CN109312390A - 生物分子的分析方法以及分析装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够容易地抑制纳米孔堵塞的生物分子的分析方法。本发明的第一实施方式是生物分子的分析方法，包含：准备具有纳米孔的基板的工序；将包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液配置于所述基板上的工序；以及对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。

Description

生物分子的分析方法以及分析装置
技术领域
本发明涉及一种生物分子的分析方法以及分析装置。
背景技术
作为一种生物分子的核酸的碱基排列的解析技术逐渐变得非常重要，其目的在于对遗传疾病的原因遗传基因的检测、对药剂的有效性·副作用的评价、对与癌症疾病相关的遗传基因变异的检测等。核酸的碱基排列例如能够利用使用了毛细血管的电泳的荧光检测装置(Thermo Fisher Scientific赛默飞世尔公司制，3500Genetic Analyzer)、对固定于平板上的核酸进行荧光检测的装置(Illumina未因生物科技公司制，HiSeq2500)等进行解析。但是，这些装置由于需要高价的荧光检测器、荧光试剂，因此该试验成本变得较高。
因此，作为能够更廉价地进行检测的解析技术，研究了如下方法：通过检测出核酸通过纳米孔时产生的光或电信号的变化从而对该碱基排列进行解析。例如，首先利用透射电子显微镜将数nm的孔(纳米孔)形成于1～60nm的薄膜。接着，在该薄膜的两侧设置充满电解质溶液的液槽，而且在各个液槽中设置电极。然后，当在这些电极间施加电压时，离子电流通过纳米孔而流动。该离子电流与纳米孔的截面积大约成比例。当DNA通过纳米孔时，DNA封闭纳米孔，由于使纳米孔的有效截面积减少，因此离子电流减少。将由于DNA的通过而变化的离子电流称为封闭电流。基于封闭电流的大小，能够判断单链DNA和双链DNA的差异、碱基的种类。利用纳米孔的分析技术的对象不特别限定于DNA，例如还可列举RNA、肽、蛋白质等的生物分子。另外，由于DNA带负电，因此DNA从负极侧向正电极侧通过纳米孔。
作为1种生物试料的DNA包含的碱基，已知有嘌呤骨架即腺嘌呤和鸟嘌呤、嘧啶骨架即胞嘧啶和胸腺嘧啶(RNA是尿嘧啶)。已知腺嘌呤和胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤分别形成氢键，利用这些氢键，形成DNA双螺旋结构，另外，产生作为单链DNA的高阶结构的自身连接。DNA的双螺旋结构、单链DNA的高阶结构在通过纳米孔时成为较大位阻，有时会由于这些结构使得纳米孔阻塞。
针对与该阻塞相关的课题，在专利文献1中，记载有将激光作为热源照射于纳米孔来消除纳米孔阻塞的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开2013/0220811号说明书
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，利用纳米孔分析核酸等的生物分子的技术中，有时生物分子会将纳米孔阻塞。针对该课题，在专利文献1中，提出了通过激光照射来消除阻塞的技术，但是照射激光的设备的搭载会涉及到高价且具有复杂结构的分析装置。另外，有时会由于通过激光照射产生的热量使得生物分子的布朗运动变大。当生物分子的布朗运动变大时，由于通过纳米孔时的生物分子的运动变大，因此封闭电流值不稳定，从而难以正确地检测出生物分子。因此，寻求不设置激光照射设备等特别的机构，能够容易地抑制纳米孔阻塞的新技术。
本发明的目的在于提供一种能够容易地抑制纳米孔堵塞的生物分子的分析方法。
解决技术问题所采用的技术方案
(1)一种生物分子的分析方法，包含：准备具有纳米孔的基板的工序；将包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液配置于所述基板上的工序；以及对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
(2)在(1)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(I)：
[化学式1]
[式中，R11是取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的伯胺或其盐。
(3)在(1)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(II)：
[化学式2]
[式中，R21以及R22是分别独立的取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的仲胺或其盐。
(4)在(1)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(III)：
[化学式3]
[式中，R31、R32、R33以及R34是分别独立的氢原子、取代或无取代的碳数量为1～6的烷基、氰基或氨基。]
来表示的胍化合物或其盐。
(5)在(1)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是单甲胺或其盐、单乙胺或其盐、二甲胺或其盐、或者二乙胺或其盐。
(6)在(1)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是胍化合物或其盐、单氨基胍或其盐、或者二氨基胍或其盐。
(7)在(1)～(6)的任何一个所记载的生物分子的分析方法中，所述试料溶液的pH在7.2以上。
(8)在(1)～(6)的任何一个所记载的生物分子的分析方法中，所述试料溶液的pH在8.4以上。
(9)一种生物分子的分析方法，包含：准备具有纳米孔的基板的工序；使所述基板与包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的溶液相接触的工序；将包含生物分子的试料溶液配置于与所述溶液相接触的所述基板上的工序；以及对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
(10)在(9)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(I)：
[化学式4]
[式中，R11是取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的伯胺或其盐。
(11)在(9)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(II)：
[化学式5]
[式中，R21以及R22是分别独立的取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的仲胺或其盐。
(12)在(9)中所记载的生物分子的分析方法中，所述化合物(A)是用下述式(III)：
[化学式6]
[式中，R31、R32、R33以及R34是分别独立的氢原子、取代或无取代的碳数量为1～6的烷基、氰基或氨基。]
来表示的胍化合物或其盐。
(13)一种生物分子的分析装置，包括：
试料导入区域；
试料流出区域，所述生物分子从所述试料导入区域流入该试料流出区域；
基板，该基板配置于所述试料导入区域和试料流出区域之间，并且具有使所述生物分子从所述试料导入区域向所述试料流出区域通过的纳米孔；以及
检测部，该检测部对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测，
所述试料导入区域保持有包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液。
(14)一种溶液，用于通过对在通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测从而分析生物分子的方法，其特征在于，
包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)。
发明效果
本发明的目的在于提供一种能够容易地抑制纳米孔堵塞的生物分子的分析方法。
附图说明
图1是用于说明包括具有纳米孔的基板的纳米孔式分析装置的腔体部的结构的示意性剖视图。
具体实施方式
本说明书中，用语[生物分子]是指核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽、蛋白质、糖链等的生物体内存在的生物高分子。核酸包含单链、双链或三链的DNA、RNA、以及它们的任意的化学修饰。
本说明书中，用语[分析]意味着生物分子的特征决定、检测或鉴定，例如意味着决定生物分子的构成要素的排列。另外，本说明书中，生物分子的定序是指决定生物分子(例如DNA或RNA)的构成要素(碱基)的排列顺序。
本说明书中，用语[纳米孔]是指纳米级别尺寸(即、0.5nm以上且小于1μm的直径)的孔。纳米孔设置为贯通基板，并与试料导入区域和试料流出区域连通。
本发明涉及使用具有纳米孔的基板(以下称为纳米孔基板)，对生物分子在通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测从而对生物分子进行分析的方法。更具体而言，本发明涉及通过包括纳米孔基板的核酸定序(也称为纳米孔定序)来决定核酸的碱基排列的方法。
以下，针对本发明的实施方式使用附图进行详细说明。
[第一实施方式]
本发明的第一实施方式是一种生物分子的分析方法，包含：准备具有纳米孔的基板的工序；将包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液配置于所述基板上的工序；以及对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
本实施方式中，使用包含作为试料的生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液进行分析。通过使用包含化合物(A)的试料溶液，从而能够抑制纳米孔的阻塞。
(试料溶液)
化合物(A)是选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物。通过使试料溶液中含有化合物(A)并进行测定，从而能够抑制纳米孔的阻塞。
伯胺是将氨的一个氢原子以烃基(优选烷基)来取代的化合物。烃基的碳数量优选为1～6，优选为1～4，更优选为1～3。烃基也可具有取代基，作为取代基可以列举出氨基(-NH2)。伯胺优选不包含胍骨架。
伯胺优选为以下式(I)表示的化合物。
[化学式7]
[式(I)中，R11是取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
仲胺是将氨的两个氢原子以烃基(优选烷基)来取代的化合物。烃基的碳数量优选为1～6，优选为1～4，更优选为1～3。烃基也可具有取代基，作为取代基可以列举出氨基(-NH2)。仲胺优选不包含胍骨架。
仲胺优选为以下式(II)表示的化合物。
[化学式8]
[式(II)中，R21以及R22是分别独立的取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
胍化合物是具有胍骨架[HN＝C(NR’R”)2]的化合物。R’以及R”分别独立，例如可以列举出氢原子、烃基(优选烷基)、氨基、氰基等。烃基的碳数量优选为1～6，优选为1～4，更优选为1～3。烃基也可具有取代基，作为取代基例如可以列举出氨基(-NH2)。
胍化合物优选为以下式(III)表示的化合物。
[化学式9]
[式中，R31、R32、R33以及R34是分别独立的氢原子、取代或无取代的碳数量为1～6的烷基、氰基或氨基。]
式(I)～(III)中，烷基也可是直链状，也可是分支链状，或者也可是环状。烷基优选直链状或分支链状。烷基的碳数量优选为1～4，更优选为1～3，进一步优选为1～2。烷基优选是甲基或乙基，更优选甲基。
式(I)～(III)中，烷基的取代基优选氨基(-NH2)。
作为伯胺优选为可以列举出单甲胺或单乙胺。作为仲胺优选为可以列举出二甲胺或二乙胺。作为胍化合物优选为可以列举出胍、单氨基胍、或二氨基胍。即，作为化合物(A)优选为可以列举出单甲胺或其盐、单乙胺或其盐、二甲胺或其盐、二乙胺或其盐、胍或其盐、单氨基胍或其盐、或者二氨基胍或其盐。
作为伯胺、仲胺或胍化合物的盐的种类，可以列举出例如盐酸盐、硫氰酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、或碳酸盐等。
化合物(A)也可单独使用1种，也可将多种组合来使用。
化合物(A)的试料溶液中的浓度未作特别的限制，例如是0.1～10M，优选为1～8M，更优选为2～6M。
试料溶液的pH优选在7.5以上，更优选在8.0以上，进一步优选在8.4以上。通过使pH在7.5以上或8.0以上，从而能够更有效地抑制纳米孔的阻塞。试料溶液的pH优选在11.0以下，更优选在10.0以下。通过使pH在11.0以下，从而能够降低对纳米孔基板的破坏。
试料溶液除了作为试料的生物分子以及化合物(A)以外，还可含有水等的溶媒、添加剂。作为添加剂，可以列举出例如缓冲剂或电解质等。作为缓冲剂，可对应于生物分子的特性适当地选择，可以列举出例如三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCI)、或磷酸缓冲液等。这些中，三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐容易将试料溶液的pH控制在7.5以上的范围，因此特别优选。电解质(化合物(A)以外)是能够产生离子电流的化合物，例如是氯化钾或氯化钠等。电解质的浓度是例如0.1～3M。
(分析装置)
图1中示出用于说明本发明所涉及的分析方法中可使用的纳米孔式分析装置的腔体部的结构示例的示意剖视图。在图1中，腔体部101具有试料导入区域104、试料流出区域105、以及在试料导入区域104及试料流出区域105之间配置的具有纳米孔102的基板(纳米孔基板)103。试料导入区域104和试料流出区域105通过纳米孔102在空间上连通，作为试料113的生物分子能够通过纳米孔102从试料导入区域104向试料流出区域105移动。试料导入区域104中经由第一流入路106填充有第一液体110。另外，试料流出区域105中经由第二流入路107填充有第二液体111。另外，第一液体110以及第二液体111也可分别经由第一流出路108以及第二流出路109从试料导入区域104以及试料流出区域105流出。在分析中，第一液体110以及第二液体111也可从流入路向流出路流动，也可不流动。第一流入路106和第二流入路107也可夹着基板设置于相对的位置。另外，同样地，第一流出路108和第二流出路109也可夹着基板设置于相对的位置。
在一个实施方式中，基板103包含基底(基材)103a、以及形成于基底103a上的薄膜103b。另外,基板103也可包含形成于薄膜103b上的绝缘层103c。纳米孔形成于薄膜103b。通过将适合于形成纳米孔的材料以及厚度的薄膜形成于基底103a上，从而能够将纳米孔简单且高效地设置于基板。构成薄膜的材料可以列举出例如石墨烯、硅、硅化合物(例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)、金属氧化物、金属硅酸盐等。在优选的一个实施方式中，薄膜由含有硅或硅化合物的材料所形成。另外，薄膜(以及根据情况是基板整体)也可实质上是透明的。在此[实质上透明]意味着能够使外部光透过约50％以上，优选80％以上。另外，薄膜可是单层也可是多层。薄膜的厚度是0.1nm～200nm，优选为0.1nm～50nm，更优选为0.1nm～20nm。通过该技术领域中公知的技术，薄膜能够例如利用低压化学气相沉积(LPCVD)形成。
本发明中，至少第一液体110是上述的试料溶液。即，第一液体110是包含作为试料113的生物分子以及化合物(A)的试料溶液。另外，第二液体111也可包含生物分子以及化合物(A)。另外，本实施方式中，第一液体110除了包含生物分子以及化合物(A)以外，还可以包含溶剂(优选水)、电解质(例如KCL(氯化钾)或NaCL(氯化钠))。因该电解质引起的离子能够起到作为电荷负载的作用。作为电解质优选电离度较高的物质，如上所述，可以列举出例如氯化钾、氯化钠等。
腔体部101在试料导入区域104和试料流出区域105设置有第一电极114以及第二电极115，该第一电极114以及第二电极115配置成以使得夹着纳米孔102相对。在本实施方式中，腔体部也包括对于第一电极114以及第二电极115的电压施加单元。通过施加电压，具有电荷的试料113从试料导入区域104通过纳米孔102向试料流出区域105移动。
纳米孔式分析装置除了具有上述腔体部以外也可具有用于对生物分子通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的检测部。检测部也可具有：放大器(放大器)，该放大器放大电信号；模拟数字转换器，该模拟数字转换器将放大器的模拟输出转换成数字输出；以及存储装置等，该存储装置用于存储测量数据。
对生物分子通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的方法无特别限制，例如能够采用公知的检测方法。作为检测方法，具体而言，可以列举出例如封闭电流方式、隧道电流法、电容方式。作为示例，针对利用了封闭电流的检测方法以下简单地进行说明。生物分子(例如核酸)通过纳米孔时，由于生物分子阻塞纳米孔内，因此纳米孔中的离子流动减少，其结果是发生电流的减少(封闭电流)。通过测量该封闭电流的大小和该封闭电流的持续时间，从而能够对通过纳米孔的各个核酸分子的长度、碱基排列进行解析。另外，例如关于隧道电流方式，能够利用隧道电流检测出通过配置于纳米孔附近的电极间的生物分子。
另外，作为检测光变化的方法，也可以列举出利用拉曼光的检测方法。例如，通过对进入至纳米孔的生物高分子照射外部光(激励光)来激励生物高分子以产生拉曼散射光，从而能够基于该拉曼散射光的光谱来决定生物高分子的特征。在该情况下，测量部也可具有用于照射外部光的光源、以及检测拉曼散射光的检测器(分光检测器等)。另外，也可在纳米孔附近配置导电性薄膜以产生接近电场，来增强光。除了通过封闭电流方式、隧道电流方式或电容方式来检测以外，也可通过进行利用拉曼光的检测从而提高分析精度。
基板103具有至少一个纳米孔。基板103能够由电绝缘体材料、例如无机材料以及有机材料(包含高分子材料)来形成。作为构成基板的电绝缘体材料的示例，可以列举出硅(硅)、硅化合物、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为硅化合物可以列举出氮化硅、氧化硅、碳化硅、或氮氧化硅等。特别是构成基板支撑部的基底(基材)能够由这些任意的材料制作而成，例如优选由包含硅或硅化合物的材料(硅材料)形成。另外，作为构成形成纳米孔的部分即薄膜的材料，如上所述那样，可以列举出例如石墨烯、硅、硅化合物(例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)、金属氧化物、金属硅酸盐等。即使在这些材料中，也优选含有硅或硅化合物的材料。即，在本实施方式中，优选纳米孔设置于由含有硅或硅化合物的材料形成的构件中。含有硅或硅化合物的材料在其表面具有硅烷醇基。因此，在本发明的方法中，通过使化合物(A)作用于硅烷醇基，从而能够推测出抑制了核酸与硅烷醇基进行作用。另外，该推测并不限定本发明。
优选将绝缘层103c设置于薄膜103b上。绝缘层的厚度优选为5nm～50nm。作为绝缘层的材料能够使用任意的绝缘材料，优选为使用例如包含硅或硅化合物(例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅)的材料。
基板可由本技术领域中公知方法来制作。或者，基板也可通过作为市售商品来获得。基板能够使用例如光刻法、电子束光刻法、蚀刻法、激光烧蚀法、注塑成形法、铸造法、分子束外延法、化学气相沉积(CVD)法、介质击穿法、以及电子束或聚焦离子束法等的技术来制作。
纳米孔的尺寸能够根据分析对象的生物高分子的种类来选择适当的尺寸。纳米孔也可具有均匀的直径，也可根据部位具有不同的直径。纳米孔也可与具有1μm以上的直径的孔连结。纳米孔的直径优选在100nm以下，优选为1nm～100nm，优选为1nm～50nm，优选为1nm～10nm。
作为分析对象的生物分子的一个示例，可以列举出ssDNA(单链DNA)。ssDNA的直径约为1.5nm，用于分析ssDNA的纳米孔直径的合适范围为1.5nm～10nm，优选为1.5nm～2.5nm。dsDNA(双链DNA)的直径约为2.6nm，用于分析dsDNA的纳米孔直径的合适范围为3nm～10nm，优选为3nm～5nm。将其它生物分子、例如蛋白质、多肽、糖链等作为分析对象的情况也同样地，可考虑到生物分子的尺寸来选择纳米孔的直径。
纳米孔的深度(长度)能够通过设置纳米孔的构件的厚度(例如薄膜103b的厚度)来进行调整。纳米孔的深度优选为构成分析对象的生物分子的单体单位。例如在选择核酸作为生物分子的情况下，纳米孔的深度优选为1个碱基以下的大小，例如约0.3nm以下。纳米孔的形状基本是圆形的，但也可以是椭圆形、多边形。
在基板上至少能够设置一个纳米孔，在设置多个纳米孔的情况下，也可规则地进行排列。纳米孔能够通过本技术领域公知的方法，例如通过照射透射电子显微镜(TEM)的电子射束，或者使用纳米光刻技术或离子束光刻技术等来形成。也可通过绝缘破坏在基板上形成纳米孔。
如上所述，腔体部101除了具有试料导入区域104、试料流出区域105以及基板103以外，还可具有用于使试料113通过纳米孔102的第一电极114以及第二电极115。优选的示例中，腔体部101具有设置于试料导入区域104的第一电极114、设置于试料流出区域105的第二电极115、向第一电极以及第二电极施加电压的电压施加单元。也可在设置于试料导入区域104的第一电极114与设置于试料流出区域105的第二电极115之间设置有电流计117。通过第一电极114和第二电极115之间的电流能够对试料通过纳米孔的速度进行调整。对本领域技术人员而言能够对该电流的值进行适当选择，但在试料是DNA的情况下优选为100mV～300mV。
作为电极的材料，能够使用金属，可以列举出例如铂、钯、铑或钌等的铂族、金、银、铜、铝、镍、石墨(可以是单层或多层中的任意一个)，例如石墨烯、钨、或钽等。
[第二实施方式]
另外，本发明的第二实施方式是一种生物分子的分析方法，包含：准备具有纳米孔的基板的工序；使所述基板与包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的溶液相接触的工序；将包含生物分子的试料溶液配置于与所述溶液相接触的所述基板上的工序；以及对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
在本实施方式中，通过使用与包含上述化合物(A)的溶液相接触且优选浸渍后的纳米孔基板，对试料进行检测，从而也能够抑制纳米孔的阻塞。另外，或许可以推测出通过使纳米孔基板与包含化合物(A)的溶液相接触，从而化合物(A)会附着于纳米孔的壁面、纳米孔周边的基板表面，附着于该壁面的化合物(A)会对试料的测定产生某种良好的影响，可抑制纳米孔的阻塞，但是本发明不被该推测所限定。
[第三实施方式]
另外，本发明的第三实施方式是生物分子的分析装置，包括：试料导入区域；试料流出区域，所述生物分子从所述试料导入区域流入该试料流出区域的；基板，该基板配置于所述试料导入区域和试料流出区域之间，并且具有使所述生物分子从所述试料导入区域向所述试料流出区域通过的纳米孔；以及检测部，该检测部对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测，所述试料导入区域保持有包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液。
[第四实施方式]
另外，本发明的第四实施方式是一种溶液，用于通过对在通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测从而分析生物分子的方法，该溶液包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)。
本实施方式所涉及的溶液通过使该溶液中含有试料等成分以作为试料溶液，从而能够用于第一实施方式所涉及的分析方法。另外，本实施方式所涉及的溶液通过使该溶液中浸渍纳米孔基板，从而能够用于第二实施方式所涉及的分析方法。
实施例
以下，通过实施例来具体地说明本发明。另外，本发明不被下述的实施例所限定。
[实施例A]
实施例A中，针对本发明的第一实施方式的示例进行说明。
(试料)
作为试料，通过以下的方法制备具有数k～数十k碱基长度的DNA。首先，合成了连续地具有50个碱基的腺嘌呤，接着连续地具有25个碱基的胸腺嘧啶，接着连续地具有25个碱基的胞嘧啶的排列A50T25C25(单链DNA)。将该合成的单链DNA用单链DNA连接酶(CircLigase(商标)ssDNA Ligase，ARBROWN公司制)进行环状化后，用phi29 DNA聚合酶(Polymerase)(NewEngland BioLabs公司制)进行增幅，从而制备长链(数k～数十k碱基的长度)的DNA。合成的DNA具有连续的腺嘌呤和胸腺嘧啶的排列，因此通过自身杂交比较容易制作高阶结构。因此，可以优选用于本发明的评价。
(试料溶液)
实施例A中，准备下述8个试料溶液(水溶液)。此外，各试料溶液以浓度1ng/μ1含有上述单链DNA以作为试料。
·试料溶液E1:2M的1，3－二氨基胍盐酸盐、0.1M的Tris
·试料溶液E2:6M的胍盐酸盐、0.1M的Tris
·试料溶液E3:4M的二乙胺盐酸盐、0.1M的Tris
·试料溶液E4:6M的甲胺盐酸盐、0.1M的Tris
·试料溶液E4:4M的二甲胺盐酸盐、0.1M的Tris
·试料溶液C1:1M的氯化钾、10mM的Tris-HCl、1mM的EDTA
·试料溶液C2:1M的氯化钾、0.1M的Tris
·试料溶液C3:4M的三甲胺盐酸盐、0.1M的Tris
＊Tris(三羟甲基氨基甲烷)
另外，试料溶液C1以及C2具有在纳米孔式DNA序列中一般所使用的溶液组成。
(实施例A1)
将试料溶液E1配置于具有图1所示的结构的纳米孔式分析装置的试料导入区域104，测定通过纳米孔102时产生的封闭电流。纳米孔直径是1.4～2.0nm。另外，使用膜片钳放大器(Axopatch 200B amplifiers,Molecular Devices美谷分子仪器社制)来检测出封闭电流。封闭电流是在采样率为50kHz，施加电压为+300mV的条件下检测出的。从所获得的检测数据，针对[阻塞]、[事件次数]、[长时间封闭次数]、[频率]进行了评价。这里，[事件次数]表示单链DNA通过纳米孔的次数。[长时间封闭次数]表示电流值减小的状态保持5秒以上的次数。[频率]是由式：[长时间封闭次数]/[事件次数]×100(％)来计算出的。在电流值减小的状态保持5秒以上的情况下，通过将电压反转为-300mV从而消除了由于DNA所致的纳米孔的封闭状态。在即使反转电压也无法消除纳米孔封闭状态的情况下，将[阻塞]评价为[存在]。
(实施例A2)
除了将试料溶液E2代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(实施例A3)
除了将试料溶液E3代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(实施例A4)
除了将试料溶液E4代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(实施例A5)
除了将试料溶液E5代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例A1)
除了将试料溶液C1代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例A2)
除了将试料溶液C2代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
(比较例A3)
除了将试料溶液C3代替试料溶液E1进行使用以外，与实施例A1相同地对封闭电流进行了测定并评价。
表1示出实施例A1～A5以及比较例A1～A3的评价结果。
[表1]
在比较例A1～A3中，产生了几个DNA的通过事件，但产生了纳米孔的阻塞。在实施例A1～A5中，未产生纳米孔的阻塞。
[实施例B]
实施例B中，针对本发明的第二实施方式的示例进行说明。
(实施例B1)
首先，将溶液E6(4M的二甲胺盐酸盐以及包含0.1M的Tris的水溶液)添加于具有图1所示的结构的纳米孔式分析装置的试料导入区域104，并使纳米孔基板浸渍于溶液E6中30分钟。接着，将溶液E6从试料导入区域去除。接着，将在4M的二甲胺盐酸盐、0.1M的Tris溶液中作为试料DNA含有高阶结构的容易制作的鸟嘌呤碱基成列30个碱基的PolyG排列在内的试料溶液(以下表述为试料溶液E7)注入于试料导入区域104。并且，在与实施例A1相同的条件下对封闭电流进行了测定并评价。
(参考例B1)
不通过溶液E6对纳米孔基板进行浸渍，而将试料溶液E7注入于试料导入区域104，在与实施例A1相同的条件下对封闭电流进行了测定并评价。
(实施例B2)
与实施例B1相同地通过溶液E6对纳米孔基板进行浸渍后，将在6M的鸟嘌呤盐酸盐、0.1M的Tris溶液中作为试料DNA含有高阶结构的容易制作的鸟嘌呤碱基成列30个碱基的PolyG排列在内的试料溶液(以下表述为试料溶液E8)注入于试料导入区域104，在与实施例A1相同的条件下对封闭电流进行了测定并评价。
(参考例B2)
不通过溶液E6对纳米孔基板进行浸渍，而将试料溶液E8注入于试料导入区域104，在与实施例A1相同的条件下对封闭电流进行了测定并评价。
表2示出实施例B1～B5以及参考例B1～B2的评价结果。
[表2]
由实施例B1与参考例B1的比较、以及实施例B2与参考例B2的比较可知，通过使纳米孔基板浸渍于包含化合物(A)的溶液,从而在其之后的测定中，纳米孔由于试料而长时间封闭的次数或频度减少。因此，可理解即使通过本发明的第二实施方式也能够抑制纳米孔的阻塞。
标号说明
101 腔体部
102 纳米孔
103 基板
103a 基底(基材)
103b 薄膜
103c 绝缘层
104 试料导入区域
105 试料流出区域
106 第一流入路
107 第二流入路
108 第一流出路
109 第二流出路
110 第一液体
111 第二液体
113 试料(生物分子)
114 第一电极
115 第二电极
117 带电流计电源

Claims (14)

1.一种生物分子的分析方法，其特征在于，包含：
准备具有纳米孔的基板的工序；
将包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液配置于所述基板上的工序；以及
对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
2.如权利要求1所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(I)：
[化学式1]
[式中，R11是取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的伯胺或其盐。
3.如权利要求1所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(II)：
[化学式2]
[式中，R21以及R22是分别独立的取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的仲胺或其盐。
4.如权利要求1所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(III)：
[化学式3]
[式中，R31、R32、R33以及R34是分别独立的氢原子、取代或无取代的碳数量为1～6的烷基、氰基或氨基。]
来表示的胍化合物或其盐。
5.如权利要求1所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是单甲胺或其盐、单乙胺或其盐、二甲胺或其盐、或者二乙胺或其盐。
6.如权利要求1所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是胍或其盐、单氨基胍或其盐、或者二氨基胍或其盐。
7.如权利要求1至6中的任一项所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述试料溶液的pH在7.2以上。
8.如权利要求1至6中的任一项所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述试料溶液的pH在8.4以上。
9.一种生物分子的分析方法，其特征在于，
准备具有纳米孔的基板的工序；
使所述基板与包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的溶液相接触的工序；
将包含生物分子的试料溶液配置于与所述溶液相接触的所述基板上的工序；以及
对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测的工序。
10.如权利要求9所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(I)：
[化学式4]
[式中，R11是取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的伯胺或其盐。
11.如权利要求9所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(II)：
[化学式5]
[式中，R21以及R22是分别独立的取代或无取代的碳数量为1～6的烷基。]
来表示的仲胺或其盐。
12.如权利要求9所述的生物分子的分析方法，其特征在于，
所述化合物(A)是用下述式(III)：
[化学式6]
[式中，R31、R32、R33以及R34是分别独立的氢原子、取代或无取代的碳数量为1～6的烷基、氰基或氨基。]
来表示的胍化合物或其盐。
13.一种生物分子的分析装置，其特征在于，包括：
试料导入区域；
试料流出区域，生物分子从所述试料导入区域流入该试料流出区域；
基板，该基板配置于所述试料导入区域和试料流出区域之间，并且具有使所述生物分子从所述试料导入区域向所述试料流出区域通过的纳米孔；以及
检测部，该检测部对所述生物分子通过所述纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测，
所述试料导入区域保持有包含生物分子、和选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)的试料溶液。
14.一种溶液，用于通过对在通过纳米孔时产生的光或电信号的变化进行检测从而分析生物分子的方法，其特征在于，
包含选自伯胺、仲胺、胍化合物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180259475A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Seagate Technology Llc Vertical nanopore coupled with a pair of transverse electrodes having a uniform ultrasmall nanogap for dna sequencing
JP7174614B2 (ja) * 2018-12-12 2022-11-17 株式会社日立製作所 ナノポア形成方法及び分析方法
CN110628598A (zh) * 2019-10-19 2019-12-31 上海新微技术研发中心有限公司 模块化组装的纳米孔装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009515169A (ja) * 2005-11-02 2009-04-09 アボット・ラボラトリーズ 抗体ＩｇＧ結合活性の決定のための方法
US20140021047A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for analyzing biomolecules using asymmetric electrolyte concentration
US20140216933A1 (en) * 2011-06-24 2014-08-07 Electronic Biosciences, Inc. High contrast signal to noise ratio device components
JP2016057263A (ja) * 2014-09-12 2016-04-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマ分析デバイス及び分析システム

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5670278B2 (ja) 2011-08-09 2015-02-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポア式分析装置
US9638661B2 (en) 2012-02-23 2017-05-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method and apparatus for controlling a flow of particles by way of a through-hole

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009515169A (ja) * 2005-11-02 2009-04-09 アボット・ラボラトリーズ 抗体ＩｇＧ結合活性の決定のための方法
US20140216933A1 (en) * 2011-06-24 2014-08-07 Electronic Biosciences, Inc. High contrast signal to noise ratio device components
US20140021047A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for analyzing biomolecules using asymmetric electrolyte concentration
JP2016057263A (ja) * 2014-09-12 2016-04-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマ分析デバイス及び分析システム

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