CN102879577B - 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102879577B CN102879577B CN201210431979.9A CN201210431979A CN102879577B CN 102879577 B CN102879577 B CN 102879577B CN 201210431979 A CN201210431979 A CN 201210431979A CN 102879577 B CN102879577 B CN 102879577B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- prion
- capture antibody
- preparation
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：包被有捕获抗体的ELISA板，所述的捕获抗体为具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列结合反应的捕获抗体；与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体，所述与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体是具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列结合反应的检测抗体；以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP、底物液和终止液。本发明利用ELISA技术，建立了检测朊病毒的试剂盒。该试剂盒使用方便，灵敏度高，可快速准确的检测朊病毒；并且该试剂盒制备简单，成本低，有利于推广和工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
朊病毒又称蛋白质侵染因子，是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。朊是蛋白质的旧称，朊病毒意思就是蛋白质病毒。
它是一类能引起哺乳动物和人的中枢神经系统病变的传染性的病变因子。其中，“谈牛色变”的疯牛病的病原就属于朊病毒。疯牛病，即牛海绵状脑病（Bovine SpongiformEncephalopathy，BSE），它是传染性海绵状脑病的一种。其症状为：多数病牛的中枢神经系统出现变化，行为反常，烦躁不安，步态不稳。经解剖发现，病牛中枢神经系统的脑灰质部分形成海绵状空泡，脑干灰质两侧呈对称性病变，神经纤维网有中等数量的不连续的卵形和球形空洞，神经细胞肿胀成气球状，细胞质变窄。另外，还有明显的神经细胞变性及坏死。
目前有研究认为引起BSE的病原是一种缺少核酸的传染性物质。1983年，Prusiner教授和他的同事成功的从患病的仓鼠脑中鉴定出了这种感染因子。所有的试验表明，感染因子是由一种蛋白质组成的，Prusiner称之为朊病毒（proteinaceous infectious particle，Prion），也可以为蛋白质状感染粒子。
自20世纪80年代中后期英国第一次大规模暴发疯牛病以来，随后在欧美的其他国家也相继发生了疯牛病的疫情，给这些国家的养牛业造成巨大的损失，并且严重危害着人类的健康生活。因此为了降低疯牛病对各国经济发展的影响，定期的检测是必要的。虽然世界上许多国家对BSE的诊断方法进行了不同程度的研究，如酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫组织化学检测、组织病理学检测、实验动物接种检测、组织化学检测等，但检测BSE商品化的试剂盒在世界范围内屈指可数，目前国内还未建立关于BSE快速、灵敏的科学检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法。
一种检测朊病毒的试剂盒，包括：
包被有捕获抗体的ELISA板，
所述的捕获抗体为具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列结合反应的捕获抗体；
与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体，
所述与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体是具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列结合反应的检测抗体；
以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP、底物液和终止液。
根据本发明优选的，所述的捕获抗体的抗体亚型为IgG2a，由两条相同的捕获抗体重链和两条相同的捕获抗体轻链构成，所述的捕获抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，捕获抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明优选的，所述的与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体亚型为IgG1，由两条相同的检测抗体重链和两条相同的检测抗体轻链构成，所述的检测抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，检测抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的另一个目的是提供上述检测朊病毒试剂盒的制备方法。
上述检测朊病毒的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
（1）包被有捕获抗体的ELISA板的制备方法，步骤如下：
取ELISA孔板，每个孔用100μl的5μg/ml捕获抗体溶液包被，4℃过夜后取出，置于室温下，静置30-60min，弃去孔内液体，用洗涤液清洗3-5次，每次5min；然后，用封闭液封闭，37℃温育2h后，弃去孔内液体，用清洗液清洗5min，置于4℃备用，制得包被有捕获抗体的ELISA板；
（2）与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体的制备方法，步骤如下：
向1ml浓度为10mg/ml的捕获抗体溶液中，加入2mg生物素，混匀，室温下静置30min，制得与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体；
（3）按现有技术配制抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP溶液、底物液和终止液，然后包装后，即得检测朊病毒的试剂盒。
所述步骤（1）和步骤（2）中的捕获抗体溶液采用如下方法制备：
A.制备抗原：从感染朊病毒的仓鼠的脑组织中提纯朊病毒蛋白分子（PrPSc）；
B.免疫：将纯化的PrPSc与弗氏佐剂混合，皮下免疫注射Balb/c小鼠；
C.克隆杂交瘤细胞制备：2月后取小鼠脾脏，收集单个脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，筛选可分泌抗PrPSc抗体的杂交瘤细胞，扩增培养，即为单克隆杂交瘤细胞。不同的单克隆杂交瘤细胞分泌针对不同抗原决定簇的抗体。
D.制备单克隆抗体:将单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，造成小鼠产生腹水，腹水中含有大量单克隆抗体溶液，即捕获抗体溶液。
所述步骤（2）中的封闭液采用如下方法配制：取2ml兔血清溶于100ml的样品稀释液中，即得。
所述步骤（3）中的抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP溶液、底物液和终止液可按现有技术配制，也可按如下方法配制：
样品稀释液：先配制10×PBS缓冲液，每升10×PBS缓冲液的组份为：NaCl80g、KCl2.0g、Na2HPO414.4g、KH2PO42.4g，调节PH值到7.4，然后稀释10倍，即得样品稀释液；
抗体稀释液：取1ml兔血清溶于100ml的样品稀释液中，即得抗体稀释液。
洗涤液：取2ml吐温-20加入到1000ml的样品稀释液中，即得洗涤液。
Streptavidin-HRP溶液：用抗体稀释液按1：100比例稀释后，即得Streptavidin-HRP。
底物液：在12.5ml的枸橼酸-磷酸盐缓冲液中加入1片5mg的OPD片剂，制得底物液。
枸橼酸-磷酸盐缓冲液：枸橼酸4.67g，Na3PO47.30g，加蒸馏水到800ml，调节pH值到5.0，再补加水到1000ml。
终止液：浓度为4mol/l的H2SO4溶液。
有益效果
本发明利用ELISA技术，建立了检测朊病毒的试剂盒。该试剂盒使用方便，灵敏度高，可快速准确的检测朊病毒；并且该试剂盒制备简单，成本低，有利于推广和工业化生产。
附图说明
图1是5%绵羊脑组织匀浆中朊病毒检测结果（OD490）；
其中：1～8代表重复次数，每组自左至右的数值柱分别代表：正常脑组织、经蛋白酶消化后的正常脑组织、患病脑组织、经蛋白酶消化后的患病脑组织；
图2是绵羊血浆中朊病毒检测结果（OD490）；
其中：1～8代表重复次数，每组自左至右的数值柱分别代表：正常血浆、经蛋白酶消化后的正常血浆、患病血浆、经蛋白酶消化后的患病血浆；
图3是绵羊尿液中朊病毒检测结果（OD490）
其中：1～8代表重复次数，每组自左至右的数值柱分别代表：正常尿液、经蛋白酶消化后的正常尿液、患病尿液、经蛋白酶消化后的患病尿液；
图4是患病绵羊Western-blot实验检测结果；
其中：1、分子量标准，2、患病绵羊脑组织匀浆，3、患病绵羊脑组织蛋白酶消化后匀浆，4、患病绵羊尿液，6、患病绵羊蛋白酶消化后尿液，7、空白缓冲液，8，正常绵羊尿液，9、空白缓冲液，10、正常绵羊蛋白酶消化后尿液；
图5是患病仓鼠Western-blot实验检测结果；
其中：1、患病仓鼠脑组织匀浆，2、患病仓鼠脑组织匀浆蛋白酶消化后，3、分子量标准，4、正常仓鼠血浆，5、空白缓冲液，6、正常仓鼠血浆蛋白酶消化后，7、空白缓冲液，8、患病仓鼠血浆，9、空白缓冲液，10、患病仓鼠血浆蛋白酶消化后。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
原料来源
兔血清购自山东龙美公司生物医学科技有限公司；
OPD片剂购自北京索莱宝科技有限公司；
弗氏佐剂购自sigma公司；
Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
SP2/0骨髓瘤细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心；
溶液配制
10×PBS缓冲液（1L）：取NaCl80g、KCl2.0g、Na2HPO414.4g、KH2PO42.4g，加水，调节PH值至7.4。
样品稀释液：取10×PBS缓冲液，然后稀释10倍，即得样品稀释液；
抗体稀释液：取1ml兔血清溶于100ml的样品稀释液中，即得抗体稀释液。
洗涤液：取2ml吐温-20加入到1000ml的样品稀释液中，即得洗涤液。
Streptavidin-HRP溶液：用抗体稀释液按1：100比例稀释后，即得Streptavidin-HRP。
底物液：在12.5ml的枸橼酸-磷酸盐缓冲液中加入1片5mg的OPD片剂，制得底物液。
枸橼酸-磷酸盐缓冲液：枸橼酸4.67g，Na3PO47.30g，加蒸馏水到800毫升，调节pH值到5.0，再补加水到1000毫升。
终止液：浓度为4mol/l的H2SO4溶液。
封闭液：取2ml兔血清溶于100ml的样品稀释液中，即得。
实施例
一种检测朊病毒的试剂盒的制备方法，包括：
（1）包被有捕获抗体的ELISA板的制备方法，步骤如下：
A.制备抗原：从感染朊病毒的仓鼠的脑组织中提纯朊病毒蛋白分子（PrPSc）；
B.免疫：将纯化的PrPSc与弗氏佐剂混合，皮下免疫注射Balb/c小鼠；
C.克隆杂交瘤细胞制备：2月后取小鼠脾脏，收集单个脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，筛选可分泌抗PrPSc抗体的杂交瘤细胞，扩增培养，即为单克隆杂交瘤细胞。不同的单克隆杂交瘤细胞分泌针对不同抗原决定簇的抗体。
D.制备单克隆抗体:将单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，造成小鼠产生腹水，腹水中含有大量单克隆抗体溶液，即捕获抗体溶液。
取ELISA孔板，每个孔用100μl的5μg/ml捕获抗体包被，4℃过夜后取出，置于室温下，静置0.5h后，弃去孔内液体，每孔用200μl的清洗液清洗，顺/反时针在实验台面上摇匀后弃去板孔内洗液，重复该步骤3次，每次5min。每孔再用100ul2%兔血清封闭，37℃温育2h后，弃去孔内液体。每孔用200μl的清洗液清洗（步骤同上），放于4℃备用。
（2）与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体的制备方法，步骤如下：
向1ml浓度为10mg/ml的捕获抗体溶液中，加入2mg生物素，混匀，室温下静置30min，制得与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体。
（3）按现有技术配制抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP、底物液和终止液，然后包装后，即得检测朊病毒的试剂盒。
经检测，捕获抗体为具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列结合反应的捕获抗体；其亚型为IgG2a，由两条相同的捕获抗体重链和两条相同的捕获抗体轻链构成，所述的捕获抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，捕获抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体是具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列结合反应的检测抗体；其亚型为IgG1，由两条相同的检测抗体重链和两条相同的检测抗体轻链构成，所述的检测抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，检测抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
试验例1
采用实施例制得的检测朊病毒的试剂盒按如下步骤进行检测：
样品处理:
A.脑组织处理:称取绵羊疑似病患脑组织或其它组织，放置离心管中，加入5%SDS/PBS缓冲液，制成10%组织匀浆,离心除去沉淀(200G，5min，RT)，取上清备用。
B.尿液处理:取绵羊疑似病患尿液，以晨尿为佳,离心(1500G，10min，RT)，取上清，用生理盐水透稀(1:1000，V/V),其后更换透稀液2次。用YM-10离心过滤装置离心分离PrPSc(5000G，30min，RT)。
C.血液处理:抽取绵羊疑似病患血液,离心分离血浆,将血浆超声处理(1500W，5min)。将血浆与2XTRIS/SARCOCYL/SB-314等体积混匀，超速离心（15000G，1h，4℃），弃取上清。将沉淀用5%SDS/PBS缓冲液溶解。
D.取上述组织匀浆或疑似病患尿液PrPSc样品或血液PrPSc样品,等分成2份(200μl/份)，向其中一份中加入蛋白酶K(组织匀浆或血浆中为100μg/ml；尿液为50μg/ml，30min，37℃),然后加入苯甲基磺酰氟(即PMSF1mg/mL)终止消化反应，加热使蛋白变性(100℃，5min)，冷却后进行ELISA检测。
加样反应：
（1）每个样本检测孔中分别加入已处理的样品100μl，每个样本要做2个平行的检测孔，同时设置阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性、和空白对照各100μl在相应的孔内，用样品稀释液做空白对照。
（2）置37℃中孵育2h后，弃去孔内液体。每孔用200μl的洗涤液清洗，顺/反时针在实验台面上摇匀后弃去板孔内洗液，重复该步骤3次，每次5min。
加检测抗体：
（1）用样品稀释液将与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体稀释成2μg/ml，制得检测抗体工作溶液，向包被有捕获抗体的ELISA板上的每孔加检测抗体工作溶液100μl。
（2）37℃孵育1.5h后，弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液清洗。
（3）每孔加入Streptavidin-HRP溶液100μl，37℃孵育1h后，弃去孔内液体。每孔用200μl的洗涤液清洗（步骤同上）。
显色反应
每孔加入100μl的底物液，在室温下避光显色15min后，加终止液100μl，混匀终止反应，立即用酶标仪检测490nm处的OD值。
重复上述检验步骤7次。
结果判断
正常无病毒样品，经蛋白酶K消化后，朊蛋白（PRPC）检测OD值为0，与未经蛋白酶K消化的相同样品OD值百分比为0%。病患组织样品，经蛋白酶K消化后，PRPSC检测OD大于0%，既可判断为阳性。如图1-3所示。
验证实验1
Westen-blot实验步骤：
药品均购自北京索莱宝科技有限公司。
（1）制胶：夹好灌制聚丙烯酸胺凝胶的玻璃板，将制好的质量浓度为12%的十二烷基硫酸钠-丙烯酞胺分离胶约7.5ml迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，在分离胶上加入一层无水乙醇。分离胶聚合后，倾出覆盖层的无水乙醇液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用滤纸片吸净残留液体，再将刚制好的积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子（1.5mm 10个梳齿）。待胶全部聚合后拔出梳子，用水洗去加样槽的残留液体，用针头拨掉加样槽内的胶，将齿弄直，固定于电泳装置。
（2）制备样品：按照实施例中样品制备的方法，分别制备2份患病绵羊脑组织匀浆、2份患病绵羊尿液、2份正常绵羊尿液，体积分别为30μl。其中一份患病绵羊脑组织匀浆加入适量的存储浓度为1mg/ml的蛋白酶K，使其工作浓度为100μg/ml，另一份患病绵羊脑组织匀浆中加入等体积的三蒸水，37℃，消化1h；患病绵羊尿液及正常绵羊尿液也做如上处理，蛋白酶K工作浓度为50μg/ml。消化结束后，每份样品中加入适量的存储浓度10mg/ml的苯甲基磺酰氟（PMSF），使其工作浓度为100μg/ml。然后每个样品中加入10μl的4×samplebuffer（上样缓冲液体），煮沸5min后制得上样样品。
（3）加电泳缓冲液，取步骤（2）制备的上样样品，每孔加30μL上样样品。上样顺序，从左到右，第1孔分子量标准，第2孔患病绵羊脑组织匀浆，第3孔患病绵羊脑组织匀浆蛋白酶消化后，第4孔患病绵羊尿液，第6孔患病绵羊尿液蛋白酶消化后，第8孔正常绵羊尿液，第10孔正常绵羊尿液蛋白酶消化后。将电泳装置与电源相接，将电压调到80V，待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调到120V，待漠酚蓝跑到分离胶底部时关掉电源，取出聚丙烯酞胺凝胶。
考马斯亮蓝染色5min后，脱色过夜。结果如图4所示。
由图4可知，正常样品中的PRPC经37℃、蛋白酶K(脑匀浆或血浆中为100ug/ml,尿液中为50μg/ml)处理1h，完全消化；而患病样品所含的PRPSC经37℃、l蛋白酶K((脑匀浆或血浆中为100μg/ml,尿液中为50ug/ml)处理1h后，消化成三个肽段，与试验例1的结果相符。
试验例2
采用实施例制得的检测朊病毒的试剂盒按如下步骤进行检测：
样品处理:
A.脑组织处理:称取仓鼠疑似病患脑组织或其它组织，放置离心管中，加入5%SDS/PBS缓冲液，制成10%组织匀浆，离心除去沉淀(200G，5min，RT)，取上清备用。
B.尿液处理:取仓鼠疑似病患尿液，以晨尿为佳,离心(1500G，10min，RT)，取上清，用生理盐水透稀(1:1000，V/V),其后更换透稀液2次。用YM-10离心过滤装置离心分离PrPSc(5000G，30min，RT)。
C.血液处理:抽取仓鼠疑似病患血液,离心分离血浆,将血浆超声处理(1500W，5MIN)。将血浆与2XTRIS/SARCOCYL/SB-314等体积混匀，超速离心（15000G，1HR，4℃），弃取上清。将沉淀用5%SDS/PBS缓冲液溶解。
D.取上述组织匀浆或疑似病患尿液PrPSc样品或血液PrPSc样品,等分成2份(200微升/份),向其中一份中加入蛋白酶K(脑匀浆或血浆中为100μg/ml，尿液中为50μg/ml，30min，37℃)，然后加入苯甲基磺酰氟(即PMSF1mg/mL)终止消化反应，加热使蛋白变性(100℃，5min)，冷却后进行ELISA检测。
加样反应：
（1）每个样本检测孔中分别加入已处理的样品100μl，每个样本要做2个平行的检测孔，同时设置阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性、和空白对照各100μl在相应的孔内，用样品稀释液做空白对照。
（2）置37℃中孵育2h后，弃去孔内液体。每孔用200μl的洗涤液清洗，顺/反时针在实验台面上摇匀后弃去板孔内洗液，重复该步骤3次，每次5min。
加检测抗体：
（1）用样品稀释液将与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体稀释2μg/ml，制得检测抗体工作溶液，向包被有捕获抗体的ELISA板上的每孔加检测抗体工作溶液100μl。
（2）37℃孵育1.5h后，弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液清洗。
（3）每孔加入Streptavidin-HRP溶液100μl，37℃孵育1h后，弃去孔内液体。每孔用200μl的洗涤液清洗（步骤同上）。
显色反应
每孔加入100μl的底物液，在室温下避光显色15min后，加终止液100μl，混匀终止反应，立即用酶标仪检测490nm处的OD值。
结果判断
正常无病毒样品，经蛋白酶K消化后，朊蛋白（PRPC）检测OD值为0，与未经蛋白酶K消化的相同样品OD值百分比为0%。病患组织样品，经蛋白酶K消化后，PRPSC检测OD大于0%，判断为阳性。
验证实验2
如验证实验1所述的Westen-blot实验步骤，不同之处在于：0
按照实施例样品制备的方法，分别制备2份患病仓鼠脑组织匀浆，2份正常仓鼠血浆、2份患病仓鼠血浆，体积分别为30μl。
一份患病仓鼠的脑组织匀浆中加入适量的存储浓度为1mg/ml的蛋白酶K,使其工作浓度为100μg/ml，另一份患病仓鼠脑组织匀浆中加入等体积的三蒸水，37℃，消化1h；正常仓鼠血浆、患病仓鼠血浆均做相同处理。
消化结束后，每份样品中加入适量的存储浓度10mg/ml的苯甲基磺酰氟（PMSF），使其工作浓度为100μg/ml。然后每个样品中加入10μl的4×sample buffer（上样缓冲液体），煮沸5min后上样。
上样顺序：第1孔患病仓鼠脑组织匀浆，第2孔患病仓鼠脑组织匀浆蛋白酶消化后，第3孔分子量标准，第4孔正常仓鼠血浆，第5孔缓冲液空白孔,第6孔正常仓鼠血浆蛋白酶消化后，第7孔缓冲液空白孔,第8孔患病仓鼠血浆，第9孔缓冲液空白孔第10孔患病仓鼠血浆蛋白酶消化后，结果如图5所示。
由图5可知，正常样品中的PRPC经37℃、蛋白酶K((脑匀浆或血浆中为100μg/ml,尿液中为50μg/ml)处理1h，完全消化；而患病样品所含的PRPSC经37℃、蛋白酶K((脑匀浆或血浆中为100μg/ml，尿液中为50μg/ml)处理1h后，消化成三个肽段，与试验例2的结果相符。
Claims (2)
1.一种检测朊病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
包被有捕获抗体的ELISA板，
所述的捕获抗体为具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列结合反应的捕获抗体；
与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体，
所述与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体是具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列结合反应的检测抗体；
以及抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP、底物液和终止液；
所述的捕获抗体的抗体亚型为IgG2a，由两条相同的捕获抗体重链和两条相同的捕获抗体轻链构成，所述的捕获抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，捕获抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体亚型为IgG1，由两条相同的检测抗体重链和两条相同的检测抗体轻链构成，所述的检测抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，检测抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.权利要求1所述检测朊病毒的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）包被有捕获抗体的ELISA板的制备方法，步骤如下：
取ELISA孔板，每个孔用100μl 的5μg/ml捕获抗体溶液包被，4℃过夜后取出，置于室温下，静置30-60min，弃去孔内液体，用洗涤液清洗3-5次，每次5min；然后，用封闭液封闭，37℃ 温育2h后，弃去孔内液体，用清洗液清洗5min，置于4℃备用，制得包被有捕获抗体的ELISA板；
（2）与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体的制备方法，步骤如下：
向1ml浓度为10mg/ml的捕获抗体溶液中，加入2mg生物素，混匀，室温下静置30min，制得与朊病毒结合的藕联生物素标记的检测抗体；
（3）按现有技术配制抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、streptavidin-HRP溶液、底物液和终止液，然后包装后，即得检测朊病毒的试剂盒。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的封闭液采用如下方法配制：取2ml 兔血清溶于100ml的样品稀释液中，即得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210431979.9A CN102879577B (zh) | 2012-11-01 | 2012-11-01 | 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210431979.9A CN102879577B (zh) | 2012-11-01 | 2012-11-01 | 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102879577A CN102879577A (zh) | 2013-01-16 |
| CN102879577B true CN102879577B (zh) | 2014-04-09 |
Family
ID=47480976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210431979.9A Active CN102879577B (zh) | 2012-11-01 | 2012-11-01 | 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102879577B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021090910A1 (ja) * | 2019-11-08 | 2021-05-14 | セントラル硝子株式会社 | タンパク質凝集塊を検出する分子構造変質剤、その検出方法、医療器具用洗浄剤、土壌洗浄剤及び土壌の洗浄方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016728A1 (en) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | The Regents Of The University Of California | FORMATION AND USE OF PRION PROTEIN (PrP) COMPLEXES |
| CN101166976A (zh) * | 2005-01-13 | 2008-04-23 | 诺华疫苗和诊断公司 | 利用朊病毒特异性肽试剂的elisa试验 |
| US7452709B2 (en) * | 2001-01-31 | 2008-11-18 | Japan As Represented By President Of Tohoku University | Method of screening prion disease infection factor |
-
2012
- 2012-11-01 CN CN201210431979.9A patent/CN102879577B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016728A1 (en) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | The Regents Of The University Of California | FORMATION AND USE OF PRION PROTEIN (PrP) COMPLEXES |
| US7452709B2 (en) * | 2001-01-31 | 2008-11-18 | Japan As Represented By President Of Tohoku University | Method of screening prion disease infection factor |
| CN101166976A (zh) * | 2005-01-13 | 2008-04-23 | 诺华疫苗和诊断公司 | 利用朊病毒特异性肽试剂的elisa试验 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Guanidin hydrochloride extraction and detection of prion proteins in mouse and hamster prion diseases by ELISA;Shin-Chung Kang et al.;《Jorunal of Pathology》;20030203;第199卷(第4期);534-541 * |
| Shin-Chung Kang et al..Guanidin hydrochloride extraction and detection of prion proteins in mouse and hamster prion diseases by ELISA.《Jorunal of Pathology》.2003,第199卷(第4期),534-541. |
| 牛朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立;白雪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊》;20081015(第10期);第二章 牛朊蛋白多克隆抗体的制备及双夹心ELISA方法的建立 * |
| 白雪.牛朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立.《中国优秀硕士学位论文全文数据库电子期刊》.2008,(第10期),第二章 牛朊蛋白多克隆抗体的制备及双夹心ELISA方法的建立. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102879577A (zh) | 2013-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102747040B (zh) | 一种抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备与应用 | |
| CN101818129B (zh) | 一种分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体 | |
| CN101226196A (zh) | 一种检测ii型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 | |
| CN101294147B (zh) | 抗猪瘟病毒野毒株e2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN103173420A (zh) | 可分泌抗心肌肌钙蛋白i单抗的杂交瘤细胞及应用 | |
| CN101833005A (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa试剂盒及其用途 | |
| CN102863524A (zh) | 诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途 | |
| CN105384803A (zh) | 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用 | |
| CN101825633A (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa试剂盒及其用途 | |
| CN105954521A (zh) | 一种结核分枝杆菌感染诊断试剂盒 | |
| CN102236021A (zh) | 人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒 | |
| CN104004763A (zh) | 一种亲和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸适体及其应用 | |
| CN102879577B (zh) | 一种检测朊病毒的试剂盒及其制备方法 | |
| CN106526196B (zh) | Sr-a作为类风湿关节炎诊断标志物及干预靶点的应用 | |
| CN101551393B (zh) | 一种检测ⅳ型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 | |
| CN105237634B (zh) | 一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用 | |
| CN106404731A (zh) | 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法 | |
| CN101726593B (zh) | 一种检测登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒及其应用 | |
| CN103833830A (zh) | 柯萨奇病毒a16型的保守中和表位多肽及其用途 | |
| CN109613249A (zh) | 一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110161237A (zh) | 一种延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒 | |
| CN106749647A (zh) | 鲑鳟鱼ihnv单克隆抗体及检测试剂盒 | |
| CN101506654B (zh) | 一种鉴定分子模拟的方法及由此产生的应用 | |
| CN106011089A (zh) | 串联hcv多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用 | |
| CN106198974A (zh) | 一种快速检测虹鳟鱼血清中ihnv抗体的elisa检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200921 Address after: 271000 No.28, Zhengyangmen street, hi tech Zone, Tai'an City, Shandong Province Patentee after: Longyou (Taian) Medical Technology Co., Ltd Address before: 271500 Shandong Tai'an Shandong biomedical science and Technology Co., Ltd. Dongping Patentee before: ACHINA COMPANY OF BIOMEDICAL SCIENCE & TECHNOLOGY |