JPWO2017212647A1 - 生体分子の分析方法および分析装置 - Google Patents

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Abstract

本発明の目的は、ナノポアの閉塞を容易に抑制することができる生体分子の分析方法を提供することである。本発明の第一の実施形態は、ナノポアを有する基板を用意する工程と、生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を、前記基板上に配置する工程と、前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、を含む、生体分子の分析方法である。

Description

本発明は、生体分子の分析方法および分析装置に関する。
生体分子の一つである核酸の塩基配列の解析技術は、遺伝的疾患の原因遺伝子の検出、薬剤の有効性・副作用の評価、ガン疾患に関連する遺伝子変異の検出などを目的として、非常に重要となってきている。核酸の塩基配列は、例えば、キャピラリーを用いた電気泳動を利用する蛍光検出装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）や平板上に固定した核酸を蛍光検出する装置（イルミナ社製、ＨｉＳｅｑ２５００）などを用いて解析することができる。しかし、これらの装置は、高価な蛍光検出器や蛍光試薬を必要とするため、その試験コストが高くなる。
そこで、より安価に検出できる解析技術として、核酸がナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出することより、その塩基配列を解析する方法が研究されている。例えば、まず、１〜６０ｎｍの薄膜に透過電子顕微鏡を用いて数ｎｍの穴（ナノポア）を形成する。次に、その薄膜の両側に電解質溶液を満たした液槽を設け、さらに、それぞれの液槽に電極を設ける。そして、これらの電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。このイオン電流はナノポアの断面積におよそ比例する。ＤＮＡがナノポアを通過する際、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、ナノポアの有効断面積を減少させるため、イオン電流が減少する。ＤＮＡの通過によって変化するイオン電流を封鎖電流と言う。封鎖電流の大きさを基にして、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異や、塩基の種類を判別することができる。ナノポアを用いた分析技術の対象は、特にＤＮＡに限られるものではなく、例えば、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質などの生体分子が挙げられる。なお、ＤＮＡは負に帯電しているため、負極側から正電極側に向かってナノポアを通過する。
生体試料の１種であるＤＮＡが含む塩基としては、プリン骨格であるアデニンとグアニン、ピリミジン骨格であるシトシンとチミン（ＲＮＡではウラシル）が知られている。アデニンとチミン、シトシンとグアニンはそれぞれ水素結合を形成することが知られており、それらの水素結合により、ＤＮＡの二重らせん構造が形成され、また、一本鎖ＤＮＡの高次構造となるセルフライゲーションが生じる。ＤＮＡの二重らせん構造や一本鎖ＤＮＡの高次構造は、ナノポアを通過させる際に大きな立体障害となり、これらの構造に起因してナノポアが閉塞される場合がある。
このような閉塞に関する課題に対し、特許文献１では、ナノポアに熱源としてレーザーを照射して、ナノポアの閉塞を解消する技術が記載されている。
米国特許出願公開第２０１３／０２２０８１１号明細書
上述のように、ナノポアを利用して核酸などの生体分子を分析する技術において、生体分子がナノポアを閉塞する場合がある。この課題に対し、特許文献１では、レーザー照射により閉塞を解消する技術が提案されているが、レーザーを照射する機器の搭載は、高価で複雑な構成を有する分析装置に繋がる。また、レーザー照射により発生した熱により、生体分子のブラウン運動が大きくなる場合がある。生体分子のブラウン運動が大きくなると、ナノポアを通過する際の生体分子の動きが大きくなるため、封鎖電流値が不安定になり、生体成分の正確な検出が困難になる。そのため、レーザー照射機器などの特別な機構を設けることなく、ナノポアの閉塞を容易に抑制することができる新たな技術が求められている。
本発明の目的は、ナノポアの閉塞を容易に抑制することができる生体分子の分析方法を提供することである。
（１） ナノポアを有する基板を用意する工程と、
生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を、前記基板上に配置する工程と、
前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、
を含む、生体分子の分析方法。
（２） 前記化合物（Ａ）が、下記式（Ｉ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ１１は、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
で表される第１級アミンまたはその塩である、(１)に記載の生体分子の分析方法。
（３） 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
で表される第２級アミンまたはその塩である、(１)に記載の生体分子の分析方法。
（４） 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩＩ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３およびＲ３４は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基、シアノ基またはアミノ基である。］
で表されるグアニジン化合物またはその塩である、(１)に記載の生体分子の分析方法。
（５） 前記化合物（Ａ）が、モノメチルアミンもしくはその塩、モノエチルアミンもしくはその塩、ジメチルアミンもしくはその塩、またはジエチルアミンもしくはその塩である、(１)に記載の生体分子の分析方法。
（６） 前記化合物（Ａ）が、グアニジンもしくはその塩、モノアミノグアニジンもしくはその塩、またはジアミノグアニジンもしくはその塩である、(１)に記載の生体分子の分析方法。
（７） 前記試料溶液のｐＨが、７．２以上である、(１)〜(６)のいずれか１つに記載の生体分子の分析方法。
（８） 前記試料溶液のｐＨが、８．４以上である、(１)〜(６)のいずれか１つに記載の生体分子の分析方法。
（９） ナノポアを有する基板を用意する工程と、
第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む溶液に前記基板を接触させる工程と、
前記溶液に接触させた前記基板上に生体分子を含む試料溶液を配置する工程と、
前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、
を含む、生体分子の分析方法。
（１０） 前記化合物（Ａ）が、下記式（Ｉ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ１１は、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
で表される第１級アミンまたはその塩である、(９)に記載の生体分子の分析方法。
（１１） 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
で表される第２級アミンまたはその塩である、(９)に記載の生体分子の分析方法。
（１２） 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩＩ）：
Figure 2017212647
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３およびＲ３４は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基、シアノ基またはアミノ基である。］
で表されるグアニジン化合物またはその塩である、(９)に記載の生体分子の分析方法。
（１３） 試料導入領域と、
前記試料導入領域から前記生体分子が流れ込む試料流出領域と、
前記試料導入領域と試料流出領域の間に配置され、かつ前記生体分子が前記試料導入領域から前記試料流出領域へ通過するナノポアを有する基板と、
前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する検出部と、
を備え、
前記試料導入領域が、生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を保持している、生体分子の分析装置。
（１４） ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出することにより生体分子を分析する方法に用いるための溶液であって、
第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む、溶液。
本発明により、ナノポアの閉塞を容易に抑制することができる生体分子の分析方法を提供することができる。
ナノポアを有する基板を備えるナノポア式分析装置のチャンバー部の構成を説明するための模式的断面図である。
本明細書において、用語「生体分子」は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖鎖などの生体内に存在する生体高分子を指す。核酸は、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの任意の化学修飾を含む。
本明細書において、用語「分析」は、生体分子の特徴決定、検出または同定を意味し、例えば、生体分子の構成要素の配列決定を意味する。また、本明細書において、生体分子のシークエンシングとは、生体分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の構成要素（塩基）の配列順序を決定することを指す。
本明細書において、用語「ナノポア」とは、ナノオーダーサイズ（すなわち、０．５ｎｍ以上１μｍ未満の直径）の孔を指す。ナノポアは、基板を貫通して設けられ、試料導入領域と試料流出領域とに連通する。
本発明は、ナノポアを有する基板（以下、ナノポア基板とも称す）を用い、生体分子がナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出することにより、生体分子を分析する方法に関する。より具体的には、本発明は、ナノポア基板を備える核酸シークエンサー（ナノポアシークエンサーとも称す）により核酸の塩基配列を決定する方法に関する。
以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。
［第一の実施形態］
本発明の第一の実施形態は、ナノポアを有する基板を用意する工程と、生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を、前記基板上に配置する工程と、前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、を含む、生体分子の分析方法である。
本実施形態では、試料としての生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）と、を含む試料溶液を用いて分析を行う。化合物（Ａ）を含む試料溶液を用いることにより、ナノポアの閉塞を抑制することができる。
（試料溶液）
化合物（Ａ）は、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である。化合物（Ａ）を試料溶液中に含有させて測定を行うことにより、ナノポアの閉塞を抑制することができる。
第１級アミンは、アンモニアの水素原子の一つを炭化水素基(好ましくはアルキル基)で置換した化合物である。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜６であり、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。炭化水素基は、置換基を有していてもよく、置換基としては、例えばアミノ基（−ＮＨ２）が挙げられる。第１級アミンはグアニジン骨格を含まないことが望ましい。
第１級アミンは、以下の式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。
Figure 2017212647
［式（Ｉ）中、Ｒ１１は、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］。
第２級アミンは、アンモニアの水素原子の二つを炭化水素基(好ましくはアルキル基)で置換した化合物である。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜６であり、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。炭化水素基は、置換基を有していてもよく、置換基としては、例えばアミノ基（−ＮＨ２）が挙げられる。第２級アミンはグアニジン骨格を含まないことが望ましい。
第２級アミンは、以下の式（ＩＩ）で表される化合物であることが好ましい。
Figure 2017212647
［式（ＩＩ）中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］。
グアニジン化合物は、グアニジン骨格「ＨＮ＝Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）２」を有する化合物である。Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立しており、例えば、水素原子、炭化水素基(好ましくはアルキル基)、アミノ基、シアノ基などが挙げられる。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜６であり、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。炭化水素基は、置換基を有していてもよく、置換基としては、例えばアミノ基（−ＮＨ２）が挙げられる。
グアニジン化合物は、以下の式（ＩＩＩ）で表される化合物であることが好ましい。
Figure 2017212647
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３およびＲ３４は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基、シアノ基またはアミノ基である。］。
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、または環状であってもよい。アルキル基は、好ましくは、直鎖状または分岐鎖状である。アルキル基の炭素数は、好ましくは、１〜４であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２である。アルキル基は、好ましくは、メチル基またはエチル基であり、より好ましくはメチル基である。
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、アルキル基の置換基は、好ましくはアミノ基（−ＮＨ２）である。
第１級アミンとしては、好ましくは、モノメチルアミンまたはモノエチルアミンが挙げられる。第２級アミンとしては、好ましくは、ジメチルアミンまたはジエチルアミンが挙げられる。グアニジン化合物としては、好ましくは、グアニジン、モノアミノグアニジン、またはジアミノグアニジンが挙げられる。すなわち、化合物（Ａ）としては、好ましくは、モノメチルアミンもしくはその塩、モノエチルアミンもしくはその塩、ジメチルアミンもしくはその塩、ジエチルアミンもしくはその塩、グアニジンもしくはその塩、モノアミノグアニジンもしくはその塩、またはジアミノグアニジンもしくはその塩が挙げられる。
第１級アミン、第２級アミンまたはグアニジン化合物の塩の種類としては、例えば、塩酸塩、チオシアン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、または炭酸塩などが挙げられる。
化合物（Ａ）は、１種を単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。
化合物（Ａ）の試料溶液中の濃度は、特に制限されるものではないが、例えば、０．１〜１０Ｍであり、好ましくは１〜８Ｍであり、より好ましくは２〜６Ｍである。
試料溶液のｐＨは、好ましくは７．５以上であり、より好ましくは８．０以上であり、さらに好ましくは８．４以上である。ｐＨを７．５以上または８．０以上とすることにより、ナノポアの閉塞をさらに効果的に抑制することができる。試料溶液のｐＨは、好ましくは１１．０以下であり、より好ましくは１０．０以下である。ｐＨを１１．０以下とすることにより、ナノポア基板へのダメージを低減することができる。
試料溶液は、試料としての生体分子および化合物（Ａ）に加え、水などの溶媒や添加剤を含有することができる。添加剤としては、例えば、緩衝剤または電解質などが挙げられる。緩衝剤としては、生体分子の特性に合わせて適宜選択することができるが、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）やトリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、またはリン酸緩衝液などが挙げられる。これらのうち、トリスやトリス塩酸塩は、試料溶液のｐＨを７．５以上の範囲で制御し易いため、特に好ましい。電解質（化合物（Ａ）を除く）は、イオン電流を発生させることができる化合物であり、例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどである。電解質の濃度は、例えば、０．１〜３Ｍである。
（分析装置）
図１に、本発明に係る分析方法に用いることができるナノポア式分析装置のチャンバー部の構成例を説明するための模式的断面図を示す。図１において、チャンバー部１０１は、試料導入領域１０４と、試料流出領域１０５と、試料導入領域１０４および試料流出領域１０５の間に配置された、ナノポア１０２を有する基板（ナノポア基板）１０３と、を有する。試料導入領域１０４と試料流出領域１０５は、ナノポア１０２により空間的に連通しており、試料１１３としての生体分子はナノポア１０２を通って試料導入領域１０４から試料流出領域１０５へと移動することができる。試料導入領域１０４には、第一の液体１１０が第一の流入路１０６を介して充填される。また、試料流出領域１０５には、第二の液体１１１が第二の流入路１０７を介して充填される。また、第一の液体１１０および第二の液体１１１は、それぞれ、第一の流出路１０８および第二の流出路１０９を介して試料導入領域１０４および試料流出領域１０５から流出してもよい。分析中、第一の液体１１０および第二の液体１１１は、流入路から流出路へ流れていてもよいし、流れていなくてもよい。第一の流入路１０６と第二の流入路１０７は基板を挟んで対向する位置に設けられてもよい。また、同様に、第一の流出路１０８と第二の流出路１０９は基板を挟んで対向する位置に設けられてもよい。
一実施形態において、基板１０３は、ベース（基材）１０３ａ、およびベース１０３ａ上に形成された薄膜１０３ｂを含む。また、基板１０３は、薄膜１０３ｂ上に形成された絶縁層１０３ｃを含んでもよい。ナノポアは薄膜１０３ｂに形成される。ナノポアを形成するのに適した材料および厚さの薄膜をベース１０３ａ上に形成することによって、ナノポアを簡便かつ効率的に基板に設けることができる。薄膜を構成する材料は、例えば、グラフェン、ケイ素、ケイ素化合物（例えば、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸窒化ケイ素）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが挙げられる。好ましい一実施形態において、薄膜がケイ素またはケイ素化合物を含有する材料から形成される。また、薄膜（および場合によっては基板全体）は、実質的に透明であってもよい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ５０％以上、好ましくは８０％以上透過できることを意味する。また、薄膜は、単層であっても複層であってもよい。薄膜の厚みは、０．１ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは０．１ｎｍ〜２０ｎｍである。薄膜は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（ＬＰＣＶＤ）により形成することができる。
本発明において、少なくとも第一の液体１１０が上述の試料溶液となる。すなわち、第一の液体１１０は、試料１１３としての生体分子と、化合物（Ａ）とを含む試料溶液である。なお、第二の液体１１１にも、生体分子および化合物（Ａ）が含まれていてもよい。また、本実施形態において、第一の液体１１０は、生体分子および化合物（Ａ）の他に、溶媒（好ましくは水）や電解質（例えば、ＫＣｌまたはＮａＣｌなど）を含むことができる。この電解質に起因するイオンが電荷の担い手として機能することができる。電解質としては、電離度が高い物質が好ましく、上述のように、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
チャンバー部１０１は、試料導入領域１０４と試料流出領域１０５に、ナノポア１０２を挟んで対向するように配置された第一の電極１１４および第二の電極１１５が設けられる。本実施形態において、チャンバー部は、第一の電極１１４および第二の電極１１５に対する電圧印加手段をも備える。電圧印加により、電荷をもつ試料１１３が試料導入領域１０４からナノポア１０２を通過して試料流出領域１０５へと移る。
ナノポア式分析装置は、上記チャンバー部に加えて、生体分子がナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出するための検出部を有してもよい。検出部は、電気的信号を増幅するアンプ（増幅器）、アンプのアナログ出力をデジタル出力に変換するアナログデジタル変換器、および計測データを記録するための記録装置などを有していてもよい。
生体分子がナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する方法は、特に制限されるものではなく、例えば、公知の検出方法を採用することができる。検出方法としては、具体的には、例えば、封鎖電流方式、トンネル電流方式、キャパシタンス方式が挙げられる。例として、封鎖電流を利用した検出方法について以下に簡単に説明する。生体分子（例えば核酸）がナノポアを通過する際、生体分子がナノポア内を塞ぐため、ナノポアにおけるイオンの流れが減少し、結果として電流の減少（封鎖電流）が生じる。この封鎖電流の大きさとその封鎖電流の継続時間を計測することにより、ナノポアを通過する個々の核酸分子の長さや塩基配列を解析することができる。また、例えば、トンネル電流方式に関しては、ナノポア近傍に配置した電極間を通る生体分子をトンネル電流で検知することができる。
また、光の変化を検出する方法としては、ラマン光を利用した検出方法も挙げられる。例えば、ナノポアに進入した生体高分子に外部光（励起光）を照射することにより生体高分子を励起させてラマン散乱光を発生させ、そのラマン散乱光のスペクトルに基づいて生体高分子の特徴を決定することができる。この場合、計測部は外部光を照射するための光源と、ラマン散乱光を検出する検出器（分光検出器など）を有していてもよい。また、ナノポア近傍に導電性薄膜を配置して近接場を発生させ、光を増強してもよい。封鎖電流方式、トンネル電流方式またはキャパシタンス方式による検出に加え、ラマン光を利用する検出も行うことにより、分析精度を高くすることも可能である。
基板１０３は、少なくとも１つのナノポアを有する。基板１０３は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料および有機材料（高分子材料を含む）から形成することができる。基板を構成する電気的絶縁体材料の例としては、シリコン（ケイ素）、ケイ素化合物、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。ケイ素化合物としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、炭化ケイ素、または酸窒化ケイ素などが挙げられる。特に基板の支持部を構成するベース（基材）は、これらの任意の材料から作製することができるが、例えばケイ素またはケイ素化合物を含む材料（シリコン材料）から形成されることが好ましい。また、ナノポアが形成される部分である薄膜を構成する材料としては、上述のように、例えば、グラフェン、ケイ素、ケイ素化合物（例えば、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸窒化ケイ素）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが挙げられる。これらの中でも、ケイ素またはケイ素化合物を含有する材料が好ましい。すなわち、本実施形態において、ケイ素またはケイ素化合物を含有する材料から形成される部材中にナノポアが設けられていることが好ましい。ケイ素またはケイ素化合物を含有する材料は、その表面にシラノール基を有する。そのため、本発明の方法において、化合物（Ａ）がシラノール基に作用することにより、核酸がシラノール基と作用することを抑制することが推測され得る。なお、当該推測は、本発明を限定するものではない。
薄膜１０３ｂ上には、絶縁層１０３ｃを設けることが好ましい。絶縁層の厚みは、好ましくは、５ｎｍ〜５０ｎｍである。絶縁層の材料としては、任意の絶縁体材料を使用できるが、例えば、ケイ素またはケイ素化合物（例えば、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸窒化ケイ素）を含む材料を使用することが好ましい。
基板は、当技術分野で公知の方法により作製することが可能である。あるいは、基板は、市販品として入手することも可能である。基板は、例えば、フォトリソグラフィ法、電子線リソグラフィ法、エッチング法、レーザーブレーション法、射出成形法、鋳造法、分子線エピタキシー法、化学蒸着（ＣＶＤ）法、誘電破壊法、および電子線もしくは収束イオンビーム法などの技術を用いて作製することができる。
ナノポアのサイズは、分析対象の生体高分子の種類によって適切なサイズを選択することができる。ナノポアは、均一な直径を有していてもよいが、部位により異なる直径を有してもよい。ナノポアは、１μｍ以上の直径を有するポアと連結していてもよい。ナノポアの直径は、好ましくは１００ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜５０ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜１０ｎｍである。
分析対象としての生体分子の一例として、ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）が挙げられる。ｓｓＤＮＡの直径は約１．５ｎｍであり、ｓｓＤＮＡを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は１．５ｎｍ〜１０ｎｍ、好ましくは１．５ｎｍ〜２．５ｎｍである。ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の直径は約２．６ｎｍであり、ｄｓＤＮＡを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は３ｎｍ〜１０ｎｍ、好ましくは３ｎｍ〜５ｎｍである。他の生体分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、糖鎖などを分析対象とする場合も同様に、生体分子の寸法を考慮してナノポアの直径を選択することができる。
ナノポアの深さ（長さ）は、ナノポアを設ける部材の厚さ（例えば薄膜１０３ｂの厚さ）により調整することができる。ナノポアの深さは、分析対象の生体分子を構成するモノマー単位とすることが好ましい。例えば生体分子として核酸を選択する場合には、ナノポアの深さは、塩基１個以下の大きさ、例えば約０．３ｎｍ以下とすることが好ましい。ナノポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
ナノポアは、基板に少なくとも１つ設けることができ、複数のナノポアを設ける場合、規則的に配列してもよい。ナノポアは、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の電子ビームを照射することにより、またはナノリソグラフィー技術またはイオンビームリソグラフィ技術などを使用することにより形成することができる。絶縁破壊によって基板にナノポアを形成してもよい。
上述の通り、チャンバー部１０１は、試料導入領域１０４、試料流出領域１０５および基板１０３に加え、試料１１３をナノポア１０２に通過させるための第一の電極１１４および第二の電極１１５を有することができる。好適な例では、チャンバー部１０１は、試料導入領域１０４に設けられた第一の電極１１４、試料流出領域１０５に設けた第二の電極１１５、第一の電極および第二の電極に電圧を印可する電圧印加手段を有する。試料導入領域１０４に設けた第一の電極１１４、試料流出領域１０５に設けた第二の電極１１５の間には、電流計１１７が配置されていてもよい。第一の電極１１４と第二の電極１１５の間の電流により、試料がナノポアを通過する速度を調整することができる。該電流の値は、当業者であれば適宜選択することができるが、試料がＤＮＡである場合、好ましくは１００ｍＶ〜３００ｍＶである。
電極の材料としては、金属を用いることができ、例えば、白金、パラジウム、ロジウムもしくはルテニウムなどの白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、グラファイト（単層または複層のいずれでもよい）、例えばグラフェン、タングステン、またはタンタルなどが挙げられる。
［第二の実施形態］
また、本発明の第二の実施形態は、ナノポアを有する基板を用意する工程と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む溶液に前記基板を接触させる工程と、前記溶液に接触させた前記基板上に生体分子を含む試料溶液を配置する工程と、前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、を含む、生体分子の分析方法である。
本実施形態においては、上述の化合物（Ａ）を含む溶液に接触させた、好ましくは浸漬させたナノポア基板を用いて、試料の検出を行うことによっても、ナノポアの閉塞を抑制することができる。なお、おそらく、ナノポア基板を化合物（Ａ）を含む溶液に接触させることにより、ナノポアの壁面やナノポア周辺の基板表面に化合物（Ａ）が付着し、この壁面に付着した化合物（Ａ）が試料の測定に何らかの良好な影響を与え、ナノポアの閉塞を抑制し得るものと推測されるが、本発明はこの推測により限定されるものではない。
［第三の実施形態］
また、本発明の第三の実施形態は、生体分子の分析装置であって、試料導入領域と、前記試料導入領域から前記生体分子が流れ込む試料流出領域と、前記試料導入領域と試料流出領域の間に配置され、かつ前記生体分子が前記試料導入領域から前記試料流出領域へ通過するナノポアを有する基板と、前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する検出部と、を備え、前記試料導入領域が、生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を保持している、生体分子の分析装置である。
［第四の実施形態］
また、本発明の第四の実施形態は、ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出することにより生体分子を分析する方法に用いるための溶液であって、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む溶液である。
本実施形態に係る溶液は、当該溶液に試料などの成分を含有させて試料溶液とすることにより、第一の実施形態に係る分析方法に用いることができる。また、本実施形態に係る溶液は、当該溶液にナノポア基板を浸漬させることにより、第二の実施形態に係る分析方法に用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［実施例Ａ］
実施例Ａでは、本発明の第一の実施形態の例について説明する。
（試料）
試料として、数ｋ〜数十ｋ塩基の長さを有するＤＮＡを以下の方法により調製した。まず、アデニンを連続して５０塩基、続いてチミンを連続して２５塩基、続いてシトシンを連続して２５塩基有する配列Ａ５０Ｔ２５Ｃ２５（一本鎖ＤＮＡ）を合成した。この合成した一本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標） ｓｓＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、エアブラウン社製）を用いて環状化した後、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いて増幅を行い、長鎖（数ｋ〜数十ｋ塩基の長さ）のＤＮＡを調製した。合成したＤＮＡは連続するアデニンとチミンの配列を有するため、自己ハイブリダイゼーションにより高次構造を比較的作りやすい。したがって、本発明の評価に好ましく用いることができる。
（試料溶液）
実施例Ａでは、下記８つの試料溶液（水溶液）を用意した。なお、各試料溶液は、試料として上記一本鎖ＤＮＡを濃度１ｎｇ／μｌで含有する。
・試料溶液Ｅ１：２Ｍ １，３−ジアミノグアニジン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｅ２：６Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｅ３：４Ｍ ジエチルアミン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｅ４：６Ｍ メチルアミン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｅ５：４Ｍ ジメチルアミン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｃ１：１Ｍ 塩化カリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
・試料溶液Ｃ２：１Ｍ 塩化カリウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
・試料溶液Ｃ３：４Ｍ トリメチルアミン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
＊Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）
なお、試料溶液Ｃ１およびＣ２は、ナノポア式ＤＮＡシーケンスにおいて一般的に使用される溶液組成を有する。
（実施例Ａ１）
試料溶液Ｅ１を図１に示す構成を有するナノポア式分析装置の試料導入領域１０４に配置し、ナノポア１０２を通過する際に生じる封鎖電流を測定した。ナノポア径は１．４〜２．０ｎｍであった。また、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて封鎖電流を検出した。封鎖電流は、サンプリングレートが５０ｋＨｚ、印可電圧が＋３００ｍＶの条件下で検出した。得られた検出データから、「閉塞」、「イベント回数」、「長時間封鎖回数」、「頻度」について評価した。なお、「イベント回数」は一本鎖ＤＮＡがナノポアを通過した回数を示す。「長時間封鎖回数」は電流値が減少した状態が５秒以上保持された回数を示す。「頻度」は、式：「長時間封鎖回数」／「イベント回数」×１００（％）により算出した。電流値が減少した状態が５秒以上保持された場合は、電圧を−３００ｍＶに反転させることによってＤＮＡによるナノポアの封鎖状態を解消した。電圧を反転させてもナノポアの封鎖状態を解消できなかった場合、「閉塞」を「あり」と評価した。
（実施例Ａ２）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｅ２を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（実施例Ａ３）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｅ３を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（実施例Ａ４）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｅ４を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（実施例Ａ５）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｅ５を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（比較例Ａ１）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｃ１を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（比較例Ａ２）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｃ２を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
（比較例Ａ３）
試料溶液Ｅ１の代わりに試料溶液Ｃ３を用いたこと以外は、実施例Ａ１と同様にして封鎖電流を測定し、評価した。
実施例Ａ１〜Ａ５および比較例Ａ１〜Ａ３の評価結果を表１に示す。
Figure 2017212647
比較例Ａ１〜Ａ３では、いくらかのＤＮＡの通過イベントが発生したが、ナノポアの閉塞が発生した。実施例Ａ１〜Ａ５においては、ナノポアの閉塞が発生しなかった。
［実施例Ｂ］
実施例Ｂでは、本発明の第二の実施形態の例について説明する。
（実施例Ｂ１）
まず、溶液Ｅ６（４Ｍ ジメチルアミン塩酸塩および０．１Ｍ Ｔｒｉｓを含む水溶液）を、図１に示す構成を有するナノポア式分析装置の試料導入領域１０４に添加し、ナノポア基板を溶液Ｅ６に３０分間浸漬させた。次に、溶液Ｅ６を試料導入領域から除去した。次に、４Ｍ ジメチルアミン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液に、試料ＤＮＡとして高次構造の作りやすいグアニン塩基が３０塩基連なったＰｏｌｙＧ配列を含有した試料溶液（以下試料溶液Ｅ７と表記）を、試料導入領域１０４に注入した。そして、実施例Ａ１と同様の条件にて、封鎖電流を測定し、評価した。
（参考例Ｂ１）
溶液Ｅ６によるナノポア基板の浸漬を行わずに、試料溶液Ｅ７を試料導入領域１０４に注入し、実施例Ａ１と同様の条件にて、封鎖電流を測定し、評価した。
（実施例Ｂ２）
実施例Ｂ１と同様にして溶液Ｅ６によるナノポア基板の浸漬を行った後、６Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液に、試料ＤＮＡとして高次構造の作りやすいグアニン塩基が３０塩基連なったＰｏｌｙＧ配列を含有した試料溶液（以下試料溶液Ｅ８と表記）を、試料導入領域１０４に注入し、実施例Ａ１と同様の条件にて、封鎖電流を測定し、評価した。
（参考例Ｂ２）
溶液Ｅ６によるナノポア基板の浸漬を行わずに、試料溶液Ｅ８を試料導入領域１０４に注入し、実施例Ａ１と同様の条件にて、封鎖電流を測定し、評価した。
実施例Ｂ１〜Ｂ２および参考例Ｂ１〜Ｂ２の評価結果を表２に示す。
Figure 2017212647
実施例Ｂ１と参考例Ｂ１との比較、および実施例Ｂ２と参考例Ｂ２との比較から、化合物（Ａ）を含む溶液にナノポア基板を浸漬させることにより、その後の測定において、ナノポアが試料により長時間封鎖される回数または頻度が減少することがわかる。そのため、本発明の第二の実施形態によっても、ナノポアの閉塞が抑制されることが理解できる。
１０１ チャンバー部
１０２ ナノポア
１０３ 基板
１０３ａ ベース（基材）
１０３ｂ 薄膜
１０３ｃ 絶縁層
１０４ 試料導入領域
１０５ 試料流出領域
１０６ 第一の流入路
１０７ 第二の流入路
１０８ 第一の流出路
１０９ 第二の流出路
１１０ 第一の液体
１１１ 第二の液体
１１３ 試料（生体分子）
１１４ 第一の電極
１１５ 第二の電極
１１７ 電流計付電源

Claims (14)

  1. ナノポアを有する基板を用意する工程と、
    生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を、前記基板上に配置する工程と、
    前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、
    を含む、生体分子の分析方法。
  2. 前記化合物（Ａ）が、下記式（Ｉ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ１１は、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
    で表される第１級アミンまたはその塩である、請求項１に記載の生体分子の分析方法。
  3. 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
    で表される第２級アミンまたはその塩である、請求項１に記載の生体分子の分析方法。
  4. 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩＩ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３およびＲ３４は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基、シアノ基またはアミノ基である。］
    で表されるグアニジン化合物またはその塩である、請求項１に記載の生体分子の分析方法。
  5. 前記化合物（Ａ）が、モノメチルアミンもしくはその塩、モノエチルアミンもしくはその塩、ジメチルアミンもしくはその塩、またはジエチルアミンもしくはその塩である、請求項１に記載の生体分子の分析方法。
  6. 前記化合物（Ａ）が、グアニジンもしくはその塩、モノアミノグアニジンもしくはその塩、またはジアミノグアニジンもしくはその塩である、請求項１に記載の生体分子の分析方法。
  7. 前記試料溶液のｐＨが、７．２以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子の分析方法。
  8. 前記試料溶液のｐＨが、８．４以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体分子の分析方法。
  9. ナノポアを有する基板を用意する工程と、
    第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む溶液に前記基板を接触させる工程と、
    前記溶液に接触させた前記基板上に生体分子を含む試料溶液を配置する工程と、
    前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する工程と、
    を含む、生体分子の分析方法。
  10. 前記化合物（Ａ）が、下記式（Ｉ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ１１は、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
    で表される第１級アミンまたはその塩である、請求項９に記載の生体分子の分析方法。
  11. 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基である。］
    で表される第２級アミンまたはその塩である、請求項９に記載の生体分子の分析方法。
  12. 前記化合物（Ａ）が、下記式（ＩＩＩ）：
    Figure 2017212647
     ［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３およびＲ３４は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１〜６のアルキル基、シアノ基またはアミノ基である。］
    で表されるグアニジン化合物またはその塩である、請求項９に記載の生体分子の分析方法。
  13. 試料導入領域と、
    前記試料導入領域から生体分子が流れ込む試料流出領域と、
    前記試料導入領域と試料流出領域の間に配置され、かつ前記生体分子が前記試料導入領域から前記試料流出領域へ通過するナノポアを有する基板と、
    前記生体分子が前記ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出する検出部と、
    を備え、
    前記試料導入領域が、生体分子と、第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含む試料溶液を保持している、生体分子の分析装置。
  14. ナノポアを通過する際に生じる光または電気的信号の変化を検出することにより生体分子を分析する方法に用いるための溶液であって、
    第１級アミン、第２級アミン、グアニジン化合物およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の化合物（Ａ）を含む、溶液。
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