Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft die selektive Bestimmung
von mikrobiellen Zellen in einer Probe, in der sowohl
mikrobielle als auch nichtmikrobielle Zellen vermutet
werden. Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft die
Verwendung eines Assays, z. B. eines Biolumineszenzassays, zur
Bestimmung von mikrobiellen Nukleotiden in einem Verfahren
zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Anzahl oder Biomasse
von mikrobiellen Zellen in einer Probe sowie das
Inaktivieren oder Entfernen von nichtmikrobiellen Nukleotiden vor
dem Erfassen von mikrobiellen Nukleotiden.
Hintergrund der Erfindung
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Für die derzeitigen Biolumineszenzassays zum
Bestimmen des Vorhandenseins, der Anzahl oder der Biomasse
von mikrobiellen Zellen in einer Probe, die auch
nichtmikrobielle Zellen enthalten kann, werden unerwünscht lange
Behandlungszeiten benötigt. Diese Verfahren beruhen
allgemein auf dem Erfassen von mikrobiellen Nukleotiden, wie
dem Adenosintriphosphat (ATP). In einem typischen Assay
können mikrobielle Zellen so behandelt werden, daß sie ihr
ATP in Lösung bringen, so daß es mit den in dem
Biolumineszenzassay verwendeten Reagenzien in Gegenwart von
Magnesium und Sauerstoff unter Erzeugen von Photonen reagieren
kann. Zu diesen Reagenzien gehören das Enzym
Leuchtkäferluciferase und Luciferin als Substrat. Diese Photonen können
erfaßt werden, und ihre Anzahl korreliert mit der Menge des
ATP und daher mit der Anzahl oder Masse der ursprünglich
vorhandenen Zellen. Siehe allgemein die US-PSen 3 745 090,
3 971 703, 4 014 745, 4 264 727, 4 303 752 und 4 501 813
und Leach, J. Appl. Biochem. 3, 473-517 (1981).
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Die Behandlungszeiten
sind unerwünscht lang,
weil zunächst dafür gesorgt werden muß, daß in der Probe
etwa vorhandene nichtnukleotide Zellen von den Nukleotiden
des Assays entfernt werden. In der US-PS 3 745 090 wird
vorgeschlagen, nichtmikrobielles ATP wie folgt zu
entfernen: Die Probe wird zum spezifischen Freisetzen von ATP
aus nichtmikrobiellen Zellen veranlaßt; das freigesetzte
ATP wird durch Zusatz eines "ATP-hydrolysierenden Enzyms"
z. B. einer ATPase oder häufiger einer Apyrase, die beide
Hydrolasen sind, hydrolysiert oder "inaktiviert", und dann
wird das Enzym inaktiviert oder zerstört, so daß es später
von den mikrobiellen Zellen freigesetzte Zellen nicht
beeinflußt. Dann wird das mikrobielle ATP freigesetzt und
durch ein Biolumineszenzassay erfaßt.
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In der US-PS 3 745 090 werden verschiedene
Maßnahmen zum Inaktivieren oder Zerstören der Apyraseaktivität
vorgeschlagen. Durch einige der dort vorgeschlagenen
Maßnahmen werden alle Proteine der Probe (einschließlich der
Enzyme) unspezifisch und unumkehrbar zerstört, z. B. durch
Wärme- oder Säurebehandlung. Derartige Maßnahmen sind nicht
einfach durchzuführen und häufig gefährlich und sind
radikal, weil sie sehr wahrscheinlich auch mikrobielle Zellen
zerstören und dadurch die Empfindlichkeit und Genauigkeit
des Assays beeinträchtigen.
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In der genannten Patentschrift wird auch die
Verwendung von "Enzyminhibitoren" vorgeschlagen, doch sind
bisher offenbar keine Inhibitoren bekannt, die ein ATP-
hydrolysierendes Enzym, wie Apyrase, inhibieren können und
z. B. hinsichtlich der Reaktionspartner, der Reaktionen und/
oder der Ergebnisse eines darauffolgenden
Biolumineszenzassays für die Verwendung in derartigen Verfahren geeignet
sind.
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Infolgedessen hat man trotz der in der US-PS
3 745 090 vorgeschlagenen Maßnahmen in technischen Verfahren
den potentiellen Einfluß des gewöhnlich als Hydrolase
verwendeten Enzyms Apyrase auf das mikrobielle ATP einfach
dadurch unterdrückt, daß die Apyrase in niedrigen
Konzentrationen verwendet wird, wie es in der US-PS 4 303 752
vorgeschlagen wird. Bei diesen niedrigen Konzentrationen
braucht die Apyrase zum Inaktivieren des nichtmikrobiellen
ATP entsprechend mehr Zeit. Nach dem vollstandigen
Inaktivieren des nichtmikrobiellen ATP kann dann das mikrobielle
ATP freigesetzt und einem Assay unterworfen werden, obwohl
ein Teil dieses ATP in dem Verfahren durch die noch
vorhandene und noch aktive Apyrase inaktiviert wird.
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Daher ist bei einer gegebenen Anwendung die
optimale Menge der verwendeten Apyrase im allgemeinen jene
Menge, mit der die nichtmikrobiellen Nukleotide in der
kürzestmöglichen Zeit inaktiviert werden können, mit der aber
doch noch ein Erfassen von mikrobiellem ATP möglich ist.
Infolgedessen sind die Apyrasekonzentrationen im allgemeinen
sehr niedrig und daher in dem Gesamtverfahren das
Inaktivieren des nichtmikrobiellen ATP der am längsten dauernde
Schritt. In zahlreichen der im Handel erhältlichen
Biolumineszenzassays zum Erfassen von Mikroben werden zum
vollständigen Inaktivieren des nichtmikrobiellen ATP durch
Apyrase Zeiträume von etwa 10 bis 60 Minuten benötigt. Man
kann dies mit den anderen Schritten eines typischen Assays
vergleichen, z. B. mit dem Hinzufügen und Mischen von
Reagenzien, dem Freisetzen von mikrobiellem ATP und dem
Erzeugen und Zahlen von Photonen, was gewöhnlich in Zeiträumen
in der Größenordnung von Minuten oder sogar von Sekunden
erfolgt und in automatischen Verfahren durchgeführt wird, die
für diese Assays spezifisch sind. In zahlreichen
Anwendungen, z. B. bei der Reihenuntersuchung von zahlreichen
Proben, wäre es sehr vorteilhaft, wenn die
nichtmikrobiellen Nukleotide in kürzerer Zeit inaktiviert werden könnten
und dieser Schritt daher in automatische Assayverfahren
aufgenommen werden könnte.
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Somit ist für das schnelle Inaktivieren von
nichtmikrobiellen Nukleotiden ein Verfahren erwünscht,
dessen Wirkungen schnell und wirksam derart unterdrückt
werden können, daß sie das darauffolgende Assay auf
mikrobielle Nukleotide nicht beeinträchtigen.
Angabe der Erfindung
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Die Erfindung schafft ein Verfahren zum
selektiven Bestimmen von mikrobiellen Nukleotiden in einer Probe,
von der vermutet wird, daß sie sowohl nichtmikrobielle als
auch mikrobielle Zellen enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
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(1) nichtmikrobielle Nukleotide werden selektiv
freigesetzt;
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(2) im wesentlichen alle freigesetzten
nichtmikrobiellen Nukleotide werden durch die Verwendung einer
wirksamen Menge eines inaktivierenden Enzyms inaktiviert, das
keine Hydrolase ist und das durch einen spezifischen
Inhibitor inhibierbar ist,
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(3) durch die Verwendung einer wirksamen Menge eines
spezifischen Inhibitors wird das inaktivierende Enzym im
wesentlichen vollständig inhibiert,
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(4) mikrobielle Nukleotide werden selektiv
freigesetzt und
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(5) durch ein geeignetes Assay wird eine statistisch
signifikante Menge der freigesetzten mikrobiellen
Nukleotide erfaßt.
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Man kann das Verfahren für das bloße Erfassen von
mikrobiellen Zellen, aber auch zum Bestimmen der Anzahl oder
Biomasse von mikrobiellen Zellen anwenden, z. B. durch
Korrelieren der Menge der in einem Biolumineszenzassay erfaßten
mikrobiellen Nukleotide mit der Konzentration der
Nukleotide pro Zelle. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht
die Verwendung von inaktivierenden Enzymen in so hohen
Konzentrationen, daß das Inaktivieren in sehr kurzer Zeit
durchgeführt werden und dadurch die für die Bestimmung
erforderliche Gesamtzeit beträchtlich verkürzt werden kann.
Das Verfahren kann den automatischen Assaytechniken, die
derzeit in Biolumineszenzassays angewendet werden, leicht
angepaßt werden und ist mit ihnen kompatibel.
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Das Verfahren kann allgemein sogar angewendet
werden, wenn ein Inhibitor gegen eine Reagens des
Biolumineszenzassays selbst wirksam sein konnte, weil die
Konzentration des wirksamen Inhibitors gegenüber dem Reagens für das
Biolumineszenzassay so niedrig gehalten werden kann, daß
die Aktivität des in dem Biolumineszenzassay verwendeten
Reagens eine genügende Empfindlichkeit des Assays
gewährleistet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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In dieser Schrift bezeichnet
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der Ausdruck "Assay" jedes Assay zum Erfassen
eines in einer lebenden Zelle enthaltenen oder von ihr
erzeugten Nukleotids,
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der Ausdruck "Nukleotid" jedes aus einem Pyrin,
Pyrimidin oder Pyridin bestehende Nukleotid, das durch ein
Assay direkt oder indirekt erfaßbar ist,
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der Ausdruck "inaktivierendes Enzym" ein Enzym,
das eine solche Wirkung hat, daß es ein Erfassen eines
Nukleotids in einem Assay verhindert, in dem das Nukleotid
sonst erfaßt werden könnte, d. h., ein Nukleotid
"inaktiviert".
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Sofern aus dem Zusammenhang nichts anderes
hervorgeht, bezeichnen der Ausdruck "inhibieren" und davon
abgeleitete Ausdrücke, wie "spezifischer Inhibitor", jede
direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen einem
Molekül, einer Verbindung, einem Reagens und/oder einer
Bedingung und einem inaktivierenden Enzym, wobei diese
Wechselwirkung insofern spezifisch ist, als alle oder die
meisten anderen Proteine in der das Enzym enthaltenden Probe
durch die Wechselwirkung nicht unumkehrbar zerstört werden,
z. B. durch Wärme oder Säure, und die Wechselwirkung
wenigstens teilweise dafür verantwortlich ist, daß die Aktivität
des Enzyms derart und in einem solchen Grade vermindert
wird, daß durch das Assay eine statistisch signifikante
Menge von mikrobiellen Nukleotiden, wenn sie vorhanden ist,
erfaßt werden kann.
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Die hier verwendeten Ausdrücke "nichtmikrobiell"
und "mikrobiell" schließen einander aus und bezeichnen
Zellen, die Nukleotide selektiv freisetzen können, z. B. unter
der Einwirkung von nichtionischen bzw. ionischen Tensiden,
wie dies in der US-PS 4 303 752 angegeben ist.
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Mit "nichtmikrobiell" werden auch freie oder
andere Nukleotide bezeichnet, die in einer von einer
beliebigen Quelle stammenden Probe vorhanden sind und vor dem
Freisetzen von in der Probe vorhandenen mikrobiellen
Nukleotiden inaktiviert werden sollen. Die Ausdrücke "erstes
Freisetzungsmittel" und "zweites Freisetzungsmittel"
bezeichnen in dieser Schrift die zum Freisetzen von
nichtmikrobiellen bzw. mikrobiellen Nukleotiden verwendeten
Mittel und/oder Bedingungen, z. B. nichtionische und ionische
Tenside, wie sie in der US-PS 4 303 752 angegeben sind,
und die in der US-PS 3 745 090 angegebenen Mittel und
Bedingungen.
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Als "statistisch signifikant" wird in dieser
Schrift ein erfaßter Spiegel von mikrobiellen Nukleotiden
bezeichnet, der für den Zweck eines Assays geeignet ist.
Beispielsweise ist für eine statistische Signifikanz für
das bloße Erfassen von mikrobiellem ATB, z. B. bei der
Sterilitätsprüfung, eine weniger strenge oder genaue Kombination
von Assaybedingungen erforderlich als in einem Assay zur
genauen zahlenmäßigen Erfassung von Mikroben. Im ersten Fall
kann beispielsweise die Feststellung genügen, ob der
erfaßbare Nukleotidenspiegel über oder unter einem
vorherbestimmten Wert liegt. Dieser vorherbestimmte Wert kann von
Fall zu Fall berechnet werden, wenn man die relativen
Aktivitäten und Konzentrationen der Reaktionspartner und
andere relevante Faktoren berücksichtigt, die die
Empfindlichkeit oder Genauigkeit des Assays beeinflussen. Als "im
wesentlichen genügend" wird hier eine Menge oder ein Grad
bezeichnet, mit dem ein statistisch signifikantes Assay
durchgeführt werden kann.
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Für die Verwendung im nahmen der Erfindung
geeignete Inhibitoren müssen zwei grundliegende Kriterien
genügen: (1) müssen sie für eine direkte oder indirekte
spezifische Wechselwirkung mit einem inaktivierenden Enzym
geeignet sein, die mindestens teilweise zur Herabsetzung
der Aktivität des Enzyms geeignet ist, und (2) müssen sie
derart und in einem solchen Grade wirksam sein, daß eine
statistisch signifikante Menge von mikrobiellen Nukleotiden,
wenn sie vorhanden ist, durch ein Assay erfaßt werden kann.
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Um dem ersten Kriterium zu genügen, ist der
Inhibitor vorzugsweise ein Molekül, eine Verbindung, ein
Reagens und/oder eine Bedingung, durch das bzw. die direkt
oder indirekt eine Reaktion mit dem Enzym herbeigeführt
werden kann.
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Ein spezifisches Inhibieren von einigen Enzymen
kann durch eine "Rückkopplungsinhibition" mit Hilfe der
Produkte der durch das Enzym katalysierten Reaktion selbst
erfolgen. Bei einem derartigen Enzym wird durch die
Zugabe des betreffenden Produkts die fortgesetzte Aktivität
des Enzyms inhibiert, im allgemeinen durch Anlagern des
Produkts an eine essentielle (z. B. aktive oder allosterische)
Stelle des Enzyms. Ferner können zahlreiche Enzyme durch
Wechselwirkungen eines Moleküls, einer Verbindung, eines
Reagens und/oder einer Bedingung mit einer oder mehreren
bestimmten Gruppen spezifisch inhibiert werden, die in dem
Enzym enthalten und irgendwie für die inaktivierende, d. h.
katalytische Wirksamkeit des Enzyms verantwortlich sind. Zu
den Gruppen, mit denen eine derartige Wechselwirkung
erzielbar ist, gehören, ohne Einschränkung darauf, Amino-,
Imidazol-, Guanidinyl-, Indol-, Thioether-, Disulfid-,
Hydroxyl-, Phenol- und Carboxylgruppen.
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Die Stelle oder die spezifische Gruppe oder
Gruppen, die an der Wechselwirkung beteiligt ist bzw. sind,
braucht oder brauchen sich nicht an der aktiven Stelle des
Enzyms zu befinden, und die Inhibition des inaktivierenden
Enzyms kann umkehrbar oder unumkehrbar sein. Ferner kann
der Inhibitor dadurch wirksam sein, daß er aus der Lösung
oder von dem Enzym ein anderes Molekül oder eine andere
Verbindung entfernt, die für die Aktivität des Enzyms
wesentlich ist. Wenn beispielsweise ein bestimmtes Enzym für
seine Wirksamkeit das Vorhandensein eines zweiwertigen
Kations erfordert, kann das Enzym dadurch inaktiviert werden,
daß durch Zusatz eines geeigneten Chelatbildners das Kation
wirksam entfernt wird. In diesem und anderen Fällen wird
dann der Inhibitor, hier der Chelatbildner, als ein
indirekter Inhibitor für das Enzym angesehen.
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In bevorzugten Inhibitoren ist eine optimale
Kombination von Faktoren, wie der Spezifizität und
Geschwindigkeit der durch sie bewirkten Inhibition des
inaktivierenden Enzyms, der minimalen Störung (z. B. durch
Abschreckung) des darauffolgenden Assays, sowie der
Löslichkeit, des Preises, der Verfügbarkeit, der Sicherheit,
Stabilität und Reinheit, vorhanden.
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Bevorzugte Inhibitoren sind im Handel erhältlich
und können unter zum Stand der Technik gehörenden Bedingungen
verwendet werden. Im allgemeinen soll der Inhibitor
hinsichtlich der Temperatur, des pH-Wertes usw. unter den für
das Gesamtassay gewählten Bedingungen wirksam sein.
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Eine bevorzugte Gruppe von Inhibitoren sind
Reagenzien, insbesondere jene, die für die Enzyme der
Sulfhydrylgruppe spezifisch sind. Einige dieser Reagenzien sind
beispielsweise im CRC Handbook of Biochemistry, 2. Auflage
(Sober), 1970, Tabelle C-139) angegeben. Die Spezifizität
eines bestimmten Inhibitors für Sulfhydrylgruppen kann
ferner durch Verfahren festgestellt werden, wie sie von Riordan
u. a. in Methods Enzym, Band XXV,
H. 449-464, angegeben sind.
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Besonders bevorzugte Inhibitoren sind
die-"Blockier- und Markierenzyme", die von G.L. Kenyon und
T.W. Bruice in Methods in Enzymol., Band XLVII, S. 407-430,
beschrieben worden sind. Zu den bevorzugten unumkehrbaren
Inhibitoren dieser Gruppen gehören ohne Einschränkung darauf
das N-Ethylmaleimid, die organischen
Quecksilberverbindungen, das Jodacetat und das Jodacetamid. Zu den
bevorzugten umkehrbaren Inhibitoren gehören ohne Einschränkung
darauf die Arylhalogenide, wie das DF Dinitrofluorbenzol.
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Damit ein Inhibitor dem zweiten Kriterium
genügt, d. h. er die Durchführung eines statistisch
signifikanten Assays gestattet, ist es nicht notwendig, daß der
Inhibitor auf das Assay überhaupt keine Wirkung ausübt. Es ist
nur notwendig, daß bei Vorhandensein einer geeigneten
Kombination von Faktoren, wie den relativen Wirkungszeiten,
Aktivitäten und Konzentrationen der beteiligten Reagenzien,
die Erfassung von mikrobiellen Nukleotiden nur minimal
gestört wird und nur so gering ist, daß trotz des
Vorhandenseins des Inhibitors eine statistisch signifikante Menge von
mikrobiellen Nukleotiden noch erfaßt werden kann.
Tatsächlich bewirken bevorzugte Inhibitoren gemäß der Erfindung,
z. B. jene, die für Sulfhydrylgruppen spezifisch sind, sehr
wahrscheinlich ein Inhibieren von sulfhydrylempfindlichen
Enzymen, wie Leuchtkäferluciferase, die in
Biolumineszenzassays verwendet erden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird Luciferase nur in einer zulässigen Menge inhibiert.
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Die Wirkung eines bestimmten Inhibitors in
einem Biolumineszenzassay kann auf verschiedene Weise
experimentell bestimmt werden, z. B. durch Erzeugen und Assayproben,
die den Inhibitor in unterschiedlichen Konzentrationen
enthalten, und durch einen Vergleich derselben mit Kontrollproben.
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Wenn für eine bestimmte Anwendung die gewünschte
Empfindlichkeit des Assays mit einer Inhibitorkonzentration
erzielt werden kann, die zum Inhibieren des inaktivierenden
Enzyms genügt, kann die Verwendung dieses Inhibitors in
dem erfindungsgemäßen Verfahren ins Auge gefaßt werden.
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Daher ist die häufig als Hydrolase verwendete
Apyrase für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen
Verfahren nicht geeignet, weil es offenbar nicht möglich ist,
einen Inhibitor anzugeben, der diesem zweiten Kriterium
genügt. Es hat sich gezeigt, daß die Apyrase z. B. durch
Reagenzien der Sulfhydrylgrupge nicht inhibiert wird. Siehe
z. B. Valenzuela u. a., Biochem. J., 133 : 755-763 (1973).
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Deshalb sind im Rahmen der Erfindung als
inaktivierende Enzyme jene Enzyme verwendbar, die keine Hydrolasen
sind. Diese Enzyme messen ebenfalls zwei grundlegenden
Kriterien genügen: (1) müssen sie derart wirksam sein, daß sie
ein Erfassen der nichtmikrobiellen Nukleotide in einem Assay
verhindern, in dem diese Nukleotide sonst erfaßt werden
könnten; (2) müssen sie geeignet sein, eine spezifische
Wechselwirkung einzugehen, durch die diese Fähigkeit im wesentlichen
verhindert oder inhibiert wird.
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Dem ersten Kriterium genügende Enzyme sind
bekannt und umfassen sowohl Enzyme, die direkt auf Nukleotide
als Substrate einwirken, z. B. indem sie ein anderes Molekül
phosphorylieren, als auch Enzyme, die in gekoppelten
endothermen Reaktionen auf andere Substrate einwirken, bei denen
aber zum Durchführen der Reaktion ein Nukleotid, z. B. als
Quelle von Energie oder von reduzierend wirkenden Äquivalenten
erforderlich ist.
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Die Enzyme werden am besten gemäß der
Klassifikation klassifiziert, die von dem Nomenklaturausschuß
der International Union of Biochemistry, Enzyme
Nomenclature (1978), empfohlen worden ist. Gemäß dieser
Enzymklassifikation ("EC") gehören zu den im Rahmen des
erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten nukleotidinaktivierenden
Enzymen bestimmte Enzyme der Klassen der Oxidoreduktasen,
Transferasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
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Es werden jene inaktivierenden Enzyme
bevorzugt, die eine starke Aktivität zum Inaktivieren von
Nukleotiden und eine hohe Empfindlichkeit gegen über einer
spezifischen Inhibition haben. Ferner werden Enzyme bevorzugt,
die exotherme Reaktionen katalysieren, z. B. Reaktionen, in
denen kein Gleichgewichtszustand zwischen dem Nukleotid und
seinem Produkt hergestellt, sondern das Nukleotid
vollständig umgewandelt wird. Ferner werden Enzyme bevorzugt, die
wegen ihrer Kosten, Verfügbarkeit, Sicherheit, Löslichkeit,
Beständigkeit und Reinheit für eine reproduzierbare
Verwendung in routinemäßig durchgeführten Analysen in einem
weiten Anwendungsbereich und mit geringen Kosten verwendbar
sind.
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Beispiele von bevorzugten inaktivierenden
Enzymen fallen in folgende Kategorien: Transferasen (Gruppe 2
der EC). Besonders bevorzugt werden die (gewöhnlich als
Kinasen bekannten) Phosphotransferasen (Gruppe 2.7 der EC).
Hinsichtlich ihrer Aktivität werden die Enzyme der Gruppe 2.7
voneinander in erster Linie durch die entsprechende
Akzeptorgruppe unterschieden. Durch die Phosphotransferasen der
Gruppe 2.7.1 wird eine Phosphatgruppe an eine Alkoholgruppe
eines Akzeptormoleküls übertragen, durch jene der Gruppe 2.7.2
an eine Carboxylgruppe, durch jene der Gruppe 2.7.3 an eine
stickstoffhaltige Gruppe und durch jene der Gruppe 2.7.4
an eine andere Phosphatgruppe, wie dies bei der
Adenylatkinase der Fall ist. Die durch Enzyme der ersten Gruppe
(2.7.1) katalysierten Reaktionen sind im allgemeinen
unumkehrbar; die durch die anderen drei Gruppen katalysierten
dagegen im allgemeinen umkehrbar. In dem erfindungsgemäßen
Verfahren ist die Umkehrbarkeit der Reaktion im allgemeinen
kein kritischer Faktor.
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Bevorzugte Phosphotransferasen sind die
Hexokinase, die Acetatkinase und chemische Modifikationen
derselben sowie die in der unter EC 2.7.1.30 klassifizierten,
die gewöhnlich als Glycerokinasen bezeichnet werden (und
auch als ATP:Glycerin-3-phosphotransferasen bekannt sind).
Glycerokinasen katalysieren die Übertragung einer
Phosphatgruppe von einem ATP-Donormolekül auf ein
Glycerinakzeptormolekül nach der Gleichung
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Verschiedene Glycerokinasen kommen in der Natur
vor. Jede von ihnen wandelt ein Glycerin in
Glycerin-3-phosphat um. Dies ist eine Form, die in verschiedene Synthesen
eintreten kann, z. B. in jene, die zu Glykogen,
Triacylglycerinen usw. führen.
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Geeignete Glycerokinasen sind im Handel
erhältlich, z. B. von der Sigma Chemical Company, St. Louis,
Missouri, von der die mikrobiellen Enzyme erhältlich sind, die
von Candida mycoderma, Candida utilis und Escherichia coli
abgeleitet sind. Glycokinase kann auch von nichtmikrobiellen
Quellen, z. B. von Säugetieren gewonnen werden. Glycerokinasen
von verschiedenen Quellen unterscheiden sich nicht nur
hinsichtlich
ihrer Inaktivierungsaktivität, sondern z. B. auch
hinsichtlich ihrer Inhibierbarkeit durch verschiedene
Inhibitoren. Beispielsweise sind von Säugetieren gewonnene
Glycerokinasen im allgemeinen durch Jodacetamid stärker
inhibierbar, während die von bakteriellen Quellen gewonnenen
durch organische Quecksilberverbindungen stärker
inhibierbar sind.
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Die physikalische Form oder die Aktivität des
inaktivierenden Enzyms, (das z. B. in Form von kristallinen
Kristallsuspensionen, gefriergetrockneten Pulvern oder
Lösungen verwendet werden kann) ist nicht kritisch, wenn sie
in ihrer Form und Aktivität für die Verwendung im
erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.
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Erforderlichenfalls wird in dem
erfindungsgemäßen Verfahren jedes inaktivierende Enzym im allgemeinen
zusammen mit einer zugesetzten, d. h. exogenen Menge des
entsprechenden Akzeptormoleküls verwendet. Man kann auch
endogene Akzeptormoleküle verwenden. Wenn anzunehmen ist, daß
die Probe das Akzeptormolekül in einer genügenden Menge
enthält, kann diese berücksichtigt werden, doch wird ein Zusatz
von Akzeptormolekülen in einer solchen Konzentration
bevorzugt, daß eine genügende Aktivität des inaktivierenden
Enzyms gewährleistet ist.
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Das bevorzugte Akzeptormolekül ist
beispielsweise für Glycerokinase das Glycerin, das von vielen
Lieferanten ohne weiteres billig erhältlich ist. Die bevorzugte
Konzentration das Glycerins liegt im allgemeinen zwischen
etwa 1 mM und etwa 30 mM, insbesondere zwischen etwa 1 mM und
etwa 10 mM. Durch die Glycerokinase werden jedoch auch andere
Akzeptormoleküle phosphoryliert, wie das Dihydroxyaceton,
1-Glyceraldehyd, 1-Glyceraldehydacetat usw.
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Jedes inaktivierende Enzym wird ferner
vorzugsweise unter solchen Bedingungen und mit Kofaktoren
verwendet, die für seine Wirksamkeit erforderlich sind,
sofern diese Bedingungen und/oder Kofaktoren das danach
durchgeführte Assay nicht merklich beeinträchtigen.
Beispielsweise wird die bevorzugte Glycerokinase im
allgemeinen in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen, wie
MG&spplus;², verwendet. Einige Glycerokinasen werden durch Mg&spplus;² oder
andere, ähnliche Kationen angeregt, während derartige
Kationen bei anderen Glycerokinasen absolut notwendig sind.
Die für die Verwendung der Glycerokinase optimale
Konzentration von Mg&spplus;² hängt teilweise auch von anderen Faktoren
ab, z. B. von der ATP-Konzentration, liegt aber im allgemeinen
zwischen 1 mM und 10 mM und vorzugsweise zwischen 3 mM und
7 mM.
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Ferner wird das inaktivierende Enzym in einem
pH-Wertbereich verwendet, in dem das Enzym wirksam ist.
Beispielsweise liegt bei Glycerokinase der pH-Wert
vorzugsweise zwischen 8 und 10, insbesondere zwischen 7 und 8.
Andere Hilfsstoffe und Bedingungen für jedes inaktivierende
Enzym sind in der Literatur gut beschrieben und sind im
allgemeinen im Handel erhältlich.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird von
einer Probe ausgegangen, die vermutlich sowohl nichtmikrobielle
als auch mikrobielle Zellen enthält. Da nichtmikrobielle
Zellen im allgemeinen mehr Nukleotide pro Zelle enthalten als
mikrobielle Zellen, ist es nicht notwendig, daß die Probe
nichtmikrobielle Zellen in einer größeren Anzahl enthält als
mikrobielle Zellen. Die Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist geboten, wenn die Probe so viele z. B. natürlich
vorkommende oder verunreinigende Nukleotide enthält oder
enthalten könnte, und zwar entweder in Lösung oder in
nichtmikrobiellen Zellen, daß die Bestimmung der mikrobiellen
Zellen verfälscht werden oder unzuverlässig sein könnte.
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Zu den typischen Proben, auf die das
erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann, gehören
Körperflüssigkeiten, wie Urin oder Blut, Molkereiprodukte, zubereitete
Nahrungsmittel, Getränke und Säfte, Kosmetika und
Pharmazeutika, der Umgebung entnommene Proben sowie Proben für
Forschungszwecke, z. B. zum Testen von Antibiotika. Die Probe
wird nach bekannten Techniken gewonnen, manipuliert und
präpariert. Z.H. kann man eine Probe durch Vorinkubieren oder
Filtrieren anreichern oder sie löslichmachen oder enttrüben
oder eine übermäßige Färbung oder Viskosität vermeiden.
Vorzugsweise werden die Proben nach bekannten Verfahren als
Einzelzellen in Suspension oder als einzelne oder doppelte
Lagen von Zellen hergestellt.
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In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden selektiv Nukleotide von nichtmikrobiellen
Zellen freigesetzt. Dazu verwendet man vorzugsweise ein erstes
Freisetzungsmittel, das die nichtmikrobiellen Zellen
beispielsweise auflöst oder durchlässig macht. Das erste
Freisetzungsmittel kann jede Verbindung oder Bedingung sein, die
eine selektive Freisetzung von nichtmikrobiellen Nukleotiden
bewirkt.
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Das erste Freisetzungsmittel ist vorzugsweise ein
nichtionisches Tensid, z. B. ein ethoxyliertes Alkylphenol
oder ein Fettsäurepolyglykolether, wie sie in der US-PS
14 303 752 beschrieben sind.
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Das erste Freisetzungsmittel wird der
Probenlösung in einer wirksamen Konzentration zugesetzt, die zum
Freisetzen im wesentlichen aller nichtmikrobiellen Nukleotide
innerhalb eines gewünschten Zeitraums genügt. Bei Verwendung
eines bevorzugten ersten Freisetzungsmittels wird die Membran
von nichtmikrobiellen Zellen
durchlässig, so daß Nukleotide
schnell und frei aus den Zellen in die extrazellulare
Umgebung diffundieren können. Bei Verwendung eines
bevorzugten ersten Freisetzungsmittels werden die meisten
Nukleotide aus nichtmikrobiellen Zellen innerhalb von 15 bis 60 s
freigesetzt, wenn nicht mehr als etwa 10 Millionen
nichtmikrobielle Zellen pro ml vorhanden sind. Da die
nichtmikrobiellen Zellen im allgemeinen nur einen kleinen
Prozentsatz des Volumens der Probe einnehmen, ist die Mehrzahl der
Nukleotide außerhalb der Zellen vorhanden, nachdem die
Zellen durchlässig geworden sind. Gegebenenfalls kann die Probe
bei Zimmertemperatur oder jeder anderen geeigneten
Temperatur, vorzugsweise jedoch bei einer Temperatur zwischen +2
und +40ºC, z. B. bis zu etwa 60 min inkubiert werden, damit
eine maximale Freisetzung der nichtmikrobiellen Nukleotide
gewährleistet ist.
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In einem weiteren Schritt werden im wesentlichen
alle freigesetzten nichtmikrobiellen Nukleotide durch ein
inaktivierendes Enzym inaktiviert, das mit einem spezifischen
Inhibitor inhibierbar ist. Das inaktivierende Enzym kann der
Probe vor, bei und/oder nach der Zugabe des ersten
Freisetzungsmittels zugesetzt werden. Der Zeitpunkt der Zugabe
des inaktivierenden Enzyms ist im allgemeinen nicht kritisch,
weil unabhängig von dem Zeitpunkt der Zugabe des Enzyms
dessen schwache inaktivierende Wirkung erst zur Geltung kommt,
nachdem Nukleotide freigesetzt worden sind. Aus Gründen der
Bequemlichkeit und Geschwindigkeit wird das Enzym
vorzugsweise gleichzeitig mit dem ersten Freisetzungsmittel
zugesetzt.
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Die Konzentration des Enzyms ist nicht so
kritisch wie in zahlreichen derzeit mit Pyrase durchgeführten
Assayverfahren, und zwar deswegen, weil die erfindungsgemäßen
Enzyme im wesentlichen beliebig und unabhängig von ihrer
Konzentration inhibiert werden können. Die tatsächliche
Konzentration dem Enzyms ist auch von der Art des Enzyms und
seiner Quelle, von seiner Aktivität, von der vermuteten
Konzentration der nichtmikrobiellen Nukleotide usw. abhängig,
wie es sich für den Fachmann versteht.
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Im allgemeinen sind die bevorzugten
inaktivierenden Enzyme gemäß der Erfindung in einer wirksamen
Konzentration vorhanden, mit der die Nukleotide in der
vermuteten Konzentration in der gewünschten Zeit inaktiviert
werden können. Diese Konzentration kann durch Berechnung oder
vorzugsweise durch einfache Versuche bestimmt werden. Etwa
verwendete Akzeptormoleküle und andere Verbindungen,
Kofaktoren oder für die Wirksamkeit des Enzyms erforderliche
andere Moleküle werden vorzugsweise zusammen mit dem
inaktivierenden Enzym zugesetzt.
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Die Probe wird vorzugsweise in Bewegung solange
inkubiert, daß das inaktivierende Enzym im wesentlichen alle
aus den nichtmikrobiellen Zellen freigesetzten Nukleotide
inaktivieren kann. Dank der notwendigerweise niedrigen
Konzentration des zum Inaktivieren von nichtmikrobiellen
Nukleotiden verwendeten Enzyms, d. h. der Apyrase, muß etwa
10 bis 60 min inkubiert werden; diese Zeit ist zum großen
Teil von der Art der Probe abhängig. In dem erfindungsgemäßen
Verfahren kann das inaktivierende Enzym in Konzentrationen
zugesetzt werden, mit denen diese Inkubationszeiten
entsprechend verkürzt werden können, im allgemeinen mindestens auf
die Hälfte und vorzugsweise auf ein Viertel oder einen noch
kürzeren Teil der Zeit, die in einem vergleichbaren üblichen
Verfahren benötigt wird, in dem mit niedrigen Konzentrationen
von Apyrase gearbeitet wird. Daher beträgt in dem
erfindungsgemäßen
Verfahren die Inkubationszeit vorzugsweise 10 min
oder weniger, insbesondere 5 min oder weniger. Die richtige
Inkubationszeit kann vor allem unter Berücksichtigung der
vermuteten Konzentration der nichtmikrobiellen Nukleotide
und der relativen Konzentrationen und Aktivitäten des
inaktivierenden Enzyms und des Inhibitors bestimmt werden. Für
den Fachmann versteht es sich, daß bei geeigneter Abstimmung
dieser Faktoren in kurzer Zeit ein solcher Grad der
Inaktivierung erzielt werden kann, daß danach eine Freisetzung und
Bestimmung von mikrobiellen Nukleotiden möglich sind.
-
In einem weiteren Schritt wird mit Hilfe eines
spezifischen Inhibitors das inaktivierende Enzym im
wesentlichen vollständig inhibiert. Der Inhibitor wird der das
inaktivierende Enzym und die nichtmikrobiellen Nukleotide
enthaltenden Lösung vorzugsweise direkt und in solchen Mengen,
zu solchen Zeitpunkten und unter solchen Bedingungen
zugesetzt, daß das Inhibieren unter Bewegung in einer kurzen Zeit
von etwa 60 s oder weniger durchgeführt werden kann.
-
Die Menge, in der der Inhibitor zugesetzt wird,
ist von Faktoren wie der Art, Quelle, Konzentration und
Empfindlichkeit des inaktivierenden Enzyms und der Konzentration
und Empfindlichkeit von in dem nachfolgenden Assay
verwendeten Reagenzien abhängig. Die Konzentration des Inhibitors ist
nicht kritisch, doch wird er vorzugsweise in einer wirksamen
Konzentration verwendet, mit der das inaktivierende Enzym im
wesentlichen vollständig inhibiert wird, bei der aber eine
statistisch signifikante Erfassung von mikrobiellen
Nukleotiden vorgenommen werden kann. Die Konzentration, in der der
Inhibitor tatsächlich verwendet wird, ist in beträchtlichem
Grade von dem gewählten Inhibitor und dem verwendeten
inaktivierenden Enzym abhängig und kann vom Fachmann durch einfache
Versuche ermittelt werden.
-
Gegebenenfalls können nach dem Inhibieren des
inaktivierenden Enzyms weitere Maßnahmen getroffen werden,
insbesondere wenn der spezifische Inhibitor in einer höheren
Konzentration als das Enzym vorhanden ist und auch auf
andere für das Assay zuzusetzenden Reagenzien inhibierend
wirkt. Da diese Assayreagenzien gewöhnlich zu den teureren
in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Substanzen
gehören und gewöhnlich in Materialsätzen in vorherbestimmten
Mengen im Handel erhältlich sind, kann es unter manchen
Umständen ratsam sein, zunächst einige oder alle der von
überschüssigem Inhibitor auf die Reagenzien ausgeübten Wirkungen
zu unterdrücken, bevor die Reagenzien selbst inhibiert
werden. Dadurch kann gewährleistet werden, daß eine wirksame
und vorzugsweise bekannte Menge von Assayreagenzien wirksam
bleibt.
-
Eine dieser möglichen Maßnahmen besteht darin,
daß der Lösung eine Verbindung zugesetzt wird, die selbst
fähig ist, mit überschüssigem Inhibitor zu reagieren und ihn
dadurch zu binden. Wenn beispielsweise der Inhibitor eine
Reagens mit einer Sulfhydrylgruppe ist, kann ein
Aminosäurencystein zugesetzt werden, das eine Sulfhydrylgruppe enthält,
die mit einem sulfhydrylempfindlichen Assayreagens um den
Inhibitor konkurriert. Durch einen Vergleich der
Bindungskinetik zwischen dem Inhibitor sind dem Cystein einerseits und
dem Assayreagens andererseits kann der Fachmann ohne weiteres
die Konzentration ermitteln, in der das Cystein erforderlich
ist, damit das nichtinhibierte Assayreagens in der gewünschten
Konzentration vorliegt.
-
Vorzugsweise wird der Inhibitor vor dem
Freisetzen der mikrobiellen Nukleotide zugesetzt oder wenigstens
bevor das inaktivierende Enzym soviel mikrobielle
Nukleotide inaktivieren kann, daß eine statistisch signifikante
Erfassung derselben nicht mehr möglich wäre. In dem
erfindungsgemäßen Verfahren wird der Inhibitor vorzugsweise
gleichzeitig mit dem zweiten Freisetzungsmittel zugesetzt,
d. h. in dem Zeitpunkt, in dem das Freisetzen von Nukleotiden
von den mikrobiellen Zellen beginnt. Bei einer Steuerung
verschiedener Faktoren, z. B. der Konzentration und Art des
inaktivierenden Enzyms, des Inhibitors und des
Freisetzungsmittels, relativ zueinander kann der Inhibitor das
inaktivierende Enzym innerhalb von Sekunden wirksam inhibieren.
Da auch das Freisetzen von mikrobiellen Nukleotiden häufig
in Sekunden erfolgt, kann der Fachmann den Inhibitor und
das Freisetzungsmittel ohne weiteres so verwenden, daß durch
die Enzymaktivität im wesentlichen alle nichtmikrobiellen
Nukleotide und vielleicht auch einige der mikrobiellen
Nukleotide inaktiviert werden, aber eine statistisch
signifikante Menge der mikrobiellen Nukleotide verbleibt.
-
In einem weiteren Schritt werden die
mikrobiellen Nukleotide selektiv freigesetzt. Dies kann
gleichzeitig mit der Zugabe des Inhibitors oder danach bewirkt
werden, indem ein zweites Freisetzungsmittel in einer
wirksamen Menge zugesetzt wird.
-
Als zweite Freisetzungsmittel werden ionische
Tenside verwendet, wie sie in der US-PS 4 303 752 angegeben
sind. Ein besonders bevorzugtes zweites Freisetzungsmittel
ist ein Gemisch eines quaternären Ammoniumsalzes und eines
ethoxylierten Amins, ethoxilierten Diamins,
Fettsäurepolyethylenglykolesters oder eines ethoxylierten Amids. Bei
einer Verwendung
von bevorzugten zweiten Freisetzungsmitteln
in geeigneten Konzentrationen z. B. in einer Größenordnung
von 0,05 bis 0,5 Vol.-%, werden die Zellmembran und die
Zellwand von Mikroben im allgemeinen so durchlässig, daß
Nukleotide schnell, in einer Mischzeit von etwa 15 bis 60 s,
freigesetzt werden können.
-
In einem weiteren Schritt wird in einem
geeigneten Assay, z. B. einem Biolumineszenz- oder
Chemilumineszenzassay, eine statistisch signifikante Menge der
freigesetzten mikrobiellen Nukleotide erfaßt. In dem
erfindungsgemäßen Verfahren können aber auch andere Assays verwendet
werden, zu denen die in der Technik bekannten photometrischen
und spektrophotometrischen Assays, Fluoreszenzassays und
andere in der Technik bekannte Assays verwendet werden
können, mit denen die vorhandenen mikrobiellen Nukleotide
direkt oder indirekt erfaßbar sind.
-
Vorzugsweise wird ein Biolumineszenzassay
verwendet. In einem typischen Assay wird eine Aliquote von z. B.
50 Mikrolitern bis 1,0 ml der Probenlösung mit dem bzw. den
geeigneten Biolumineszenzreagens oder -reagenzien, z. B. dem
aus Leuchtkäferluciferase und Luciferin bestehenden Reagens
für ATP gemischt, und wird die erhaltene Lichtemission in
an sich bekannter Weise photometrisch gemessen.
-
Als Reagenzien für die Erfassung von ATP durch
Biolumineszenz erden Luciferase und Luciferin bevorzugt.
Ein typisches handelsübliches Reagens ("Lumit PM", Lumac/3M,
Niederlande) enthält das gereinigte Enzym Luciferase von
Leuchtkäfern, ferner synthetisches D-Luciferin als Kofaktor
für das Enzym, einen Stabilisator, die Rinderserumalbumin,
und eine Verbindung zum Schutz der Sulfhydrylgruppen der
Luciferase während der Lagerung, z. B. Dithiothreitol. Dieses
Reagens wird gewöhnlich gefriergetrocknet und wird in einer
opaken Ampulle unter einem Vakuum geliefert. Das Reagens
kann in einer Pufferlösung suspendiert und nach den
Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird gewöhnlich
in einer gepufferten Lösung durchgeführt, und jeder
Inhaltsstoff wird entweder in derselben Pufferlösung oder
in einer anderen Lösung erzeugt, die die Wirksamkeit der
gepufferten Lösung nicht beeinträchtigt. Beispielsweise ist
für diese Zwecke eine handelsübliche Pufferlösung mit 25mM
Hepes und 7,5 mM MgSO&sub4; und dem pH-Wert 7,75 ("Lumit Buffer",
Lumac/3M) besonders gut geeignet.
-
Das inaktivierende Enzym und der ihm
entsprechende spezifische Inhibitor, die in dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden, können auf eine Weise erzeugt
und verpackt werden, die ihre Verwendung bei einer raschen
automatischen Anwendung des Verfahrens auf eine große
Anzahl von Proben erleichtert. Beispielsweise können das Enzym
und der Inhibitor z. B. vorherbestimmten Mengen einzeln z. B.
in Ampullen, verpackt werden, und zwar gegebenenfalls
zusammen mit anderen Substanzen für ein Assay und/oder mit
Hilfsstoffen, wie Konservierungsmitteln. Diese
vorherbestimmten Mengen können dann mit Materialsätzen zur
selektiven Bestimmung von mikrobiellen Nukleotiden zusammen mit
Anleitungen für die Verdünnung oder Verwendung dieser Stoffe
abgegeben werden.
-
Andere für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignete Reagenzen sind im Handel erhältlich und können in
dem Fachmann bekannter Weise erzeugt und verwendet werden.
-
Zu den zum Erfassen von in einer Biolumineszenz-
oder Chemilumineszenzreaktion erzeugten Photonen geeigneten
Apparaturen gehören verschiedene im Handel erhältliche
photometrische Instrumente, u. a. Instrumente mit Photodioden
und Photonenzählinstrumente. In einem Photonenzählinstrument,
z. B. einem im Handel von Lumac/3M erhältlichen "Biocounter"
wird das in einer Biolumineszenzreaktion erzeugte Licht über
eine feste Zeitspanne von z. B. 10, 30 oder 60 s integriert.
-
Ideal ist es, denn das photometrische
Instrument eine schnell und automatisch arbeitende
Pipettiereinrichtung umfaßt, die eine genauere Steuerung der Zeit,
Genauigkeit und Bedingungen der in dem Assay
durchzuführenden Schritte ermöglicht.
-
Der bei der bevorzugten photometrischen
Erfassung von Photonen erhaltene Meßwert, z. B. in von einem
Photonenzählinstrument ermittelten relativen Lichteinheiten
(RLE), kann mit der Menge der mikrobiellen Nukleotide
korreliert werden. Diese Bestimmung kann auf verschiedene in
der Technik bekannte Weisen durchgeführt werden, z. B. in
einem zur Reihenuntersuchung durchgeführten Assay auf
Verunreinigungen oder Sterilität durch einen Vergleich mit einem
vorherbestimmten Schwellenwert, oder er kann mit der Anzahl
oder der Masse der vorhandenen Zellen korreliert werden.
Beispielsweise kann nach einem üblichen Plattenzählverfahren
eine Standardkurve generiert und zum Korrelieren der Zahl
der koloniebildenden Einheiten (CFU/ml) mit den RLE-Werten
verwendet werden.
-
Die nachstehenden Ausführungsbeispiele sollen
den Umfang der Erfindung erläutern. In allen Beispielen
bedeutet ein "+", daß ein bestimmter Inhaltsstoff in der
angegebenen Konzentration vorhanden war, und ein "-", daß er
nicht vorhanden war. Soweit nichts anderes angegeben ist,
sind alle in den Tabellen angegebenen Konzentrationen
Endkonzentrationen in der Probe vor der Zugabe von
Biolumineszenzreagenzien.
-
Jede Probe wurde nach genormten
Biolumineszenzverfahren in einem Photonenzählinstrument (Biocounter "M202
M2010, Lumac/3M) analysiert. In diesen Verfahren wird eine
Aliquote von 50 oder 100 Mikrolitern der zu analysierenden
Probe in eine Küvette gegeben, die in das Zählinstrument
eingesetzt wird, in dem 100 Mikroliter der
Biolumineszenzreagenzien (Lumit PM) zugegeben werden. Gleichzeitig mißt
das Zählinstrument mit einer Integrationszeit von 10 s das
emittierte Licht, das in relativen Lichteinheiten
"(RLE-Werten)" angezeigt wird.
BEISPIEL 1
-
Die Fähigkeit des Enzyms Glycerokinase und die
Wirksamkeit der Chlormercuribenzoesäure ("PCMB"), einer
organischen Quecksilberverbindung, als Inhibitor für dieses
Enzym wurden zur Bewertung ihrer Eignung in einem
erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt.
Substanzen
-
- Pufferlösung: Lumit Buffer, Lumac/3M, Niederlande, 25 mM
Hepes, 7,5 mM MgSO&sub4;(pH-Wert 7,75)
-
- ATP: Lumac/3M, Inhalt einer Ampulle (10 Mikrogramm) mit
Pufferlösung auf 10 ml aufgefüllt. Diese Lösung wurde mit
Pufferlösung im Verhältnis von 1 : 10 weiter verdünnt.
-
- Magnesiumsulfat: Merck GmbH, Darmstadt, Bundesrepublik
Deutschland, 500 mM in bidestilliertem Wasser
-
- Glycerin als Akzeptormolekül: Merck, 300 mM in
bidestilliertem Wasser
-
- Glycerokinase als Enzym: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
80 E/mg, 2 mg/ml in 3,2 M Ammoniumsulfat, Endkonzentration
1,6 E/ml
-
- Inhibitor: o-Chlormercuribenzoesäure (PCMB), Sigma, 100 mM
in 25 mM Hepes, 0,2 N NaOH (Lösung A); diese Lösung wurde
mit Pufferlösung derart weiter verdünnt, daß
PCMB-Konzentrationen von 10 mM (Lösung B) bzw. 1,0 mM (Lösung C)
erhalten wurden
-
- Luciferase-Luciferin: Lumit PM, Lumac/3M; der Inhalt
einer Ampulle wurde mit Pufferlösung auf 7,0 ml
aufgefüllt
Protokoll: Es wurden folgende Proben hergestellt:
Probe Puffer-Lösung ATP MgSO&sub4; Glycerin Glycerokinase PCMB
Assay:
-
Den Proben wurde als letztes Glycerin zugesetzt,
um die Wirkung des Enzyms einzuleiten. Vor dem Zusatz des
Glycerins wurde von allen Proben eine Aliquote von 50
Mikrolitern genommen. Die ATP-Spiegel in diesen Aliquoten (in
RLE-Werten) wurden als Nullzeitwerte bestimmt. Dann wurde
den Gemischen Glycerin zugesetzt und wurden nach 5, 10 und
50 min weitere Aliquoten von 50 Mikrolitern genommen. In
allen Aliquoten wurde ATP in der beschriebenen Weise durch
Biolumineszenzverfahren bestimmt.
Ergebnisse:
TABELLE 1 Relative Lichteinheiten (RLE-Werte)
Probe min PCMB (mM)
-
Schlußfolgerung: Aus der Tabelle 1 ergibt sich, daß die
Glycerokinase ein wirksames inaktivierendes Enzym für ATP
ist (siehe Probe 7) und daß die PCMP ein sehr wirksamer
Inhibitor für die Glycerokinase ist (weil in den Proben 1
bis 6 ein großer Teil des ATP vor einem Inaktivieren
geschützt wurde). Selbst bei einer Endkonzentration von 0,01
mM PCMB wird die Glycerokinase offenbar innerhalb der
gewählten Zeiten bei der gewählten Konzentration genügend
inhibiert.
BEISPIEL 2
-
Für die Verendung in einem erfindungsgemäßen
Verfahren wurde die Wirkung der o-Chlormercuribenzoesäure
als Inhibitor in dem Biolumineszenzassay auf ATM bewertet.
Protokoll:
-
Unter Verwendung von PCMB und den anderen im
Beispiel 1 verwendeten Substanzen wurden folgende Proben
hergestellt
Probe Puffer-Lösung ATP PCMR
Assay:
-
Von jeder Probe wurden drei Aliquoten von je
100 Mikrolitern entnommen. In diesen Aliquoten wurde ATP
wie beschrieben bestimmt.
Ergebnisse:
TABELLE 2
Probe RLE-Wert Mittelwert % des Kontrollversuchs PCMB
Schlußfolgerungen:
-
Es gibt Konzentrationen von PCMP (z. B. 0,01 bis
1 mM), mit denen im Beispiel 1 die Glycerokinase inhibiert
werden konnte und die ein Biolumineszenzassay nicht
signifikant beeinträchtigen. Daher kann im Rahmen der Erfindung
die Kombination von Glycerokinase als Enzym und PCMB als
Inhibitor mit Erfolg verwendet werden.
BEISPIEL 3
-
Es wurde die Wirksamkeit des Dinitrofluorbenzols
("DNFB"), eines Arylhalogenids, als Inhibitor für das Enzym
Glycerokinase bestimmt.
Substanzen:
-
-
Inhibitor:
Dinitrofluorbenzol, Sigma (98%); verdünnt mit
absolutem Ethanol; es wurden folgende Lösungen hergestellt:
-
- Lösung A: 82,7 mM
-
- Lösung B: 8,27 mM
-
- Lösung C: 0,827 mM
Protokoll:
-
Aus den vorgenannten und vorher beschriebenen
Substanzen wurden folgende Proben hergestellt:
Probe Pufferlösung ATP MgSO&sub4; Glycerin Glycerokinase DNFB
-
Den Proben wurde als letztes Glycerin zugesetzt,
um die Wirkung des Enzyms einzuleiten. Vor dem Zusatz des
Glycerins wurde von allen Proben eine Aliquote von 50
Mikrolitern genommen. Die ATP-Spiegel in diesen Aliquoten (in
PLE-Werten) wurden als Nullzeitwerte bestimmt. Dann wurde
den Gemischen Glycerin zugesetzt und wurden nach 5, 10 und
15 min weitere Aliquoten von 50 Mikrolitern genommen. In
allen Aliquoten wurde ATP in der beschriebenen Weise bestimmt.
Ergebnisse:
TABELLE 3 Relative Lichteinheiten (PLE-Werte)
Probe min DNFB
Schlußfolgerungen:
-
Der Vergleich der für die Proben 1 bis 3
erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen für die Probe 14
(Kontrollversuch) zeigen, daß die Glyceronkinase unter den
angewendeten Bedingungen und Konzentrationen durch 0,0827 mM
DNFB nicht wirksam inhibiert wird, aber bei 0,827 mM mäßig
und bei 8,27 mM DNFB wirksam inhibiert wird.
BEISPIEL 14
-
Für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen
Verfahren wurde die Wirkung von Dinitrofluorbenzol als
Inhibitor in dem Biolumineszenzassay auf ATP bewertet.
Protokoll:
-
Aus den im Beispiel 3 verwendeten Substanzen
wurden folgende Proben hergestellt:
Probe Pufferlösung ATP DNFM
Assay:
-
Von jeder Probe wurden drei Aliquoten von je
100 Mikrolitern entnommen. In diesen Aliquoten wurde ATP
wie beschrieben bestimmt.
Ergebnisse:
TABELLE 4
Probe Mittelwert % des Kontrollversuchs DNFB
-
Schlußfolgerungen: Aus den Daten der Tabelle 4 geht hervor,
daß bei den DNFB-Konzentrationen, bei denen im Beispiel 3
eine Inhibition festgestellt wurde, das mit
Leuchtkäferluciferase durchgeführte Biolumineszenzassay auf ATP durch
das DNFB nicht beeinträchtigt wird.
BEISPIEL 5
-
Es wurde die Wirksamkeit von N-Ethylmaleimid
("NEM") als Inhibitor für das Enzym Glycerokinase bestimmt.
Substanzen:
-
- Inhibitor: N-Ethylmaleimid ("NEM"), Sigma, 416 mM in
16,6% (V/V) Ethanol
Protokoll:
-
Aus den vorgenannten und vorherbeschriebenen
Substanzen wurden folgende Proben hergestellt:
Probe Pufferlösung ATP MgSO&sub4; Glycerin Glycerokinase NEM
Assay:
-
Den Proben wurde als letztes Glycerin zugesetzt,
um die Wirkung des Enzyms einzuleiten. Vor dem Zusatz des
Glycerins wurde von allen Proben eine Aliquote von 50
Mikrolitern genommen. Die ATP-Spiegel in diesen Aliquoten (in
RLE-Werten) wurden als Nullzeitwerte bestimmt. Dann wurde
den Gemischen Glycerin zugesetzt und wurden nach 5, 10 und
15 min weitere Aliquoten von 50 Mikrolitern genommen. In
allen Aliquoten wurde ATP in der beschriebenen Weise
bestimmt.
Ergebnisse:
TABELLE 5 Relative Lichteinheiten (RLE-Werte)
Probe min NEM (mM)
Schlußfolgerungen:
-
Die Ergebnisse für die Proben 1 bis 5
werden mit denen für die Probe 6 (Kontrollversuch ohne
Inhibitor) verglichen. Offenbar wird das Enzym Glycerokinase
bei jeder getesteten NEM-Konzentration inhibiert. Dabei
steht besonders nach 15 min das Ausmaß dem Inhibition in
einer gewissen Beziehung zu der NEM-Konzentration.
BEISPIEL 6
-
Für die Verwendung in einem erfindungsgemäßen
Verfahren wurde die Wirkung von N-Ethylmaleimid als
Inhibitor in dem Biolumineszenzassay auf ATP bewertet.
Protokoll:
-
Aus den im Beispiel 5 beschriebenen Substanzen
wurden folgende Proben hergestellt:
Probe Pufferlösung ATP NEM
Assay:
-
Von jeder Probe wurden drei Aliquoten von je
100 Mikrolitern entnommen. In diesen Aliquoten wurde ATP
wie beschrieben bestimmt.
TABELLE 6
Probe Mittelwert % des Kontrollversuchs NEM (mM)
Schlußfolgerungen:
-
Bei den Konzentrationen, mit denen im Beispiel 5 das Enzym effektiv inhibiert wurde, wird das
Biolumineazenzassay auf ATP durch NEM nicht oder nur mäßig
beeinträchtigt.
BEISPIEL 7
-
Die Wirksamkeit des Enzyms Hexokinase zum
Inaktivieren von ATP und Inhibierbarkeit durch die
p-Chlormerkuriphenylsulfonsäure als Inhibitor wurden bei
verschiedenen Konzentrationen des Enzyms bestimmt.
Substanzen:
-
- Inhibitor: p-Chlormercuriphenylsulfonsäure ("PCMPSA"),
Sigma Chemical Co:), 50 mM-Lösung in Pufferlösung
-
- Enzym Hexokinase, Boehringer Mannheim, 140 E/mg, erzeugt
als Stammlösung von 10 mg/ml in 3,2 M Ammoniumsulfat, die
vor der Verwendung 1 : 100 mit Pufferlösung verdünnt wurde.
-
- Glucose als Akzeptormolekül: Sigma, 100 mg/di in
gesättigter Benzoesäure
Protokoll:
-
Gemäß der Tabelle 7-1 wurden aus den vorgenannten
und vorstehend beschriebenen Substanzen acht Proben
hergestellt, die verschieden lang, und zwar 0, 5, 10 bzw. 15 min,
inkubiert wurden, ehe Aliquoten genommen und wie beschrieben
analysiert wurden.
Ergebnisse:
TABELLE 7-1
Probe Pufferlösung ATP Glucose Hexokinase PCMPSA Gesamtvolumen
TABELLE 7-2 Ergebnisse
Probe Hexokinase PCMPSA min (RLE)
Schlußfolgerungen:
-
Bei zunehmenden Konzentrationen der
Hexokinase (Proben 2 bis 4) und zunehmend längerwerdenden
Inkubationszeiten nimmt die Menge des erfaßbaren ATP ab,
vermutlich weil das ATP durch das Enzym transphosphoryliert
(d. h. "inaktiviert") wird. Bei den Proben 5 bis 8 erkennt
man, daß die inaktivierende Wirkung, der Hexokinase durch die
PCMPSA wenigstens teilweise inhibiert wird.
-
Aus den Ergebnissen geht ferner hervor, daß in
Abwesenheit von Hexokinase durch eine wirksame Konzentration
von PLMPSA allein (wie bei der Probe 5) das darauffolgende
Biolumineszenzassay im wesentlichen nicht beeinträchtigt
wird.
BEISPIEL 8
-
Da in dem erfindungsgemäßen Verfahren der
Inhibitor häufig gleichzeitig mit einem zweiten
Freisetzungsmittel zugesetzt wird, wurden die Wirkungen eines
handelsüblichen zweiten Freisetzungsmittels auf die
Inaktivierungswirkung des Enzyms Hexokinase und auf die Inhibition der
Hexokinase durch PCMPSA bestimmt.
Substanzen:
-
- Zweites Freisetzungsmittel ("ZFM"): Gemisch aus
ethoxyliertem quaternärem Amin und quaternären Ammoniumsalzen
(NRB, Luman/3M)
Protokoll:
-
Gemäß der Tabelle 8-1 wurden aus den vorgenannten
und vorstehend beschriebenen Substanzen zunehmende
Konzentrationen von Hexokinase mit und ohne PCMPSA hergestellt.
TABELLE 8-1
Probe ZFM ATP Glucose Hexokinase PCMPSA Gesamtvolumen
Ergebnisse:
TABELLE 8-2
Probe Hexokinase PCMPSA min (RLE)
Schlußfolgerungen:
-
Man erkennt, daß in Anwesenheit des ZFM
Hexokinase durch PCMPSA genügend inhibiert werden kann.
Durch die PCMPSA allein wird das mit dem ZFM durchgeführte
Biolumineszenzassay auf ATP nicht oder nur sehr wenig
beeinträchtigt.
BEISPIEL 9
-
Es wurden die Einflüsse einer bei
Zimmertemperatur erfolgenden Lagerung einer Hexokinase-Glucose-Lösung
in einer Pufferlösung und in einer ein erstes
Freisetzungsmittel enthaltenden Lösung miteinander verglichen. Das
gewählte Enzym soll vorzugsweise zum Inaktivieren von ATP in
Anwesenheit eines ersten Freisetzungsmittels geeignet sein,
weil das Enzym und das erste Freisetzungsmittel gewöhnlich
gleichzeitig vorhanden sind und gegebenenfalls auch
gleichzeitig zugegeben werden.
Substanzen:
-
- Erstes Freisetzungsmittel ("EFM"): Ethoxyliertes
Alkylphenol mit Na-Azid als Konservierungsstoff (NRS, Lumac/3M).
Protokoll:
-
Unter Verwendung der vorgenannten und vorstehend
beschriebenen Substanzen wurden zwei Lösungen hergestellt.
-
1: Hexokinase in Pufferlösung: Zu 1,0 ml Pufferlösung wurden
140 Mikroliter der Hexokinase-Stammlösung und 20
Mikroliter der Glucose-Stammlösung zugesetzt.
-
2: Hexokinase im EFM: Zu 1,0 ml des EFM wurden 40 Mikroliter
der Hexokinase-Stammlösung und 20 Mikroliter der Glucose-
Stammlösung zugesetzt.
-
Die beiden Gemische wurden als solche bei
Zimmertemperatur gespeichert. In Zeitabständen von 1 Stunde
wurde die Aktivität der Hexokinase in den beiden Gemischen
durch folgendes Assay annähernd bestimmt:
-
A. Zu 50 Mikrolitern ATP-Lösung wurden 50
Mikroliter Pufferlösung und 100 Mikroliter Luciferase-Luciferin-
Lösung zugesetzt. ATP wurde die beschrieben bestimmt. Die
Ergebnisse sind in der Spalte A der Tabelle 9-1 angegeben.
-
B. Zu 50 Mikrolitern ATP-Lösung wurden 50
Mikroliter Hexokinase in Pufferlösung zugesetzt. Diese Lösung
wurde 5 min bei Zimmertemperatur stehengelassen. ATP wurde
wie beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Spalte
6 der Tabelle 9-1 angegeben.
-
C. Zu 50 Mikrolitern ATP-Lösung wurden 50
Mikroliter dem EFM und 100 Mikroliter
Luciferase-Luciferin-Lösung zugesetzt. ATP wurde wie beschrieben bestimmt. Die
Ergebnisse sind in der Spalte C der Tabelle 9-1 angegeben.
-
D. Zu 50 Mikrolitern ATP-Lösung wurden 50
Mikroliter Hexokinase im EFM zugesetzt, und das Gemisch wurde
5 min stehengelassen. ATP wurde wie beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Spalte D der Tabelle 9-1 angegeben.
Ergebnisse:
TABELLE 9-1 ZUSTAND WÄHREND DER LAGERUNG
Lagerungszeit Hexokinase in Pufferlösung A ATP-Ausgangsspiegel (RLE) ATP-Restspiegel nach 5 min Hexokinase im EFM C ATP-Ausgangsspiegel D ATP-Restspiegel
Schlußfolgerungen:
-
Man erkennt, daß Hexokinase nach der
Lagerung ATP in Lösungen inaktivieren kann, die entweder
das EFM oder die Pufferlösung enthalten. Die
ATP-Restspiegel nach 5 min sind zwar bei Hexokinase im EFM stets
höher als bei Hexokinase in Pufferlösung, sie sind jedoch
über die ganze Zeit stets niedrig, was besagt, daß die
Hexokinase durch eine mindestens 7stündige Lagerung nicht
geschädigt wird.
BEISPIEL 10
-
Es wurden die inaktivierende Aktivität des Enzyms
Acetatkinase und seine Inhibierbarkeit durch PCMPSA
bestimmt.
Substanzen:
-
- Enzym Acetatkinase: Boehringer Mannheim, 170 E/mg,
erhältlich als 1 mg/ml in 3,2 M Ammoniumsulfat
-
- Magnesiumacetat als Akzeptormolekül: Merck, 0,3 M in
bidestilliertem Wasser
Protokoll:
-
Unter Verwendung der vorgenannten und vorstehend
beschriebener Substanzen wurden Proben gemäß der Tabelle
10-1 hergestellt. Zum Einleiten der Enzymwirkung wurde
Acetatkinase zugesetzt. Von diesen Proben wurden nach
0, 5, 10 bzw. 15 min Aliquoten von je 100 m Mikrolitern
entnommen. Das in diesen Aliquoten enthaltene ATP wurde
wie beschrieben bestimmt.
TABELLE 10-1
Probe EFM Magnesiumacetat Endkonz. Acetatkinase PCMPSA
-
Jede Probe enthielt ferner: MgSO&sub4; (10 Mikroliter)
für eine Endkonzentration von 5 mM und ATP (100 Mikroliter)
für eine Endkonzentration von 1,0 ug/ml.
Ergebnisse:
TABELLE 10-2
Probe RLE-Wert nach min
Schlußfolgerungen:
-
Die Werte für die Kontrollproben 1 und
2 besagen, daß in Abwesenheit des Enzyms Acetatkinase
(Probe 1) oder seines Akzeptormoleküls Magnesiumacetat
(Probe 2) der ATP-Spiegel während der ganzen Versuchszeit
von 15 Minuten konstant bleibt. Der niedrigere RLE-Wert
bei der Probe 2 ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß
das in Ammoniumsulfat zugesetzte Acetat bin stärkeres
Abschrecken bewirkt.
-
Die Werte für die Probe 3 besagen, daß unter den
angewendeten Bedingungen die Acetatkinase in Gegenwart
ihres Akzeptormoleküle ATP sehr wirksam inaktiviert. Das
geht aus der Tatsache hervor, daß der ATP-Spiegel nach 5
min fast auf den Untergrundpegel vermindert dar.
-
PCMPSA hat auf Acetatkinase offenbar eine
beträchtliche inhibierende Wirkung, weil nach 5, 10 und 15
min. in der Probe 14 (mit PCMPSA) mehr ATP erfaßt wird als
in der Probe 3 (ohne PCMPSA).
-
Daher versteht es sich, daß die Acetatkinase zum
Inaktivieren von ATP verwendet werden kann und daß das
Enzym offenbar durch PCMPSA inhibierbar ist.
BEISPIEL 11
-
Die inaktivierende Wirkung des Enzyms
Glycerokinase wurde während eines Zeitraums in einem Bereich von
Konzentrat innen mit der von Apyrase verglichen.
Substanzen:
-
- Apyrase ("Somase", Lumac/3M, gefriergetrocknete Apyrase,
etwa 4,3 E/Ampulle), mit Pufferlösung auf 1,0 ml aufgefüllt
-
- Rohmilch: vom örtlichen Vertrieb, Trinkrahm, sterilisiert
Protokoll:
-
Gemäß der
Tabelle 11-1 wurden aus den
vorgenannten und aus vorstehend beschriebenen Substanzen vier
Proben hergestellt, von denen nach 0, 2,5, 5, 10 und 20 min
Aliquoten genommen wurden
Ergebnisse:
TABELLE 11-1
Probe Rohmilch EFM Glycerin (Endkonz. 3,0 mM) Glycerokinase Apyrase
TABELLE 11-2
Probe Nr. Glycerokinase Apyrase RLE-Wert nach min
Schlußfolgerungen:
-
Man erkennt daß in dem Assay der RLE-
Wert in den ersten 2,5 min mit höherer Geschwindigkeit
abnimmt als in den darauffolgenden 17,5 min. Die
Reaktionsgeschwindigkeit von enzymkatalysierten Reaktionen ist häufig
u. a. auch von den Konzentrationen des Substrats abhängig.
Die Substrate für Glycerokinase sind gewöhnlich ATP und
Glycerin. Beim Vorhandensein von
Glycerin im Überschuß hängt
die Reaktionsgeschwindigkeit in hohem Maße von der
ATP-Konzentration ab. Da während der Versuchszeit die
ATP-Konzentration sehr schnell abnimmt, nimmt auch die
Reaktionsgeschwindigkeit ab. Die nach 2,5 min erhaltenen RLE-Werte
besagen, daß die Geschwindigkeit der Abnahme der RLE-Werte
von der Menge (E/ml) der verwendeten Glycerokinase abhängt.
Ferner kann man erkennen, daß bei einer Verwendung von
Glycerokinase in Konzentrationen von oder über 0,425 E/ml
die RLE-Werte signifikant schneller abnehmen als bei
0,096 E/ml Apyrase (in üblichen Protokollen wird häufig
0,096 E/ml Apyrase verwendet).
BEISPIEL 12
-
Es wurde bestimmt, in welchen Konzentrationen von
Glycerin und Magnesiumsulfat eine optimale Aktivität der
Glycerokinase erzielt wird.
-
Es hat sich gezeigt, daß bei Endkonzentrationen
von Glycerin von 1,5, 3, 6, 15 und 30 mM in Rohmilch:EFM-
Lösungen (50 : 50) die Aktivität von 0,425 E/ml Glycerokinase
durch eine Inkubation von 5, 10, 20 oder 30 min nur wenig
verändert wird. Daher wird die Geschwindigkeit der
Inaktivierung von ATP durch 0,425 E/ml Glycerokinase durch eine
Standardkonzentration von Glycerin in einer Größenordnung
von etwa 3,0 offenbar nicht begrenzt.
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In ähnlicher Weise wurden Versuche mit
Magnesiumsulfat in Endkonzentrationen von 1, 2, 3, 14, 5 und 10 mM
bei 0,425 E/ml Glycerokinase durchgeführt. Da bei zunehmenden
Konzentrationen eine geringe Zunahme der Aktivität
erkennbar war, wird angenommen, daß eine Endkonzentration von etwa
5 mM zufriedenstellend ist.
BEISPIEL 13
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In diesem Versuch wurde das Freisetzen und
Messen von mikrobiellem ATP in einer bereits Glycerokinaae
enthaltenden Lösung simuliert.
Protokoll:
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Es wurden Proben aus folgenden Substanzen
hergestellt: 1000 Mikroliter Milch (vom örtlichen Vertrieb,
Trinkrahm, sterilisiert), 800 Mikroliter EFM, 200 Mikroliter
eines handelsüblichen ersten Freisetzungsmittels, das in einer
Pufferlösung für die Verwendung mit Proben, wie Obstsäften
(F-NRS, Lumac/3M), hergestellt wird, und 2,45 mM MgSO&sub4;. Etwa
verwendetes Glycerin hatte eine Endkonzentration von 1,47 mM.
Glycerokinase war in den in der Tabelle 13 angegebenen
Konzentrationen vorhanden. Zu Beginn jedes Assays wurde ATP
(10 mg/ml) in dem ZFM zugesetzt. Etwa verwendete PCMPSA war
in dieser ZFM-Aliquote ebenfalls in einer solchen Menge
vorhanden, daß die Endkonzentration 0,5 mM betrug.
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Zu Beginn des Assays wurden zu 50 Mikrolitern
der betreffenden Probe 100 Mikroliter ZFM/ATP ± PCMPSA
zugesetzt. Nach 15 min (der normalerweise für die Extraktion
von mikrobiellen Nucleotiden mit ZFM verwendeten Zeit)
wurden
100 Mikroliter Luciferase-Luciferin-Lösung zugesetzt
und wurde ATP wie vorstehend beschrieben gemessen.
Ergebnisse:
TABELLE 13
Probe Glycerin Glycerokinase PCMPSA RLE-Wert % des Kontrollversuchs
Schlußfolgerungen:
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Man erkennt, daß (in Abwesenheit von
PCMPSA) Glycerokinase in jeder der in den Proben 7 bis 9
verwendeten Konzentrationen in milchhaltigen Proben
inaktivierend wirkt. Wenn ein Inhibitor vorhanden ist, werden die
Kinetik der stattfindenden Reaktionen und die relativen
Konzentrationen und die Zugabezeiten der Reaktionspartner
wichtig. Wenn bei jeder der drei Konzentrationen der
Glycerokinase der Inhibitor bei einer gegebenen Konzentration
zusammen mit ATP
in demselben Zeitpunkt zugesetzt wird, nimmt mit
der Ausgangskonzentration des Enzyms die ATP-Menge zu, die
inaktiviert wird, bevor das Enzym vollständig inhibiert
werden kann. Aber ATP kann in jeder grobe festgestellt werden,
und es können Spiegel in der Nähe der Kontrollspiegel
festgestellt werden, wenn die Ausgangsspiegel des Enzyms genügend
niedrig sind, wie in den Proben 4 bis 6.
BEISPIEL 14
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Die Wirkung und die Inhibition von Glycerokinase
wurden in zwei verschiedenen Proben - Milch und Orangensaft -
bestimmt, die häufig in Biolumineszenzassays auf mikrobielle
Verunreinigung getestet werden.
Protokoll:
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Es wurden Orangensaftproben mit 500 Mikrolitern
Orangensaft (Riedel, Niederlande, ohne Konservierungsstoffe,
pasteurisiert), 500 Mikroliter gepuffertes EFM, 3 mM
Glycerin und gegebenenfalls 0,5 mM PSMPSA hergestellt und bei
vier verschiedenen Glycerokinasekonzentrationen 0, 5, 10
bzw. 20 min lang inkubiert.
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Auf ähnliche Weise wurden Proben mit Milch
hergestellt, bei denen 500 Mikroliter Rohmilch (frisch, vom
örtlichen Bauern) und 500 Mikroliter EFM anstelle des
gepufferten EFM verwendet wurden.
Ergebnisse:
TABELLE 14
Glycerokinase PCMPSA RLE-Wert nach min Probe: Orangensaft
Glycerokinase PCMPSA RLE-Wert nach min Probe: Rohmilch
Schlußfolgerungen:
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Die Ergebnisse der mit Orangensaft bzw.
Milch durchgeführten Versuche besagen, daß ohne Inhibitor
durch Glycerokinase selbst bei der geringsten Aktivität
während eines Zeitraums von 20 min im wesentlichen alles in
den Proben vorhandene ATP inaktiviert wird.
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Ferner erkennt man, daß die gewählte
Konzentration des Inhibitors zum Inhibieren des Enzyms selbst in den
höchsten verwendeten Konzentrationen genügt.
BEISPIEL 16
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Für die schnelle Erfassung von Mikroorganismen
in Rohmilchgroben wurde ein im technischen Maßstab
durchführbares Protokoll erarbeitet.
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Es wurde eine EFM-Stammlösung hergestellt, die
3,0 mM Glycerin und 5,0 mM MgSO&sub4; enthielt. Ferner wurde eine
ZFM-Stammlösung hergestellt, die als Inhibitor 0,5 mM
PCMPSA enthielt. Unmittelbar vor einem Assay wurde mit
dem EFM/Glycerin/MgSO&sub4; eine Lösung hergestellt,
die 1,275
E/ml Glycerokinase enthielt.
Protokoll:
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1. 25 Mikroliter Rohmilch werden in eine Küvette gegeben.
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2. 100 Mikroliter der EFM/Glycerokinase-Lösung werden
zugesetzt.
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3. Die Küvette wird 5 min bei Zimmertemperatur
stehengelassen.
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4. Die Küvette wird in die Zählkammer eines Photometers
eingesetzt.
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5. Es werden 100 Mikroliter ZFM/Inhibitor zugesetzt.
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6. Nach einer Inkubation von 10 oder 15 s werden 100
Mikroliter Luciverase-Luciferin-Lösung zugesetzt.
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7. Das Licht wird während einer Integrationszeit von 10 s
gemessen, und die RLE-Werte werden aufgezeichnet.
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Es ist eine enge Korrelation
(Korrelationskoeffizient = 0,91) zwischen dem nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren bestimmten mikrobiellen ATP und der Anzahl der
mikrobiellen Zellen festzustellen, die als koloniebildende
Einheiten erfaßbar sind, wenn Verdünnungen derselben Proben
auf Selektivagarplatten aufgebracht, 148 h bei 32ºC
inkubiert und nach üblichen Verfahren gezählt wurden.