WO2020122406A1 - 심혈관계 질환의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

심혈관계 질환의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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WO2020122406A1
WO2020122406A1 PCT/KR2019/013765 KR2019013765W WO2020122406A1 WO 2020122406 A1 WO2020122406 A1 WO 2020122406A1 KR 2019013765 W KR2019013765 W KR 2019013765W WO 2020122406 A1 WO2020122406 A1 WO 2020122406A1
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gene
biomarker
vascular endothelial
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cardiovascular disease
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PCT/KR2019/013765
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양철우
정병하
김경운
고은정
김보미
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for detecting a cardiovascular disease, a composition or kit for detecting a cardiovascular disease using the biomarker, and a method for providing information necessary for diagnosing a cardiovascular disease using the biomarker.
  • the kidney is an organ that metabolizes in the body and releases various substances present in the blood.
  • the blood is filtered through the glomerular filtration, renal tubular absorption, and reabsorption processes to release unnecessary substances in the body in the form of urine.
  • the kidney weight is only 0.5% of the weight of the body, blood flow to the kidneys is 20-25% of the total cardiac output, so it is easy to be damaged by various toxic xenobiotics in the blood. For example, if an excessive amount of drugs are injected into the body or various diseases occur, the kidney may be damaged. When the kidney is damaged, unnecessary substances present in the body are not discharged, resulting in additional physical damage.
  • Renal failure refers to a condition in which nitrogen metabolites, water, and electrolytes are not excreted sufficiently due to impaired kidney blood flow, reduced functional nephron, and urinary tract obstruction. Kidney failure is divided into acute renal failure with reversible progression and chronic renal failure with reversible kidney damage. In particular, renal failure is diagnosed as renal failure.
  • vascular endothelial cells function as a barrier surrounding the vascular wall as well as regulating the tension of blood vessels, maintaining the structure of blood vessels, and interacting with blood components contacting the blood vessel walls, endocrine, which plays an important physiological role. It has been known as an institution (Nature 362:801-809, 1993).
  • Vascular endothelial dysfunction is a process observed at the earliest stages in the development of arteriosclerosis, and unlike reversible arteriosclerosis, it is a reversible change that can be recovered. It could contribute greatly to improving the prognosis of cardiovascular disease.
  • An object of the present invention is to provide a biomarker for detecting cardiovascular diseases, a composition or kit for detecting cardiovascular diseases using the biomarker, and a method for providing information necessary for the diagnosis of cardiovascular diseases using the biomarker. I want to.
  • the present invention is to predict or diagnose the onset of cardiovascular disease in a subject by measuring the expression level of the mRNA or the protein encoded by the gene of the biomarker gene, for a biological sample discharged or obtained from a test subject. And a method for preventing or treating a cardiovascular disease to a subject predicted or diagnosed as having the cardiovascular disease, and a method for diagnosing and treating a cardiovascular disease.
  • the subject may be a patient with renal failure.
  • the predicting or diagnosing step may further include a step of determining whether the subject has a cardiovascular disease by comparing the mRNA or protein expression level of the biomarker with the normal control sample and the test sample.
  • the present inventors induce induced pluripotent stem cells using monocytes derived from peripheral blood, and biomarkers showing specific expression patterns of vascular endothelial cells derived from the induced pluripotent stem cells.
  • the biomarker can be used to detect, diagnose, or predict prognosis of cardiovascular disease.
  • the present invention provides a composition for predicting cardiovascular disease prognosis in a patient with renal failure, comprising an agent that measures the expression level of a protein encoded by the gene or mRNA of a specific marker in a patient with renal failure.
  • the present invention also provides a kit for predicting cardiovascular disease prognosis of a renal failure patient comprising the composition for predicting cardiovascular disease prognosis.
  • the present invention further comprises measuring the expression level of a gene marker specific for a kidney failure patient from a sample; Comparing the expression level of the mRNA or protein with that of a normal control;
  • the expression level is T1H (metallothionein 1H) gene, NLRP7 (NLR family, pyrin domain containing 7) gene, MIR302C (microRNA 302c) gene, DPPA3 (developmental pluripotency associated 3) gene, MT1G (metallothionein 1G) gene, ESRG (embryonic stem) cell related (non-protein coding) gene, L1TD1 (LINE-1 type transposase domain containing 1) gene, SLC7A3 (solute carrier family 7 (cationic amino acid transpoter, y+ system), member 3) gene, ZNF729 (zinc finger protein) 728)
  • T1H metalothionein 1H
  • NLRP7 NLR family, pyrin domain containing 7
  • MIR302C microRNA 302c
  • prognosis refers to the course and completeness of a disease, including the likelihood of cardiovascular disease-caused death or progression, including onset, of diseases, including cardiovascular disease.
  • prognosis is worse means, for example, complications after diagnosis of kidney disease including kidney failure, cardiovascular disease development, cardiovascular disease due to progression of cardiovascular disease, cardiovascular disease, etc. This may be an increase in the likelihood of death.
  • normal or “normal person” refers to an individual with healthy kidney, who has no kidney disease, including terminal kidney disease.
  • the present invention provides a composition for predicting cardiovascular disease prognosis in a patient with renal failure, comprising an agent that measures the expression level of mRNA or a protein encoded by the gene of a cardiovascular disease-specific gene marker.
  • Biomarker according to the present invention is MT1H gene, NLRP7 gene, MIR302C gene, DPPA3 gene, MT1G gene, ESRG gene, L1TD1 gene, SLC7A3 gene, ZNF729 gene, PRDM14 gene, CEMIP gene, COL12A1 gene, LOC151760 gene, TYRP1 gene, TXNIP Gene, IL18 gene, PCDH10 gene, GDF6 gene, LINC00842 gene, and FGF7 gene.
  • isolated pluripotent stem cells are prepared by isolating monocytes of patients with end-stage renal disease (ESRD), and from which the differentiated stem cell-derived vascular endothelial cells (iPS-ECs) are generated. It was produced. In the iPS-EC, a tube formation area was reduced by 80% or more compared to iPS-EC derived from a normal person (Example 3). This means that the ability to produce blood vessels in patients with end-stage renal disease is inhibited compared to normal people.
  • ESRD end-stage renal disease
  • iPS-ECs differentiated stem cell-derived vascular endothelial cells
  • CD31 positive cells among the iPS-ECs were selected and RNA microarray analysis was performed to compare the gene expression patterns of iPS-ECs derived from end-stage renal disease patients and normal-derived iPS-ECs, resulting in gene expression in patient samples.
  • 148 genes that increased by 1.5 times or more and 78 genes whose expression was decreased by 1.5 times or more were identified.
  • the top 10 genes with increased expression were MT1H gene, NLRP7 gene, MIR302C gene, DPPA3 gene, MT1G gene, ESRG gene, L1TD1 gene, SLC7A3 gene, ZNF729 gene, and PRDM14 gene.
  • the top 10 genes with reduced expression were CEMIP gene, COL12A1 gene, LOC151760 gene, TYRP1 gene, TXNIP gene, IL18 gene, PCDH10 gene, GDF6 gene, LINC00842 gene, and FGF7 gene.
  • the gene with increased expression was shown to inhibit inflammation or oxidative stress-related gene and vascular endothelial cell migration or proliferation, and the gene with reduced expression was related to vascular development and extracellular matrix (ECM) components of the cell membrane.
  • ECM extracellular matrix
  • the 20 genes whose expression has been increased or decreased show specific expression of end-stage renal disease in which angiogenesis ability is reduced by 80% compared to a normal person, and can be used as a gene marker for predicting cardiovascular disease prognosis in renal failure patients.
  • the biomarker according to the present invention may be a biomarker for detecting dysfunction of vascular endothelial cells, that is, it may be used for the detection of cardiovascular diseases, and more specifically, for the detection of cardiovascular diseases associated with kidney disease.
  • the biomarker for detecting dysfunction of vascular endothelial cells is a gene or a fragment thereof related to vascular development and extracellular matrix components of vascular endothelial cells, and the mRNA or protein expression level of the biomarker is higher than that of a normal control group. It may be a decrease in patients with cardiovascular disease associated with kidney disease.
  • biomarker examples include COL12A1 (collagen, type XII, alpha 1), PCDH10 (protocadherin 10), VTN (vitronectin), CALB2 (calbindin 2), ITGA11 (integrin alpha 11), EFEMP1 (EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), PCDHB14 (protocadherin beta 14), FBN1 (fibrillin 1), CDH5 (cadherin 5, type 2 (vascular endothelium), FBLN5 (fibulin 5) and FBN2 (fibrillin 2).
  • the number of decreases in the expression level compared to normal iPS-EC may be genes reduced by 1.5 times or more (Fold change 1.5 or more), preferably genes reduced by 2.0 times, reduced by 2.5 times, reduced by 3.0 times, reduced by 4.0 times or reduced by 4.5 times Table 1 below.
  • Biomarkers for detecting dysfunction of vascular endothelial cells are vascular endothelial cells and genes related to cell migration, or fragments thereof, wherein the level of mRNA or protein expression of the biomarkers is related to kidney disease compared to normal controls It may be a decrease in patients with related diseases.
  • the biomarker include EDN1, ANGPT2 (angiopoietin 2), MXRA5 (matrix-remodelling associated 5), MME (membrane metallo-endopeptidase), CEMIP (Cell Migration Inducing Hyaluronan Binding Protein).
  • the biomarker for detecting dysfunction of vascular endothelial cells is a gene or fragment thereof related to inflammation or oxidative stress of vascular endothelial cells, and the biomarker mRNA or protein expression level is It may be increased in patients with cardiovascular disease associated with kidney disease compared to normal controls.
  • biomarker examples include MT1H (metallothionein 1H), MT1G (metallothionein 1G), NLRP7 (NLR family, pyrin domain containing 7), NLRP2 (NLR family, pyrin domain containing 2), SOX2 (SRY box 2), IFIT1 (interferon) -induced protein with tetratricopeptide repeats 1), IFIT2 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), CXCL10 (chemokine (CXC motif) ligand 10), IFI6 (interferon, alpha- inducible protein 6), IFIH1 (interferon induced, with helicase C domain 1), IFI44 (interferon-induced protein 44), FOXI3 (forkhead box I3) and IFI44L (interferon-induced protein 44-like).
  • IFIT1 interferon
  • IFIT2 interfer
  • the biomarker for detecting dysfunction of vascular endothelial cells is a gene or fragment thereof that inhibits the movement or proliferation of vascular endothelial cells, and the level of mRNA or protein expression of the biomarker is higher than that of the normal control group. It may be increasing in patients with related cardiovascular diseases. Examples of such biomarkers include MIR302C, MIR302B, MIR302D and MIR302A.
  • the biomarkers are, for example, metallothionein 1H (MT1H), NLR family, pyrin domain containing 7 (NLRP7), microRNA 302c (MIR302C), developmental pluripotency associated 3 (DPPA3), metallothionein 1G (MT1G), embryonic stem cell related ESRG (non-protein coding)), L1TD1 (LINE-1 type transposase domain containing 1), SLC7A3 (solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), ZNF729 (zinc finger protein 729), PRDM14 (PR domain containing 14 ), LIN28A (lin-28 homolog A (C.
  • MT1H metallothionein 1H
  • NLR family pyrin domain containing 7
  • NLRP7 pyrin domain containing 7
  • MIR302C microRNA 302c
  • DPPA3 developmental pluripotency associated 3
  • MT1G metallothionein 1G
  • SLCO4C1 solute carrier organic anion transporter family, member 4C1
  • TUBB4A tubulin, beta 4A class Iva
  • GDF3 growth differentiation factor 3
  • HRASLS5 HRAS -like suppressor family, member 5
  • DNMT3L DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like
  • ERVH48-1 endogenous retrovirus group 48, member 1
  • ESRP1 epidermal splicing regulatory protein 1
  • NTS neutralrotensin
  • EPCAM epidermal cell adhesion molecule
  • HIST1H1A histone cluster 1, H1a
  • HERC5 HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 5
  • GLDC glycine de hydrogenase (decarboxylating)
  • SCGB3A2 secretoglobin, family 3A, member 2)
  • POU5F1P3 POU class 5 homeobox 1 pseudogene 3
  • the biomarkers are, for example, CEMIP (cell migration inducing protein, hyaluronan binding), COL12A1 (collagen, type XII, alpha 1), TYRP1 (tyrosinase-related protein 1), TXNIP (thioredoxin interacting protein), IL18 (interleukin 18) , PCDH10 (protocadherin 10), and one or more genes selected from the group consisting of growth differentiation factor 6 (GDF6).
  • CEMIP cell migration inducing protein, hyaluronan binding
  • COL12A1 collagen, type XII, alpha 1
  • TYRP1 tyrosinase-related protein 1
  • TXNIP thioredoxin interacting protein
  • IL18 interleukin 18
  • PCDH10 protocadherin 10
  • GDF6 growth differentiation factor 6
  • the agent for measuring the mRNA expression level of the cardiovascular disease-specific gene marker may be an antisense oligonucleotide, a primer pair or a probe specifically binding to each gene, and the base of each marker gene Primers or probes that specifically amplify specific regions of these genes based on the sequence can be designed.
  • an agent that measures the expression level of a protein encoded by the cardiovascular disease-specific marker gene may be an antibody or aptamer specific for the protein expressed from each marker gene.
  • the renal failure patient may be an acute renal failure patient, a chronic renal failure patient, or a terminal renal failure patient, preferably a terminal renal failure patient.
  • Cardiovascular disease is the most common cause of death in patients with end-stage renal disease, including dialysis patients, and the mortality rate from cardiovascular disease in these patients is reported to be 20-30 times higher than in normal subjects.
  • Dysfunction of vascular endothelial cells is considered to be an important early change that is commonly involved in the development of cardiovascular diseases such as atherosclerosis, hypertension, and heart failure.
  • Vascular endothelial cells are endocrine organs that play a physiologically important role, including not only functioning as a barrier that surrounds the walls of blood vessels, but also regulating the tension of blood vessels, maintaining the structure of blood vessels, and interacting with blood components that contact blood vessel walls. It has been known.
  • the dysfunction of vascular endothelial cells is the process observed at the earliest stages in the development of arteriosclerosis, and unlike reversible arteriosclerosis, it is a reversible change that can be recovered. It could greatly contribute to improving the prognosis of the cardiovascular disease in the patient.
  • the cardiovascular disease may be one or more selected from the group consisting of myocardial infarction, stroke, arteriosclerosis, angina pectoris, and heart failure.
  • An example of the present invention relates to a kit for predicting cardiovascular disease prognosis in a kidney failure patient, comprising the composition.
  • the kit can predict the cardiovascular disease prognosis in renal failure patients by confirming the mRNA expression level or protein expression level of a specific marker gene for renal failure patients.
  • the kit for predicting cardiovascular disease prognosis in patients with renal failure may include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analysis in addition to the above composition.
  • the kit provided by the present invention may be a kit including essential elements required for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC- in addition to each primer pair specific for a marker gene.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq-polymerase and reverse transcriptase DNase
  • RNase inhibitors DEPC- in addition to each primer pair specific for a marker gene.
  • DEPC-water sterilized water, and the like.
  • the kit provided by the present invention may be in the form of a microarray.
  • the microarray may include a DNA or RNA polynucleotide probe.
  • the microarray includes a conventional microarray configuration, except that it includes a probe specific to the nucleotide sequence of the cardiovascular disease prognosis marker gene of a renal failure patient according to the present invention.
  • the kit provided by the present invention may be a protein chip kit.
  • the protein chip may include a buffer solution suitable for immunological detection, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like to measure the expression level of the protein encoded from the marker gene.
  • the present invention also includes the step of measuring the expression level of the mRNA or the protein encoded by the gene of the renal failure patient specific marker gene in the sample to be tested, the information necessary to predict the prognosis of cardiovascular disease in renal failure patients It is about how to provide.
  • the present invention is a biological sample discharged or obtained from a test subject (subject), for example, blood, plasma, vascular endothelial cells, etc., of the cardiovascular disease specific marker gene of a renal failure patient, or of a protein encoded by the gene
  • a test subject for example, blood, plasma, vascular endothelial cells, etc.
  • the cardiovascular disease specific marker gene of a renal failure patient or of a protein encoded by the gene
  • Predicting or diagnosing the development of a cardiovascular disease in a subject by measuring an expression level, and administering a drug for preventing or treating a cardiovascular disease to a subject predicted or diagnosed as having the cardiovascular disease It relates to a diagnosis and treatment method of the disease.
  • the subject may be a patient with renal failure.
  • the predicting or diagnosing step may further include a step of determining whether the subject has a cardiovascular disease by comparing the mRNA or protein expression level of the biomarker with the normal control sample and the test sample.
  • the cardiovascular disease prevention or treatment drug may be a drug used for chronic venous obstruction, primary hypertension, or the like, Beraprost (Prostacyclin analog), and preferably an ACE inhibitor, a drug known to be effective in endothelial dysfunction among drugs used in patients with chronic kidney failure.
  • ACE inhibitor a drug known to be effective in endothelial dysfunction among drugs used in patients with chronic kidney failure.
  • captopril, ramipril, etc. beta-blocker (nevivolol, etc.), statin series (atorvastatin, pravastatin, etc.), PDE5 inhibitors (viagra, etc.).
  • the stage of administration of the disease is possible at any stage of stages 1 to 5 diagnosed with chronic kidney disease. Since the drug treatment is usually performed after the 3rd stage (3rd, 4th, 5th stage), it can be broadly included in the CKD stages 1-5, and concentrated stages 3-5.
  • MT1H gene NLRP7 gene, MIR302C gene, DPPA3 gene, MT1G gene, ESRG gene, L1TD1 gene, SLC7A3 gene, ZNF729 gene, PRDM14 gene, CEMIP gene, COL12A1 gene, LOC151760 gene, from samples isolated from normal control and test subjects TYRP1 gene, TXNIP gene, IL18 gene, PCDH10 gene, GDF6 gene, LINC00842 gene, and FGF7 gene selected from the group consisting of at least one vascular endothelial cell dysfunction abnormal biomarker mRNA or encoded by the gene Measuring the expression level of the protein; And
  • It relates to a method for providing information for diagnosing cardiovascular disease associated with kidney disease, comprising the step of comparing the mRNA or protein expression level of the biomarker with the normal control sample.
  • the biomarker is a gene related to vascular development and extracellular matrix components of vascular endothelial cells, or a gene related to vascular endothelial cell or cell migration
  • the test subject may further include determining that the cardiovascular disease is associated with kidney disease.
  • Biomarkers with reduced expression levels in cardiovascular disease targets compared to the normal control group include CEMIP gene, COL12A1 gene, LOC151760 gene, TYRP1 gene, TXNIP gene, IL18 gene, PCDH10 gene, GDF6 gene, LINC00842 gene, and FGF7 gene. It may be selected from the group consisting of.
  • the biomarker is a gene related to inflammation or oxidative stress of vascular endothelial cells, or a gene that inhibits movement or proliferation of vascular endothelial cells
  • the test object may further include determining that the cardiovascular disease is related to kidney disease.
  • the biomarker in which the expression level is increased in the cardiovascular disease target compared to the normal control group consists of the MT1H gene, NLRP7 gene, MIR302C gene, DPPA3 gene, MT1G gene, ESRG gene, L1TD1 gene, SLC7A3 gene, ZNF729 gene and PRDM14 gene. It may be selected from the group.
  • the step of measuring the expression level of the mRNA may be used without limitation as long as it is known in the art as a method of measuring the expression level of the mRNA, for example, reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time Reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting and DNA microarray chip may be performed by one or more assays selected from the group consisting of chips.
  • the step of measuring the expression level of the protein may be used without limitation as long as it is known in the art to measure the expression level of the protein, for example, Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Ouchterlony (Ouchterlony) immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, FACS and may be performed by one or more assays selected from the group consisting of protein chips.
  • Prediction or early diagnosis of cardiovascular disease in kidney disease patients is possible by analyzing the expression level of the mRNA or the protein encoded by the gene based on the specific marker gene of the kidney failure patient provided by the present invention. It can improve the patient's survival rate.
  • 1A is a micrograph of iPS derived from a normal person and iPS derived from an ESRD patient.
  • 1B is a photograph obtained by fluorescence microscopy of immunofluorescence staining results of normal-derived iPS and ESRD-derived iPS.
  • Figure 1c is a graph showing the fluorescent signals of NANOG, SSEA-4 and TRA-1-81, which are specific markers for induced stem cells.
  • Figure 1d shows a picture observed under a microscope for the results of AP staining for iPS derived from a normal person or ESRD patient.
  • Figure 2a briefly shows the experimental process of inducing vascular endothelial cells from iPS.
  • Figure 2b is a photograph showing the results of immunostaining for vascular endothelial cell specific markers of iPS-EC from normal or ESRD patients.
  • Figure 2c is a graph showing the results of performing FACS after iPS-EC induction.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of tube formation assay for iPS-EC derived from normal humans and iPS-EC derived from ESRD patients.
  • Figure 4a shows the RNA microarray results of the three types of normal-derived iPS samples (N-1 to N-3) and three types of iPS-EC derived from ESRD patients (P-1 to P-3). This is the heat map shown.
  • 4B is a scatter diagram showing the expression level of each gene with the expression level in iPS-EC derived from normal persons as the x-axis and the expression level in iPS-EC derived from ESRD patients as the y-axis.
  • ESRD end-stage renal disease
  • Mononuclear cells from isolated normal and ESRD patients were cultured for 4 days in StemSpan TM ACF (Stem Cell Technologies) supplemented with StemSpan cc110. Subsequently, mononuclear cells were coated with 24-well plates in vitronectin (BD BioCoat TM ) and Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen) to prepare dedifferentiated stem cells (iPS) Did. Medium was changed daily until iPS colonies formed. After manual picking, iPS lines were maintained in plates coated with vitronectin (Life Technologies, Invitrogen) in TeSR-E8 medium (Stem Cell Technologies). On day 12 after transduction, new iPS colonies were picked individually and expanded for characterization. Cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions from 3 to 21 days after transduction.
  • StemSpan TM ACF StemSpan TM ACF (Stem Cell Technologies) supplemented with StemSpan cc
  • Fig. 1A The result of observing the cell shape by magnifying the iPS obtained in Example 1-1 with a microscope 50 times is shown in Fig. 1A.
  • iPS For normal iPS and ESRD iPS, immunofluorescence staining for NANOG, SSEA-4 and TRA-1-81, respectively known as iPS markers, specifically, iPS was grown in a plastic cover slide chamber and 4% (w/v). It was fixed with paraformaldehyde. The following antibodies were used for immunofluorescence staining: NANOG (1E6C4, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology), stage specific embryo antigen SSEA-4 (813-70, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology) TRA-1-81 ( TRA- 80, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology). The stained slides were performed by visualizing under a Zeiss microscope (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) at 200 and 400 times magnification.
  • LSM 510 Meta Carl Zeiss, Oberkochen, Germany
  • FIGS. 1B and 1C The results of immunofluorescence staining for NANOG, SSEA-4 and TRA-1-81, known as iPS markers, for normal iPS and ESRD iPS, respectively, are shown in FIGS. 1B and 1C. It was confirmed that the iPS markers NANOG, SSEA-4, and TRA-1-81 were expressed in both normal iPS and ESRD iPS (FIGS. 1B and 1C ).
  • APPS alkaline phosphatase staining
  • FIG. 1D The results of AP staining of the two iPS are shown in FIG. 1D. It can be confirmed that it is strongly stained in both normal iPS and ESRD iPS and has a multipotency (FIG. 1D).
  • iPS-ECs iPS Produced derived Pluripotent Stem Cells derived Endothelial Cells
  • Vascular endothelial cells (EC) from the iPS prepared in Example 1-1 were prepared by the method shown in FIG. 2A. Specifically, the VEGF-A 50ng/ml, BMP4 50ng/ml was added to the iPS prepared in Example 1-1 to produce an embryonic body (EB), and after 4 days, VEGF-A 50ng/ml After proliferation of embryoid bodies in the addition medium, for the production of hiPS-Endothelial cells (iPS-ECs), embryoid bodies (EB) were attached to the gelatin coated dish on the 4th day in the presence of VEGF-A. After growing in a gelatin coated dish until day 14, only vascular endothelial cells were isolated and confirmed using a microbead with CD31 antibody, a specific marker for vascular endothelial cells.
  • iPS-ECs hiPS-Endothelial cells
  • FIG. 2B shows the observed results.
  • Figure 2b is a photograph showing the results of immunostaining for vascular endothelial cell specific markers of iPS-EC from normal or ESRD patients.
  • immunofluorescence staining and confocal microscopy observations showed that normal humans and ESRD iPS-ECs were grown in plastic cover slide chambers and fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde.
  • the following antibodies were used for immunofluorescence staining: CD31 (WM-59 (WM59), eBioscience); CD34 (4H11, eBioscience); CD133 (TMP4, eBioscience); vWF (sc-53466, 1:1, Santa Cruz Biotechnology); Flk (sc-6251, 1:1, Santa Cruz Biotechnology); Flt (sc-271789, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology).
  • Alexa Fluor 488- or 647-conjugated streptavidin (Molecular Probes) was used according to the manufacturer's instructions.
  • the stained slides were performed by visualizing under a Zeiss microscope (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) at 200 and 400 times magnification.
  • Figure 2c is a graph showing the results of performing FACS after iPS-EC induction.
  • ESRD sample the fluorescence signal is significantly weaker than the normal sample appears, it can be seen that the vascular endothelial cell differentiation ability of iPS derived from ESRD patients is reduced.
  • 2c shows a graph of the results of FACS analysis of isotype control, normal iPS-EC, and ESRD iPS-EC. (P ⁇ 0.01, ESRD iPS-EC (4.1 ⁇ 2.7) vs normal iPS-EC (33.6 ⁇ 7.3).
  • CD31 positive cells which are vascular endothelial cell specific markers, were reduced by about 6-fold in iPS-EC derived from ESRD patients.
  • the average ratio of CD31 positive cells, a specific marker for vascular endothelial cells was 33.6 ⁇ 7.3%, but the average ratio of CD31 positive cells of iPS-EC derived from ESRD was only 4.1 ⁇ 2.7%, compared to normal samples. It showed about 8 times lower vascular endothelial cell differentiation ability.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of tube formation assay for iPS-EC derived from normal humans and iPS-EC derived from ESRD patients.
  • ESRD iPS-EC can be confirmed that after 4 hours, the area where blood vessels were formed was significantly less than normal iPS-EC. It can be seen that the tube formation area was significantly reduced in iPS-EC derived from ESRD patients compared to normal iPS-EC. Table 3 shows the results of this as a tube formation area (%).
  • IPS-EC derived from ESRD patients had a 80% reduction in tube formation area compared to normal iPS-EC. These results indicate that vascular endothelial cell-derived vascular endothelial cell-derived vascular endothelial cell-derived vascular endothelial cell-derived cells are inhibited compared to normal humans.
  • RNA microarray was performed to analyze the gene expression pattern specific to end-stage renal disease patients.
  • the whole RNA was isolated using the ReliaPrep RNA Miniprep system (Promega Corgoration) from normal iPS-EC and ESRD iPS-EC produced by the method of Example 2-1 and showing CD31 positive.
  • the isolated whole RNA was subjected to the Affymetrix whole transcription expression array process according to the manufacturer's protocol (GeneChip WT Pico reagent Kit).
  • cDNA was synthesized using the GeneChip WT Pico Amplification kit as described by the manufacturer.
  • the sense cDNA was fragmented and biotin was labeled with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) using GeneChip WT Terminal labeling kit.
  • RNA microarray results signal values are generated using the Affymetrix® GeneChip ⁇ Command Console software program, Gene Ontology (www.geneontology.org/) and KEGG (www.genome.jp/kegg/) for the important probe list. -Hierarchical clustering of gene expression was performed under the conditions of Enrichment and Functional Annotation. As a result, the heat map is shown in Fig. 4A.
  • Figure 4a shows the RNA microarray results of the three types of normal-derived iPS samples (N-1 to N-3) and three types of iPS-EC derived from ESRD patients (P-1 to P-3). This is the heat map shown.
  • the gene expression pattern of normal iPS-EC and ESRD iPS-EC was significantly different.
  • the results of plotting the scatter plot of each gene as a dot in the x-axis as the normal iPS-EC and the y-axis as the ESRD iPS-EC gene expression level are shown in FIG. 4B.
  • the gray dot represents a group without change
  • the yellow dot represents a gene with a difference in expression level of 1.5 times or more when the difference in expression (Fold change, FC) is less than 1.5 times.
  • Table 4 shows the top 10 genes in ESRD iPS-EC with the largest increase in expression among the 148 genes whose expression level increased more than 1.5 times compared to normal iPS-EC.
  • the genes related to inflammation or oxidative stress MT1H (metallothionein 1H), MT1G (metallothionein 1G), NLRP7 (NLR family, pyrin domain containing 7), NLRP2 ( NLR family, pyrin domain containing 2), SOX2 (SRY box 2), IFIT1 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), IFIT2 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3) ), CXCL10 (chemokine (CXC motif) ligand 10), IFI6 (interferon, alpha-inducible protein 6), IFIH1 (interferon induced, with helicase C domain 1), IFI44 (interferon-induced protein 44), FOXI3 (forkhead box I3) ) And IFI44L (interferon
  • COL12A1 and VTN are characterized by decreased expression of COL12A1 and VTN, genes related to vascular development and extracellular matrix (ECM) components of the cell membrane, compared to normal humans.
  • Table 5 shows the top 10 genes out of 78 genes in which the expression level of ESRD iPS-EC decreased more than 1.5 times (FC -1.5 or more) compared to normal iPS-EC.
  • vascular development and extracellular matrix (ECM) component related genes (COL12A1 (collagen, type XII, alpha 1), PCDH10 (protocadherin 10), VTN (vitronectin), CALB2 (calbindin 2), ITGA11 (integrin alpha 11), EFEMP1 (EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), PCDHB14 (protocadherin beta 14), FBN1 ( fibrillin 1), CDH5 (cadherin 5, type 2 (vascular endothelium), FBLN5 (fibulin 5) and FBN2 (fibrillin 2)), and genes associated with vascular endothelial cell and cell migration (EDN1, ANGPT2 (angiopoietin 2), MXRA5 ( Matrix-remodelling associated 5), MME (me
  • genes important for angiogenesis were reduced in iPS-EC derived from ESRD patients, and it is believed that inflammation or oxidative stress-related genes increase, leading to dysfunction of the kidneys.

Abstract

본 발명은 신부전 환자 특이적 심혈관계 질환 관련 유전자 마커를 발굴함으로써 신부전 환자, 특히 말기 신부전증 환자의 심혈관계 질환 발병 또는 예후를 예측하기 위한 조성물과 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 유전자 마커를 이용한 조성물 또는 키트를 이용하셔 심혈관계 질환의 위험이 높은 신부전 환자에게서 심혈관계 질환의 발병을 예측하거나 심혈관계 질환의 초기 발병 단계에서의 예후를 예측할 수 있으며, 비가역적인 동맥경화증과 같은 질환의 단계로 진입하기 전에 적절한 치료 또는 처치가 가능하다.

Description

심혈관계 질환의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
본 발명은 심혈관계 질환을 검출하는 바이오마커, 상기 바이오마커를 이용한 심혈관계 질환의 검출용 조성물 또는 키트, 및 상기 바이오마커를 이용하여 심혈관계 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
신장은 체내에서 대사되어 혈액 속에 존재하는 다양한 물질들을 배출하는 장기로서, 혈액을 사구체 여과, 신세뇨관 흡수 및 재흡수 과정을 통하여 여과함으로써 체내의 불필요한 물질들을 뇨(尿)의 형태로 배출한다. 신장 무게는 몸무게의 0.5%에 불과하지만, 신장으로 흐르는 혈액량은 총 심박출량의 20-25%에 달하므로 혈액에 포함되어 있는 각종 독성물질(toxic xenobiotics)로 인해 손상 받기 쉽다. 예를 들어, 체내에 과다한 약물을 주사하거나 각종 질환이 발생할 경우 신장이 손상될 수 있는데, 신장이 손상되면 체내에 존재하는 불필요한 물질이 배출되지 않아, 추가적인 신체손상이 발생하게 된다.
신부전은 신장의 혈류장해, 기능 네프론의 감소, 요로 폐색 등에 의해 질소 대사물이나 물, 전해질의 배설이 충분히 행해지지 않게 되어 체액의 양적, 질적 항상성을 유지할 수 없게 된 상태를 말한다. 신부전은 경과가 가역적인 급성 신부전, 신손상이 비가역적인 만성 신부전으로 나뉘며, 특히 신대체요법이 필요한 경우, 신부전으로 진단된다.
국내 말기 신장 질환 환자 수는 매년 5% 정도의 빠른 증가율을 보이고 있으며, 합병증에 의한 심혈관계 질환은 투석환자를 포함한 만성신부전 환자에서 가장 흔한 사망 원인으로 (American Journal of Kidney Diseases, 32 (Suppl 1):S81-S88, 1998), 이들 환자에서 심혈관계 질환에 의한 사망률은 정상인에 비해 20-30배 정도 높은 것으로 보고되고 있다 (American Journal of Kidney Diseases,32 (Suppl 3):S112-S119, 1998). 따라서 말기 신부전증 환자에서 심혈관계 질환의 발생과 밀접한 관련이 있는 위험 인자에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 혈관내피세포는 혈관벽을 안쪽에서 둘러싸고 있는 장벽으로서의 기능뿐 아니라 혈관의 긴장도 조절, 혈관의 구조 유지, 혈관벽과 접촉하는 혈액 성분들과 상호작용하는 기능을 포함하는 생리적으로 중요한 역할을 담당하는 내분비 기관으로 알려져 왔다 (Nature 362:801-809, 1993). 혈관내피세포의 기능이상은 동맥경화증 발생에서 가장 초기 단계에 관찰되는 과정으로, 비가역적 변화인 동맥경화증과는 달리 회복이 가능한 가역적인 변화이므로, 이 단계에서의 진단과 치료가 가능하다면 신부전 환자의 심혈관계 질환의 예후 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 심혈관계 질환을 검출하는 바이오마커, 상기 바이오마커를 이용한 심혈관계 질환의 검출용 조성물 또는 키트, 및 상기 바이오마커를 이용하여 심혈관계 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 시험 대상(subject)에서 배출 또는 얻은 생물학적 시료에 대해, 상기 바이오마커 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하여 대상의 심혈관계 질환의 발병 예측 또는 진단하는 단계, 및 상기 심혈관계 질환을 갖는 것으로 예측 또는 진단된 대상에게 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관계 질환의 진단 및 치료방법에 관한 것이다.
상기 대상은 신부전증 환자일 수 있다. 상기 예측 또는 진단단계는, 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을, 정상 대조군과 시험 대상 시료에서 비교하여, 대상의 심혈관계 질환 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 말초혈액에서 유래된 단핵구세포를 이용하여 유도만능줄기세포를 유도하고, 상기 유도만능줄기세포에서 유래된 혈관내피세포 특이적 발현 양상을 나타내는 바이오마커를 발굴하여, 상기 바이오마커를 이용하여 심혈관계 질환의 검출, 진단 또는 예후 예측을 수행할 수 있다.
본 발명은 신부전 환자에 특이적 마커의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 심혈관계 질환 예후 예측용 조성물을 포함하는 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 시료로부터 신부전 환자 특이적 유전자 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 상기 발현 수준이 T1H(metallothionein 1H) 유전자, NLRP7(NLR family, pyrin domain containing 7) 유전자, MIR302C(microRNA 302c) 유전자, DPPA3(developmental pluripotency associated 3) 유전자, MT1G(metallothionein 1G) 유전자, ESRG(embryonic stem cell related (non-protein coding)) 유전자, L1TD1(LINE-1 type transposase domain containing 1) 유전자, SLC7A3(solute carrier family 7 (cationic amino acid transpoter, y+ system), member 3) 유전자, ZNF729(zinc finger protein 728) 유전자 및 PRDM14(PR domain containing 14) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현 수준이 정상 대조군보다 높게 나타나는 경우 및/또는 CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현 수준이 정상 대조군보다 낮게 나타나는 경우에 해당하는 경우, 상기 개체의 심혈관계 질환의 발생 또는 악화 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예후"는 심혈관계 질환을 비롯한 질병의, 예를 들어 발병을 비롯한 심혈관계 질환 기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 "예후가 나빠진다"는 의미는 예를 들어, 신부전을 비롯한 신장질환의 진단 후 합병증으로서 심혈관계질환의 발병, 심혈관계 질환의 진행으로 인한 심혈관 기능의 저하, 심혈관계질환으로 인한 사망 가능성의 증가일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 기재된 "정상"또는 "정상인"이란 말기 신장 질환을 비롯한 신장 질환을 가지지 않은, 건강한 신장을 가진 개체를 의미한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 심혈관계 질환 특이적 유전자 마커의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오마커는 MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자, PRDM14 유전자, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 말기 신장질환 (ESRD) 환자의 단핵구를 분리하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)를 제작하여 그로부터 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포(iPS-ECs)를 제작하였다. 상기 iPS-EC는 정상인 유래 iPS-EC에 비해 관 형성 면적(tube formation area)이 80% 이상 감소하였다 (실시예 3). 이는 말기 신장질환 환자의 혈관 생성능이 정상인에 비해 저해되어 있음을 의미한다.
상기 iPS-EC 중 CD31 양성 세포를 선별하여 이에 대해 RNA 마이크로어레이 분석을 수행하여, 말기 신장질환 환자 유래 iPS-EC와 정상인 유래 iPS-EC의 유전자 발현 양상을 비교한 결과, 환자 샘플에서 유전자 발현이 1.5배 이상 증가한 유전자 148개, 유전자 발현이 1.5배 이상 감소한 유전자 78개가 동정되었다. 그 중 발현이 증가한 유전자 상위 10개는 MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자, 및 PRDM14 유전자로 나타났다. 발현이 감소한 유전자 상위 10개는 CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자였다. 상기 발현이 증가한 유전자는 염증 또는 산화 스트레스 관련 유전자와 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자로 나타났으며, 발현량이 감소한 유전자는 혈관 발달과 세포막의 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 성분 관련 유전자, 혈관 내피세포 및 세포 이동과 관련된 유전자로 나타났다.
상기 발현이 증가 또는 감소한 20개의 유전자는 혈관 형성능이 정상인에 비해 80% 감소한 말기 신장질환 특이적 발현을 나타내, 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 유전자 마커로 사용될 수 있다.
말기신장질환 환자는 정상인과 비교해 임상적으로 혈관내피세포 기능이상이 가장 특징적인데 그에 관한 연구로 정상인과 말기신장질환에서 혈액단핵세포 iPS유래 혈관내피세포로의 분화능과 혈관형성이 정상인에 비해 감소되어있으며 그 원인이 유전자 분석한 결과 혈관 발달과 세포막의 extracellular matrix (ECM) 성분, 세포이동과 관련된 유전자 감소, 염증 (inflammation)이나 산화스트레스 (oxidative stress), 혈관 내피세포의 이동과 증식억제 관련 유전자는 증가되어 있어서 임을 확인한 결과이다. 결국, 혈관형성에 중요한 유전자들이 말기신장질환 환자의 iPS 유래 혈관내피세포에서 감소되어있고 염증이나 산화스트레스 관련 유전자는 증가되어 기능이상이 발생하는 것이다.
본 발명에 따른 바이오마커는 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커일 수 있으며, 즉, 심혈관계 질환의 탐지용, 더욱 자세하게는 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환의 탐지용으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 혈관 내피세포의 혈관 발달과 세포외 기질 성분과 관련된 유전자 또는 이의 단편이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 감소하는 것일 수 있다. 상기 바이오마커의 예는, COL12A1 (collagen, type XII, alpha 1), PCDH10 (protocadherin 10), VTN (vitronectin), CALB2 (calbindin 2), ITGA11 (integrin alpha 11), EFEMP1 (EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), PCDHB14 (protocadherin beta 14), FBN1 (fibrillin 1), CDH5 (cadherin 5, type 2 (vascular endothelium), FBLN5 (fibulin 5) 및 FBN2 (fibrillin 2)을 포함한다. 상기 바이오마커는, 정상 iPS-EC에 비해 발현량의 감소 배수가, 1.5배 이상(Fold change 1.5 이상) 감소한 유전자, 바람직하게는 2.0배 감소, 2.5배 감소, 3.0배 감소, 4.0배 감소 또는 4.5배 감소한 유전자일 수 있으며, 하기 표 1에 구체적 사항을 기재하였다.
Figure PCTKR2019013765-appb-T000001
본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 혈관내피 세포 및 세포이동과 관련된 유전자 또는 이의 단편이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 감소하는 것일 수 있다. 상기 바이오마커의 예는, EDN1, ANGPT2 (angiopoietin 2), MXRA5 (matrix-remodelling associated 5), MME (membrane metallo-endopeptidase), CEMIP (Cell Migration Inducing Hyaluronan Binding Protein)을 포함한다.
본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 혈관내피 세포의 염증 (inflammation)이나 산화스트레스 (oxidative stress)와 관련된 유전자 또는 이의 단편이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 증가하는 것일 수 있다. 상기 바이오마커의 예는 MT1H (metallothionein 1H) , MT1G(metallothionein 1G), NLRP7(NLR family, pyrin domain containing 7), NLRP2 (NLR family, pyrin domain containing 2), SOX2 (SRY box 2), IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), IFIT2 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), CXCL10(chemokine (C-X-C motif) ligand 10), IFI6(interferon, alpha-inducible protein 6), IFIH1(interferon induced, with helicase C domain 1), IFI44(interferon-induced protein 44), FOXI3 (forkhead box I3) and IFI44L (interferon-induced protein 44-like)을 포함한다. 정상 iPS-EC에 비해 발현량의 증가 배수가, 1.5배 이상(Fold change 1.5 이상), 바람직하게는 2.0배 증가, 5.0 배 증가, 7.0배 증가, 9.0배 증가, 10배 증가 또는 11.0배 증가한 유전자일 수 있으며, 하기 표 2에 구체적 사항을 기재하였다.
Figure PCTKR2019013765-appb-T000002
본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자 또는 이의 단편이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 증가하는 것일 수 있다. 상기 바이오마커의 예는 MIR302C, MIR302B, MIR302D 및 MIR302A을 포함한다.
본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 시험 대상과 정상 대조군의 시료에서 측정된 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 구별이 되어야 하며, 이를 구별하는 기준으로서 cut-off 수치는 말기신장질환 환자의 iPS 유래 혈관내피세포(n=3)에서 정상인의 iPS 유래 혈관내피세포(n=3)와 비교하여, p< 0.05이하이면서 유전자 ratio값이 1.5이상, 더욱 바람직하게는 5이상으로 증가하는 것일 수 있다.
상기 바이오마커는 예를 들어 MT1H(metallothionein 1H), NLRP7(NLR family, pyrin domain containing 7), MIR302C(microRNA 302c), DPPA3(developmental pluripotency associated 3), MT1G(metallothionein 1G), ESRG(embryonic stem cell related (non-protein coding)), L1TD1(LINE-1 type transposase domain containing 1), SLC7A3(solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), ZNF729(zinc finger protein 729), PRDM14(PR domain containing 14), LIN28A(lin-28 homolog A (C. elegans)), SLCO4C1(solute carrier organic anion transporter family, member 4C1), TUBB4A(tubulin, beta 4A class Iva), GDF3(growth differentiation factor 3), HRASLS5(HRAS-like suppressor family, member 5), DNMT3L(DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like), ERVH48-1(endogenous retrovirus group 48, member 1), ESRP1(epithelial splicing regulatory protein 1), NTS(neurotensin), EPCAM(epithelial cell adhesion molecule), HIST1H1A(histone cluster 1, H1a), HERC5(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 5), GLDC(glycine dehydrogenase (decarboxylating)), SCGB3A2(secretoglobin, family 3A, member 2), POU5F1P3(POU class 5 homeobox 1 pseudogene 3), TRIM71(tripartite motif containing 71, E3 ubiquitin protein ligase), ZNF208(zinc finger protein 208), ZFP42(ZFP42 zinc finger protein), RNF125(ring finger protein 125, E3 ubiquitin protein ligase), APELA(apelin receptor early endogenous ligand), DPPA4(developmental pluripotency associated 4), ZNF257(zinc finger protein 257), CDH1(cadherin 1, type), MIR302B(microRNA 302b), CALB1 (calbindin 1), SOX2(SRY box 2), 및 MIR302D(microRNA 302d)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함한다.
또한 본 발명에 따른 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커는, 시험 대상과 정상 대조군의 시료에서 측정된 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 구별 되어야 하며, 이를 구별하는 기준으로서 cut-off 수치는 말기 신장질환 환자의 iPS 유래 혈관내피세포(n=3)에서 정상인의 IPS 유래 혈관내피세포(n=3)와 비교하여, p<0.05이하이면서 유전자 ratio값이 -1.5이하, 바람직하게는 -11.9 이하까지 감소하는 것으로 결정할 수 있다. 상기 바이오마커는 예를들어 CEMIP(cell migration inducing protein, hyaluronan binding), COL12A1(collagen, type XII, alpha 1), TYRP1(tyrosinase-related protein 1), TXNIP(thioredoxin interacting protein), IL18 (interleukin 18), PCDH10(protocadherin 10), 및 GDF6(growth differentiation factor 6)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 예에서 상기 심혈관계 질환 특이적 유전자 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 각 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머쌍 또는 프로브일 수 있으며, 상기 각 마커 유전자의 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 고안할 수 있다.
본 발명의 일 예에서 상기 심혈관계 질환 특이적 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 각 마커 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머일 수 있다.
본 발명의 일 예에서 상기 신부전 환자는 급성 신부전 환자, 만성 신부전 환자 또는 말기 신부전 환자일 수 있으며, 바람직하게는 말기 신부전 환자일 수 있다.
심혈관계 질환은 투석환자를 포함한 말기신장질환 환자에서 가장 흔한 사망 원인으로, 이들 환자에서 심혈관계 질환에 의한 사망률은 정상인에 비해 20-30배 정도 높은 것으로 보고되고 있다. 혈관내피세포의 기능이상은 동맥경화증, 고혈압, 심부전 등의 심혈관계 질환의 발생에 공통적으로 관여하는 중요한 조기 변화로 간주된다. 혈관내피세포는 혈관벽을 안쪽에서 둘러싸고 있는 장벽으로서의 기능뿐 아니라 혈관의 긴장도 조절, 혈관의 구조 유지, 혈관벽과 접촉하는 혈액 성분들과 상호작용하는 기능을 포함하는 생리적으로 중요한 역할을 담당하는 내분비 기관으로 알려져 왔다. 혈관내피세포의 기능이상은 동맥경화증 발생에서 가장 초기 단계에 관찰되는 과정으로, 비가역적 변화인 동맥경화증과는 달리 회복이 가능한 가역적인 변화이므로, 이 단계에서의 진단과 치료가 가능하다면 말기신장질환 환자의 심혈관계 질환의 예후 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 예에서 상기 심혈관계 질환은 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화증, 협심증, 및 심부전으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예는, 상기 조성물을 포함하는, 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 신부전 환자 특이적 마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 신부전 환자에서의 심혈관계 질환 예후를 예측할 수 있다.
본 발명이 제공하는 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 예측용 키트는 상기 조성물 외에도 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명에서 제공하는 키트는 RT-PCR을 수행하는 데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
일 예로, 본 발명에서 제공하는 키트는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 신부전 환자의 심혈관계 질환 예후 마커 유전자의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다.
일 예로, 본 발명에서 제공하는 키트는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩은 상기 마커 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해 면역학적 검출을 위해 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 시험 대상 시료에서 상기 신부전 환자 특이적 마커 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신부전증 환자에서 심혈관계 질환의 예후를 예측하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 시험 대상(subject)에서 배출 또는 얻은 생물학적 시료, 예를 들면 혈액, 혈장, 혈관내피세포 등에 대해 신부전 환자의 심혈관계 질환 특이적 마커 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하여 대상의 심혈관계 질환의 발병 예측 또는 진단하는 단계, 및 상기 심혈관계 질환을 갖는 것으로 예측 또는 진단된 대상에게 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관계 질환의 진단 및 치료방법에 관한 것이다. 상기 대상은 신부전증 환자일 수 있다. 상기 예측 또는 진단단계는, 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을, 정상 대조군과 시험 대상 시료에서 비교하여, 대상의 심혈관계 질환 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 약물은, 만성정맥폐색증, 원발성 고혈압 등에 쓰이는 약 Beraprost (Prostacyclin analog) 일 수 있으며, 바람직하게는 만성신부전 환자들에게서 쓰는 약 중에 endothelial dysfunction 에 효과가 있다고 알려진 약인 ACE inhibitor (captopril, ramipril 등), beta-blocker (nevivolol 등), statin 계열 (atorvastatin, pravastatin 등), PDE5 inhibitor (viagra 등)일 수 있다.
질병의 투약 단계는 만성신부전 (Chronic kidney disease)를 진단받은 1~5 단계 중 어느 단계에서도 가능하나. 보통 3단계 이후 (3, 4, 5단계)부터 약물치료를 하게 되기 때문에, 넓게는 CKD 1-5단계, 집중해서는 3~5단계로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 신부전증 환자의 심혈관계 질환의 예후를 예측하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법은,
정상 대조군과 시험 대상에서 분리된 시료로부터, MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자, PRDM14 유전자, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을, 정상 대조군과 시험 대상 시료에서 비교하는 단계를 포함하는 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 혈관 발달과 세포외 기질 성분과 관련된 유전자, 또는 혈관내피 세포 또는 세포 이동과 관련된 유전자이며, 상기 시험 대상 시료에서 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료에 비해 낮은 경우, 상기 시험 대상은 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정상 대조군에 비해 심혈관계 질환 대상에서 발현 수준이 감소하는 바이오마커는, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또는, 상기 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 유전자, 또는 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자이며, 상기 시험 대상 시료에서 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료에 비해 높은 경우, 상기 시험 대상은 신장 질환 관련 심혈관계 질환을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정상 대조군에 비해 심혈관계 질환 대상에서 발현 수준이 증가하는 바이오마커는, MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자 및 PRDM14 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법으로 알려진 것이면 제한 없이 선택하여 사용될 수 있으며, 예를 들어, 역전사효소중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 마이크로어레이 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법에 의해 수행될 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법으로 알려진 것이면 제한 없이 선택하여 사용될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정 분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명이 제공하는 신부전 환자 특이적 마커 유전자에 기초하여 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 분석하여 신장 질환 환자의 심혈관계 질환의 발병 예측 또는 조기 진단이 가능하며, 신부전 환자의 생존률을 향상시킬 수 있다.
도 1a는 정상인 유래 iPS 및 ESRD 환자 유래 iPS 현미경 사진이다.
도 1b는 정상인 유래 iPS 및 ESRD 환자 유래 iPS의 면역형광 염색 결과를 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 1c는 유도줄기세포 특이적 마커인 NANOG, SSEA-4 및 TRA-1-81의 형광 신호를 그래프로 나타낸 것이다.
도 1d는 정상인 유래 또는 ESRD 환자 유래의 iPS에 대한 AP 염색을 수행한 결과를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2a는 iPS로부터 혈관내피세포를 유도하는 실험 과정을 간략히 나타낸 것이다.
도 2b는 정상 또는 ESRD 환자 유래의 iPS-EC의 혈관내피세포 특이적 마커들에 대한 면역염색 수행 결과를 나타낸 사진이다.
도 2c는 iPS-EC 유도 후 FACS를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상인 유래 iPS-EC 및 ESRD 환자 유래 iPS-EC에 대한 혈관 형성 분석(tube formation assay) 결과를 나타낸 사진이다.
도 4a는 정상 유래 iPS 샘플 3종(N-1 내지 N-3) 및 ESRD 환자 유래 iPS-EC 3종(P-1 내지 P-3)에 대한 RNA 마이크로 어레이 결과 mRNA 양 차이(fold change)를 나타낸 히트맵이다.
도 4b는 정상인 유래 iPS-EC에서의 발현량을 x축으로, ESRD 환자 유래 iPS-EC에서의 발현량을 y축으로 두고 각 유전자의 발현량을 나타낸 산포도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 역분화줄기세포(iPS)의 제작
1-1. 단핵세포로부터 iPS의 제조
정상인 및 말기 신장질환(ESRD) 환자의 혈액은 기관 IRB를 승인받아 질환이 없는 정상인 기부자와 말기 신장 질환으로 진단받은 환자로부터 얻어 사용되었다. 혈액을 2,000rpm, 30분간 Ficoll PaqueTM PLUS (GE Healthcare)를 사용하여 원심 분리하여 단핵세포를 분리하였다.
분리된 정상인과 ESRD환자의 단핵세포는 StemSpan cc110이 보충된 StemSpanTM ACF (Stem Cell Technologies)에서 4 일 동안 배양되었다. 이후, 단핵구 세포를 24-well plate에 vitronectin으로 코팅후 (BD BioCoatTM) 및 Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen)를 통해 역분화줄기세포 (iPS)를 제조하였다. 배지는 iPS 콜로니가 형성 될 때까지 매일 바꾸었다. 수동 피킹 후, iPS 라인은 TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technologies)에서 vitronectin (Life Technologies, Invitrogen)으로 코팅 된 플레이트에서 유지되었다. 형질 도입 후 12 일에 신생 iPS 콜로니를 개별적으로 골라 특성화를 위해 확대시켰다. 형질 도입 후 3 일부터 21 일까지 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
1-2. iPS의 줄기세포 콜로니의 형성 특성 확인
상기 실시예 1-1에서 얻어진 iPS를 현미경으로 50배 확대하여 세포 모양을 관찰한 결과를 도 1a에 나타냈다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 말기 신장질환 환자(ESRD) 유래 iPS 및 정상 혈액으로부터 얻은 iPS 모두에서 줄기세포 콜로니가 나타남을 확인할 수 있었다.
1-3. iPS의 iPS 마커 발현 확인
정상 iPS 및 ESRD iPS에 대해서, 각각 iPS 마커로 알려져 있는 NANOG, SSEA-4 및 TRA-1-81에 대해 면역 형광 염색은 구체적으로, iPS를 플라스틱 커버 슬라이드 챔버에서 성장시키고 4 %(w/v) 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 면역형광염색을 위해 다음 항체를 사용하였다: NANOG (1E6C4, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology), 단계 특이성 배아 항원 SSEA-4 (813-70, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology) TRA-1-81 (TRA- 80, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology). 염색된 슬라이드를 200 배 및 400 배 배율로 Zeiss 현미경 (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 시각화하는 방법으로 수행하였다.
또한, 도 1d의 결과는 배양 5 일 후, 제조자의 지시에 따라 정상 iPS 및 ESRD iPS에 대해서 Alkaline Phosphatase Detection Kit (Merck-Millipore)를 사용하여 Alkaline Phosphatase 효소 활성에 대해 분석하여 수행하였다.
정상 iPS 및 ESRD iPS에 대해서, 각각 iPS 마커로 알려져 있는 NANOG, SSEA-4 및 TRA-1-81에 대해 면역 형광 염색을 수행한 결과를 도 1b 및 1c 에 나타내었다. 정상 iPS 및 ESRD iPS 모두에서 iPS 마커인 NANOG, SSEA-4, 및 TRA-1-81이 발현되는 것을 확인하였다 (도 1b, 1c).
1-4. iPS의 다세포 분화능 확인
정상 및 말기 신장질환 환자의 iPS가 다세포 분화능을 가지는 지 여부를 확인하기 위해 AP 염색(alkaline phosphatase staining)을 진행하였다. 구체적으로 정상 iPS 및 ESRD iPS에 대해서 Alkaline Phosphatase Detection Kit (Merck-Millipore)를 사용하여 Alkaline Phosphatase 효소 활성에 대해 분석하여 AP염색을 수행하였다.
상기 두 가지 iPS의 AP 염색 결과를 도 1d에 나타내었다. 정상 iPS와 ESRD iPS 모두에서 강하게 염색되어 다분화능을 가짐을 확인할 수 있다(도 1d).
실시예 2. iPS 유래 혈관내피세포 (Induced Pluripotent Stem Cells derived Endothelial Cells; iPS-ECs) 제작
2-1 iPS-EC의 제작
실시예 1-1에서 제작된 iPS로부터 혈관내피세포(EC)를 도 2a에 나타낸 방법으로 제작하였다. 구체적으로, 실시예 1-1에서 제작된 iPS에 VEGF-A 50ng/ml, BMP4 50ng/ml가 되도록 첨가하여, 배상체(Embryoid body, EB)를 생성하였고, 4일 후 VEGF-A 50ng/ml 첨가 배지에서 배상체를 증식시킨 후 hiPS-Endothelial cells (iPS-ECs)의 생성을 위해, VEGF-A의 존재하에 젤라틴 코팅 접시에 4 일째 배상체(Embryoid body, EB)를 부착하였다. 14일까지 젤라틴 코팅 접시에서 키운 후 혈관내피세포 특이적 마커인 CD31 항체가 붙은 microbead를 이용하여 혈관내피세포만을 분리후 확인하였다.
2-2 iPS-EC의 혈관내피세포 특이적 마커 발현 확인
실시예 2-1에서 제작된 iPS-EC의 특성을 확인하기 위해, 혈관내피세포 마커인 CD31, CD34, CD133, vWF, FIK, 및 Flt의 면역형광염색을 수행하여 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용해 관찰한 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b는 정상 또는 ESRD 환자 유래의 iPS-EC의 혈관내피세포 특이적 마커들에 대한 면역염색 수행 결과를 나타낸 사진이다.
구체적으로, 면역형광염색 및 공촛점 현미경 관찰은, 정상인과 ESRD iPS-EC를 플라스틱 커버 슬라이드 챔버에서 성장시키고 4 %(w/v) 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 면역형광염색을 위해 다음 항체를 사용하였다: CD31 (WM-59 (WM59), eBioscience); CD34 (4H11, eBioscience); CD133 (TMP4, eBioscience); vWF (sc-53466, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology); Flk (sc-6251, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology); Flt (sc-271789, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology). Alexa Fluor 488- 또는 647- 접합 streptavidin (Molecular Probes)을 제조자의 지시에 따라 사용 하였다. 염색된 슬라이드를 200 배 및 400 배 배율로 Zeiss 현미경 (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 시각화하는 방법으로 수행하였다.
2-3 iPS-EC의 혈관내피세포 분화능 분석
도 2c는 iPS-EC 유도 후 FACS를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. ESRD 샘플이, 정상 샘플에 비해 형광 신호가 크게 약해지는 현상이 나타나, ESRD 환자 유래의 iPS의 혈관내피세포 분화능이 감소하였음을 알 수 있다. 도 2c에 isotype control, 정상 iPS-EC, 및 ESRD iPS-EC의 FACS 분석 결과 그래프를 나타내었다. (P<0.01, ESRD iPS-EC (4.1±2.7) vs 정상 iPS-EC (33.6±7.3).
도 2c에 나타낸 바와 같이, 정상 iPS-EC에 비해 ESRD 환자 유래 iPS-EC에서 혈관 내피세포 특이적 마커인 CD31 양성 세포가 약 6배 감소하였다. 정상 iPS-EC에서는 혈관내피세포 특이적 마커인 CD31 양성 세포 평균값 비율이 33.6±7.3%로 나타났으나, ESRD 유래 iPS-EC의 CD31 양성세포 평균값 비율은 4.1±2.7%에 불과하여 정상 샘플에 비해 약 8배 가량 낮은 혈관내피세포 분화능을 보였다.
실시예 3. iPS-EC의 혈관 형성 능력 확인
정상인과 ESRD 환자 유래 iPS-EC에 대해 혈관 형성 분석(tube formation assay) 방법을 이용하여 혈관 생성 능력을 비교하였다. 구체적으로 혈관 형성 분석은 재구성된 기저막 매트릭스 인 Matrigel (354230, Becton Dickinson)으로 코팅 된 96-well plate에서 수행되었다. 대략 2 Х 104 iPS-EC를 200ul EGM-2MV + 20 % 인간 혈청 배지로 각 well에 seeding 하였다. 그런 다음 모세 혈관 형성 네트워크를 모니터링하고 4-6시간 후 촬영했다. 상기 혈관 형성 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 정상인 유래 iPS-EC 및 ESRD 환자 유래 iPS-EC에 대한 혈관 형성 분석(tube formation assay) 결과를 나타낸 사진이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, ESRD iPS-EC에서는 4시간 경과 후 정상 iPS-EC에 비해 혈관이 형성된 면적이 현저히 적음을 확인할 수 있다. 정상 iPS-EC에 비해 ESRD 환자 유래 iPS-EC에서 관 형성 면적(tube formation area)이 현저히 감소하였음을 알 수 있다. 이를 혈관 형성 면적(tube formation area, %)으로 나타낸 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2019013765-appb-T000003
ESRD 환자 유래의iPS-EC는 정상 iPS-EC에 비해 관 형성 면적이 80%가량 감소하였다. 이러한 결과는 말기 신장질환 환자의 단핵세포에서 유도된 유도줄기세포 유래의 혈관내피세포의 혈관 생성능이 정상인에 비해 저해되어 있음을 의미한다.
실시예 4. 말기 신장질환 특이적 마커 발굴
말기 신장질환 환자 특이적인 유전자 발현 양상 분석을 위해, RNA 마이크로어레이를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 2-1의 방법으로 제작되어 CD31 양성을 보이는 정상 iPS-EC 및 ESRD iPS-EC로부터 ReliaPrep RNA Miniprep system (Promega Corgoration) 를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 Affymetrix 전체 전사 발현 어레이 프로세스를 제조자의 프로토콜 (GeneChip WT Pico reagent Kit)에 따라 수행하였다. cDNA는 GeneChip WT Pico Amplification kit를 사용하여 제조사의 설명대로 합성하였다. 이후, 센스 cDNA를 단편화하고 GeneChip WT Terminal 라벨링 키트를 사용하여 TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)로 바이오틴을 표지하였다. 약 5.5 ug의 표지 된 DNA 표적을 45 ℃에서 16 시간 동안 Affymetrix GeneChip Human 2.0 ST 어레이에 하이브리드시켰다. Hybridized arrays된 어레이를 세척하고 GeneChip Fluidics Station 450에서 염색하고 GCS3000 스캐너 (Affymetrix)상에서 스캐닝 하였다.
RNA 마이크로어레이 결과는 신호값은 Affymetrix® GeneChip 쪠 Command Console 소프트웨어 프로그램을 이용하여 Gene Ontology (www.geneontology.org/) 및 KEGG (www.genome.jp/kegg/)를 사용하여 중요한 프로브 목록에 대한 Gene-Enrichment 및 Functional Annotation 조건으로 유전자 발현의 계층적 클러스터링을 수행하였다. 그 결과 히트맵을 도 4a에 나타내었다. 도 4a는 정상 유래 iPS 샘플 3종(N-1 내지 N-3) 및 ESRD 환자 유래 iPS-EC 3종(P-1 내지 P-3)에 대한 RNA 마이크로 어레이 결과 mRNA 양 차이(fold change)를 나타낸 히트맵이다.
도 4a를 통해 알 수 있는 바와 같이, 정상 iPS-EC와 ESRD iPS-EC의 유전자 발현 양상이 확연히 다르게 나타났다. 이러한 유전자 발현 양상을 분석하기 위해 x축을 정상 iPS-EC, y축을 ESRD iPS-EC의 유전자 발현 수준으로 하여 각 유전자를 점으로 표시한 산포도를 그린 결과를 도 4b에 나타내었다. 회색 점은 변화가 없는 그룹, 노란색 점은 발현량 차이(Fold change, FC) 1.5배 미만인 경우, 붉은색 점은 발현량 차이가 1.5배 이상인 유전자를 나타낸다.
하기 표 4에 ESRD iPS-EC에서 정상 iPS-EC에 비해 발현량이 1.5배 이상 증가한 유전자 148개 중 그 증가폭이 가장 큰 상위 10개 유전자를 표시하였다.
Figure PCTKR2019013765-appb-T000004
상기 표 4에 나타난 유전자들의 특징을 살펴본 결과, 염증(inflammation)이나 산화스트레스(oxidative stress) 관련 유전자 MT1H (metallothionein 1H) , MT1G(metallothionein 1G), NLRP7(NLR family, pyrin domain containing 7), NLRP2 (NLR family, pyrin domain containing 2), SOX2 (SRY box 2), IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), IFIT2 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), CXCL10(chemokine (C-X-C motif) ligand 10), IFI6(interferon, alpha-inducible protein 6), IFIH1(interferon induced, with helicase C domain 1), IFI44(interferon-induced protein 44), FOXI3 (forkhead box I3) 및 IFI44L (interferon-induced protein 44-like))와, 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자 (MIR302C, MIR302B, MIR302D 및 MIR302A)의 발현이 증가하는 특징을 보였다.
특히 혈관 발달과 세포막의 세포외 기질(ECM) 성분 관련 유전자인 COL12A1 및 VTN의 발현이 정상인에 비해 감소되는 것에 특징이 있다.
하기 표 5에는 ESRD iPS-EC에서 정상 iPS-EC보다 발현량의 감소 정도가 1.5배 이상(FC -1.5 이상) 감소한 유전자 78개 중 상위 10가지 유전자를 나타내었다.
Figure PCTKR2019013765-appb-T000005
정상인에 비해 말기 신장질환 환자의 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포에서 감소한 유전자들이 특징을 살펴본 결과, 혈관 발달과 세포막의 세포외기질(Extracellular matrix, ECM) 성분 관련 유전자(COL12A1 (collagen, type XII, alpha 1), PCDH10 (protocadherin 10), VTN (vitronectin), CALB2 (calbindin 2), ITGA11 (integrin alpha 11), EFEMP1 (EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), PCDHB14 (protocadherin beta 14), FBN1 (fibrillin 1), CDH5 (cadherin 5, type 2 (vascular endothelium), FBLN5 (fibulin 5) 및 FBN2 (fibrillin 2))과, 혈관 내피세포 및 세포 이동과 관련된 유전자(EDN1, ANGPT2 (angiopoietin 2), MXRA5 (matrix-remodelling associated 5), MME (membrane metallo-endopeptidase), CEMIP (Cell Migration Inducing Hyaluronan Binding Protein))의 발현이 감소된 특징을 나타냈다.
즉, 혈관 형성에 중요한 유전자들이 ESRD 환자 유래 iPS-EC에서 감소되어 있었으며, 염증이나 산화 스트레스 관련 유전자는 증가하여 신장의 기능 이상이 발생하는 것으로 판단된다.

Claims (20)

  1. MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자, PRDM14 유전자, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환의 탐지용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여, 시험 대상과정상 대조군의 시료에서 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하고, 정상 대조군과 시험 대상 시료에서 발현수준을 비교하여, 시험 대상의 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 결정하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 혈관 발달과 세포외 기질 성분과 관련된 유전자, 또는 혈관내피 세포 또는 세포 이동과 관련된 유전자이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 감소하는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이오마커는, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 유전자, 또는 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자이며, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군에 비해 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 환자에서 증가하는 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 바이오마커는 MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자 및 PRDM14 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화증, 협심증, 및 심부전으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 말기 신부전(End stage renal disease, ESRD)인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머쌍 또는 프로브인 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적인 항체 또는 압타머인 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신장 질환 관련 심혈관계 질환의 탐지용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR키트, 마이크로어레이칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 키트.
  13. 정상 대조군과 시험 대상에서 분리된 시료로부터, MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자, PRDM14 유전자, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 혈관내피세포의 기능이상을 검출하는 바이오마커의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을, 정상 대조군과 시험 대상 시료에서 비교하는 단계를 포함하는 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 혈관 발달과 세포외 기질 성분과 관련된 유전자, 또는 혈관내피 세포 또는 세포 이동과 관련된 유전자이며, 상기 시험 대상 시료에서 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료에 비해 낮은 경우, 상기 시험 대상은 신장 질환과 관련된 심혈관계 질환을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바이오마커는, CEMIP 유전자, COL12A1 유전자, LOC151760 유전자, TYRP1 유전자, TXNIP 유전자, IL18 유전자, PCDH10 유전자, GDF6 유전자, LINC00842 유전자, 및 FGF7 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 바이오마커는 혈관 내피세포의 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 유전자, 또는 혈관 내피세포의 이동이나 증식을 억제하는 유전자이며, 상기 시험 대상 시료에서 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료에 비해 높은 경우, 상기 시험 대상은 신장 질환 관련 심혈관계 질환을 갖는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이오마커는 MT1H 유전자, NLRP7 유전자, MIR302C 유전자, DPPA3 유전자, MT1G 유전자, ESRG 유전자, L1TD1 유전자, SLC7A3 유전자, ZNF729 유전자 및 PRDM14 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화증, 협심증, 및 심부전으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 신장 질환은 말기 신부전(End stage renal disease, ESRD)인, 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 시험대상이 심혈관계 질환을 갖는 환자로 진단된 경우 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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