JP2016057263A - 生体ポリマ分析デバイス及び分析システム - Google Patents
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Abstract
Description
上記のグリセロール等を添加して粘度に代表される溶液物性を調整する手法では,例えば生体ポリマとして二本鎖DNAを対象とした場合が開示されており,添加前後でたかだか通過時間は5倍に遅延する程度にとどまる。加えて,生体ポリマ通過時に添加物も同時に通過するため,モノマ1分子単位のモノマ種別信号値差が小さくなり,モノマ種検出が困難になるという課題もある。リチウムイオンを添加する方法も,例えば生体ポリマとして一本鎖DNAを対象とした場合が開示されており,添加前後での遅延効果は10倍程度である。
上記以外の,課題,構成及び効果は,以下の実施形態の説明により明らかにされる。
図1は,本発明による生体ポリマ分析デバイスの一例を示す模式図である。
上記性質を備えた三次元構造体を実現する生体ポリマ分析デバイスの一形態として,図7にナノポア周辺部をデバイスに対して垂直上方から見た図を示す。また,図8は図7の断面Aにて切断したナノポア周辺の斜視模式図であり,図9はナノポア周辺の断面模式図である。
図11は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図11に示した実施例は,図9の隣接する粒子同士を一体化させたことを特徴とする。
図12は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図9には粒子が一層積層された三次元構造体の例を示したが,図12に示した実施例は粒子が多層積層された三次元構造体の例を示している。多層積層することにより,比表面積が積層分増大するため,上述した生体ポリマの吸着確率が向上し,更なる遅延効果が得られる。また,網目状流路の長さが更に増大するため,上述した直鎖にほどける効果が更に向上し,よりスムーズな検出が実現できる。
図13は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図13に示した実施例には,図12において異なるサイズを有した2種類の粒子を用いて三次元構造体を形成した例を示した。大小異なる2種類の粒子を用いることにより,小さい粒子が大きい粒子間の空隙に自己配列して配置されるようになり,比表面積を更に増大して生体ポリマの吸着確率を高めることができる。
図14は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は,異なるサイズを有した2種類の粒子を用いて,図13とは別形態の三次元構造体を形成したことを特徴とする。
図15は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図15に示した実施例は,例えば図12で示した三次元構造体の周囲に,三次元構造体の厚みよりも大きい厚みを有した壁114が備えられていることを特徴とする。
図17は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は,図9や図12とは逆の構造であり,粒子が空隙部,空隙部がバルク体部へと変更した逆オパール構造を三次元構造体に用いることを特徴とする。
図18は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図18には三次元構造体の最も単純な例として,ナノポア106を有する第一の薄膜104の上に,ナノポアの真上に空隙を有する第二の薄膜117を載置する例を示した。
図19は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。これまでの実施例では三次元構造体は全て薄膜の片側のみに載置した例を示していたが,本実施例は両側に載置することを特徴とする。これにより,更なる遅延効果を得ることが可能である。図19には図12に示した三次元構造体を薄膜104の両側に載置した例を示した。
図20は,本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は,三次元構造体の厚みが生体ポリマ捕捉長よりも小さいことを特徴とする。ここでは一例として,図9の実施例を示した。
流路及び空隙の断面積に関する定義は実施例1にて説明した内容と同一である。
図21は,本発明による生体ポリマ分析デバイスを用いた生体ポリマ分析システムの一例を示す概略図である。本システムは典型的には図1で示した生体ポリマ分析デバイス118,生体ポリマ分析デバイスの一対の電極の間に流れるイオン電流を計測するイオン電流計測装置119,イオン電流計測装置119の出力信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル出力変換装置120,アナログデジタル出力変換装置120から供給された信号を処理するデータ処理装置121,データ処理装置121による処理結果を表示するデータ表示出力装置122,入出力補助装置123から構成される。典型的にはイオン電流計測装置には電流電圧変換型の高速増幅回路が搭載され,データ処理装置には演算装置,一時記憶装置,不揮発性記憶装置が搭載されている。外部ノイズを低減するため,生体ポリマ分析デバイス部はファラデーケージで覆われていることが好ましい。
三次元構造体をナノポアが開口していない状態の絶縁薄膜の上に載置してからナノポアを開口することもできる。絶縁薄膜にパルス状の電圧を連続的に印加することにより所望の直径のナノポアを開口できる技術が文献(I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.)に記載されている。本発明の三次元構造体は薄膜まで接続された空隙を保有しており,この薄膜と接している空隙部が最も抵抗値が低い箇所となっている。そのため,上記パルス電圧を連続的に印加した際にこの薄膜と接した空隙部に電圧が集中することで,ナノポアを開口できる。
本実施例における流路及び空隙の断面積に関する定義は実施例1で説明した内容と同一である。
粒子を用いて三次元構造体を形成する場合には,検体からの標的生体ポリマ回収と,速度遅延の両方を一体化した生体ポリマ分析デバイスを実現することもできる。図24には本実施例のプロトコルの概念フローを,図25にはプロトコル手順の模式図を示した。
以下では,図21に示した生体ポリマ分析システムを用いた生体ポリマの分析例を示す。生体ポリマ分析デバイスとしては,図15に示した三次元構造体を有するデバイスを用いた。薄膜には,直径2nmのナノポアを有する窒化ケイ素から成る薄膜を用いた。粒子には表面がシラノール基で覆われた直径100nm,50nmのシリカナノ粒子と表面が1級アミン基で覆われた直径50nmのシリカナノ粒子を用いた。三次元構造体は上記粒子をディップコーティングにて塗布後,加熱乾燥することで成型した。また,対照実験として,三次元構造体が載置されていない直径2nmのナノポアを有する窒化ケイ素から成る薄膜だけから構成される分析デバイスも用意した。生体ポリマとしては人工的に合成された5000塩基長のポリアデニン(polyA)を用いた。溶液には1Mの塩化カリウムが溶解した水溶液を用いた。生体ポリマを搬送するための電位差としては1Vを印加した。
102 溶液
103 三次元構造体
104 薄膜
105 電極
106 ナノポア
107 溶液注入口
108 空隙
109 生体ポリマ
110 官能基
111 粒子
112 流路
114 壁
115 第二の薄膜
116 バルク体
117 空隙を有する第二の薄膜
118 生体ポリマ分析デバイス
119 イオン電流計測装置
120 アナログデジタル出力変換装置
121 データ処理装置
Claims (23)
- 生体ポリマと電解質が含まれる溶液を収納できる2つの槽と,
前記2つの槽にそれぞれ配置された一対の電極と,
ナノポアを有し,前記ナノポアを介して前記2つの槽が連通するように前記2つの槽の間に配置された薄膜と,
前記薄膜に載置された三次元構造体とを備え,
前記三次元構造体は空隙を有し,
前記空隙は前記溶液を前記ナノポアから前記三次元構造体の上まで通す流路を形成し,前記流路の表面は前記生体ポリマを吸着できる官能基を有しており,
前記一対の電極への電圧印加時に,少なくとも前記ナノポアを中心とし下式で定義される生体ポリマ捕捉長rを半径とする半球の範囲内において,前記三次元構造体が前記溶液に再分散しないことを特徴とする,生体ポリマ分析デバイス。
d:ナノポアの直径
μ:生体ポリマの電気泳動の移動度
L:薄膜の厚み
D:生体ポリマの拡散係数
ΔV:2つの電極間に印加した電圧差 - 前記官能基はシラノール基であることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記溶液はカオトロピック効果を有するチオシアン酸イオン(SCN-),リン酸二水素イオン(H2PO4 -),硫酸水素イオン(HSO4 -),炭酸水素イオン(HCO3 -),ヨウ化物イオン(I-),塩化物イオン(Cl-),硝酸イオン(NO3 -),アンモニウムイオン(NH4 +),セシウムイオン(Cs+),カリウムイオン(K+),グアニジウムイオン,又はテトラメチルアンモニウムイオンを含むことを特徴とする,請求項2に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記溶液のpHは1以上10以下であることを特徴とする,請求項2に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記溶液のイオン強度は10mM以上,飽和塩化カリウム溶液のイオン強度以下であることを特徴とする,請求項2に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記官能基はカチオンに電離する官能基であることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記カチオンに電離する官能基は,1級アミン基,2級アミン基,3級アミン基,4級アミン基,ピリジン基,イミノ基,イミダゾール基,ピラゾール基,又はトリアゾール基であることを特徴とする,請求項6に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記溶液のpHは前記カチオンに電離する官能基のpKa以下であることを特徴とする,請求項6に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記流路の断面積は前記生体ポリマの分子断面積以上,前記空隙の最大断面積以下であることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体は表面に前記生体ポリマを吸着できる官能基を有する複数の粒子から成型されていることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記成型後の粒子は非球状であり,前記薄膜に載置された粒子第1層を真上から前記薄膜へと投影した図形において,前記成型後の粒子中心間が正三角形の格子を描いている場合の前記投影図形の面積占有率がπ/(12)1/2よりも大きい,あるいは前記成型後の粒子中心間が正四角形の格子を描いている場合の前記投影図形の面積占有率がπ/4よりも大きいことを特徴とする,請求項11に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記成型後の粒子は多面体であることを特徴とする請求項11に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記粒子の材質はセラミックス又は樹脂であることを特徴とする,請求項11に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記成型後の粒子は焼結反応又はガラス転移温度以下にまで加熱することにより隣接する粒子同士が一体化していることを特徴とする,請求項11に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体は異なるサイズを有する2種類以上の粒子から成型されていることを特徴とする,請求項11に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体は逆オパール構造体であることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体は,周囲を前記三次元構造体の厚みよりも厚い壁で覆われていることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体は前記薄膜の両側に載置されていることを特徴とする,請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 前記三次元構造体の厚みは,前記生体ポリマ捕捉長よりも小さいことを特徴とする請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイス。
- 請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイスと,
前記生体ポリマ分析デバイスが備える前記一対の電極の間に流れるイオン電流を計測するイオン電流計測装置と,
前記イオン電流計測装置の出力信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換装置と,
前記アナログデジタル変換装置から供給された信号を処理するデータ処理装置と,
を有することを特徴とする生体ポリマ分析システム。 - 請求項1に記載の生体ポリマ分析デバイスの製造方法において,
空隙を有する三次元構造体であって,前記空隙は表面に生体ポリマを吸着できる官能基を有する三次元構造体が載置された絶縁体薄膜の表面及び裏面を,電解質を含んだ溶液に浸す工程と,
前記薄膜の表面が浸された溶液と裏面が浸された溶液に一対の電極を浸漬する工程と,
前記一対の電極にパルス状の電圧を印加する工程と,を有し,
前記薄膜と前記空隙が接する箇所にナノポアを開口することを特徴とする方法。 - 表面に標的生体ポリマが吸着できる官能基を有する複数の粒子を用いて,検体から前記標的生体ポリマを吸着回収する工程と,
ナノポアを有する薄膜上に前記粒子から成型された空隙を有する三次元構造体を載置する工程と,
前記ナノポアを有する薄膜を電解質を含む溶液に浸し,前記薄膜を挟んで配置された2つの電極間に電圧を印加する工程と,
前記標的生体ポリマが前記ナノポアを通過する時のイオン電流の変化から前記標的生体ポリマを分析する工程と,を有し,
前記空隙は前記電解質を含む溶液を前記ナノポアから前記三次元構造体の上まで通す流路を形成し,前記電圧印加時に,少なくとも前記ナノポアを中心として下式で定義される生体ポリマ捕捉長rを半径とする半球の範囲内において,前記溶液に再分散しないことを特徴とする分析方法。
d:ナノポアの直径
μ:標的生体ポリマの電気泳動の移動度
L:薄膜の厚み
D:標的生体ポリマの拡散係数
ΔV:2つの電極間に印加した電圧差
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