maschenförmiger Strömungsweg gebildet werden kann. Normalerweise nimmt das Biopolymer, insbesondere eine einsträngige DNA, in der Lösung keine unverzweigte, sondern eine gefaltete Gaußform an. Bei einer solchen Form kann es vorkommen, dass die einsträngige DNA beim Passieren der Nanopore auf dem Teil des Dünnfilms hängenbleibt und eine reibungslose Feststellung nicht durchgeführt wird. Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird dadurch, dass die einsträngige DNA an mehreren Stellen in den Molekülen in den maschenförmigen Strömungsweg adsorbiert wird, die Wirkung erzielt, dass sie sich in die Form einer unverzweigten Kette auflöst. Dadurch kann in der Nanopore eine reibungslose Feststellung des Biopolymers durchgeführt werden.
Um die Adsorptionswirkung des Biopolymers zu erhöhen, ist es bevorzugt, wenn der Volumenanteil, den die Partikel in dem dreidimensionalen StrukturKörper einnehmen, größer ist als der Anteil, wenn die Partikel untereinander in einer engst gepackten Struktur Punktkontakt haben. Leicht verständlich ist es dabei, wenn man sich bei einer Einschicht-Schichtbildung der Partikel den Flächenanteil einer von direkt oberhalb des dreidimensionalen Strukturkörpers auf den Dünnfilm projizierten Figur vorstellt. Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn für den Fall, dass die Partikel vor dem Formen eine sphärische Form haben und das Zentrum der jeweiligen Partikel der projizierten Figur ein Gitter eines gleichseitigen Dreiecks darstellen, der Flächenanteil größer ist als der theoretische Wert des Punktkontakts von n/^12. Ferner ist es bevorzugt, wenn für den Fall, dass die Partikel vor dem Formen eine sphärische Form haben und das Zentrum der jeweiligen Partikel der projizierten Figur ein Gitter eines Quadrats darstellt, der Flächenanteil größer ist als der theoretische Wert des Punktkontakts von π/√4.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bezeichnet der minimale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges den minimalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums, der innerhalb des vorstehenden Bereichs der Hemisphäre den bis zur Nanopore innerhalb des Hohlraums zwischen den verformten Partikeln verketteten Strömungsweg bildet. Durch die Verwendung von Partikeln, die einen Partikeldurchmesser von einigen nm oder mehr aufweisen, kann ein Wirkungsquerschnitt gleich dem vorstehend beschriebenen oder größer als der vorstehend beschriebene Wirkungsquerschnitt der Moleküle des Biopolymers sichergestellt werden. In gleicher Weise bezeichnet der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges den maximalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums, der innerhalb des vorstehenden Bereichs der Hemisphäre den bis zur Nanopore innerhalb des Hohlraums zwischen den verformten Partikeln verketteten Strömungsweg bildet. Der maximale Wirkungsquerschnitt des Hohlraums bezeichnet ferner den maximalen Wirkungsquerschnitt in dem gesamten Hohlraum zwischen den verformten Partikeln in dem dreidimensionalen Strukturkörper. Es kann daher vorkommen, dass außerhalb des Bereichs der Hemisphäre Z. B. ein Teil der Partikel verlorengeht und der maximale Wirkungsquerschnitt des Hohlraums größer wird als der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges. Da eine solche Stelle jedoch ein Bereich ist, der nicht zur Analyse von Biopolymeren beiträgt, stellt dies bei der praktischen Anwendung kein Problem dar. Diese Definitionen sind für die nachstehend erläuterten Ausführungsbeispiele 2 bis 6 und 9 identisch.
[Zweites Ausführungsbeispiel]
11 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Das in 11 dargestellte Ausführungsbeispiel ist gekennzeichnet durch die einteilige Bildung der Partikel untereinander, die in 9 benachbart sind.
In 9 ist das Beispiel eines dreidimensionalen Strukturkörpers dargestellt, der aus verformten Partikeln gebildet wird, die Formbarkeit kann aber auch durch eine einteilige Bildung der benachbarten Partikel untereinander mittels einer chemischen Reaktion oder Materialschichten auf der Oberfläche erzielt werden. Für den Fall, dass es sich bei dem Partikelmaterial um ein Harz handelt, ist z. B. eine einteilige Bildung möglich, indem das Harz durch eine Erwärmung auf die oder oberhalb der Glasübergangstemperatur plastisch deformiert wird und die Molekülketten des Harzes sich beim Kontakt miteinander verflechten. Als Harz ist z. B. Polystyrolharz bevorzugt. Ein derartiges Verfahren ist in der Literatur (A. Kosiorek, et al., Small, 2005, 1, 439.) angegeben. Handelt es sich bei dem Partikelmaterial ferner um eine Keramik, wie z. B. Siliziumdioxid oder Titanoxid, ist auch eine Realisierung mittels einer chemischen Reaktion, wie z. B. eines Reaktionssinterns, möglich, durch die die Partikel miteinander verfestigt einteilig gebildet werden können. Ein derartiges Verfahren des Sinterns von Siliziumdioxidpartikeln, ist z. B. in der Literatur (T. V. Le, et al., Langmuir, 2007, 23(16), 8554.) angegeben. Eine einteilige Bildung ist auch dadurch möglich, dass eine Polimerisationsreaktion erfolgt, indem in den Hohlraum zwischen den Partikeln Monomere eingeführt werden, und das Harz geschichtet wird. Die Monomere können dabei sowohl anorganisch als auch organisch sein. Die gleiche Struktur kann ferner auch realisiert werden, indem mit einer Oberflächenpfropfpolymerisation von der Partikeloberfläche begonnen wird. Als ein anderes Verfahren, gibt es ein Verfahren, bei dem die Oberfläche der Partikel durch eine Atomlagenabscheidung (atomic layer deposition) bedeckt wird. Dadurch, dass die Partikel miteinander einteilig gebildet werden, wird die Wirkung erzielt, dass ein stabilerer, nicht redispergierender dreidimensionaler Strukturkörper realisiert wird und eine Vorrichtung mit einer hohen Robustheit realisiert werden kann.
[Drittes Ausführungsbeispiel]
12 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. 9 stellt das Beispiel eines dreidimensionalen Strukturkörpers dar, bei dem die Partikel einer Einschicht-Schichtbildung unterzogen werden, während das in 12 dargestellte Ausführungsbeispiel das Beispiel eines dreidimensionalen Strukturkörpers darstellt, bei dem die Partikel einer Mehrschicht-Schichtbildung unterzogen werden. Durch die Mehrschicht-Schichtbildung wird die spezifische Oberfläche um den Anteil der Schichtbildung vergrößert, sodass sich die vorstehend beschriebene Adsorptionsrate des Biopolymers verbessert und eine weitere Verzögerungswirkung erzielt wird. Ferner nimmt die Länge des maschenförmigen Strömungsweges weiter zu, sodass die vorstehend beschriebene Wirkung des Auflösens in unverzweigte Ketten weiter verbessert und eine reibungslosere Feststellung realisiert werden kann.
Als Verfahren zur Mehrschicht-Schichtbildung gibt es das Verfahren, die Partikelkonzentration der Partikeldispersionslösung einzustellen, oder auf dem dreidimensionalen Strukturkörper, der der in 9 eingestellten Einschicht-Schichtbildung unterzogen wurde, die gleiche Verarbeitung wiederholt durchzuführen. Ein derartiges Verfahren ist z. B. in der Literatur (P. Jiang, et al., Chem. Mater., 1999, 11(8), 2132.) angegeben. Auch bei dieser Schichtbildungsstruktur kann ebenso wie bei dem ersten Ausführungsbeispiel und dem zweiten Ausführungsbeispiel ein nicht redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden, indem die Form in eine nicht sphärische Form verformt wird, oder die Partikel miteinander einteilig gebildet werden.
[Viertes Ausführungsbeispiel]
13 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Das in 13 dargestellte Ausführungsbeispiel stellt ein Beispiel dar, bei dem der dreidimensionale Strukturkörper mittels zwei Arten von Partikeln gebildet wird, die in 12 eine unterschiedliche Größe aufweisen. Durch die Verwendung von zwei Arten von Partikeln, die sich in der Größe unterscheiden, erfolgt eine Selbstanordnung, bei der sich die kleinen Partikel in dem Hohlraum zwischen den großen Partikeln positionieren, wodurch die spezifische Oberfläche weiter vergrößert wird und die Adsorptionsrate des Biopolymers erhöht werden kann.
Ein derartiges Verfahren ist in der Literatur (K.W. Tan, et al., Langmuir, 2010, 26(10), 7093.) angegeben. Auch bei diesem Strukturkörper kann ein nicht in die Lösung redispergierender Strukturkörper realisiert werden, indem wie vorstehend beschrieben, die Partikel verformt oder einteilig gebildet werden. Da sich ferner die Kontaktfläche der Partikel untereinander vergrößert, hat dies ebenfalls den Effekt, dass der Strukturkörper weniger leicht redispergiert und stabilisiert wird. Hier ist ein Beispiel dargestellt, bei dem Partikel von zwei Größenarten einer Mehrschicht-Schichtbildung unterzogen werden, es kann sich aber auch um drei oder mehrere Größenarten bei den Partikeln handeln.
[Fünftes Ausführungsbeispiel]
14 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist gekennzeichnet durch einen mittels zwei Arten von Partikeln, die eine unterschiedliche Größe aufweisen, in einer anderen Ausgestaltung als bei 13 gebildeten dreidimensionalen Strukturkörper.
In 14 ist ein Beispiel dargestellt, bei dem auf einem Dünnfilm kleine Partikel als erste Schicht angeordnet werden, und darüber große Partikel als zweite Schicht geschichtet werden. Durch eine derartige Anordnung der Partikel wird zusätzlich zu der Wirkung der Verzögerung des Biopolymers eine Filterung durch die Polymerlänge ermöglicht. Ein Biopolymer, das eine kurze Polymerlänge aufweist, kann die zweite Schicht durchqueren und zu der ersten Schicht gelangen, da bei dem Hohlraum zwischen den großen Partikeln der zweiten Schicht der eigene hydromechanische Radius kleiner ist, während es bei einem Biopolymer, das eine lange Polymerlänge aufweist, zu dem Phänomen kommt, dass es dadurch, dass der eigene hydromechanische Radius groß ist, in dem Hohlraum zwischen den großen Partikeln der zweiten Schicht adsorbiert wird und nicht bis zu der ersten Schicht gelangt. Infolgedessen können durch die Steuerung der Größe der Partikel der ersten Schicht und der zweiten Schicht, nur Biopolymere, die eine Polymerlänge in einem gewünschten Bereich aufweisen, selektiv festgestellt werden. Im Übrigen ist auch eine Struktur effektiv, bei der die Größe der Partikel von der ersten Schicht bis zur obersten Schicht mit einem Gradienten größer wird. Auch bei dieser Schichtbildungsstruktur kann ebenso wie bei dem ersten Ausführungsbeispiel und dem zweiten Ausführungsbeispiel ein nicht redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden, indem die Form in eine nicht sphärische Form verformt wird, oder die Partikel miteinander einteilig gebildet werden.
[Sechstes Ausführungsbeispiel]
15 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Bei dem in 15 dargestellten Ausführungsbeispiel ist dadurch gekennzeichnet, dass in der Umgebung des z. B. in 12 dargestellten dreidimensionalen Strukturkörpers eine Wand 114 vorgesehen ist, die eine Dicke aufweist, die dicker ist als die Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers.
Durch die Anordnung einer Wand in der Umgebung des dreidimensionalen Strukturkörpers ergeben sich zwei Vorteile. Der erste Punkt besteht darin, dass durch das Aufweisen einer Wand in der Umgebung der Bewegungsbereich des dreidimensionalen Strukturkörpers begrenzt werden kann, was den Effekt hat, dass eine Redispergierung des dreidimensionalen Strukturkörpers in die Lösung unterdrückt wird. Der zweite Punkt besteht darin, dass eine Verbesserung der Feststellungshäufigkeit von Biopolymeren den Effekt hat, dass die Analysezeit verkürzt werden kann. Indem die Höhe und die Breite der Wand ungefähr gleich der oder kleiner als die Länge der Fänger des Biopolymers bestimmt wird, kann der dreidimensionale Strukturkörper im Bereich der Länge der Fänger des Biopolymers gehalten werden. Durch einen derartigen Aufbau wird das mit dem Strukturkörper in einer Wechselbeziehung stehende Biopolymer gleichzeitig durch das Potentialgefälle an die Nanopore herangezogen. Infolgedessen wird die Häufigkeit von in die Nanopore eintretenden Biopolymeren erhöht. Abgesehen von der Verkürzung der Analysezeit, ergibt sich die Wirkung, dass Biopolymere einer geringeren Konzentration festgestellt werden können. Die vorstehende Wirkung wird auch dann erzielt, wenn die Höhe und Breite der Wandfläche größer ist als die Länge der Fänger des Biopolymers.
Ferner ist auch eine Struktur wirkungsvoll, bei der, wie in 16 dargestellt, durch die Vorsehung eines zweiten Dünnfilms 115, die Fläche des Öffnungsteils der Wand gegenüber der Fläche des Dünnfilms verkleinert wird. Durch eine derartige Struktur, bei der die Fläche auf der Seite der Lösung kleiner wird, kann der Bewegungsbereich des dreidimensionalen Strukturkörpers wirkungsvoller beschränkt werden, wodurch sich die Wirkung ergibt, dass eine Redispergierung in die Lösung unterdrückt werden kann. Ein derartiger Aufbau ist in der Literatur (I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.) angegeben und kann z. B. mittels des folgenden Verfahrens hergestellt werden. Zunächst wird eine mittels z. B. einer Flusssäurelösung, wie z. B. Siliziumdioxid ätzbare Schicht auf einem Dünnfilm 104 angeordnet, in den eine Nanopore 106 eingebracht wird, und als Nächstes wird eine Schicht eines Materials (z. B. Siliziumnitrid) vorgesehen, das durch die vorstehende Lösung schwer ätzbar ist. Dann wird mittels eines allgemein üblichen Trockenätzens ein die zweite Schicht durchbohrendes Loch gebildet. Wird der Vorgang zu diesem Zeitpunkt gestoppt, kann eine wie in 15 dargestellte Struktur, die eine Wand aufweist, hergestellt werden. Es ist ferner möglich, eine Vorrichtung bereitzustellen, die eine Wandstruktur wie in 16 aufweist, indem durch die Durchführung eines Nassätzens mittels einer Ätzflüssigkeit wie z. B. Flusssäure eine ätzbare Schicht auf der Hemisphäre abgetragen wird. Dabei wird das Auftragen der Partikel mittels des beim ersten Ausführungsbeispiel dargestellten Verfahrens als letzter Vorgang durchgeführt.
[Siebtes Ausführungsbeispiel]
17 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel handelt es sich um eine zu 9 und 12 inverse Struktur, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine inverse Opalstruktur als dreidimensionaler Strukturkörper verwendet wird, bei dem die Partikel zum Hohlraumteil und der Hohlraumteil zum Schüttungsteil geändert wird.
Der Aufbau des vorliegenden Ausführungsbeispiels ist im Wesentlichen der gleiche Aufbau wie bei 9 und 12, wobei auch durch diese Struktur die gleichen Wirkungen wie bei 9 und 12 realisiert werden können. Inverse Opalstrukturen sind in der Literatur (J. H. Moon, et al., Chem. Rev., 2010, 110, 547.) konkret angegeben. Die vorliegende Struktur wird mittels der folgenden Methode erzielt. Nachdem sich die Partikel zunächst durch Selbstanordnung in einer regelmäßigen Struktur angeordnet haben, werden ohne Verformung oder einteilige Bildung der Partikel in den Hohlraum zwischen den Partikeln Monomere (wobei es sich sowohl um organische als auch um anorganische handeln kann) eingefüllt, eine Polymerisationsreaktion wird vorangetrieben und eine Schüttung 116 gebildet. Als Nächstes wird eine Verarbeitung durchgeführt, bei der mittels eines Lösungsmittels, mit dem nur der Partikelteil auflösbar ist, der Partikelteil durch Auflösen beseitigt wird. Um die Oberfläche des Strukturkörpers mit einer funktionellen Gruppe zu behandeln, wird diese zuletzt z. B. in eine Lösung eingetaucht, die ein Oberflächenbehandlungsmittel mit einer starken Reaktivität beinhaltet, wie z. B. einen Silan-Haftvermittler mit einem primären Amin, und z. B. mit Alkohol gespült. Der Vorteil einer inversen Opalstruktur, die auf diese Weise mittels Partikeln als Template gebildet wird, besteht darin, dass während die gleiche Oberflächenfläche wie beim Befüllen mit Partikeln realisiert wird, das Volumen des Lösungsteils weiter vergrößert und der Widerstandswert gesenkt werden kann. Infolgedessen kann ein höherer Ionenstromwert sichergestellt werden, was den Effekt einer Erhöhung der Empfindlichkeit der Messung hat. Polystyrol und Siliziumdioxid sind als Materialien für die Verwendung zur Bildung der Schüttung der vorliegenden Struktur bevorzugt. Bei der vorliegenden Struktur wurde der dreidimensionale Strukturkörper als Schüttung einteilig gebildet, so dass ein nicht in die Lösung redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden kann.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bezeichnet der minimale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges im Bereich der durch die vorstehende Formel 1 ausgedrückten Hemisphäre mit dem Radius der Länge r der Fänger des Biopolymers den minimalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums, der den bis zur Nanopore 106 verketteten Strömungsweg innerhalb des Hohlraums der zum Template gewordenen Partikelform bildet. Ebenso wie bei dem ersten Ausführungsbeispiel, kann durch die Verwendung von Partikeln, die einen Partikeldurchmesser von einigen nm oder mehr aufweisen, ein Wirkungsquerschnitt gleich dem oder größer als der Wirkungsquerschnitt der Moleküle des Biopolymers sichergestellt werden. In gleicher Weise bezeichnet der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges den maximalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums, der innerhalb des vorstehenden Bereichs der Hemisphäre den bis zur Nanopore verketteten Strömungsweg innerhalb des Hohlraums der zum Template gewordenen Partikelform bildet. Der maximale Wirkungsquerschnitt des Hohlraums bezeichnet ferner den maximalen Wirkungsquerschnitt innerhalb des gesamten Hohlraums der zum Template gewordenen Partikelform.
[Achtes Ausführungsbeispiel]
18 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. In 18 ist ein Beispiel dargestellt, bei dem als einfachstes Beispiel eines dreidimensionalen Strukturkörpers auf einem ersten Dünnfilm 104 mit einer Nanopore 106 ein zweiter Dünnfilm 117 angeordnet wird, der direkt über der Nanopore einen Hohlraum aufweist.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist es einfach, den Wirkungsquerschnitt des Hohlraums 108 und die Dicke des Dünnfilms 117 zu steuern, was den Vorteil hat, dass die Adsorptionsrate des Biopolymers leicht zu steuern ist. Hinsichtlich des Hohlraums 108 kann ein Hohlraum einer gewünschten Größe mittels einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen geschaffen werden, wobei es auch möglich ist, in dem Zustand, in dem noch keine Nanopore in den ersten Dünnfilm 104 eingebracht wurde, gleichzeitig die Nanopore 106 und den Hohlraum 108 in dem ersten Dünnfilm 104 und dem zweiten Dünnfilm 117 zu bilden. Der zweite Dünnfilm 117 kann mittels einer Halbleiter-Mikrobearbeitungstechnologie geformt werden. Bei solchem Material des Dünnfilms handelt es sich um ein Material, das mittels einer Halbleiter-Bearbeitungstechnologie geformt werden kann, wobei es sich bevorzugt um ein Material mit einer niedrigen Dielektrizitätskonstante, z. B. Siliziumdioxid handelt, sodass die Kapazitanz niedrig wird. Durch das Reduzieren der Kapazitanz, kann bei der Durchführung einer Hochfrequenzmessung ein von der Kapazitanz abhängiges Rauschen mit einer Frequenzantwort reduziert werden, sodass eine Feststellung von Biopolymeren stabiler durchgeführt werden kann. Auch bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird wie bei dem siebten Ausführungsbeispiel nach dem Bilden eines dreidimensionalen Strukturkörpers bei einer chemischen Reaktionsbearbeitung auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe gebildet. Das Verfahren zur Behandlung der funktionellen Gruppe schließt wie bei dem siebten Ausführungsbeispiel ein Verfahren ein, bei dem das Eintauchen in eine Lösung, die z. B. einen Silan-Haftvermittler mit einem primären Amin beinhaltet, und das Abspülen z. B. mit Alkohol erfolgen. Durch die Herstellung mittels Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid, die in einer wässrigen Lösung nicht lösbar sind, als Material für die Halbleiter-Mikrobearbeitungstechnologie kann ein nicht in die Lösung redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bezeichnet der minimale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges den im Bereich der durch die vorstehende Formel 1 ausgedrückten Hemisphäre mit dem Radius der Länge r der Fänger des Biopolymers minimalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums des den Hohlraum 108 aufweisenden zweiten Dünnfilms 117. Durch die Vorsehung eines Durchmessers des Hohlraums des zweiten Dünnfilms von 1 nm oder mehr kann ein Wirkungsquerschnitt gleich dem oder größer als der Wirkungsquerschnitt der Moleküle des Biopolymers sichergestellt werden. In gleicher Weise bezeichnet der maximale Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges den im Bereich der Hemisphäre maximalen Wirkungsquerschnitt des Hohlraums 108 des den Hohlraum aufweisenden zweiten Dünnfilms 117. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel stimmen der Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges und der Wirkungsquerschnitt des Hohlraums vollständig überein.
[Neuntes Ausführungsbeispiel]
19 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Bei den bisherigen Ausführungsbeispielen sind als Beispiel alle dreidimensionale Strukturkörper nur auf einer Seite des Dünnfilms angeordnet, während das vorliegende Ausführungsbeispiel durch eine Anordnung auf beiden Seiten gekennzeichnet ist. Dadurch kann ein weiterer Verzögerungseffekt erzielt werden. In 19 ist ein Beispiel dargestellt, bei dem der in 12 dargestellte dreidimensionale Strukturkörper auf beiden Seiten des Dünnfilms 104 angeordnet wurde.
Da auf den beiden Seiten der Eingangs- und der Ausgangsseite ein Potentialgefälle der Umgebung der Nanopore entsteht, wird durch das Errichten eines dreidimensionalen Strukturkörpers auf den beiden Seiten der Eingangs- und der Ausgangsseite der Nanopore 106 auf beiden Seiten die Zugkraft des Biopolymers 109 reduziert, sodass eine weitere Verzögerungswirkung realisiert werden kann. In 19 wurde auf beiden Seiten des Dünnfilms derselbe dreidimensionale Strukturkörper angeordnet, es kann sich bei dem dreidimensionalen Strukturkörper aber auch um eine Kombination der Ausführungsbeispiele von 9 bis 18 oder deren abgewandelte Beispiele handeln. Ferner kann auch nur auf der Ausgangsseite ein dreidimensionaler Strukturkörper angeordnet werden. Auch bei dieser Schichtbildungsstruktur kann ebenso wie bei dem ersten Ausführungsbeispiel und dem zweiten Ausführungsbeispiel ein nicht redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden, indem die Form in eine nicht sphärische Form verformt wird, oder die Partikel miteinander einteilig gebildet werden.
[Zehntes Ausführungsbeispiel]
20 ist ein schematischer Querschnitt, der den Teil der Umgebung der Nanopore eines dreidimensionalen Strukturkörpers einer anderen Ausgestaltung bei einer Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren der vorliegenden Erfindung zeigt. Das vorliegende Ausführungsbeispiel ist dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers kleiner ist als die Länge der Fänger des Biopolymers. Als ein Beispiel ist hier das Ausführungsbeispiel von 9 dargestellt.
Durch eine derartige Begrenzung der Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers werden die gleichen Wirkungen wie bei dem sechsten Ausführungsbeispiel erzielt. Das heißt, das mit dem dreidimensionalen Strukturkörper in einer Wechselbeziehung stehende Biopolymer 109 wird gleichzeitig durch das Potentialgefälle an die Nanopore 106 herangezogen. Infolgedessen kann die Häufigkeit von in die Nanopore eintretenden Biopolymeren erhöht werden. Abgesehen von der Verkürzung der Analysezeit, ergibt sich die Wirkung, dass Biopolymere einer geringeren Konzentration festgestellt werden können. Das vorliegende Ausführungsbeispiel kann auf alle der mittels 9 bis 19 erläuterten Strukturen angewandt werden. Die Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers ist bei 9 und 11 mittels des Partikeldurchmessers, bei 12 bis 16 und 19 mittels des Partikeldurchmessers und der Anzahl der Schichten, bei 17 mittels des Durchmessers der zu beseitigenden Partikel und der Anzahl der Schichten, und bei 18 mittels der Dicke des Dünnfilms jeweils steuerbar. Auch bei dieser Schichtbildungsstruktur kann ebenso wie bei dem ersten Ausführungsbeispiel und dem zweiten Ausführungsbeispiel ein nicht redispergierender, stabiler Strukturkörper realisiert werden, indem die Form in eine nicht sphärische Form verformt wird, oder die Partikel miteinander einteilig gebildet werden.
Die Definition bezüglich des Querschnitts des Strömungsweges und des Hohlraums ist gleich mit dem Inhalt der Erläuterung zu dem ersten Ausführungsbeispiel.
[Elftes Ausführungsbeispiel]
21 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel eines Systems zur Analyse eines Biopolymers mittels der Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt. Das vorliegende System besteht typischerweise aus der in 1 dargestellten Vorrichtung 118 für die Analyse von Biopolymeren, einer Ionenstrommessvorrichtung 119, die den zwischen einem Paar Elektronen der Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren fließenden Ionenstrom misst, einer A/D-Ausgabe-Wandlervorrichtung 120, die von der Ionenstrommessvorrichtung 119 ausgegebene Signale in Digitalsignale umwandelt, einer Datenverarbeitungsvorrichtung 121, die die von der A/D-Ausgabe-Wandlervorrichtung 120 zugeführten Signale verarbeitet, einer Datenanzeige-Ausgabevorrichtung 122, die das Ergebnis der Verarbeitung durch die Datenverarbeitungsvorrichtung 121 anzeigt, und einer Ein-/Ausgabe-Hilfsvorrichtung 123. Typischerweise ist die Ionenstrommessvorrichtung mit einer Hochgeschwindigkeits-Verstärkerschaltung vom Typ des Strom-Spannungs-Wandlers bestückt, und die Datenverarbeitungsvorrichtung ist mit einer Recheneinheit, einer temporären Speichervorrichtung und einer nichtflüchtigen Speichervorrichtung bestückt. Um ein externes Rauschen zu reduzieren, ist es bevorzugt, dass das Vorrichtungsteil für die Analyse eines Biopolymers von einem faradayschen Käfig abgeschirmt ist.
[Zwölftes Ausführungsbeispiel]
Es ist auch möglich, ohne dass eine Nanopore eingebracht ist, den dreidimensionalen Strukturkörper auf dem Isolationsdünnfilm anzuordnen, und dann die Nanopore einzubringen. Eine Technik, durch die mittels des kontinuierlichen Anlegens einer impulsförmigen Spannung in einen Isolationsdünnfilm eine Nanopore mit einem gewünschten Durchmesser eingebracht werden kann, ist in der Literatur (I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.) angegeben. Der dreidimensionale Strukturkörper besitzt einen Hohlraum, der sich bis zu dem Dünnfilm fortsetzt, wobei der an den Dünnfilm anstoßende Hohlraumteil zu der Stelle des niedrigsten Widerstandswert wird. Wird daher eine Impulsspannung fortgesetzt angelegt, konzentriert sich die Spannung auf den mit dem Dünnfilm in Berührung kommenden Hohlraumteil, sodass eine Nanopore eingebracht werden kann.
Bei dem Verfahren zur Einbringung einer Nanopore des vorliegenden Ausführungsbeispiels handelt es sich als ein Beispiel um einen dreidimensionalen Strukturkörper, der einen Hohlraum aufweist, wobei das Verfahren einen Schritt, in dem die Ober- und Unterseite eines Isolationskörper-Dünnfilms, auf dem der dreidimensionale Strukturkörper angeordnet wurde, bei dem der Hohlraum auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe aufweist, die das Biopolymer adsorbieren kann, in eine einen Elektrolyten aufweisende Lösung eingetaucht wird, einen Schritt, in dem in die Lösung, in die die Oberfläche des Dünnfilms eingetaucht wurde, und in die Lösung, in die die Unterseite eingetaucht wurde, ein Paar Elektroden getaucht wird, und einen Schritt, in dem an das Paar Elektroden eine impulsförmige Spannung angelegt wird, aufweist und an der Stelle, an der sich der Dünnfilm und der Hohlraum berühren, die Nanopore eingebracht wird.
Als konkretes Beispiel ist in 22 der Fall der Verwendung des Dünnfilms 104, in dem in 9 keine Nanopore eingebracht ist, dargestellt. Bei dieser Struktur wird dadurch eine Nanopore eingebracht, dass sich die Spannung an einer Stelle, an der der Dünnfilm und die Partikel nach dem Formen nicht in Berührung kommen, konzentriert, wobei die gleiche Struktur wie bei 9 erzielt werden kann. Bei einem herkömmlichen Einbringungsprozess mittels einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen kann es vorkommen, dass der vorstehende dreidimensionale Strukturkörper zu einer Abdeckung wird und die Elektronenstrahlen nicht bis zu dem Dünnfilm vordringen, sodass der dreidimensionale Strukturkörper bevorzugt nach dem Einbringungsprozess angeordnet wird. Durch die Verwendung des vorliegenden Prozesses kann, ungeachtet ob vor oder nach dem Anordnen des dreidimensionalen Strukturkörpers, die Nanopore zu einem beliebigen Zeitpunkt eingebracht werden. Außerdem wird es durch eine Steuerung des mit dem Dünnfilm in Berührung stehenden Hohlraumteils möglich, die Stelle, an der die Nanopore eingebracht wird, zu steuern. Wie z. B. in 23 dargestellt, kann durch die Verwendung einer Vorrichtung, die einen in 15 anhand eines Beispiels dargestellten, aus Partikeln geformten dreidimensionalen Strukturkörper und eine Wandfläche aufweist, ohne mit den Partikeln in Berührung zu kommen, und außerdem die Spannung an einer von der Wandfläche entfernten Stelle konzentriert, an der mit einem Pfeil bezeichneten Stelle eine Nanopore eingebracht werden. Der vorliegende Prozess kann auf die Ausführungsbeispiele 1 bis 10 und auf alle der mittels 9 bis 20 erläuterten Strukturen angewandt werden. Aus dem vorstehend erläuterten Grund kann daher eine stabile Vorrichtung zugeführt werden, bei der auch beim Anlegen einer Spannung der dreidimensionale Strukturkörper nicht redispergiert, und der Strukturkörper vor oder nach der Einbringung der Nanopore nicht verfällt.
Die Definition bezüglich des Querschnitts des Strömungsweges und des Hohlraums bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist gleich mit dem Inhalt der Erläuterung zu dem ersten Ausführungsbeispiel.
[Dreizehntes Ausführungsbeispiel]
Beim Bilden des dreidimensionalen Strukturkörpers mittels Partikeln kann auch eine Vorrichtung für die Analyse eines Biopolymers realisiert werden, bei der beides, das Einsammeln des angestrebten Biopolymers aus der Probe und die Verzögerung der Geschwindigkeit in einem erfolgt. In 24 ist der Konzeptfluss des Protokolls des vorliegenden Ausführungsbeispiels und in 25 eine schematische Darstellung der Protokollabfolge dargestellt.
Zunächst wird in die Probenlösung, in der das angestrebte Biopolymer gelöst ist, eine Lösung eingeführt, in der Partikel dispergiert sind, die eine funktionale Gruppe aufweist, die das angestrebte Biopolymer adsorbieren kann (S1 1). Nach dem Einführen wird abgewartet, bis genügend Zeit für das ausreichende Adsorbieren des Biopolymers in die Oberfläche der Partikel vergangen ist (S12). Nachdem genügend Zeit vergangen ist, werden mittels einer Super-Zentrifugalabscheidung nur die Partikel, die das angestrebte Biopolymer adsorbiert haben, selektiv eingesammelt (S13). Werden magnetische Partikel verwendet, ist es möglich, mittels eines Magnetfeldes nur die Partikel einzusammeln. Nach dem Einsammeln wird der aus den Partikeln, die das angestrebte Biopolymer adsorbiert haben, geformte dreidimensionale Strukturkörper von 9 bis 16 oder 19, 20 auf einem Dünnfilm, der eine Nanopore aufweist, aufgesetzt (S14). Zuletzt wird die vorstehend hergestellte Vorrichtung in das in 21 dargestellte System für die Analyse eines Biopolymers eingebettet, eine Spannung angelegt und die Feststellung des Biopolymers durchgeführt (S15). Damit das Einsammeln der Partikel reibungslos abläuft, ist es bei dem vorliegenden Prozess bevorzugt, wenn mit der Partikelsubstanz Paramagnetismus mit sich führende magnetische Partikel, z. B. aus Ferrit verwendet werden.
Das heißt, das Analyseverfahren des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist einen Schritt, in dem mittels mehrerer Partikel, die auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe aufweisen, die das angestrebte Biopolymer adsorbieren können, aus der Probe das angestrebte Biopolymer adsorbiert und eingesammelt wird, einen Schritt, in dem auf einem Dünnfilm, der eine Nanopore aufweist, ein aus diesen Partikeln geformter, dreidimensionaler Strukturkörper, der einen Hohlraum aufweist, angeordnet wird, einen Schritt, in dem der Dünnfilm, der eine Nanopore aufweist, in eine Lösung eingetaucht wird, die einen Elektrolyten beinhaltet, und zwischen zwei mit dem Dünnfilm in der Mitte angeordneten Elektroden eine Spannung angelegt wird, und einen Schritt auf, in dem das angestrebte Biopolymer anhand des sich, wenn das angestrebte Biopolymer die Nanopore passiert, ändernden lonenstroms analysiert wird. Zu diesem Zeitpunkt bildet der Hohlraum des dreidimensionalen Strukturkörpers einen Strömungsweg, den die das Elektrolyt beinhaltende Lösung von der Nanopore bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper passiert, wobei der dreidimensionale Strukturkörper beim Anlegen der Spannung zumindest in dem Bereich einer Hemisphäre mit dem Radius der Länge r der Fänger des Biopolymers, die in Formel 1 definiert ist, und mit der Nanopore als Zentrum nicht in die Lösung redispergiert.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel kann das Biopolymer vorab in der Nähe der Nanopore angeordnet werden, sodass die Feststellungshäufigkeit erhöht werden kann. Infolgedessen ergibt sich die Wirkung einer Verkürzung der Analysezeit, und dass Biopolymere einer geringeren Konzentration festgestellt werden können. Da im Übrigen aus dem zu den Ausführungsbeispielen 1 bis 6, 9 und 10 erläuterten Grund der dreidimensionale Strukturkörper nicht in die Lösung redispergiert, wird die Durchführung einer stabilen Messung möglich. Die Definition bezüglich des Querschnitts des Strömungsweges und des Hohlraums bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist gleich mit dem Inhalt der Erläuterung zu dem ersten Ausführungsbeispiel.
[Vierzehntes Ausführungsbeispiel]
Im Folgenden wird ein Beispiel der Analyse eines Biopolymers mittels des in 21 dargestellten Systems für die Analyse eines Biopolymers dargestellt. Als Vorrichtung für die Analyse eines Biopolymers wurde eine Vorrichtung verwendet, die den in 15 dargestellten dreidimensionalen Strukturkörper aufweist. Als Dünnfilm wurde ein eine Nanopore mit einem Durchmesser von 2 nm aufweisender Dünnfilm, der aus Siliziumnitrid besteht, verwendet. Als Partikel wurden Siliziumdioxid-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 100 nm, 50 nm, bei denen die Oberfläche mit einer Silanolgruppe bedeckt ist, und Siliziumdioxid-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 50 nm, bei denen die Oberfläche mit einer primären Amingruppe bedeckt ist, verwendet. Der dreidimensionale Strukturkörper wurde geformt, indem die vorstehenden Partikel nach dem Auftragen durch Tauchlackieren erwärmt und getrocknet wurden. Als Kontrollversuch wurde auch eine Analysevorrichtung vorbereitet, die lediglich aus einem eine Nanopore mit einem Durchmesser von 2 nm aufweisenden Dünnfilm, der aus Siliziumnitrid besteht, gebildet wird, auf dem kein dreidimensionaler Strukturkörper angeordnet ist. Als Biopolymer wurde ein künstlich synthetisiertes Polyadenin (polyA) mit einer Basenlänge von 5.000 verwendet. Für die Lösung wurde eine wässrige Lösung verwendet, in der 1-M-Kaliumchlorid gelöst wurde. Als Potentialdifferenz zum Übertragen des Biopolymers wurde 1 V angelegt.
In 26 ist ein typisches Beispiel einer Biopolymerfeststellung mittels des Systems für die Analyse eines Biopolymers des vorstehenden Ausführungsbeispiels dargestellt. Bei der Vorrichtung, bei der kein dreidimensionaler Strukturkörper angeordnet wurde, betrug die typische Geschwindigkeit des Passierens von polyA 0,01 µs/l Monomermoleküleinheit. Andererseits betrug diese bei der Vorrichtung, auf der der in 15 dargestellte dreidimensionale Strukturkörper angeordnet wurde, für den Fall, dass Siliziumdioxid-Nanopartikel eines Durchmessers von 100 nm verwendet wurde, bei denen die Oberfläche mit einer Silanolgruppe bedeckt ist, 0,46 µs/l Monomermoleküleinheit und für den Fall, dass Siliziumdioxid-Nanopartikel eines Durchmessers von 50 nm verwendet wurden, 4,6 µs/l Monomermoleküleinheit. Ferner betrug sie für den Fall, dass Siliziumdioxid-Nanopartikel eines Durchmessers von 50 nm verwendet wurden, bei denen die Oberfläche mit einer primären Amingruppe bedeckt ist, 230 µs/l Monomermoleküleinheit. Infolgedessen konnte bestätigt werden, dass durch die Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und Einstellung der optimalen Bedingungen, im Vergleich zu dem Fall, wenn kein dreidimensionaler Strukturkörper verwendet wird, das 100-fache bis 10.000-fache einer ausreichenden Geschwindigkeitsverzögerung realisiert werden kann.
Indem die Vorrichtung für die Analyse eines Biopolymers der vorliegenden Erfindung, die Substanz (z. B. Graphen) einer monomolekularen Schicht für den Dünnfilm und z. B. in der Literatur (A. H. Laszlo, Nature Biotechnology, 2014, June 25) offenbarten Lösungsbedingungen/Analysebedingungen kombiniert werden, kann die Geschwindigkeit des Passierens des Biopolymers, insbesondere einer einsträngigen DNA durch eine Nanopore ausreichend verzögert und ein von der Monomersequenz abhängiges Signalmuster erzielt werden. Anhand des erzielten Signalmusters kann aufgrund der von der Art der Monomere abhängigen Signalwertdifferenz eine Analyse durchgeführt werden, sodass das Muster der Monomersequenzen in dem Biopolymer analysiert werden können.
Die vorliegende Erfindung ist im Übrigen nicht auf die vorstehenden Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern beinhaltet verschiedene Abwandlungsbeispiele. Zum Beispiel handelt es sich bei den vorstehenden Ausführungsbeispielen um solche, die für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung konkret erläutert wurden, wobei nicht unbedingt eine Beschränkung darauf besteht, dass alle erläuterten Strukturen vorgesehen sind. Es ist ferner möglich, einen Teil einer Struktur eines Ausführungsbeispiels durch eine Struktur eines anderen Ausführungsbeispiels zu ersetzen, oder einer Struktur eines Ausführungsbeispiels eine Struktur eines anderen Ausführungsbeispiels zuzusetzen. Bezüglich eines Teils der Strukturen der jeweiligen Ausführungsbeispiele besteht ferner die Möglichkeit des Zusatzes von, des Entfernens von oder des Austauschs mit einer anderen Struktur.
Bezugszeichenliste

101: Wanne
102: Lösung
103: dreidimensionaler Strukturkörper
104: Dünnfilm
105: Elektrode
106: Nanopore
107: Lösungseinfüllöffnung
108: Hohlraum
109: Biopolymer
110: funktionelle Gruppe
111: Partikel
112: Strömungsweg
114: Wand
115: zweiter Dünnfilm
116: Schüttung
117: einen Hohlraum aufweisender zweiter Dünnfilm
118: Vorrichtung für die Analyse von Biopolymeren
119: Ionenstrommessvorrichtung
120: A/D-Ausgabe-Wandlervorrichtung
121: Datenverarbeitungsvorrichtung

Claims

Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109), mit zwei Wannen (101a, 101b), in denen ein Biopolymer (109) und eine Lösung (102), die ein Elektrolyt beinhaltet, aufbewahrt werden, einem Paar Elektroden (105a, 105b), die jeweils an den beiden Wannen (101a, 101b) angeordnet sind, einem Dünnfilm (104), der eine Nanopore (106) aufweist und zwischen den beiden Wannen (101a, 101b) so angeordnet ist, dass die beiden Wannen (101a, 101b) über die Nanopore (106) in Kontakt stehen, und einem auf dem Dünnfilm (104) angeordneten dreidimensionalen Strukturkörper (103), der aus mehreren Partikeln (111) gebildet ist, die auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe (110) aufweisen, die das Biopolymer (109) adsorbieren kann, wobei der dreidimensionale Strukturkörper (103) einen Hohlraum (108) aufweist, der Hohlraum (108) einen Strömungsweg (112) bildet, der die Lösung (102) von der Nanopore (106) bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper (103) führt und die Oberfläche des Strömungsweges (112) die funktionelle Gruppe (110) aufweist, die das Biopolymer (109) adsorbieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass der aus den mehreren Partikeln (111) gebildete dreidimensionale Strukturkörper (103) dadurch hergestellt ist, dass nach dem Auftragen der in einem Lösungsmittel dispergierten Partikel (111) auf den Dünnfilm (104) nur das Lösungsmittel thermisch verdampft wird, wobei durch geeignete Auswahl der Materialeigenschaften der Partikel (111) dabei die jeweiligen Partikel (111) nicht-sphärisch verformt werden, und, wenn an das Paar Elektroden (105a, 105b) eine Spannung angelegt wird, der dreidimensionale Strukturkörper (103) in der Lösung (102) nicht redispergiert.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der funktionellen Gruppe (110) um eine Silanolgruppe handelt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung (102) Thiocyansäure-Ionen (SCN-), Dihydrogenphosphat-Ionen (H₂PO₄ ^-), Schwefelwasserstoff-Ionen (HSO₄ ^-), Hydrogenkarbonat-Ionen (HCO₃ ^-), Jodid-Ionen (I^-), Chlorid-Ionen (Cl^-), Nitrat-Ionen (NO₃ ^-), Ammonium-Ionen (NH₄ ⁺), Cäsium-Ionen (Cs⁺), Kalium-Ionen (K⁺), Guanidin-Ionen oder Tetramethylammonium-Ionen umfasst, die eine chaotrope Wirkung aufweisen.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der ph-Wert der Lösung (102) bei zwischen 1 und 10 liegt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die lonenintensität der Lösung (102) bei 10 mM oder mehr und auf oder unterhalb der lonenintensität einer gesättigten Kaliumchloridlösung liegt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der funktionellen Gruppe (110) um eine zu Kationen ionisierende funktionelle Gruppe (110) handelt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der zu Kationen ionisierenden funktionellen Gruppe (110) um primäre Aminogruppen, sekundäre Aminogruppen, tertiäre Aminogruppen, quartäre Aminogruppen, Pyridingruppen, Iminogruppen, Imidazolgruppen, Pyrazolgruppen oder Triazolgruppen handelt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Lösung (102) auf oder unterhalb des pKs-Wertes der zu Kationen ionisierenden funktionellen Gruppe (110) liegt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges (112) gleich dem oder größer als der Molekül-Wirkungsquerschnitt des Biopolymers (109) und gleich dem oder kleiner als der maximale Wirkungsquerschnitt des Hohlraums (108) ist.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkungsquerschnitt des Strömungsweges (112) gleich dem oder größer als der Molekül-Wirkungsquerschnitt des Biopolymers (109) und gleich der oder kleiner als die in der nachstehenden Formel definierte mittlere freie Weglänge S des Biopolymers (109) ist. $S = \sqrt{Dt}$
D: Diffusionskoeffizient des Biopolymers (109) t: mittlere Verweildauer in der Nähe der Nanopore (106)
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (111) nicht sphärisch sind, und die Zentren der Partikel (111) bei einer Figur, die von direkt oberhalb einer auf dem Dünnfilm (104) angeordneten ersten Schicht von Partikeln (111) auf den Dünnfilm (104) projiziert wurde, entweder das Gitter eines gleichseitigen Dreiecks beschreiben, wobei der Flächenanteil der projizierten Figur größer als π/(12)^1/2 ist, oder das Gitter eines Quadrats beschreiben, wobei der Flächenanteil der projizierten Figur größer als π/4 ist.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Material der Partikel (111) um eine Keramik oder um ein Harz handelt.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der dreidimensionale Strukturkörper (103) aus zwei oder mehreren Arten von Partikeln (111) mit einer unterschiedlichen Größe geformt ist.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem dreidimensionalen Strukturkörper (103) die Umgebung mit einer Wand (114), die dicker ist als die Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers (103), bedeckt ist.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein dreidimensionaler Strukturkörper (103) auf beiden Seiten des Dünnfilms (104) angeordnet ist.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke des dreidimensionalen Strukturkörpers (103) geringer ist als die Länge des Einfangbereichs des Biopolymers (109).
System für die Analyse von Biopolymeren (109), dadurch gekennzeichnet, dass das System aufweist: die Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, eine lonenstrommessvorrichtung (119), die den zwischen dem Paar Elektroden (105a, 105b), das die Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) aufweist, fließenden Ionenstrom misst, eine A/D-Wandlervorrichtung (120), die von der lonenstrommessvorrichtung (119) ausgegebene Signale in Digitalsignale umwandelt, und eine Datenverarbeitungsvorrichtung (121), die die von der A/D-Wandlervorrichtung (120) zugeführten Signale verarbeitet.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109), wobei die Vorrichtung (118) einen dreidimensionalen Strukturkörper (103) umfasst, der aus Partikeln (111) gebildet ist und einen Hohlraum (108) aufweist, und das Verfahren aufweist: einen Schritt, in dem die in einem Lösungsmittel dispergierten Partikel (111) auf einen Dünnfilm (104) aufgetragen werden und nach dem Auftragen nur das Lösungsmittel thermisch verdampft wird, wobei durch geeignete Auswahl der Materialeigenschaften der Partikel (111) dabei die jeweiligen Partikel (111) nicht-sphärisch verformt werden, einen Schritt, in dem die Ober- und Unterseite des Dünnfilms (104), auf dem der dreidimensionale Strukturkörper (103) angeordnet wurde, bei dem der Hohlraum (108) auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe (110) aufweist, die das Biopolymer (109) adsorbieren kann, in eine einen Elektrolyten aufweisende Lösung (102) eingetaucht wird, einen Schritt, in dem in die Lösung (102), in die die Oberfläche des Dünnfilms (104) eingetaucht wurde, und in die Lösung (102), in die die Unterseite eingetaucht wurde, ein Paar Elektroden (105a, 105b) getaucht wird, und einen Schritt, in dem an das Paar Elektroden (105a, 105b) eine impulsförmige Spannung angelegt wird, wodurch an der Stelle, an der sich der Dünnfilm (104) und der Hohlraum (108) berühren, eine Nanopore (106) eingebracht wird.
Analyseverfahren, das aufweist: einen Schritt, in dem mittels mehrerer Partikel (111), die auf der Oberfläche eine funktionelle Gruppe (110) aufweisen, die ein zu analysierendes Biopolymer (109) adsorbieren kann, aus einer Probe das zu analysierende Biopolymer (109) adsorbiert und eingesammelt wird, einen Schritt, in dem auf einem Dünnfilm (104), der eine Nanopore (106) aufweist, ein aus diesen mehreren Partikeln (111) gebildeter, dreidimensionaler Strukturkörper (103), der einen Hohlraum (108) aufweist, angeordnet wird, einen Schritt, in dem der Dünnfilm (104), der die Nanopore (106) aufweist, in eine Lösung (102) eingetaucht wird, die einen Elektrolyten beinhaltet, und zwischen zwei mit dem Dünnfilm (104) in der Mitte angeordneten Elektroden (105a, 105b) eine Spannung angelegt wird, und einen Schritt, in dem das zu analysierende Biopolymer (109) anhand des sich, wenn das zu analysierende Biopolymer (109) die Nanopore (106) passiert, ändernden lonenstroms analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Hohlraum (108) einen Strömungsweg (112) bildet, den die den Elektrolyten enthaltende Lösung (102) von der Nanopore (106) bis auf den dreidimensionalen Strukturkörper (103) passiert, und der dreidimensionale Strukturkörper (103) beim Anlegen der Spannung nicht in die Lösung (102) redispergiert.
Vorrichtung (118) für die Analyse von Biopolymeren (109) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Biopolymer (109) um eine einsträngige DNA handelt.