JP2000500439A

JP2000500439A - プリオンタンパク質（ＰｒＰ）複合体の形成とその使用

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Publication number: JP2000500439A
Application number: JP9517540A
Authority: JP
Inventors: スタンレービー．プルシナー; キヨトシカネコ; フレッドイー．コヘン
Original assignee: ザレジェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 2000-01-18
Also published as: AU715659B2; AU7601296A; EP1007964A1; WO1997016728A1; BR9611428A; US5750361A; EP1007964A4

Abstract

(57)【要約】水溶液中において、少なくとも一つのα−ヘリックスドメインを有し、ランダムコイル構造を形成するプリオンタンパク質（PrP）ペプチドは、細胞由来のPrP（PrP^c）に結合し、スクレーピー型異性体（PrP^Sc）の特徴を持つ複合体を形成する。PrP^Scのアッセイ法と共に、PrPペプチドのPrP^cへの結合を阻害または減少させることのできる化合物を検索する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】プリオンタンパク質（PrP）複合体の形成とその使用政府の権利合衆国政府は、国立保健研究所により授与された、AG10770、AG08967、NS0721 9、NS14069、NS22786およびAG021732の各番号の補助金により、本出願に一定の権利を有する場合がある。発明の分野本発明は、天然および合成のプリオンタンパク質ペプチドを用いて薬剤を検査するためのアッセイに関する。発明の背景プリオンは、ヒトおよび動物に中枢神経系の海綿状脳炎を引き起こす、感染性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。現時点における主要な仮説は、プリオンタンパク質が感染するためには核酸成分を必要としない、というものである。更に、１種類の動物種（たとえばヒト）に感染するプリオンは、その他の動物種（例えばマウス）には感染しない。プリオンタンパク質（"PrP"）と名付けられたタンパク質の発見および精製が、プリオンおよびそれらが引き起こす疾患に関する研究における重要な第一歩となった（Boltonら（1982）Science 218:1309〜11； Prusinerら（1982）Bioche mistry 21:6942〜50； McKinleyら（1983）Cell 35:57〜62）。その後、全長のプリオンタンパク質をコードする遺伝子のクローニング、塩基配列の決定、およびトランスジェニック動物での発現が行われた。PrP^cは、単一コピーの宿主遺伝子にコードされており（Baslerら（1986）Cell 46:417〜28）、通常はニューロン外表部に見出される。プリオン病では、PrP^cがPrP^Scと呼ばれる異性体に変換される。しかし、PrP^cの実際の生物学的または生理学的機能は不明である。プリオンタンパク質のスクレーピー型異性体（PrP^Sc）は、動物およびヒトの伝染性神経変性疾患の伝播にもまた病因としても、必要である。（Prusiner（19 91 ）Science 252:1515〜1522参照。）動物における最も一般的なプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレーピーならびにウシのウシ海綿状脳炎（BSE）である（W ilesmithおよびWells（1991）Microbiol．Immunol．172:21〜38）。ヒトについては、これまでに４つのプリオン病が同定された：(1)クールー、(2)クロイツフェルト−ヤコブ病（CJD）、(3)ゲルシュトマン−シュトロイスラー−シャインカー病（GSS）、および(4)致死性家族性不眠症（FFI）（Gajdusek（1977）Science 197:943〜960；Medoriら（1992）N．Engl．J．Med．326:444〜449）である。ヒトのプリオン病は、散発性、遺伝性および伝染性の疾患として提示されたため、当初は難問であったが、その後、PrPの起源は細胞の遺伝子にあるという説明がなされている。 CJDの多くの症例は散発性であるが、約10〜15％は、ヒトPrP遺伝子中に起きた突然変異による、常染色体性優性の遺伝性疾患である（Hsiaoら（1990）Neurolo gy 40:1820〜1827；Goldfarbら（1992）Science 258:806〜808；Kitamotoら（19 94）Proc．R．Soc．Lond．(印刷中)）。医原性CJDは、硬膜移植と同様に、死体の脳下垂体から得たヒト成長ホルモンによっても引き起こされてきた（Brownら（1992）Lancet 340:24〜27）。CJDと、スクレーピーに感染したヒツジの肉を摂取したというような感染源とを結びつけようとする試みは、数多くなされてきたが、医原性に病気を起こした場合を除いては、現在に至るまで同定されていない（Harries-Jonesら（1988）J．Neurol．Neurosurg．Psychiatry 51:1113〜1119 ）。一方、ニューギニア高地のフォア族および近隣の種族を何十年にもわたって荒廃させたクールーは、宗教的な食人による感染で伝播したと信じられている（ Alpers（1979）神経系の遅発性伝染性疾患（Slow Transmissible Diseases of t he Nervous System）Vol.1、Prusiner，S.B.およびHadlow，W.J.編(New York: A cademic Press)、pp.66〜90）。 CJDを初めて実験用霊長類に伝播するまでには、William Hadlowがクールーとスクレーピーとの類似性を見出したことをはじめとする数々の歴史がある。1959 年に、Hadlowは、クールーで死んだ患者から得た抽出物をヒト以外の霊長類へ接種し、長い潜伏期間の後に、その動物に予想された疾患が起こるのを見いだせることを示唆した（Hadlow（1959）Lancet 2:289〜291）。その７年後、Gajdusek 、G ibbsおよびAlpersらは、クールーが18〜21ケ月にわたる潜伏期間の後に、チンパンジーに感染させられることを示した（Gajdusekら（1966）Nature 209:794〜79 6）。神経病理学的にクールーとCJDが類似していること（Klatzoら（1959）Lab ．Invest．8:799〜847）から、チンパンジーで同様の実験を行い、疾患を伝播できることが、1968年に報告された（Gibbsら（1968）Science 161:388〜389）。その後の25年間で、CJD、クールー、およびGSS約300例が、様々な類人猿およびサルに伝播されてきた。こうした実験は費用がかかり、滅多に行うことができず、またしばしば非人道的とされることから、この研究には制限があり、このため知識の蓄積に限りがあった。最も信頼できる感染のデータは、ヒト以外の霊長類を用いた研究から得られるといわれてきたが、ヒトプリオン病のうちで、明らかに常時とはいえないものの、齧歯類に感染させられるものがでてきた（Gibbsら（1979）神経系の遅発性伝染性疾患（Slow Transmissible Diseases of the Nervous System）Vol.2、 Prusiner，S.B.およびHadlow，W.J.編(New York: Academic Press)、pp.87〜110 ；Tateishiら（1992）ヒトおよび動物のプリオン病（Prion Diseases of Humans and Animals）Prusinerら編(London: Ellis Horwood)、pp.129〜134）。ヒトプリオン病が齧歯類に頻繁には伝染しないことは、Pattisonがスクレーピー病原体をヒツジと齧歯類との間で伝達させようとした研究の中で、初めて記載された「種の障壁」の一例として、引用されてきた（Pattison（1965）ＮＩＮＤＢモノグラフ(NINDB Monograph)2、Gajdusek,D.C.、Gibbs Jr.,C.J.およびAlper s,M.P.編(Washington，D.C.: U.S．Government Printing pp.249〜257)。これらの研究の中で、プリオンが一つの動物種から他の動物種へ初めて伝達する場合、潜伏期間は長くなり、発病する動物の数は少なかったが、その後同じ動物種で感染させていくと、潜伏期間は著しく短縮され、全ての動物が発病するという特徴があった。シリアンハムスター（SHa）とマウスとの間にある種の障壁の分子的基礎は、トランスジェニック（Tg）マウスを用いて、PrP遺伝子の配列にあることが示された（Scottら（1989）Cell 59:847〜857）。SHaPrPは、254アミノ酸残基のうち 16箇所で、MoPrPと異なっている（Baslerら（1986）Cell 46:417〜428；Lochtら（19 86）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6372〜6376）。SHaPrPを発現しているTg（ SHaPrP）マウスでは、SHaプリオンを接種すると潜伏期間が短縮された。同様の実験をヒトまたはヒツジのPrPトランスジーンを発現しているマウスを用いて行った場合には、種の障壁はなくならなかった。すなわち、信じ難いほど、感染した動物の比率は低く、潜伏期間は長かった。このため、たとえばヒトプリオンの場合において、トランスジェニック動物（たとえば他の種のPrP遺伝子を含んでいるマウス）を用いて、ある試料がプリオンで汚染されているかどうかを、信頼性をもって検査することは、これまで不可能であった。こうした検査がないために発生する健康上の危険の重大性について、以下に例示する。ヒト脳下垂体由来のHGHで以前に治療を受けた45名以上の青年が、CJDを発症した（Kochら（1985）N．Engl．J．Med．313:731〜733；Brownら（1992）Lancet 3 40:24〜27；Fradkinら（1991）JAMA 265:880〜884；Buchananら（1991）Br．Med ．J．302:824〜828）。幸いにも、現在は組み換えHGHが用いられているが、高濃度のHGHによる刺激によって野生型PrP^Cの発現が増加することが、プリオン病を引き起こすのではないかという、一見非常に低い可能性が提起されてきた（Lasm ezasら（1993）Biochem．Biophys．Res．Commun．196:1163〜1169）。脳下垂体から得たHGHにプリオンが混入していることは、疑わしいロットのHGHを接種したサルに、66ケ月後にプリオン病が伝達されたことで支持された（Gibbsら（1993 ）N．Engl．J．Med．328:358〜359）。プリオン病の潜伏期間は長いため、HGHによる治療を受けた世界中の何千もの人々のうち、どれだけの範囲に医原性CJDが伝播されたのかが完全に明らかになるには、何十年もかかることだろう。医原性 CJDはまた、汚染したヒト下垂体由来ゴナドトロピンホルモンによる治療を受けた４名の不妊症の女性にも発症し（Healyら（1993）Br．J．Med．307:517〜518 ；Cochiusら（1993）Aust．N.Z．J．Med．20:592〜593；Cochiusら(1992)J．Neu rol．Neurosurg．Psychiatry 55:1094〜1095）、硬膜移植を受けた少なくとも11 名の患者で発症した（Nisbetら（1989）J．Am．Med．Assoc．261:1118；Thadani ら（1988）J．Neurosurg．69:766〜769；Willisonら（1991）J．Neurosurg．Psy chiatric 54:940；Brownら（1992）Lancet 340:24〜27）。最近、フランスの医師２名が、死体から抽出した成長ホルモンで治療した子供の過失致死罪で告訴された。この子供は、クロイツフェルト・ヤコブ病を発症した（New Scientist、July 31、1993、p.4 参照。）。パスツール研究所によれば、1983年から1985年中頃にかけてヒト成長ホルモンによる治療を受けた若年患者のうちで、1989年以来24名のCJDが報告されているという。これらのうち15名が死亡した。現在フランスにおいては、死体から抽出した成長ホルモンで治療された数百名の子供達が、CJDを発症する危険を負っていると考えられている（New S cientist、November 20、1993、p.10 参照。）これらの症例は、CJDのようなPrP^Scが介在する疾患に対する治療法を、早急に開発することが必要なことを、強調するものである。PrP^Cが改変を受けてスクレーピー型異性体PrP^Scに転換されるという考えは、多くの証拠により支持されているが、これが起こる条件はわかっていない。新たにスクレーピー型の感染性がおきる条件を知ることは、PrP^Scの産生を阻害できる化合物を同定するアッセイ法の開発に、有用であろう。インビトロでのPrP^CからPrP^Scへの転換を阻害できる化合物は、発症の危険のある動物およびヒト個体でのプリオン介在性疾患の治療および予防に有用であろう。プリオン、PrP遺伝子などの同定が進歩したにも関わらず、プリオンが引き起こす疾患の治療に用いる化合物をアッセイするために有用なアッセイ法はない。プリオンによって引き起こされる疾患の重大性を考えると、本発明が提供するようなアッセイ法は必須である。発明の概要本発明は、たとえばPrP^Sc様複合体のような、PrP^Sc異性体の特徴を示すプリオンタンパク質複合体の形成によって、PrP^Cに構造変化を起こす、天然および合成のプリオンタンパク質ペプチド（PrPペプチド）を用いたアッセイ法を提供する。本アッセイ法は、インビトロでPrP^CのPrP^Sc様複合体への誘導を阻止できる化合物の検索に有用である。本発明の方法によって同定された化合物は、PrP^Sc介在性疾患の治療法を開発するための候補となるものであり、たとえばPrP^Sc介在性疾患が発症する危険性の高い個体において、PrP^Sc介在性疾患の発症を阻害または遅延させることができる化合物である。従って、本発明は、PrP^CまたはPrP変異体に結合し、βシート含量の増加、水溶性の減少、および／または、PrP^Scと比べてタンパク質分解酵素に抵抗性であるというPrP^Sc様の特徴を、１つまたはそれ以上有するプリオンタンパク質複合体を形成することのできる、PrPペプチドに関する。本発明のPrPペプチドは、水溶液中で、少なくとも１つのα−ヘリックスドメインを有する、および／またはランダムコイル構造を形成する特徴をもつ。本発明によるPrPペプチドは、天然、組み換え体、および合成のペプチドを含む。好ましくは、これらのペプチドが天然PrPタンパク質のアミノ酸配列（図１）の、第90-145番目の残基のアミノ酸配列（配列番号：１）、および天然PrP^Cタンパク質の第90-231番目の残基のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むランダムコイルペプチドを含んでいる。天然型アミノ酸配列の第90-145番目のアミノ酸部分は、２つのα−ヘリックスドメインを含んでいる。第90-231番目のアミノ酸配列は、４つのα−ヘリックスドメインを含んでいる。本発明は、第90-145番目（配列番号：１）または第90-231番目（配列番号：２）のアミノ酸をわずかに改変し、その結果PrP^Cへの結合が促進される、および／またはPrP^Sc様複合体の誘導が促進されるようになったPrPペプチドを含む。好ましい態様として、第117番目のアラニンがバリンで置換された第90-145番目のアミノ酸配列を持つ（PrPペプチド90-145(A117V)）PrPペプチドを挙げることができる。本発明は、さらに、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を欠失した結果、 PrP^Cに結合してプリオンタンパク質複合体を形成し、またはPrP^Cの構造変化を起こして、PrP^Sc様複合体を形成する能力を著しく変化させないような分子構造に改変されたペプチドを含む。 PrPペプチドがPrP^CまたはPrP変異体に結合することによって形成されるプリオンタンパク質複合体は、βシート含量が増加し、溶解性が減少し、および／またはPrP^Cと比較してタンパク質分解反応に対して抵抗性が増すという特徴を有する。このプリオンタンパク質複合体は、線維状の凝集物を形成し、100,000 x g、１時間の遠心で沈降し、タンパク質分解反応に抵抗性で、βシート含量が高い、 PrP^Sc様複合体である。このプリオンタンパク質複合体は、好ましくは、PrP^Cと比較して、βシート含量が20〜100％、さらに好ましくは、PrP^Cと比較して、β シート含量が約50〜100％増加している。不溶性のプリオンタンパク質複合体は、少なくとも約20％がプロテアーゼ抵抗性であり、好ましくは約45〜100％、さらに好ましくは約60〜100％がプロテアーゼ抵抗性である。本発明の一つの形態は、PrPペプチドがPrP^CまたはPrP変異体に結合するのを減少または阻害することができる化合物を検索する、アッセイ法に関する。検体化合物を、第２番目の構成要素であるPrPペプチドの存在下で、第１番目の構成要素であるPrP^CまたはPrP変異体と接触させ、検体化合物がプリオンタンパク質複合体形成を妨げる能力を決定する。第１番目の構成要素であるPrP^Cは、ヒト、マウス、ハムスター、ウシまたはヒツジを含む、対象となるいかなる動物種由来の、合成、天然、または組み換え体タンパク質であってもよい。PrP^Cは、好ましくはヒトプリオンタンパク質であり、より好ましくは組み換えヒトプリオンタンパク質である。第１番目の構成要素であるPrP^Cはまた、天然または組み換え体タンパク質の変異体をも含む。一つの態様において、この第１番目の構成要素は、ヒトPrP^Cの第90〜231番目のアミノ酸残基をもつ組み換えペプチド（配列番号：１０）である。関連した形態として、本発明は、第１番目の構成要素であるPrP^Cと、第２番目の構成要素であるPrPペプチドとの間のプリオンタンパク質複合体の誘導を、減少または阻害することができる化合物を検索する方法を提供する。検体化合物を、PrPペプチド存在下でPrP^Cと接触させ、プリオンタンパク質複合体の誘導を測定する。 PrPペプチドのPrP^Cへの結合を阻害または減少させる、および／またはプリオンタンパク質複合体の形成を阻害または減少させることのできる検体化合物は、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、ゲルシュトマン−シュトロイスラー−シャインカー病（GSS）、致死性家族性不眠症（FFI）、クールー、スクレーピー、ウシ海綿状脳症（BSE）等のPrP^Sc介在性疾患、およびその他のPrP^Scの形成に関連するあらゆる疾患の、インビボでの予防または治療に有用であろう。インビトロでプリオンタンパク質複合体の誘導を阻害または減少できるものとして、本発明の方法で同定された検体化合物の、PrP^Sc疾患の発症を阻害する能力を、PrP^Sc 疾患のインビボモデルにおいて測定することができる。別の形態は、本発明はPrP^Scのアッセイ法に関する。試料中のPrP^Scの存在は、プリオンタンパク質複合体からPrPペプチドが解離することにより決定される。１つの態様において、標識したPrPペプチドおよびPrP^Cの間でプリオンタンパク質複合体を形成させ、ここに検査対象となる試料を添加する。移行したペプチドの量は、不溶性のプリオンタンパク質複合体を遠心によって沈澱させた後、上清画分に存在する標識の量を測定することで決定される。別の態様において、第１番目の構成要素であるPrP^Cを、第２番目の構成要素である標識されたPrPペプチドとプリオンタンパク質複合体を形成させた後に、親和性標識して固定化する。検査対象となる試料を加えて、非結合相中に解離した標識ペプチドの量を測定する。別の形態として、本発明は、プリオンタンパク質複合体の形成を誘導する能力が向上したPrP^Cトランスジーンをデザインする方法に関する。改変したPrP^C分子を作成し、上述の方法でプリオンタンパク質複合体を形成する能力が測定される。本方法によって、PrP^Sc結合能が向上した改変型トランスジーンは、改良型プリオンバイオアッセイに用いるために同定することができる。このようなバイオアッセイは、たとえばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタプリオン等の、各々の動物種ごとに最適化することができる。本発明の重要な特徴は、本方法論によれば、PrP^C異性体からのPrP^Sc様複合体へのインビトロでの誘導を妨げる候補化合物を同定できることである。本発明の利点は、本方法論によって、このようにして同定された候補化合物を、既存のPrP^Sc疾患のインビボモデルで検査することができることである。別の利点は、PrP^Scの迅速で便利なアッセイ法が提供されたことである。本発明の、これら及び他の目的、有利性、および特徴は、当業者にとって、以下においてより完全に記述された本発明の方法、アッセイ法、およびペプチドの詳細を読むことで明らかになるだろう。図の簡単な説明図１は、シリアンハムスターPrP^C配列の第90-231番目のアミノ酸配列を（配列番号：２）、ヒトPrP^Cの第90-231番目の配列（配列番号：１０）との特異的な相違点と比較して示したものである。詳細な説明この方法及び対照が記載されるに先立って、本発明は、記載された特定の方法、アッセイ法、またはペプチドに限定されるものではないことが理解されねばならない。というのも、そのような方法、アッセイ法およびペプチドは、様々に改変される可能性があるためである。本発明の範囲は、添付した請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に用いられる用語は、特定の態様を記述することのみが目的であり、限定するものではないこともまた、理解されねばならない。特別に定義しない限り、本明細書で用いられているすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと、同一の意味を有する。本明細書中で記載されているものと類似または同等のいかなる方法及び材料も、本発明を実行または検査する際に用いることができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で引用したすべての出版物は、引用した出版物と関連のある方法及び／または材料を開示および記載するために、参照として本明細書に組み入れられる。定義「プリオン」という用語は、ヒト及び動物に疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている伝染性粒子を意味する。「プリオン」は、「タンパク質」および「感染」という語の短縮形であり、その粒子は大部分またはすべてはPrP遺伝子でコードされるPrP^Sc分子を含んでいる。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。既知のプリオンには、動物に感染して、ウシ海綿状脳症（BSE）または狂牛病およびネコのネコ海綿状脳症と同様に、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレーピーを起こすものが含まれる。ヒトに発症する４つのプリオン病としては、（１）クールー、（２）クロイツフェルト−ヤコブ病（CJD）、（３）ゲルシュトマン−シュトロイスラー−シャインカー病（GSS）、および（４）致死性家族性不眠症（FFI）が知られている。本明細書で用いているプリオンは、用いたいかなる動物においても、そして特にヒトおよび家畜の場合において、これらの全てまたはいずれかの疾患や他の疾患を起こす、全てのプリオンの形態を含んでいる。ヒトPrP遺伝子には多くの変異体が知られている。さらに、ヒト、ヒツジおよびウシのPrP遺伝子では、多型性が知られている。以下はこうした変異体の一覧である：本明細書において、「PrPペプチド」という用語は、天然に存在するまたは組み換え体のPrP^CまたはPrP変異体と接触すると、βシート形成の促進、不溶性の増大、および／またはPrP^Cに比較してプロテアーゼ抵抗性の増大、というような、たとえばPrP^Scのような特徴を持つことで同定できる、構造変化を誘導するあらゆるペプチドとして、広く定義される。１つの態様において、PrPペプチドは、天然プリオンタンパク質の配列の第90-145番目の残基（配列番号：１）の一部、またはその一部分の配列と、実質的に類似した（たとえば90％またはそれ以上の相同性）配列をもつ、天然、組み換え、または合成のアミノ酸配列で、PrP^Cに結合して、PrP^Scの特徴を１つまたはそれ以上持つようなプリオンタンパク質複合体を形成できるものを意味する。第２の態様において、PrPペプチドは、天然プリオンタンパク質配列の第90-231番目の残基（配列番号：１０）の一部、またはその一部分と実質的に類似した、天然、組み換え、または合成のアミノ酸配列で、PrP^Cと結合してPrP^Sc様複合体を形成できるものを意味する。PrPペプチドは、水溶液中で、少なくとも１つのα−ヘリックスドメインを持ち、および／またはランダムコイル構造を持つものとして特徴づけられる。さらに、PrPペプチドは、実質的に βシート構造をとりにくい水溶液中で、ある特定の構造を持つものとして特徴づけられてもよい。本発明のPrPペプチドの構造は、円偏光二色性（ＣＤ）を含む、当技術分野において既知の多くの方法によって、決定される。具体的な態様において、本発明のPrPペプチドは、1〜4個のα−ヘリックスドメインを持ち、PrP^Cに結合してプリオンタンパク質複合体を形成することを特徴とする。好ましい態様においては、PrPペプチドは、配列番号：１または配列番号：１０のアミノ酸配列を持つ。PrPペプチドは、少なくとも１つのα−ヘリックスドメインおよび／または水溶液中でのランダムコイル構造形成能をもち、Pr P^Cに結合してプリオンタンパク質複合体を形成するという特徴を有する限り、たとえば１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、１つまたはそれ以上のアミノ酸の削除、および／もしくは１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入のような、配列番号：１または配列番号：１０のアミノ酸配列の改変を含んでいてもよい。好ましくは、置換、削除、挿入などは、第90-145番目の間のアミノ酸配列で行われる。たとえば、PrPペプチド90-145（A117V）は、第117番目のアミノ酸残基の病原性突然変異（アラニンからバリン）を含み、これはGSS病の終脳型および失調型を引き起こす。「PrP^Sc様複合体」、「プリオンタンパク質複合体」または「PrP^C／PrPペプチド複合体」という用語は、互換性をもって、100,000 x g、1時間の遠心で不溶性の沈渣を形成すること、および／または、PrP^Scに典型的な、βシート含量が高いこと、および／またはタンパク質分解反応に抵抗性を示すことを特徴とする、 PrP^Sc異性体の特徴を示す、PrP^CとPrPペプチドとの間に形成された複合体を意味する用語として用いる。プリオンタンパク質複合体は、第１および第２の構成要素間で形成される。複合体の第１の構成要素であるPrP^Cは、天然、または組み換えPrP^Cタンパク質またはその変異体であってもよい。たとえば、ある特定の態様においては、第１の構成要素PrP^Cは天然PrP^Cである。他の具体的な態様においては、第１の構成要素PrP^Cは、第90-231番目のアミノ酸（配列番号：１０）をもつ、Ｎ末端を切断したPrP^Cタンパク質である。複合体の第２の構成要素は、組み換えまたは合成PrPペプチドである。PrP^Sc様複合体またはプリオンタンパク質複合体を形成するためには、ランダムコイルまたはα−ヘリックス構造をとる第２の構成要素が過剰量必要である。具体的な態様においては、第２の構成要素であるPrP ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および、配列番号：１０のうちから選ばれた１つのアミノ酸配列を持つ。本明細書中で用いられる「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを、一般的に意味する。その効果は、完全にまたは部分的にその疾患またはそれに由来する症状を防ぐという点で予防的であり、ならびに／または、疾患および／もしくは疾患に関連する副作用を部分的または完全に治癒させるという点で、治療的でもあり得る。さらに具体的には、「治療」とは、PrP関連疾患の患者に対して、治療上検出でき、有用な効果を提供するという意味を意図している。PrP^Sc の形成 PrP^Scの形成は、PrP^CがPrP^Scと複合体を形成し、PrP^Scの第２の分子へと変換される（Prusinerら（1990）Cell 63:673〜686）、翻訳後の過程である（Borsch eltら（1990）J．Cell Biol．110:743〜752）。PrP^ScとPrP^Cを区別できるような共有結合の変化を検出する試みは成功しなかったが（Stahlら（1993）Biochemis try 32:1991〜2002）、分光学的研究によって、PrP^Cは〜40％のα−ヘリックスを含み、βシートを欠いていることが示された（Panら（1993）Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 90:10962〜10966）。一方、PrP^Scはβシート含量が高く、このことは、スクレーピーの感染性と相関している（Prusinerら（1983）Cell 35:349〜3 58；Caugheyら（1991）Biochemistry 30:7672〜7680；Gassetら（1993）Proc．N atl．Acad．Sci．USA 90:1〜5；Safarら（1993）J．Biol．Chem．268:20276〜20 284）。シリアンハムスター（SHa）のPrPトランスジーンを発現しているマウスの研究から、PrP^CおよびPrP^Scは、生成されようとするPrP^Scの形成中に複合体を形成することが示唆されている（Prusinerら（1990）Cell 63:673〜686）。本発明の発明者らは、２つの異性体を精製した分画を等モル量混合したが、こうした複合体を形成し、PrP^Scの産生を示すことはできなかった（Raeberら（1992）J．Virol ．66:6155〜6163）。他の研究者らは、標識したPrP^Cに50倍過剰量のPrP^Scを混合することによって、PrP^ScとPrP^Cの間の相互作用を示した（Kociskoら（1994）Na ture 370:471〜474）。二次構造が推定される領域に対応し、構造上複数の状態を示す合成PrPペプチドが研究されてきた（Gassetら（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10940 〜10944；Nguyenら（1995）Biochemistry 34:4186〜4192）。キメラPrPを用いたトランスジェニックの研究から、PrP^CとPrP^Scは、コドン94および169で区切られる中央ドメイン内で相互作用をするらしいことが示唆された（Scottら（1992）P rotein Sci．1:986〜997；Scottら（1993）Cell 73:979〜988；Tellingら（1994 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9936〜9940）。本開示は、最初の２つのα− ヘリックスと推定される領域を含む２つのPrP異性体の多くの構造上の特徴とよく似たPrPペプチドをPrP^Cと混合すると、タンパク質分解反応に抵抗性を示し、1 00,000 x g、1時間の遠心によって沈降する複合体の形成を誘導する物理的証拠を、初めて示したものである。当研究室のこれまでの研究により、小さなPrPペプチドは互いに相互作用して構造変化を誘導すること（Nguyenら（1985）Biochemistry 34:4186〜4192）、およびPrP27-30のＮ末端に対応するSHa 90-145の56アミノ酸残基からなるペプチドが多様な構造をとることを示してきた（Zhangら（1995）J．Mol．Biol．250:514 〜526）。以下の実施例２では、PrP^Sc様複合体の形成における構造形態の役割を解明する実験について記載している。標識したSHaPrP^Cを、ランダムコイルまたはβシート構造のPrPペプチドSHa 90-145、SHa 109-122およびMo 90-145で処理し、それらがプロテアーゼ抵抗性の誘導に与える効果を検討した。PrP^CとSHa 90 -145との混合物は、線維状の凝集物を形成し、これはPrP^Scに典型的な高いβシート含量を示した。予想外に、ランダムコイルのSHa 90-145はプロテアーゼ抵抗性を誘導するが、βシート構造のSHa 90-145はこれを誘導しないことが明らかになった。Mo 90-145は、ランダムコイルであってもβシート構造であっても、SHa PrP^Cで処理した際にプロテアーゼ抵抗性を誘導しなかった。いくつかの実験において、大腸菌で発現させた組み換えSHa 90-231を、PrP^Cの代わりに用いた。PrP^CとSHa 90-145との間でPrP^Sc様複合体が形成されるのと同じ条件下でSHa 90-145およびSHa 90-231とを混合すると、プロテアーゼ抵抗性を示す不溶性の複合体が形成された。 PrPペプチドがPrP^Cと相互作用する領域を特定するため、組み換えSHa 90-231 ペプチドを含むより短いペプチドを検索した。H1（第109-122残基を含む）または第104-122残基からなるより長いペプチド（104H1）のいずれも、PrP^Cにプロテアーゼ抵抗性を誘導することはできなかった。緩衝液中で、H1は速やかに折り畳まれてβシートとなり、多量体を形成する（Gassetら（1992）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 89:10940〜10944）が、一方、104H1はランダムコイルの形をとる（N guyenら（1995）前記）。SHa 109-141およびSHa 90-145はともに、プロテアーゼ抵抗性を誘導した。終脳型および失調型の両方の型のゲルシュトマン−シュトロイスラー−シャインカー（GSS）病を引き起こす、病原性のA117V変異（Dohuraら（1989）Biochem．Biophys．Res．Commun．163:974〜979；Hsiaoら（1991）Neur ology 41:681〜684；Mastrianniら（1995）Neurology(in press)）をペプチド中で交換すると、放射標識されたPrP^Cの〜65％が、沈降する複合体を形成した。等量のプロテアーゼ抵抗性のPrP^Cを産生するために、野生型のペプチドと比較して、変異型SHa 90-145（A117V）ペプチドはわずか30〜40％しか必要としなかった。SHa 90-145の代わりにSHa 90-231を用いると、より強いプロテアーゼ抵抗性を示す不溶性の複合体が形成された。 2％（w/v）ザルコシルを加えると、プリオンタンパク質複合体は破壊され、Pr P^Cはプロテアーゼ活性に感受性になった。SHa 90-145（A117V）存在下では、約3 0％の[³⁵S-]-PrP^C/PrPペプチド複合体が、プロテアーゼ抵抗性を示した；一方、 SHa 90-145存在下では、わずかに10〜15％が抵抗性であった。 PrP^C/PrPペプチド複合体のプロテアーゼ抵抗性がPrP^Scのものと類似していた（Turkら（1988）Eur．J．Biochem．176:21〜30；Meyerら（1986）Proc．Natl． Acad．Sci．USA 83:2310〜2314；McKinleyら（1991）J．Virol．65:1440〜1449 ）ため、PrP^C/SHa 90-145複合体の物理学的特性を、SHa 90-145およびPrP^C/SHa 90-145複合体について、FTIRスペクトル分析、CD、および電子顕微鏡により、検討した（実施例３）。SHaPrP^Cを単独で処理すると、[³⁵S-]PrP^Cのうち10％以下しか沈降しなかったが、一方、SHa 90-145（A117V）を加えると、〜65％の放射標識が沈澱となった。沈降したPrP^C/SHa 90-145複合体は、沈澱となったPrP^Cと比較して、βシート含量が大きく増加していた。抗PrP単クローン抗体3F4および13A5は、SHa 90-145ペプチドによりカバーされる領域内のSHaPrP^Cに結合する。3F4は、第109-122番目の残基を認識し（Rogers ら（1991）J．Immunol．147:3568〜3574）、13A5は第138-141番目の残基を認識する（BarryおよびPrusiner（1986）J．Infect．Dis．154:518〜621）。これらの抗体がプロテアーゼ抵抗性の獲得を阻害できるかどうかについて検討した（実施例４）。どちらのmAbも、プロテアーゼ抵抗性のPrP^C/SHa 90-145複合体の形成を阻害することがわかった。 PrP^CがPrPペプチドの非存在下で自然発生的にプロテアーゼ抵抗性になるかどうかについて検討するために、実験を行った（実施例５）。SHa 90-145（A117V ）非存在下では、PrP^Cの約1％がプロテアーゼ抵抗性であることがわかったが、ペプチド存在下では、PrP^Cの約30％が抵抗性となった。PrP^Cと混合したPrP^Scが、PrP^Cをプロテアーゼ抵抗性にするかどうかについて検討するため、実験を行った。他の研究者たちは、3 M Gdn-HCl中で変性したPrP^ScをPrP^Cと混合すると、２分以内に変性前の状態に戻り、PrP^Cをタンパク質分解反応に抵抗性にすると報告している（Kociskoら（1994）Nature 370:417〜474）。Gdnおよび尿素の両方からプリオンの感染性を回復させようという試みは数多くなされたが失敗したため（Prusinerら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:2793〜2797）、PrP^Scに対する3 M Gdn-HClの効果について検討した（実施例６）。変性したPrP^ScをPrP^C と混合しても、プロテアーゼ抵抗性のPrP^Cは形成されなかった。 SHa 90-145（A117V）ペプチドと混合すると約30％のPrP^Cがプロテアーゼ抵抗性を示した（実施例５）のとは対照的に、変性していないPrP^Scと混合したPrP^C のうちで、48時間後にプロテアーゼ抵抗性を獲得するのは、10〜15％と考えられる（実施例６）。SHa 90-145で1時間処理すると、48時間の時点でプロテアーゼ抵抗性を示した[³⁵S-]PrP^Cの約35％が存在しており、24時間後までは、約75％の PrP^Cがプロテアーゼ抵抗性だった。50倍過剰量の末標識のPrP^Scと混合すると、2 分以内に、プロテアーゼ抵抗性の[³⁵S-]PrP^Cが産生されるという報告（Kociskoら（199 4）Nature 370:471〜474）を、実験で再現することはできなかった。 PrP^CとPrP^Scとの間の相互作用は、抗PrP mAb 3F4では阻害されるが、13A5では阻害されないことがわかった（実施例７）。２つのmAbのこの違いが、H1領域のＮ端にある3F4のエピトープ付近のPrPの残基が重要な役割を果たすことを示すものであるかどうかを調べるため、Ｎ端を切断して3F4エピトープを欠失したPrP^C （PrP^C-II）の結合を検討した。PrP^C-IIはPrP^Scに接触後にプロテアーゼ抵抗性を示さず、3F4エピトープの含まれるH1領域がPrP^C-PrP^Scの結合に特に重要であるという考えを支持した（Panら（1992）Protein Sci．1:1343〜1352；Haraguch iら（1989）Arch．Biochem．Biophys．274:1〜13）。 PrP^CへのPrP^Scの結合に対する動物種および界面活性剤の影響について検討した（実施例８）。Mo 90-145をSHaPrP^Cと混合すると、プロテアーゼ抵抗性のPrP^C は、比較的少量しか形成されず、ザルコシルを加えると、複合体はタンパク質分解反応に感受性となった。これに対して、[³⁵S-]PrP^C/SHaPrP^Sc複合体は、消化前に2％ザルコシルに48時間接触させても、タンパク質分解反応に抵抗性であった。これらの結果は、SHa 90-145をSHa PrP^Cと混合するとプロテアーゼ抵抗性のタンパク質が産生されるのに対し、Mo 90-145をSHaPrP^Cと混合しても抵抗性にはならないという結果に合致する。スクレーピープリオンの感染性を保持するような条件下でPrP^C/PrP^Sc複合体を破壊するために、NP-40、Tween-10、Zwittergent 3-12、およびデオキシコール酸ナトリウムのような界面活性剤を、単独またはリン脂質と組み合わせて用いて、界面活性剤−脂質−タンパク質複合体を形成させる試みがなされた（Gabizon ら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6617〜6621）。抗PrP 3F4 mAbおよび第109-122番目または第90-145番目の残基を含む合成ペプチドを用いて、これらの複合体を破壊することができるかどうかを検討した。mAbおよびペプチドを、1000:1のモル比で複合体に加えたが、PrP^Scから[³⁵S-]PrP^Cを解離させることはできなかった。CHO細胞由来の未標識のPrPを10倍量過剰に加えても、やはり、複合体から[³⁵S-]PrP^Cを解離させることはできなかった。これらの結果は、PrP^Cが最初の２つの推定上のα−ヘリックスを含むドメインを通じて相互作用し、しかも相互作用にはランダムコイル構造が必要であることの証拠を示している。アッセイプリオンタンパク質複合体の形成を阻害する化合物の検索一つの形態として、本発明は、PrPペプチドがPrP^Cに結合して得られるPrP^Sc様複合体の形成阻害剤を同定するのに有用な、新しいアッセイを提供する。本発明のインビトロのアッセイは、多くの方法で行うことが可能であるが、検査対象の化合物をPrP^Cと接触させ、PrPペプチドを検体化合物/PrP^Cの混合物に加え、プリオンタンパク質複合体の形成を検出することが、好ましい形態である。プリオンタンパク質複合体の検出は、例えば、20℃で100,000 x g、１時間の遠心で、少なくとも65％が沈降するような線維状凝集物を形成し、そのうち少なくとも20％がプロテアーゼ抵抗性でβシートを多量に含有する構造を示すような不溶性複合体の形成を含む、様々な方法により、達成することができる。沈降百分率、プロテアーゼ抵抗性、および構造は、以下に記述する各種の方法のような、当技術分野において既知の方法により、決定される。検体化合物存在下でのPrP^S ^c 様複合体の形成を、検体化合物非存在下での複合体形成（対照）と比較する。好ましくは、検体化合物は対照と比較して20％またはそれ以上、複合体形成を阻害する、より好ましくは、50％またはそれ以上、および最も好ましくは、75％またはそれ以上、複合体形成を阻害する。上述の如く、例えば大腸菌で発現させたPrPペプチドであるSHaまたはHu 90-23 1（図１）を、天然に形成されたPrP^Cの代わりに、または合成ペプチドの代わりに用いることができる。大腸菌で組み換え体PrPタンパク質を産生する利点としては、高レベルのPrPを産生できること；PrP遺伝子の部位特異的突然変異誘発により、PrPの配列や長さを変えられること；糖鎖結合のような多くの翻訳後修飾がないこと；およびPrPを夾雑物から容易に精製できること、が含まれる。本発明のアッセイ法により、複合体形成の阻害作用を持つことが同定された化合物は、PrP^C介在性疾患の動物モデルで検定することができ、インビボでのPrP^S ^c 産生の阻害能、またはPrP^Sc介在性疾患の治療効果を検討できる。そのような動物モデルは、同時係属中の米国特許出願第08/449,485号に記載されている。上記で規定したように、PrP^Sc介在性疾患の治療には、PrP^Sc介在性疾患に罹患した患者に対し、治療的に検出可能および有益な効果を得ることを含む。 PrP^CおよびPrP^Sc間の相互作用に対して抗PrP単クローン抗体3F4が競合するという報告から、プリオンの誘発を阻止できる化合物を検索するアッセイ法として、また別の戦略を提供することができる。一つの態様において、PrP^Cを、たとえばストレプトアビジンを結合した誘導体とし、たとえば96ウェルプレートのウェルの底面のような固相に固定する。候補となる化合物が3F4をPrP^Cから解離させる能力を検定する。結合を、たとえば未結合の抗体量を測定することにより、標準測定値との比較で定量する。本アッセイの変法としては、組み換え体を用いた様々なPrP^C様分子を用いることが含まれる。 PrP^Sc アッセイ系一つの形態において、本発明はPrP^Scのアッセイ法を特徴とする。PrP^ScはPrP^Cに強固に結合するため、プリオンタンパク質複合体から標識したPrPペプチドが解離することを利用して、PrP^Scの存在をアッセイすることができる。本発明のこの方法の１つの態様においては、PrP^CおよびHu 90-231の間に形成されたプリオンタンパク質複合体から、標識した組み換えPrP（Hu 90-231 ）（配列番号：１０）が解離することを利用して、PrP^Scの存在をアッセイしている。本発明のPrP^Scアッセイ法においては、PrPペプチドまたはPrP構成要素のいずれかを標識することが考えられる。当技術分野において適切な標識が知られており、その中に放射性同位元素、蛍光色素、または分光光度測定法で検出可能な発色団が含まれる。上述の如く、PrP^C/PrPペプチド、PrP^C/組み換えPrP（90-231）、または組み換えPrP（90-231）/PrPペプチドからなるプリオンタンパク質複合体の形成には、ランダムコイルおよび／またはα−ヘリックス構造を持つ第２の構成要素が過剰に存在することが必要である。本明細書に記述したPrP^Scアッセイの好ましい態様において、第２の構成要素は標識されている。最初の実験では、第２の構成要素に対する第１の構成要素の比は1:5000であったが、その後の最適化のための実験により、この比は1:500へと減少した。プリオンタンパク質複合体は不溶性のため、一旦プリオンタンパク質複合体が形成されると、過剰な第２の構成要素は、超遠心により簡単に除去される。複合体の化学量論は、約1:1と決定された。解離したPrPペプチドの量は、PrP^Scを加えた後に測定する。PrP^C／PrP^Sc複合体は不溶性のため、解離したペプチド分子は、超遠心後の上清画分で測定する。別の態様においては、PrP^Cを親和性標識し、複合体形成後に固相に結合させる。 PrP^Scが、固相に接着して固定されたPrP^Cに結合した後、解離した標識ペプチドの量を、未結合相で測定する。このため、本アッセイは、既知量のPrP^Scを加えることにより算出し、末知の検体中に存在するPrP^Scの量は、解離したPrPペプチドの量により決定することができると考えられる。 PrP^Cまたは組み換えPrPの固定は、たとえば活性化ビオチンを用いた化学修飾のような、当技術分野では既知の方法により、行うことができる。ビオチン化したPrP^C、またはたとえば放射標識したSHa 90-145のようなもう一つのPrP分子が組み合わされた組み換えPrPを、その後、ストレプトアビジンで被覆した固相支持体に結合する（WoodおよびWarnke（1981）J．Histochem．Cytochem．29:1196 〜1204）。PrP^Scを加えると、標識した合成ペプチドが解離し、解離したペプチドの量は加えたPrP^Scの量に比例すると考えられる。このため、可溶性の未結合の標識ペプチドの量を測定すれば、感度よく、迅速におよび定量的に、PrP^Scをアッセイできる。本発明のPrP^Scアッセイは、たとえば、免疫検定によるアッセイで必要とされるように、PrP^Scが可溶性である必要はなく、およびPrP^Scの検出に先立ってPrP^C を除去する必要がない点で、利用可能な免疫アッセイに比べてすぐれた利点がある。PrP^Scは非常に不溶性が高く、現在までのところ、PrP^Scを可溶化できるものはリポソームしか見つかっていない（Gabizonら（1987）前記）。このため、本発明のPrP^Scアッセイは、PrP^Scがもつ可溶性の問題を、有効に回避することができる。本アッセイは、ヒト、ウシ、ヒツジまたはブタのプリオンに含まれるPrP^S ^c を検出するために、最適化することができる。マウスのプリオンをバイオアッセイするためのトランスジーンのデザイン上述したPrP^Scのアッセイは、プリオンをより早くおよび感受性高く検出できるバイオアッセイに用いるトランスジーンをデザインするためにも用いることができる。第96-169番目のコドンの範囲として定められるPrPの中央領域は、PrP^CおよびP rP^Scの二つの分子間で複合体を形成する際に、両者が相互作用する領域であると考えられる（Tellingら（1995）Cell 83:79〜90）。PrP^C/PrPペブチド、PrP^C/組み換えPrP、または組み換えPrP/PrPペプチド間で形成されるプリオンタンパク質複合体は、今日までに研究されたどの自然発生的な相互作用よりも感受性の高い、PrP^CおよびPrP^Sc間の相互作用を検出するのに用いることができる。複合体の第１の構成要素の配列を変えることにより、非相同な第二の構成要素をより強固に結合させることのできる残基を同定できる。一旦そのような配列が明らかになれば、そのような改変PrP^C分子を発現するトランスジェニックをプリオンと共に接種して、潜伏期間を測定することができる。一つの態様として、酵母のツーハイブリッド系を利用して中間段階の検索を用いることが考えられる。たとえばChienら（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9578〜9582の記載のように、PrP遺伝子の一つに変異を導入して相互作用の増加するものを検索するような、酵母のツーハイブリッド系を用いて、相互作用するPrP分子の研究を迅速に行うことができる。一旦そのようなクローンが同定されれば、合成ペプチドまたは組み換えPrP分子を作成し、プリオンタンパク質複合体の形成状態を調べる。プリオンタンパク質複合体が効率よく形成されれば、そのような配列を持つトランスジーンを構築してマイクロインジェクションし、当技術分野においては既知の方法により、トランスジェニックマウスを作成する。第１の構成要素に対する第２の構成要素の親和性は、プリオンタンパク質複合体を形成するのに必要な第２の構成要素の濃度により評価する。一旦プリオンタンパク質複合体を形成するのに必要な第２の構成要素の濃度を低くさせるような配列が同定されれば、第１の構成要素に対する第２の構成要素の親和性は、たとえば、表層プラズマ共鳴（Fagerstamら（1990）J．Mol．Recognit．3:208〜214 ；Stenbergら（1991）J．Colloid Interface Sci．143:513〜526；LiedbergおよびLundstrom（1993）Sensors Actuagers B 11:64〜72）によって、測定する。第１の構成要素を金フィルム上に固定した後、第２の構成要素を結合させる。第２の構成要素が結合すれば、屈折率の変化として検出できる。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、およびブタのプリオンのバイオアッセイ用のトランスジーンに対して最適化される。このアプローチは、ヒトのプリオンのバイオアッセイ用として普遍的なトランスジーンを構築するために、重要な意味を持つ。本研究室から最近発表されたように、第102番目および129番目のアミノ酸残基にミスマッチがあると、PrP介在性の疾患が発症するまでの潜伏期間はかなり延長するが、第200番目の残基の場合には、そのようなことはない（Tel lingら（1995）前記）。上述のようなアッセイ方法論によれば、PrP^Scのアミノ酸配列とは関わりなくすべてのヒトプリオンが伝達されるようにしてしまう、これらおよびその他の重要な残基のアミノ酸側鎖を同定できるようになる。PrP^Sc のアミノ酸配列という点からみた普遍的なトランスジーンを作成することに加えて、上述したアプローチは、自然発生したヒトPrP^Cそれ自身よりも効率よくヒト PrP^Scと相互作用する、人工的なPrP^Cを創造することにも用いることができる可能性がある。このため、本発明を用いることにより、ヒトプリオンに対する、より感受性の高い迅速なバイオアッセイを作出できるであろう。実施例以下の実施例は、当業者に対して、本発明のアッセイ法の作出および使用法を完全に開示および記載するために示したもので、それらの発明に関する発明者らの関わりの範囲を限定するためのものではない。使用した数値（例えば、量、温度、その他）に関しては正確を期すよう努力したが、ある程度の実験誤差および偏差については説明がなされねばならない。特に示さない限り、温度は摂氏、分子量は平均分子量、および圧力はほぼ大気圧である。実施例１．材料と方法 SHaPrPを、グルタミン合成酵素発現ベクター、pEE 12（Cell/Tech，Alameda， CA）にサブクローニングした。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）K1細胞（ATC C）を、10％の透析ウシ胎仔血清（FCS）（Gibco-BRL）を含むGMEM-S培地で、10 cmのペトリ皿当たり10⁶個撒いた（BebbingtonおよびHentschel（1987）： DNA クローニング：実践的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）(Glov er，D.M.，編)；IRL Press、Oxford、pp．163〜188）。CaPO₄法（Gorman（1985 ）： DNA クローニング：実践的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Appro ach）前記、pp．143〜190）を用いて、細胞に、ペトリ皿１枚当たり10 μgの pE E 12-SHaPrPベクターを形質導入した。25 μM のスルホキシイミンメチオニン（MS X）（Sigma）存在下で２週間細胞を増殖させた後、60クローンを任意に選択して、100、200、または400 μM MSX存在下で増殖させた。最も発現の高いクローンを同定するため、各クローンをウエスタンブロットで解析した（Towbinら、(197 9)Proc，Natl．Acad．Sci．USA 76:4350〜4354）。クローン#30C1では、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（PIPLC）による消化で、10⁶個の細胞から、〜90 ngのSHaPrP^cが放出された（Kokeら（1991）Protein Expr．Puri f．2:51〜58）。シリアンハムスター（SHa）PrPの第90-231残基（配列番号：２）に相当する14 2アミノ酸の組み換えPrPを、大腸菌で高発現させ、再生条件下で単一にまで精製した。 SHaPrP^Cを発現しているCHO細胞を、[³⁵S-]Met（100 μCi/ml、NEN）で代謝的に放射標識し（Borcheltら、（1990）J．Cell Biol．110:743〜752）、SHaPrPの第109-112残基（Rogersら、（1991）J．Immunol．147:3568〜3574）を認識する抗 PrP 3F4単クローン抗体（mAb）（Kascsakら、（1987）J．Virol．61:3688〜3693 ）を用いて、免疫親和性により、溶解液から精製した（Panら、（1992）Protein Sci．1:1343〜1352）。3 M グアニジン塩酸（Gdn-HCl）でmAb/プロテインA セファロースからSHaPrP^Cを溶出し、４℃で16,000 x g で2分間遠心して、上清をTN 緩衝液（130 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.4）で1:10に希釈した；場合によっては、PrP^CをGdn-HClおよび残存する界面活性剤から分離するため、4倍量のメタノールで沈澱させた。[³⁵S-]PrP^Cの濃度を、SHaの脳由来の既知量のPrP^Cのウエスタンブロットのシグナルと比較することおよびシンチレーション分光計で測定することにより、決定した。 Charles River Laboratoriesより入手したシリアンハムスター（Lak:LVG）に、Sc237プリオン（MarshおよびKimberlin（1975） J．Infect．Dis．131:104〜110）を接種し、CNS（中枢神経系）の機能障害の兆候が出現した時点で屠殺した。Turkらの方法（(1988)Eur．J．Biochem．176:21 〜30、参照として特別に本明細書に組み入れられる）に従って、これらの患畜の脳からSHaPrP^Scを精製した。同様に、RMLプリオン（Chandler（1961）Lancet 1: 1378〜1379）を接種し発病したマウスの脳から、マウス（Mo）PrP^Scを精製した。接種を受けていない成体のSHaの脳からもSHaPrP^Cを精製し（Panら、（1993）Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 90:10962〜10966、参照として特別に本明細書に組み入れられる）、LeeおよびGriffithsの方法（(1984)J．Immunol．Methods 74:181〜189、参照として特別に本明細書に組み入れられる）に従って、Iodo-Beads（Pierce）を用いて、[¹²⁵Ｉ]（１mCi/50 μg PrP^C、Amersham）で放射性ヨード標識した。 PrPペプチドを合成し、前述の如く精製した（Gassetら、（1992）前記；Nguyen ら、（1995）前記）；構造は、FTIR分光学およびCDにより、前述の方法で（Nguye nら、（1995）Biochemistry 34:4186〜4192 および Zhangら、（1995）J．Mol． Biol．250:514〜526、両文献は、参照として特別に本明細書に組み入れられる）、確認した。実験に用いたPrPペプチドは、表１に示してある。PrPペプチドは、 Applied Biosystems（Foster City、CA）のモデル430自動合成機、またはMillip ore（Bedford、MA）のモデル9050 Plus PepSynthesizerのいずれかを用いて、N- Fmocで保護されたアミノ酸から合成し、Nguyenら(1995)の前記の記載に従って、 RP-HPLCで精製した。 FTIR測定は、顕微鏡を装着し、乾燥窒素でパージした、Perkin Elmer（Norwal k、CT）System 2000分光計を用いた伝導分光学により行った。CDスペクトルは、軌道長0.01 cmの円柱型水晶セルを用い、室温で、Jasco Model 720の分光偏光計に記録した。ペプチド濃度は、Nguyenら(1995)の前記の記述に従った。プロテイナーゼＫ（Gibco-BRL）は50 μg/mlの濃度で用い、37℃で1 時間処理した。PrP^C を3 M Gdn-HCl存在下で消化したが、プロテイナーゼＫの活性は、carbobenzoxy- valyl-glycyl-arginine-ρ-nitroanilide（Boerhinger Mannheim）を用いた比色定量アッセイによる測定では、〜90％減少していた。プロテイナーゼＫによる消化は、1 mMの(4-amidinophenyl)methanesulfonyl fluoride（PMSF）（Boerhinge r Mannheim）を加えることにより終了した。SDS-PAGEはLaemmli（Laemmli（1970 ）Nature 227:680〜685）に従って行い、オートラジオグラムを得た。イムノブロットはECLシステム（Amersham）を用い、抗PrP 3F4 mAbで作成した。JEOL 100 CX 電子顕微鏡を用いて、陰性染色後、80 Kevで検体を観察した。 50 ngの[³⁵S-]SHaPrP^cを、TN緩衝液中の濃度〜10 μg/mlで、エッペンドルフ微量遠心チューブ中で、37℃で48時間まで処理した。PrPペプチドを、免疫精製して放射標識したPrP^cと、0.3 M Gdn-HCl中で、50:1から5000:1の範囲のモル比で混合した。抗PrP 3F4 mAbおよび13A5 mAb（BarryおよびPrusiner（1986）前記）を、1:1から50:1の範囲のモル比でSHaPrP^cに加えた。3F4および13A5は、SHa PrPタンパク質の、各々第109-112番目および第138-141番目のアミノ酸残基を認識する、マウスの単クローン抗体である（Rogersら（1991）J．Immunol．147:33568〜3 574、参照として特別に本明細書に組み入れられる）。PrP^Sc（〜1 mg/ml）は、0 から6 Mの濃度範囲のGdn-HClで、37℃で16時間、前処理した。全ての検体に等量のTN緩衝液を加えて処理を終了し、ただちに解析を行った。実施例２． PrPペプチドによるプロテアーゼ抵抗性PrPの形成の促進 [³⁵S-]SHaPrP^Cを、合成ペプチドまたはPrP^Scで処理した。使用した合成ペプチドは、以下の通りである：ランダムコイル構造のSHa 90-145を、PrP^Cに対するペプチドの比が50:1、500:1、または5000:1で；βシート構造のSHa 90-145を、50: 1、500:1、または5000:1の比で；ランダムコイル構造のMo 90-145を、5000:1の比で；βシート構造のMo 90-145を、5000:1の比で；βシート構造のSHa 109-122 （H1）を、5000:1の比で；ランダムコイル構造のSHa 104-122（104H1）を、5000 :1の比で；ランダムコイル構造のSHa 109-141；ランダムコイル構造のSHa 90-14 5（A117V）を、5000:1の比で用いた。いくつかの実験では、PrP^Cの代わりに、大腸菌で発現させたSHa 90-231を用いた。SHa 90-231を、上述のものと同じ条件下で、合成ペプチドSHa 90-145と混合した。実施例１の記述と同様に、0.3 M Gdn- HClを含むTN緩衝液で、37℃で48時間処理した。検体を、プロテイナーゼＫで、3 7℃で1時間消化した後、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーを行った。SDS- PAGEには、未消化のPrP^CおよびSHaPrP^Scをも使用した。結果 5000:1の比で処理したランダムコイル構造のSHa 90-145はプロテアーゼ抵抗性を誘導したが、βシート構造のSHa 90-145は誘導しなかった。ランダムコイルまたはβシートのいずれの構造のMo 90-145も、SHaPrP^Cと処理してもプロテアーゼ抵抗性を誘導しなかった。H1（第109-122番目の残基を含む）または第104 -122番目の残基を含む更に長いタイプ（104H1）のいずれも、PrP^Cにプロテアーゼ抵抗性を誘導しなかった。SHa 109-141およびSHa 90-145は、どちらもプロテアーゼ抵抗性を誘導した。最も効率よくプロテアーゼ抵抗性で放射標識を持つPr P^Cを形成したのは、第117番目のアラニンをアラニンに置換した、SHa 90-145（A117V ）を用いた場合であった。野生型のペプチドと比較して、等量のプロテアーゼ抵抗性のPrP^Cを産生するために必要な変異型ペプチドは、わずか30〜40％に過ぎなかった。界面活性剤（2％（w/v）ザルコシル）を添加するとPrP^C/PrPペプチド複合体は破壊され、PrP^Cはプロテアーゼ活性に感受性となった。SHa 90-145（A117 V）存在下では、[³⁵S-]PrP^C/PrPペプチド複合体の約30％がプロテアーゼ抵抗性を示した；SHa 90-145存在下では、抵抗性を示したのはわずか10〜15％に過ぎなかった。 SHa 90-145をSHa 90-231と混合した場合、不溶性およびプロテアーゼ抵抗性の複合体が形成された。実施例３． PrP^C/PrPペプチド複合体の溶解性の特徴 SHa PrP^Cを、単独またはSHa 90-145（A117V）存在下で、0.3 M Gdn-HClを含む TN緩衝液中で、48時間処理した；検体を、20℃で、100,000 x gで１時間遠心し、沈渣をTN緩衝液に再浮遊させた。沈降した沈渣を、FTIR分光学、CD、および電子顕微鏡（EM）により、Zhangら(1995)の前記の記述に従って解析した。標本は、2 ％酢酸ウラニルまたは2％モリブデン酸アンモニウムで染色した。結果 SHa PrP^C単独で処理した場合には、[³⁵S-]PrP^Cのうちの10％以下しか沈澱しなかった。SHa 90-145（A117V）を加えると、放射標識の〜65％が沈渣に沈降した。沈降したPrP^C/SHa 90-145複合体をFTIR分光学で解析すると、PrP^Cの沈渣と比較して、βシート含量が大きく増加していた。CDで測定した結果、上清中に含まれる主として未結合のSHa 90-145ペプチドは、TN緩衝液中で48時間単独で処理したペプチドの場合同様に、ランダムコイル構造のままであった。電子顕微鏡で観察すると、単独処理したPrP^Cの沈渣には、直径20 nmまでの大きさの球形凝集物が多数認められた。これとは対照的に、PrP^C/PrPペプチド複合体の沈渣では、大きなフィラメント状のポリマーが多数認められた。実施例４．抗PrP単クローン抗体のPrP^Cへの結合抗PrP 3F4または13A5 mAbの存在下または非存在下で、SHa 90-145ペプチドまたはSHaPrP^Scとともに48時間、[³⁵S-]PrP^Cを処理した。検体をプロテイナーゼＫで、37℃で1 時間消化した後、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーを行った。 mAb 3F4（mAb:PrP^Cの比50:1）またはmAb 13A5（500:1）存在下および非存在下で、SHa 90-145とPrP^Cを、5000:1（PrPに対するペプチド）の比で混合して処理した。3F4および13A5 mAbは、共に、プロテアーゼ抵抗性のPrP^C/PrPペプチド複合体の形成を阻害した。実施例５．プロテアーゼ抵抗性PrPの自発的形成実施例１の記載に従って形質導入したCHO細胞から免疫精製したPrP^C（10 μg/ ml）（[³⁵S]SHaPrP^C）、およびSHaの脳由来のPrP^C（1 mg/ml）を、0.75 MのGdn- HCl存在下、37℃で0分、2分または48時間処理した。プロテイナーゼＫで37℃で1 時間消化する前に、検体をTN緩衝液で1:4に希釈した。次に検体をプロテイナーゼＫで消化し、SDS-PAGEおよび抗PrP 3F4 mAbを用いたウエスタンブロッティングで解析した。結果 SHa 90-145（A117V）ペプチドとともに処理することにより、約30％のP rP^Cが抵抗性となったのに比較して、これらの条件下では、48時間後に、約1％の PrP^Cがプロテアーゼ抵抗性であることがわかった。CHOで過剰発現させたPrP^Cは様々な大きさを示したが、これは恐らく、SHaの脳由来のPrP^Cとは対照的に、高度に糖化されているためと考えられる。プロテアーゼ抵抗性のバンドが何であるかを確認するため、ブロットのオートラジオグラムを撮った；４週間の曝露の後、³⁵S-PrP^Cを含むレーンの対応する大きさの位置に、弱いが明確なバンドが検出された。0.2％ザルコシルを加えると、「プロテアーゼ抵抗性」のPrP^Cは、タンパク質分解反応に感受性となった。実施例６． Gdn-HClによるPrP^Sc変性の効果 SHaPrP^Scを、0、3 M、または6 MのGdn-HCl存在下で、37℃で0分、2分、または 48時間処理した後、プロテイナーゼＫで1 時間消化した。検体をSDS-PAGEおよび抗PrP 3F4 mAbを用いたウエスタンブロットにより解析した。結果 PrP^Sc（3 M Gdn-HClで変性させた後、緩衝液で、Gdn-HClの最終濃度0.3 〜2 Mに希釈したもの）をPrP^Cと混合しても、プロテアーゼ抵抗性の[³⁵S-]PrP^C は、全く産生されなかった。しかしながら、実施例２で示したように、未変性の PrP^ScをPrP^Cと混合すると、プロテアーゼ抵抗性の[³⁵S-]PrP^Cが産生された。PrP^Sc を10倍量過剰に用いても、プロテアーゼ抵抗性の[³⁵-S]PrP^Cを産生するには不十分であった；50倍量過剰のPrP^Scが必要であった。混合前にメタノール沈澱によってGdn-HClを除くと複合体の形成が阻害されることから、反応液中にGdn-HCl が0.3 M存在することが必須であると考えられた。100,000 x g での1 時間の遠心により、約50％の[³⁵S]PrP^Cが複合体の沈澱として回収され、このうち10〜15 ％がプロテアーゼ抵抗性であった。実施例７．抗PrP単クローン抗体はPrP^CへのPrP^Scの結合を阻害する mAb/PrP^cの比500:1での、抗PrP 3F4または13A5の存在下または非存在下で、[³ ⁵ S]PrP^CをSHa 90-145ペブチドまたはSHaPrP^Scで48時間処理し、PrP^c/PrP^Sc複合体の形成を、上述の如く測定した。PrP^cとPrP^Scとの相互作用は、抗PrP mAb 3F4 により阻害されたが、13A5では阻害されなかった。 N端を切断して3F4エピトープを欠失したPrP^cペプチドであるPrP^c-IIをPrP^Scで処理し、プロテアーゼ抵抗性の形成を測定した。PrP^c-IIは、プロテアーゼ抵抗性を示さなかった。実施例８． MoPrP^ScまたはSHaPrP^Scで処理したSHaPrP^cに対する界面活性剤の効果 0.2％、1％、または2％ザルコシル存在下または非存在下で、[³⁵S-]SHaPrP^Cを、未標識のMoPrP^ScまたはSHaPrP^Scで48時間処理した。検体を、SDS-PAGEおよび抗PrP 3F4を用いたウエスタンブロットで解析した。結果 MoPrP^ScをSHaPrP^cと混合した場合、形成されたプロテアーゼ抵抗性のPr P^Cは比較的少量であり、ザルコシルを加えると、複合体は、タンパク質分解反応に感受性となった。これに対し、[³⁵S]PrP^c/SHaPrP^Sc複合体は、消化を行う前に 48時間まで2％ザルコシルで処理しても、タンパク質分解反応に抵抗性であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コヘンフレッドイー. アメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコロードアイランドストリート 767

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞由来のプリオンタンパク質（PrP^c）に構造変化を引き起こす能力を有するプリオンタンパク質（PrP）ペプチド。２．構造変化が、PrP^cよりも不溶性を増大させる、請求項１記載のPrPペプチド。３．構造変化が、PrP^cよりもβシート構造を増加させる、請求項１記載のPr Pペプチド。４． βシートの形成がPrP^cの場合よりも約30％から100％多い、請求項３記載のPrPペプチド。５． βシートの形成がPrP^cの場合よりも約50％から100％多い、請求項３記載のPrPペプチド。６．構造変化が、PrP^cよりもプロテアーゼ抵抗性を増強させる、請求項１記載のPrPペプチド。７．構造変化が、約20％から約100％のプロテアーゼ抵抗性を有する複合体を形成する、請求項６記載のPrPペプチド。８．構造変化が、約45％から約100％のプロテアーゼ抵抗性を有する複合体を形成する、請求項６記載のPrPペプチド。９．構造変化が、約60％から約100％のプロテアーゼ抵抗性を有する複合体を形成する、請求項６記載のPrPペプチド。１０．ペプチドが、水溶液中で、α−ヘリックスドメインおよびランダムコイルからなる群より選択される構造である、請求項１記載のPrPペプチド。１１． (a) 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０からなる群より選択される；ならびに (b) (a)の配列と実質的に同様のアミノ酸配列であって、該実質的に同様のアミノ酸配列がPrP^cに結合して複合体を形成する、アミノ酸配列を有する、請求項１記載のPrPペプチド。１２． PrP^cが、ヒトPrP^c、ハムスターPrP^c、マウスPrP^c、ウシPrP^c、およびヒツジPrP^cからなる群より選択される、請求項１記載のPrPペプチド。１３． PrP^cがヒトPrP^cである、請求項８記載のPrPペプチド。１４． (a) 検体化合物を、第２の構成要素であるPrPペプチド存在下で第１の構成要素であるPrP^cと接触させ、この場合第１および第２の構成要素がプリオンタンパク質複合体を形成し；および (b) プリオンタンパク質複合体の形成を検出する、工程を含む、PrPペプチドへのPrP^cの結合を阻害する化合物を検索する方法。１５．プリオンタンパク質複合体の不溶性がPrP^cよりも増大している、請求項１４記載の方法。１６．複合体のβシート構造が、第１の構成要素であるPrP^cよりも増加している、請求項１５記載の方法。１７．第１の構成要素であるPrP^cが、ヒトPrP^c、ハムスターPrP^c、マウスPrP^C 、ウシPrP^c、およびヒツジPrP^cからなる群より選択される、請求項１４記載のPr Pペプチド。１８． PrP^cがヒトPrP^cである、請求項１７記載の方法。１９．第１の構成要素であるPrP^cが、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１４記載の方法。２０．第２の構成要素が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０のうちの１つである、請求項１４記載の方法。２１． (a) 検体化合物を、第２の構成要素であるPrPペプチド存在下で、第１の構成要素であるPrP^cと接触させ；および (b) プリオンタンパク質複合体の誘導を検出する、工程を含む、プリオンタンパク質複合体の誘導を阻害する化合物を検索する方法。２２．プリオンタンパク質複合体の不溶性がPrP^cよりも増大している、請求項２１記載の方法。２３．第１の構成要素であるPrP^cが、ヒトPrP^c、ハムスターPrP^c、マウスPrP^c 、ウシPrP^c、およびヒツジPrP^cからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。２４． PrP^cが、ヒトPrP^cである、請求項２３記載の方法。２５．第１の構成要素であるPrP^cが、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項２１記載の方法。２６．第２の構成要素が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０のうちの１つである、請求項２１記載の方法。２７． PrP^cタンパク質を供給すること； PrP^cタンパク質と検体化合物とを接触させること；検体化合物の非存在下で、PrP^cタンパク質にβシートの形成を含む構造変化を起こさせるペプチドを、PrP^cタンパク質と結合させること；およびその構造変化の阻害に及ぼす検体化合物の影響を検出すること、を含むアッセイ方法。２８．構造変化が、PrP^cに比し不溶性の増大をもたらす、請求項２７記載のアッセイ方法。２９．構造変化が、PrP^cに比しプロテアーゼ抵抗性の増強をもたらす、請求項２７記載のアッセイ方法。３０． PrP^cが、ヒトPrP^c、ハムスターPrP^c、マウスPrP^c、ウシPrP^c、およびヒツジPrP^cからなる群より選択される、請求項２７記載のアッセイ方法。３１． PrP^cがヒトPrP^cである、請求項３０記載のアッセイ方法。３２． PrP^cがPrP^cのヒト変異体である、請求項２７記載のアッセイ方法。３３． (a) プリオンタンパク質複合体が形成される条件下で、第１の構成要素であるPrP^cおよび第２の構成要素であるPrP^cペプチドを混合し； (b) PrP^Scを含む可能性のある検体を加え； (c) PrP^c／PrP^Sc複合体の形成により、プリオンタンパク質複合体から解離したPrPペプチドの量を測定する工程を含み、該プリオンタンパク質複合体から解離するPrPペプチドの量が、検体中に存在するPrP^Scの量に比例する、PrP^S ^c のアッセイ。３４．第２の構成要素であるPrPが標識されており、プリオンタンパク質複合体から解離したPrPペプチドの量が、PrP^c／PrP^Sc複合体を除去し、残存した標識の量を検出することにより測定される、請求項３３記載の方法。３５．第１の構成要素であるPrP^cが、固相に付着することにより固定されており、解離した標識PrPペプチドの量が非結合相で測定される、請求項３３記載の方法。３６． PrPペプチドが、放射性同位元素、蛍光色素、または発色団で標識される、請求項３４記載の方法。