JP2010502938A - 診断および治療のためのペプチドプローブ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年7月28日付で出願した米国特許仮出願第60/833,854号、および2006年10月2日付で出願した米国特許仮出願第60/848,358号に対し米国特許法第119条(e)項の下で優先権の恩典を主張し、これらの全内容はその全体が参照により本明細書において組み入れられる。
本発明は、疾患状態に関連するものなどの、誤って折り畳まれたタンパク質を含む、特定の構造型のタンパク質の検出の分野に関し、およびそれらの疾患状態の処置に関する。さらに詳しくは、本発明は、生物学的および臨床的試料などの、試料においてまたはインビボにおいて特定の構造型のタンパク質を検出するための方法、プローブおよびキットに関する。いくつかの態様において、タンパク質はアミロイド形成性疾患に関連する。本発明は同様に、そのようなタンパク質に関連する疾患を処置するための方法、作用物質およびキット、ならびにそのような疾患を処置するのに有用な他の作用物質を特定するための方法、作用物質およびキットに関する。
さまざまな疾患がタンパク質の特定の構造型(例えば、「誤って折り畳まれたタンパク質」または自己凝集したタンパク質)に関連している一方で、異なる構造型のタンパク質(例えば、「正常なタンパク質」)は有害ではない。多くの場合に、正常なタンパク質が可溶性であるのに対し、誤って折り畳まれたタンパク質は不溶性凝集体を形成する。そのような不溶性タンパク質の例としては、伝達性海綿状脳症(TSE)におけるプリオン; アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド血管症(CAA)および脳血管疾患(CVD)のアミロイドプラークにおけるAβペプチド; パーキンソン病のレヴィー小体におけるα-シヌクレイン沈着、前頭側頭認知症およびピック病における神経原線維濃縮体中のタウ; 筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ; ならびにハンチントン病におけるハンチンチンが挙げられる。例えば、Glenner et al., J. Neurol. Sci. 94:1-28, 1989; Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305-310, 1990を参照されたい。
プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系の海綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。プリオンは細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。潜在的なプリオン前駆体はPrP 27-30といわれるタンパク質であり、これは、感染脳内でプラークとして見出される棒状フィラメントに重合する(凝集する) 28キロダルトンの疎水性糖タンパク質である。正常なタンパク質相同体は、これが容易に分解可能であるという点でプリオンとは異なるのに対し、プリオンはプロテアーゼに強い抵抗性を示す。プリオンは、従来のアッセイ法によって検出不可能な、ごく微量の非常に感染性の高い核酸を含有しうることが示唆されている。例えば、Benjamin Lewin, 「Genes IV」, Oxford Univ. Press, New York, 1990, 1080頁を参照されたい。しかしながら、目下の有力な仮説は、プリオンタンパク質の感染性に核酸成分は必要ないというものである。
伝達性海綿状脳症または「TSE」は、CJDおよびクールーのようなヒト障害を含む致死性神経変性疾患である。TSEの動物型はヒツジにおけるスクレイピー、シカおよびエルクにおけるCWD、ならびにウシにおけるBSEを含む。これらの疾患は、宿主によりコードされるプロテアーゼ感受性の正常プリオンタンパク質(PrP-sen)のプロテイナーゼK抵抗性の異常アイソフォーム(PrP-res)の脳内での形成および蓄積によって特徴付けられる。PrP-resは、PrP-senをβ-シート含有量のより多いPrP-res分子凝集体に変換する立体構造変化を伴う翻訳後過程によりPrP-senから形成される。PrP-resのこれらの高分子凝集体の形成は、PrP-resのアミロイド沈着が脳内に形成され、最終的には「海綿状」となる(孔で満たされる)、TSEによって媒介される脳病態と密接に関連している。
AD、CAAおよびCVDにおいて、主なアミロイド成分はアミロイドβタンパク質(Aβ)である。Aβタンパク質は、推定上の二つのセクレターゼの作用によってアミロイドβ前駆体タンパク質(APP)から生成され、正常なCNSおよび血液の中に低レベルで存在する。APPはいくつかの部位で切断されうるので、天然に存在するAβタンパク質は、均一な生成物ではない。アミロイドプラーク中に見られる二つの豊富な型は、Aβ1-40(Aβ40ともいわれる)およびAβ1-42(Aβ42ともいわれる)であり、これらはAPPの選択的カルボキシ末端切断によって生成される。例えば、Selkoe et al., PNAS USA 85:7341-7345, 1988; Selkoe, Trends Neurosci. 16:403-409, 1993を参照されたい。Aβ40およびAβ42は同一のアミノ酸配列を有しているが、Aβ42はそのC末端にさらに2残基(IleおよびAla)を有している。Aβ40の方が豊富にあるが、Aβ42はより線維形成性であり、ADおよびCAAの両方のアミロイド沈着においてその二つのうち主要な成分である。例えば、Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-90 (2002)を参照されたい。
本発明は、特定の構造状態のタンパク質に関連する種々の疾患を診断および処置するために使用できる方法、プローブ、作用物質およびキットを提供する。この作用物質および方法は同様に、そのような疾患を処置または予防するのに有用な他の作用物質を特定するために使用することができる。
本発明は、疾患状態に関連するものなどの、誤って折り畳まれたタンパク質および自己凝集したタンパク質を含む、特定の構造状態のタンパク質の検出のためのプローブおよび方法、ならびにそれらの疾患状態の処置のためのプローブおよび方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、試料においてまたはインビボにおいて特定の構造型のタンパク質を検出するための方法、プローブおよびキットを提供する。いくつかの態様において、タンパク質はアミロイド形成性疾患に関連する。本発明は同様に、そのようなタンパク質に関連する疾患を処置するための方法、作用物質およびキット、ならびにそのような疾患を処置するのに有用な他の作用物質を特定するための方法、作用物質およびキットを提供する。
本明細書において用いられる場合、「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」という単数形は、単数形だけを指すよう明示的に記述されていない限り、単数形も複数形もともに指す。
-Cys、Ser、Tyr、Thr;
-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;
-Lys、Arg、His;
-Phe、Tyr、Trp、His; および
-Asp、Glu。
タンパク質の配列が特定の三次元立体構造の形成を指令する正確な機構は不明である。天然の立体構造状態を達成するには、タンパク質分子は多くの選択肢から固有の立体構造をとらなければならない。機能的タンパク質は、典型的には可溶性であり、コイルおよび秩序ある要素を含む種々の構造をとりうる。秩序ある要素にはミオグロビンおよびヘモグロビンなどの、タンパク質において主要なα-ヘリックスが含まれる。
本発明の一つの局面は、試料においてまたはインビボにおいて標的タンパク質の特定の構造状態を検出するのに有用な、すなわち、標的の構造状態のタンパク質を検出するのに有用なペプチドプローブに関する。典型的には、ペプチドプローブは、α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、ペプチドプローブそれ自体がα-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす。例えば、ペプチドプローブは、β-ヘリックスの立体構造にある標的タンパク質と接触された場合に立体構造の転換を起こしうる。以下にさらに詳しく論じるように、いくつかの態様において、ペプチドプローブは同様に、治療剤を特定するのにおよび治療剤それ自体として有用である。
一つの態様において、プローブは、標的タンパク質と、または標的タンパク質の一部と相同または同一であるアミノ酸配列を含む。「相同性」、「の相同体」、「相同の」、「同一性」または「類似性」とは二つのポリペプチド間の配列類似性をいい、同一性がいっそう厳密な比較である。相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的で整列されうる各配列中の位置を比較することにより判定することができる。比較される配列中の位置が同じアミノ酸によって占有されている場合には、その位置で分子は同一である。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置の同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置の、アミノ酸の、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。「関連のない」または「非相同の」配列は、本明細書において記述する配列の一つと10%またはそれ以下の同一性を共有する。関連する配列は少なくとも約15%の配列同一性、少なくとも約20%の配列同一性、少なくとも約30%の配列同一性、少なくとも約40%の配列同一性、少なくとも約50%の配列同一性、少なくとも約60%の配列同一性、少なくとも約70%の配列同一性、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約90%の配列同一性、少なくとも約95%の配列同一性または少なくとも約99%の配列同一性のような、10%を超える配列同一性を共有する。
本明細書において開示するプローブは、またはインビボにおいて特定の構造状態、例えば、標的の構造状態で試料に存在するタンパク質を検出するために使用することができる。一つの態様において、プローブは、標的タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部に基づく(例えば、その一部と相同または同一の)アミノ酸配列を含む。そのようなプローブは同様に、標的タンパク質のアミノ酸配列の一部に「対応する」といわれる。したがって、プローブのアミノ酸配列は、配列データベース中の既存の情報に基づき標的タンパク質からデザインされてもよく、あるいは、実験的に容易に決定されてもよい。プローブは標的タンパク質の任意の領域に基づく配列を含んでもよいが、一つの態様において、配列は、標的の構造状態に関与する標的タンパク質の一部に基づく。例えば、一つの態様において、プローブは、α-ヘリックス/ランダムコイル立体構造からβ-シート立体構造への転換のような、構造の転換を起こす標的タンパク質のアミノ酸配列の一部と類似の(例えば、相同の)、または同一のアミノ酸配列を含む。
(ここで、AAAV (SEQ ID NO:30)は疎水性アミノ酸配列である)を含む場合には、このパリンドロームは
である第一のペプチド配列および
である第二のペプチド配列(またはその配列に近い異形)を含んでよく、この二つの配列は、約1から約5アミノ酸を、これらのアミノ酸の少なくとも一つが、および好ましくは、これらのアミノ酸の全てではないにせよ大部分が、プロリンアミノ酸であるように含んだリンカーにより隔てられてもよい。したがって、この標的タンパク質に適したプローブは、以下であることができると考えられる。
(仮想的なパリンドロームプローブ)。
ペプチドプローブは化学的にまたは組換えDNA法を用いることにより合成することができる。
開示する方法において有用なα-ヘリックスまたはランダムコイルプローブ(すなわち、溶液中でα-ヘリックスまたはランダムコイル立体構造を示すプローブ)は、以下を含むことができる。
PrPScタンパク質のアミノ酸番号122-104および109-122 (SEQ ID NO:13および14) (SwissProt P04156; Pfam ID Prion Pf00377および03991)と同一であるアミノ酸配列を含むパリンドロームの33-mer:
(マウス);
(ヒト)。いくつかの態様において、C末端リジンをパリンドロームの33-merに付加して34-mer (例えば、
を形成させることができる。C末端リジンは適当な標識(例えば、ピレン)へのプローブの連結で用いるのに適当でありうる。
任意で、プローブはさらなるN末端リジン(K)を含んでもよく
、C末端リジン(K)を含んでもよく
、またはその両方を含んでもよい。
(b) 不安定化され、かつ非感染性である; および
(c) 野生型(wt) TSE (ヒトNref00130350)のアミノ酸配列番号104-122 (SEQ ID NO:10)と相同であるアミノ酸配列を有する、
アミノ酸配列を含むプローブ。
(b) 不安定化され、かつ非感染性である; および
(c) 野生型(wt) TSE (ヒトNref00130350)のアミノ酸配列番号104-122 (SEQ ID NO:10)と等価であるアミノ酸配列を有する、
アミノ酸配列を含むプローブ。
(b) 不安定化され、かつ非感染性である; および
(c) 野生型(wt) TSE (ヒトNref00130350)のアミノ酸配列番号104-122 (SEQ ID NO:10)と約70%〜約90%同一であるアミノ酸配列を有する、
アミノ酸配列を含むプローブ。
ヒト糖尿病に関与するヒト膵島アミロイドポリペプチド前駆体(アミリン)タンパク質(アクセッション番号NP_000406; ヒト)のアミノ酸番号1-38と同一であるアミノ酸配列を含むプローブ:
本明細書において開示するプローブは標識を含むことができる。例えば、プローブは、標識に、共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングまたは融合されているペプチドプローブを含むことができる。一つの態様において、ペプチドプローブは、プローブそれ自体の検出およびプローブの構造状態の検出を含むペプチドプローブの分析を促進しうる部分または化学的実体により(ペプチドの一端または両端で)末端キャッピングされる。
グリーン(Sodium Green); スペクトラムアクア(SpectrumAqua); スペクトラムグリーン(SpectrumGreen); スペクトラムオレンジ(SpectrumOrange); スペクトラムレッド(Spectrum Red); SPQ (6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)キノリニウム); スチルベン(Stilbene); スルホローダミン(Sulphorhodamine) B can C; スルホローダミン(Sulphorhodamine) G エキストラ; SYTO 11 ; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61 ; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOXブルー(Blue); SYTOXグリーン(Green); SYTOXオレンジ(Orange); TET(商標); テトラシクリン(Tetracycline); テトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine) (TRITC); テキサスレッド(Texas Red) (商標); テキサスレッド-X (Texas Red-X) (商標)結合体; チアジカルボシアニン(Thiadicarbocyanine) (DiSC3); チアジンレッド(Thiazine Red) R; チアゾールオレンジ(Thiazole Orange); チオフラビン(Thioflavin) 5; チオフラビンS; チオフラビンTCN; チオライト(Thiolyte); チオゾールオレンジ(Thiozole Orange); チノポール(Tinopol) CBS (カルコフロールホワイト(Calcofluor White)); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; トリコロール(TriColor) (PE-Cy5); TRITC テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TetramethylRodaminelsoThioCyanate); トゥルーブルー(True Blue); トゥルーレッド(TruRed); ウルトラライト(Ultralite); ウラニン(Uranine) B; ウビテックス(Uvitex) SFC; VIC(登録商標); wt GFP; WW 781 ; X-ローダミン; XRITC; キシレンオレンジ(Xylene Orange); Y66F; Y66H; Y66W; イエロー(Yellow) GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3; およびそれらの塩。フルオロフォアは蛍光タンパク質を含むことができる。
いくつかの態様において、ペプチドプローブは固体支持体に固定化される。これは、固体支持体へのプローブの固定化を可能とするのに十分な量の時間にわたって固体支持体にプローブを曝露する段階を含む方法のような、当技術分野において公知の方法により達成することができる。この方法はさらに、未結合のプローブを除去する段階、プローブを固体支持体に(例えば、化学的におよび/またはUV照射への曝露により)架橋する段階、ならびに固体支持体およびプローブを乾燥する段階を含むことができる。ペプチドを固体支持体に固定化する方法は、当技術分野において公知である。一つの態様において、全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第2006-0057671号に記述されているように、プローブは特定の立体構造(例えば、主にα-ヘリックス/ランダム(radon)コイルまたは主にβ-シート)などの、特定の構造状態で固定化される。
上記のように、本発明の一つの局面では、試料においてまたはインビボにおいてタンパク質を検出するための、および特定の構造状態(例えば、標的の構造状態)のタンパク質を検出するためのプローブを提供する。例えば、ペプチドプローブがα-ヘリックスもしくはランダムコイル立体構造(または溶解状態)である場合には蛍光を発し、ペプチドプローブがβ-ヘリックス立体構造(または不溶性の凝集状態)にある場合には蛍光を発しないように、ペプチドプローブを標識することができる。同様に、ペプチドプローブがα-ヘリックスもしくはランダムコイル立体構造(または溶解状態)である場合にはエキシマーを形成しないが、しかしペプチドプローブがβ-ヘリックス立体構造(または不溶性の凝集状態)にある場合にはエキシマーを形成するように、ペプチドプローブを標識することができる。例示的な標識としてはフルオロフォアまたは蛍光タンパク質、例えばピレン、トリプトファン、フルオレセイン、ローダミン、GFP、および本明細書において記述のその他多くのものが挙げられる。
一つの態様において、標識は、エキシマーとして公知の種を生成するような方式で相互作用する能力を有する。エキシマーとは、必ずしも共有結合性ではない、かつ光子によって励起された分子的実体と励起されていない同一の分子的実体との間で形成される付加物である。この付加物は天然では一過性であり、光子の放出によって蛍光を発するまで存在する。エキシマーは、特定波長の光での励起によって、異なる波長で光を放出する二つのフルオロフォアの相互作用を示し、これはどちらかのフルオロフォアが単独で作用することによって放出されるものとは光度も異なる。通常の発光スペクトルの波長よりも長い波長の新たな蛍光バンドの生成によって、エキシマー(またはエキシマーの形成)を認識することが可能である。エキシマーは、励起スペクトルがモノマーのそれと同一であるので、蛍光共鳴エネルギー転移と区別することができる。
「円偏光二色性」(「CD」)は、CD分光偏光計により測定した場合、光学的に活性な物質がLおよびR円偏光をわずかに異なるように吸収する際に観察される。差異は非常に小さく、楕円率の程度の分数に相当する。ペプチドおよびタンパク質に存在する、異なる型の二次構造に対するCDスペクトルは異なる。複合体化タンパク質 対 非複合体化タンパク質のCD曲線の測定および比較は、本明細書において開示する方法のための正確な測定手段になる。
一つの態様において、プローブまたは試験タンパク質の特定の構造状態を測定するために、GFP融合タンパク質系が用いられる。試験タンパク質の溶解度を測定するために、試験タンパク質および緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む融合タンパク質が記述されている。例えば、Waldo et al., Nat. Biotech. 17:691-695 (1999); 米国特許第6,448,087号, Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-1290 (2002); Kim et al., J. Biol. Chem. 280:35059-35076 (2005)を参照されたく、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。GFPのその天然の蛍光構造への折り畳みはゆっくり起こると考えられるので(Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995))、GFP融合タンパク質の蛍光は試験タンパク質の溶解度に依存しうる。試験タンパク質が不溶性である場合には、融合タンパク質のGFP部分は試験タンパク質とともに溶液の中から引き出され、それにより、その蛍光構造に折り畳むことを妨げられうる。
生体分子構造は同様に、「表面プラズモン共鳴」または「SPR」を評価することによって試験することができる。SPRの現象は、光学的に透明な材料(例えば、ガラス)と不透明な材料との間の界面から特定の角度で反射された光の強度の低下として観察され、他の要因のなかでも特に、不透明な材料の表面に近い媒体(例えば、試料溶液)の屈折率に依存する(国際公開公報第90/05295号参照)。不透明な材料への材料の吸着または結合によるような、不透明な材料の表面での屈折率の変化は、SPRが起こる角度において、対応するシフトを生じるであろう。SPRに基づくタンパク質結合アッセイ法において、ペプチドプローブを、不透明な支持体の表面に固定化されている標的タンパク質と接触させることができる。その後の標的タンパク質とのペプチドプローブの相互作用を、不透明な支持体および透明な材料の表面の界面間のSPRをモニターすることによって評価することができる。
開示する方法のいくつかの態様において、ペプチドプローブは、特定の構造状態で存在する標的タンパク質を含む、試料にまたはインビボに存在する標的タンパク質を検出するよう未知試料もしくは試験試料への添加のためにまたはインビボでの使用のために選択される。検出方法は、米国特許第7,166,471号; 米国特許出願第10/728,246号; PCT出願PCT/US2006/005095および/または米国特許出願第11/030,300号に記載の一般方針に沿って行うことができ、これらの全内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において開示するプローブは、標的タンパク質の自己凝集を調節する作用物質を特定するためのスクリーニング方法において使用することができる。
疾患状態に関連する特定の構造状態を阻害することが知られるまたは考えられる任意の作用物質をスクリーニング方法で用いて、凝集を調節するその能力、すなわち治療用作用物質としてのその資格を評価することができる。例えば、標的タンパク質のβシート立体構造の形成を阻害することが、標的タンパク質のオリゴマーもしくは不溶性の無定形自己凝集体の形成を阻害することが、または原線維の形成を阻害することが知られるまたは考えられる作用物質を本発明の方法によりスクリーニングして、治療用作用物質を特定することができる。前述のようにデザインしたペプチドプローブ(標識の有無にかかわらず)は同様に、治療用作用物質としてのその可能性の高い有用性を評価するための試験作用物質として適している。
抗アミロイド剤は、キレート剤(例えば、銅および鉄などの、遷移金属に対するキレート剤、例えば三座鉄キレート剤)、ジケトン(例えば、β-ジケトン)、2-ピリドキサルイソニコチニルヒドラゾン類似体、タキピリジン(tachypyridine)、クリオキノール、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤キレート剤、2,3-ジヒドロキシ安息香酸、ピコリンアルデヒド、ニコチンアルデヒド、2-アミノピリジン、3-アミノピリジン、局所2-フリルジオキシム、n-酪酸、フェニルブチレート、トリブチリン、スベロイラニリドハイドロザミック酸、6-シクロヘキシル-1-ヒドロキシ-4-メチル-2(1H)-ピリジノン、リロピロックス、ピロクトン、安息香酸系のキレート剤、サリチル酸、ニコチンアミド、クリオキノール(Clioquniol)、ヘパリン硫酸、トリメチルアミンN-オキシド(TMNO)、ポリエチレングリコール(PEG)、銅カチオン(例えば、Cu++)、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびデクスラゾキサンを含む。
上記のように、本発明のペプチドプローブは、ADのようなアミロイド形成性疾患の予防および処置において、ならびにアミロイド形成性疾患の進行した段階の予防において抗アミロイド剤として有用である。前述のように、所与の標的タンパク質に対するペプチドプローブは、そのタンパク質に特異的に結合し、標的タンパク質の特定の構造型に選択的に結合することができる。
本発明のペプチドプローブは同様に、他の活性作用物質(上記の作用物質のような)をAβタンパク質のような、標的タンパク質に、またはAβ42、Aβ42モノマー、Aβ42 ADDL、Aβ42の不溶性凝集体、原線維などのような、特定型のAβに送達するための標的化薬として有用である。本発明のこの態様において、ペプチドプローブを一つまたは複数の活性作用物質と、当技術分野において公知の方法により、例えば直接的にまたはリンカーを通じて結合することにより組み合わせる。活性作用物質は、当技術分野において公知のものおよび上記のもののいずれかのような、治療用活性作用物質であってよく、またはこれは当技術分野において公知のものおよびペプチドプローブ標識に関して上記のもののいずれかのような、検出作用物質であってもよい。いくつかの態様において、ペプチドプローブは、血管組織、リンパ組織、脳、または腎臓、肝臓、心臓もしくは肺などの他の臓器の一つまたは複数のような、患者での特定部位に存在する標的タンパク質の位置に局在化し、それによって治療用作用物質をそのような特定部位に送達する。
本明細書において開示する方法のいずれにおいても、アッセイ法の有効性を確認するために対照(陽性、陰性またはその両方)を立てることができる。陽性対照は一般に、少なくとも一つの標的タンパク質(典型的には特定の、公知のタイプの)を含むことが分かっている試料により本方法を行うことを含み、本方法がそのタンパク質を検出できること、および/またはその特定のタンパク質に特異的であることを確認するために用いることができる。一般に、陽性対照は、公知の標的タンパク質が、典型的には既知量で意図的に(手順の任意の段階で)添加されている試料を含む。陰性対照は一般に、いかなる標的タンパク質も含まないことが分かっている試料により本方法を行うことを含み、本方法がシステム上の偽陽性結果を与えないことを確認するために用いることができる。その他の対照を本方法における一つまたは複数の特定の段階に立てて、その段階が予想通りに機能していることを検証することができる。当業者は適当な対照を十分に承知しており、過度の実験なしにそれらをデザインし、実行に移すことができる。
「試験標本」とは、試験しようとする材料の試料のことであり、「試料」と意味の点で等価であり、それ故に互換的に用いられる。試料は、組織(例えば、挽肉の一部分、生検処置によって得られたある量の組織、血液または血液画分、例えば血漿など)から、ガラス製ホモジナイザー中でのホモジナイゼーションによって調製してもよく、得られたものを直接用いてもよい。試料の量は、試料が用いられる用途に適した任意の量でありうる。例えば、血液または血液画分を用いる場合には、それは約1 μl、約100 μ1、約1 ml、約10 ml、約100 ml、約1リットル(もしくは1パイント)またはそれ以上でありうる。いくつかの用途においては、1リットル(または1パイント)を上回る量を含む、大量の血液または血液製剤を試料として用いることができる。固形組織が試料の供給源である場合、試料は約1 mg〜1 gmの間、好ましくは10 mg〜250 mgの間、理想的には20 mg〜100 mgの間であるべきである。
本明細書において開示する方法を実践するために、キットを調製することができる。典型的には、キットは少なくとも一つの構成要素または開示の方法を実践するための構成要素を包装した組み合わせを含む。「包装した組み合わせ」とは、キットが、プローブ、緩衝液、使用説明書などのような、一つまたは複数の構成要素の組み合わせを含有する単一の包装を提供することを意味する。単一の容器を含有するキットは「包装した組み合わせ」の定義のなかに含まれる。いくつかの態様において、キットは少なくとも一つのプローブを含む。例えば、キットは、フルオロフォアで標識されているプローブまたは融合タンパク質の一員であるプローブを含むことができる。キットにおいて、プローブは固定化されていてもよく、特定の立体構造で固定化されていてもよい。例えば、固定化プローブは標的タンパク質を特異的に結合するように、試料中の標的タンパク質を検出するようにおよび/または試料から標的タンパク質を除去するように供与されてもよい。
以下は、例示的な態様の羅列である。
(a) (i) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(ii) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(iii) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブ; および
(b) 緑色蛍光タンパク質(GFP)。
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、融合タンパク質および試験作用物質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルを、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力と相関させる段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、標的タンパク質、融合タンパク質、および試験作用物質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルを、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力と相関させる段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、凝集を促進する条件に融合タンパク質を供する段階;
(B) 標識によって生じた第一のシグナルを検出する段階;
(C) 試験作用物質の存在下で、凝集を促進する条件に融合タンパク質を供し、かつ標識によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(D) 第一および第二のシグナルの相対強度を評価し、それによって標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質を特定する段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、融合タンパク質および標的タンパク質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じた第一のシグナルを検出する段階;
(C) 融合タンパク質、標的タンパク質および試験作用物質を接触させ、かつ標識によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(D) 第一および第二のシグナルの相対強度を評価し、それによって標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質を特定する段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。
(b) ペプチドプローブと特定の構造型で存在する任意の標的タンパク質との間の任意の結合を検出する段階
を含む、特定の構造型で試料に存在する標的タンパク質を特定するための方法。
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
参照ペプチドプローブと、
(ii) 緑色蛍光タンパク質と
を含む参照融合タンパク質によって生じた第一のシグナルを、検出する段階:
(B) 試験ペプチドプローブが、参照ペプチドプローブのアミノ酸配列と比べてアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む参照ペプチドプローブの変異体である、試験ペプチドプローブおよび緑色蛍光タンパク質を含む試験融合タンパク質によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(C) 第一のシグナルと比べて第二のシグナルの強度を関連付け、それにより参照ペプチドプローブと比べて凝集体を形成する傾向の増大または低下を示す標的タンパク質に対するペプチドプローブを特定する段階
を含む、参照ペプチドプローブと比べて凝集体を形成する傾向の増大または低下を示す標的タンパク質に対するペプチドプローブを特定する方法。
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 緑色蛍光タンパク質と
を含む、自己凝集を促進する条件に融合タンパク質を供する段階;
(B) 融合タンパク質によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルの強度を、特定の構造状態の標的タンパク質に対するペプチドプローブの特異性と相関させ、それにより特定の構造状態の標的タンパク質に特異的なペプチドプローブを特定する段階
を含む、低級の可溶性モノマーから高級の不溶性自己凝集体に及ぶ構造状態の範囲に入る特定の構造状態の標的タンパク質に特異的なペプチドプローブを特定する方法。
(ii) 治療用作用物質と
を含む融合タンパク質と、標的タンパク質を接触させる段階
を含む、標的タンパク質に関連する疾患を処置するための方法。
(a) (i) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(ii) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(iii) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブ; および
(b) 薬学的賦形剤。
以下の例は、例証であり、本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
ヒトプリオンタンパク質またはAβ42に対するペプチドプローブをコードするdsDNAオリゴヌクレオチドを合成する。このdsDNAオリゴヌクレオチドは、GFP発現ベクターにdsDNAオリゴヌクレオチドをクローニングするために5'および3'末端に制限部位を含む(Waldo et al., Nature Biotechnol. 17:691-695 (1999)を参照のこと)。dsDNAオリゴヌクレオチドおよびGFP発現ベクターを、対応する制限酵素で消化し、dsDNAオリゴヌクレオチドをGFP発現ベクターの中に連結して、GFP-融合タンパク質発現ベクターを作出する。この発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、これをカナマイシン選択下で増殖させる。特定の変種GFP-ペプチドプローブの一つでは、I41DおよびA42Qの置換を有する完全長の変異体Aβ42(すなわち「DQ変異体」)であって、緩徐な凝集を起こすことが認められる該変異体を含む、GFP-融合タンパク質発現ベクターを作出する。
形質転換した大腸菌株からDNAライブラリーを単離し、IPTG誘導性のタンパク質発現に適した別の菌株に形質転換する。形質転換した細菌をニトロセルロース紙の上に置く。37℃で終夜増殖の後、ニトロセルロース紙を、選択用のカナマイシンおよび発現誘導用のIPTG (1 mM)を含んだLBプレートに移す。コロニーをカウントし、緑色の表現型は可溶性の融合タンパク質(例えば、非凝集ペプチドプローブ)に対応し、白色の表現型は不溶性の融合タンパク質(例えば、凝集ペプチドプローブ)に対応するとして、緑色 対 白色の表現型に留意する。
コロニーをピックし、カナマイシンを含有するLB液体培地中で増殖させる。培養物が吸光度(A600nm) 0.8に達した後に、IPTGを濃度1 mMにまで加えることで発現を誘導し、増殖を37℃でまたは30℃で継続する。誘導後、培養物をTris-緩衝生理食塩水中でA600nm 0.15にまで希釈する。蛍光光度計を用い490 nmの励起および510 nmの発光により蛍光を測定する。図4はアルツハイマープローブペプチド-GFP融合体(Alz)およびプリオンプローブペプチド-GFP融合体(Pri)のGFP蛍光測定の例示的な結果を示す。発現を誘導し、細胞を37℃で3時間(左グラフ)または30℃で5時間(右グラフ)インキュベートした後に、測定値を得る。細胞培養物200 μlを取り出し、SDS-PAGEにより全細胞含有物を分析することによって、GFP-融合タンパク質の発現も評価する。
上記のアッセイ法において白色の表現型をもたらす(例えば、凝集体を形成する)ことが分かっているGFP-ペプチドプローブ融合タンパク質を用いて、凝集を阻害する作用物質を特定する。GFP-ペプチドプローブ(プリオン)融合タンパク質を発現するためのベクターを、IPTG誘導性の発現のため細菌細胞に形質転換する。形質転換した細菌を、選択用にカナマイシンを補充したLB培地中で増殖させる。培養物がOD600 = 0.8に達した時点で、培養物の一定分量(100 μl)をマルチウェルプレートのウェルに移す。試験作用物質を各ウェルに加え、IPTGを終濃度1 mMまで加えることによってタンパク質の発現を誘導する。試料を37℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートする。3時間のインキュベーションの後、各ウェルの蛍光を自動プレートリーダーにより512 nm (励起490 nm)で測定する。細胞密度が全試料にわたって一致することを確認するため、OD600も測定する。試験作用物質を複数の濃度で試験する。緑色の表現型をもたらす試験作用物質を、凝集を阻害する作用物質と特定する。
高感染型のPrPScに特異的なペプチドプローブを次のように特定する。
PrPScに特異的なペプチドプローブ(SEQ ID NO:43)を次のように、ヒツジ血中のPrPScを検出するために用いる。ピレン標識ペプチドプローブを、スクレイピーのヒツジ、末期のヒツジおよび正常のヒツジから得た血清より調製した試料と接触させ、得られる蛍光を上記のように測定する。(血清に組織調製法を取り入れて、試料をGrosset et al., Peptides 26: 2193-200 (2005)に記述のように調製する)。図7は、ペプチドプローブが、感染ヒツジ由来の血清中PrPScと反応し、正常ヒツジ由来の血清と反応しなかったことを図示する。図中、「HP1」は3ヶ月齢の健常ヒツジのプール血清由来試料を指し; 「HP2」は2歳齢の健常ヒツジのプール血清由来試料を指し; 「ln1」から「ln4」は18〜24ヶ月齢のスクレイピーのヒツジ由来血清を指し、および「ln5」は末期のヒツジ由来の血清を指す。これらのデータから、ペプチドプローブがこのアッセイ法において100%の感度および特異性を示し、ヒツジ血中のPrPScを的確に検出したことが実証される。
PrPScに特異的なペプチドプローブ(SEQ ID NO:43)を次のように、ヒツジ血液成分中のPrPScを検出するために用いる。ピレン標識ペプチドプローブを感染(スクレイピー)および正常(健常)ヒツジ由来の白血球層、血清、および血漿試料と接触させ、得られる蛍光を上記のように測定する。図9は、ペプチドプローブが白血球層 > 血清 > 血漿の順でヒツジ血液成分と相対反応性を示すことを図示する。
Aβペプチドプローブを次のように特定する。Aβに特異的なペプチドプローブ(SEQ ID NO:36)およびGFPを含む、融合タンパク質を構築する。(i) Aβ42 (SEQ ID NO:42)およびGFP、または(ii) Aβ42変異体クローンGM6 (SEQ ID NO:44)およびGFPを含む、参照融合タンパク質を構築する。タンパク質を発現させ、GFP蛍光を上記のように検出する。図10に示すように、Aβ42-GFP融合タンパク質は、Aβ42部分の素早い凝集によって蛍光に必要なGFP部分の適切な折り畳みが阻止されるので、ほとんど蛍光を示さない。対照的に、変異体-GFP融合タンパク質は、GM6がAβ42の緩徐な折り畳み変異体であるので、高レベルの蛍光を示す。すなわちGM6部分は、蛍光に必要なGFP部分の折り畳みを等しく妨げることがない。ペプチドプローブ-GFP融合タンパク質は中レベルの蛍光を示し、ペプチドプローブ部分がGFPの折り畳みを中レベルで妨げることが示唆される。これらのデータから、Aβペプチドプローブ(SEQ ID NO:36)が、Aβペプチドの凝集に影響を及ぼす作用物質を特定する方法において有用であることが示唆される。
Aβに特異的なペプチドプローブ(SEQ ID NO:36)を、Aβ40およびAβ42の特定の構造型を検出するために用いる。ペプチドプローブをピレンにより各末端の位置で標識する。このペプチドプローブを、Aβ42オリゴマー、Aβ40オリゴマーおよびAβ40モノマーを含んだ異なる試料と接触させる。
Aβに特異的なペプチドプローブ(SEQ ID NO:36)を、アルツハイマーの患者から得たおよび年齢を適合させた健常患者から得たヒト脳脊髄液(CSF)試料中のAβ40およびAβ42を検出するために用いる。ペプチドプローブをピレンにより各末端の位置で標識する。CSF試料40 μLを、2 μMのペプチドプローブとともにインキュベートし、350 nmでの励起および360〜600 nmの蛍光の走査の前に、1時間インキュベートさせる。データをモノマー領域(370〜385 nm)に対するエキシマー領域(430〜530 nm)の比として図12に示す。ペプチドプローブはアルツハイマーの患者(黒)を、年齢を適合させた健常患者(白)から層別化することができる。図12に示す結果はp値 = 0.0005を有する。図12Aは各患者に対するデータを示し、その一方で図12Bは各患者群に対する平均データを示す。抗体に基づく市販のキット(Biosource ELISA, Invitrogen)を用いAβタンパク質について患者試料を同様にアッセイしたが、そのアッセイ法ではAβタンパク質が検出されず、ペプチドプローブは感受性が高いことを示唆している。
以下は、ペプチドプローブがインビトロでもインビボでもともにAβプラーク(例えば、アルツハイマー病に関連するAβタンパク質の不溶性自己凝集体)を標的化する能力を例証する。Aβに特異的なかつピレンにより各末端の位置で標識したペプチドプローブ(SEQ ID NO:36)を用いる。
Claims (24)
- (a) 特定の自己凝集状態の標的タンパク質に選択的に結合する、標的タンパク質に対するペプチドプローブと、試料を接触させる段階; および
(b) ペプチドプローブと特定の自己凝集状態で存在する任意の標的タンパク質との間の任意の結合を検出し、それによって特定の自己凝集状態で存在する任意の標的タンパク質を特定する段階
を含む、特定の自己凝集状態で試料に存在する標的タンパク質を特定するための方法。 - ペプチドプローブが、モノマー、可溶性オリゴマーおよび不溶性自己凝集体からなる群より選択される特定の自己凝集状態の標的タンパク質に、選択的に結合する、請求項1記載の方法。
- ペプチドプローブが、不溶性の無定形自己凝集体、原線維前駆体(protofibril)および原線維からなる群より選択される標的タンパク質の不溶性自己凝集体に、選択的に結合する、請求項2記載の方法。
- 標的タンパク質が、膵島アミロイドポリペプチド前駆体タンパク質、アミロイドβタンパク質またはAβペプチド、血清アミロイドA、インスリン、アミリン、非アミロイドβ成分、プリオン、ヘモグロビン、免疫グロブリンまたはその断片、β2-ミクログロブリン、α-シヌクレイン、ロドプシン、α1-アンチキモトリプシン、シスタリン(cystallin)、タウ、p53、プレセニリン、低密度リポタンパク質受容体、アポリポタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、神経フィラメントタンパク質、トランスサイレチン、プロカルシトニンまたはカルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、ゲルゾリン、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ハンチントン病タンパク質、フィブリノゲンα鎖、フェニルアラニン水酸化酵素、コラーゲン、β-ヘキソサミニダーゼ、ならびにシスタチンCタンパク質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ペプチドプローブが検出可能な標識をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ペプチドプローブが、SEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:45より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- ペプチドプローブが固体支持体に固定化される、請求項1記載の方法。
- (a) 特定の自己凝集状態の標的タンパク質に選択的に結合し、かつ検出可能な標識で標識されている、標的タンパク質に対するペプチドプローブを、患者に投与する段階; および
(b) 患者に存在する標的タンパク質の位置に局在化された標識ペプチドプローブについて被験者を走査し、それによって特定の自己凝集状態で、患者に存在する標的タンパク質を特定する段階
を含む、特定の自己凝集状態で、患者に存在する標的タンパク質を特定するためのインビボの方法。 - ペプチドプローブが、モノマー、可溶性オリゴマーおよび不溶性自己凝集体からなる群より選択される特定の自己凝集状態の標的タンパク質に、選択的に結合する、請求項8記載の方法。
- 標的タンパク質が、膵島アミロイドポリペプチド前駆体タンパク質、アミロイドβタンパク質またはAβペプチド、血清アミロイドA、インスリン、アミリン、非アミロイドβ成分、プリオン、ヘモグロビン、免疫グロブリンまたはその断片、β2-ミクログロブリン、α-シヌクレイン、ロドプシン、α1-アンチキモトリプシン、シスタリン、タウ、p53、プレセニリン、低密度リポタンパク質受容体、アポリポタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、神経フィラメントタンパク質、トランスサイレチン、プロカルシトニンまたはカルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、ゲルゾリン、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ハンチントン病タンパク質、フィブリノゲンα鎖、フェニルアラニン水酸化酵素、コラーゲン、β-ヘキソサミニダーゼ、ならびにシスタチンCタンパク質からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
- 特定の自己凝集状態の標的タンパク質に選択的に結合する、標的タンパク質に対するペプチドプローブと、標的タンパク質を接触させ、それによって標的タンパク質の高次タンパク質凝集体の形成を阻止する段階を含む、標的タンパク質のタンパク質凝集体の形成を阻止するための方法。
- ペプチドプローブが、モノマー、可溶性オリゴマーおよび不溶性自己凝集体からなる群より選択される特定の自己凝集状態の標的タンパク質に、選択的に結合する、請求項11記載の方法。
- 標的タンパク質が、膵島アミロイドポリペプチド前駆体タンパク質、アミロイドβタンパク質またはAβペプチド、血清アミロイドA、インスリン、アミリン、非アミロイドβ成分、プリオン、ヘモグロビン、免疫グロブリンまたはその断片、β2-ミクログロブリン、α-シヌクレイン、ロドプシン、α1-アンチキモトリプシン、シスタリン、タウ、p53、プレセニリン、低密度リポタンパク質受容体、アポリポタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、神経フィラメントタンパク質、トランスサイレチン、プロカルシトニンまたはカルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、ゲルゾリン、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ハンチントン病タンパク質、フィブリノゲンα鎖、フェニルアラニン水酸化酵素、コラーゲン、β-ヘキソサミニダーゼ、ならびにシスタチンCタンパク質からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ標的タンパク質の完全長の配列を含まない、標的タンパク質に対するペプチドプローブと、治療用作用物質を組み合わせる段階、および
ペプチドプローブ-治療用作用物質の組み合わせをその必要性がある患者に投与する段階
を含む、治療用作用物質を標的タンパク質に送達する方法。 - 治療用作用物質が抗アミロイド活性を有する、請求項14記載の方法。
- ペプチドプローブが、特定の自己凝集状態の標的タンパク質に選択的に結合する、請求項14記載の方法。
- ペプチドプローブが、モノマー、可溶性オリゴマーおよび不溶性自己凝集体からなる群より選択される特定の自己凝集状態の標的タンパク質に選択的に結合する、請求項16記載の方法。
- (A) 融合タンパク質が、
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、融合タンパク質および試験作用物質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルを、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力と相関させる段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。 - (A) 融合タンパク質が、
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、標的タンパク質、融合タンパク質、および試験作用物質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルを、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力と相関させる段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。 - (A) 融合タンパク質が、
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、凝集を促進する条件に融合タンパク質を供する段階;
(B) 標識によって生じた第一のシグナルを検出する段階;
(C) 試験作用物質の存在下で、凝集を促進する条件に融合タンパク質を供し、かつ標識によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(D) 第一および第二のシグナルの相対強度を評価し、それによって標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質を特定する段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。 - (A) 融合タンパク質が、
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 融合タンパク質の凝集状態に依存してシグナルを生ずる標識と
を含む、融合タンパク質および標的タンパク質を接触させる段階;
(B) 標識によって生じた第一のシグナルを検出する段階;
(C) 融合タンパク質、標的タンパク質および試験作用物質を接触させ、かつ標識によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(D) 第一および第二のシグナルの相対強度を評価し、それによって標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質を特定する段階
を含む、標的タンパク質の凝集を阻害する作用物質の能力を評価する方法。 - (A) (i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
参照ペプチドプローブと、
(ii) 緑色蛍光タンパク質と
を含む参照融合タンパク質によって生じた第一のシグナルを、検出する段階:
(B) 試験ペプチドプローブが、参照ペプチドプローブのアミノ酸配列と比べてアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む参照ペプチドプローブの変異体である、試験ペプチドプローブおよび緑色蛍光タンパク質を含む試験融合タンパク質によって生じた第二のシグナルを検出する段階; ならびに
(C) 第一のシグナルと比べて第二のシグナルの強度を関連付け、それにより参照ペプチドプローブと比べて凝集体を形成する傾向の増大または低下を示す標的タンパク質に対するペプチドプローブを特定する段階
を含む、参照ペプチドプローブと比べて凝集体を形成する傾向の増大または低下を示す標的タンパク質に対するペプチドプローブを特定する方法。 - (A) 融合タンパク質が、
(i) (a) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こす標的タンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を含み、
(b) α-ヘリックス立体構造からβ-ヘリックス立体構造への立体構造の転換を起こし、かつ
(c) 標的タンパク質の完全長の配列を含まない、
標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 緑色蛍光タンパク質と
を含む、自己凝集を促進する条件に融合タンパク質を供する段階;
(B) 融合タンパク質によって生じたシグナルを検出する段階; ならびに
(C) シグナルの強度を、特定の構造状態の標的タンパク質に対するペプチドプローブの特異性と相関させ、それにより特定の構造状態の標的タンパク質に特異的なペプチドプローブを特定する段階
を含む、低級の可溶性モノマーから高級の不溶性自己凝集体に及ぶ構造状態の範囲に入る特定の構造状態の標的タンパク質に特異的なペプチドプローブを特定する方法。 - (i) 標的タンパク質に選択的に結合する、標的タンパク質に対するペプチドプローブと、
(ii) 治療用作用物質と
を含む融合タンパク質と、標的タンパク質を接触させる段階
を含む、標的タンパク質に関連する疾患を処置するための方法。
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