JP2004536296A - 欠陥折畳み蛋白質センサー方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
この発明は触媒構造的センサー方法および蛋白質・蛋白質粒子の検知への該方法の応用に関するものであり、特に欠陥折畳みまたは罹病蛋白質および蛋白質粒子の検知に関するものである。
【背景技術】
【0002】
本書はアメリカ特許出願第60/295,456号(2001年5月31日出願)に開示された主題の優先権を主張するものであり、該仮出願は完全にここに取り入れたものである。
【0003】
この発明は「折畳み病」などを引き起こす蛋白質またはペプチドの欠陥折畳みまたは異常構造を検知するものである。「折畳み病」は集合し易くて、ときには脳や他の組織中に毒性のプラークを形成する不安定化配座異性体を有した蛋白質を特徴とするものである。Bucciantini、M.他(2002)の「蛋白質欠陥折畳み病についての共通メカニズムを暗示する集合の本来的毒性」。Nature誌 416:507−511を参照。
【非特許文献1】
Bucciantini、M.他(2002)「Inherent Toxicity of Aggregates Implies a Common Mechanism for Protein Misfolding Diseases。Nature 416:507−511。
【0004】
これらの「折畳み病」は、病気症状が潜在性で時間と共に集合が緩慢にできて集合が進むと細繊維形成に至りときにはプラーク堆積が細胞生存能力を損ねるので、診断するのが困難である。
【0005】
そのようなペプチドの欠陥折畳みと集合形成はアルツハイマー病の鍵となる役割をするものと信じられており、アルツハイマー病にあってはβアミロイド蛋白質(またはAβ、39−42残留ペプチド)が配座異性体変化により細繊維堆積物を形成する。ハンチントン病にあっては、ハンチントンN―付着端(Htt)、抗アポプトティック(antiapoptotic)ニューロン蛋白質および非感染性癌中のポリグルタミン管の拡張により非溶解性の蛋白質集合が形成される。非感染性癌にあっては、伴腫瘍細胞表面NADHオキシダーゼ(tNOX)がプロテイナーゼRなどのプリン状特性、アミロイドフィラメント形成能力および正常なNOX蛋白質をtNOXに変更する能力を有している(tNOXに関する情報についてはKelker他のBiochemistry2001年版40:7351−7354参照)。
【0006】
しかしこの発明は折畳み病の蛋白質またはペプチドまたは感染性試料の検知のみに限定されるものではない。この発明はプリオンなどの蛋白質粒子の検知をも含むものである。プリオンは核酸を有さない小さな蛋白質粒子であり、しかしてほとんどの核酸改変処置やプロテアーゼに対して抵抗性である。正常なプリオン蛋白質(PrP)は細胞面メタログリロ(metalloglyro)蛋白質であって、図8に示すようにほとんどα―螺旋および環状構造であり、通常は神経およびリンパシステム中に現れる。その機能は酸化防止剤および細胞正常剤のそれである。
【0007】
しかしPrPの異常な形態は配座異性体であって、プロテアーゼに対して抵抗性を有しており、図9に示すようにその二次構造においてほとんどβシートである。二次構造におけるこの構造的な変化は集合およびプリオン病プロセスにおける偶発的神経毒性プラークの堆積に至るものと信じられている。
【0008】
異常プリオンは非感染性の粒子であって、クロイツフェルト−ヤコブ症、消耗病(CWD)、nvCJD、伝達性スポンジ形態脳病(TSE)、狂牛病(BSE)および羊や山羊におけるスクラピー神経病学的不調などのいくつかの病気の伝達において鍵となる役割を有している。1
【非特許文献2】
1 Clayton Thomas、「Tabor’s Cyclopedic Medical Dictionary」(Phil.、F. A. Davis Company、1989)、1485。
【0009】
プリオンに起因する病気は、活動が休止している場合には潜在性で、異常プリオンが明白だが病気が急性または慢性的に無症状感染である場合には無症状であるので、診断することが困難である。さらに非感染器官の脳中に存在する伴プリオン蛋白質の正常相同器官が検知を複雑にしている。2
【非特許文献3】
2 Ivan Roitt他、「Immunology」(Mosby−Year Book Europe Limited、1993)、15.1。
【0010】
蛋白質に伴うプリオンはPrP27−30、28kダルトン疎水性グリコプロテインと呼ばれており、ロッド状フィラメント中に合成(集合)され、そのプラークは感染脳中に見出される。正常蛋白質相同器官は、プロテアーゼに高抵抗性のプリオンとは反対に容易に急速劣化する点で、プリオンとは異なっている。
【0011】
プリオンは極度に少量の高感染性核酸を含有しており、従来の分析方法では検知不可能であると考える論者もいる。その結果プリオン関連感染の存在を検知する現在の方法の多くは脳における大形態変化と症状が明白になった後で適用される免疫化学技術に依存している。3
【非特許文献4】
3 Benjamin Lewin、「Genes IV」(Oxford Univ. Press、New York、1990)、108。
【0012】
多くの現在の検知方法は死んだ動物からの脳組織を用いた抗体基分析または親和性クロマトグラフィーに依存しており、ある場合には血液試料を使った毛細管免疫電気泳動にも依存している。以下に現在の検知方法を評価してみる。
【0013】
脳組織採取:抗体基分析または病気特定プリオン堆積を検知できる親和性クロマトグラフィーなどの免疫組織化学技術に加えて、脳の断面を使って脳におけるスポンジ形態の発現などの病状を示す大形態変化を審査・モニターする。これらの技術は診療的症状を呈示する動物の解体処理後の最終牛亜科スポンジ形態脳病(BSE)診断に使われる。組織採取の欠点は症状が発現し感染動物の必要な解体処理にのみ可能な遅延検知にあり、完成するには数日から数週間かかることになる。
【0014】
プリオンチェックはウエスタン法技術において新規な抗体と一緒に用いるために液化脳組織を必要とする。このテストは免疫化学技術と同じくらい信頼性があり、より迅速で6〜7時間で結果が得られる。しかし脳内におけるPrPS蓄積(大形態変化を起こす)と臨床症状の発現との間に6ヶ月の時間遅れがあるという欠点を有している。また動物を解体処理して試料を取得する必要がある。
【0015】
扁桃腺バイオプシー試料採取。非常に正確ではあるが、外科的な侵入を必要とし結果を得るのに数日から数週間必要とする。
【0016】
体液。血液および脳脊髄試料採取。上記の検知方法のように結果が即座に得られない。
【0017】
電子散布イオン化マス分光計(ESI−MS)、核磁気共鳴NMR、円偏光二色性(CD)および他の非増幅構造的技術。これらの技術はすべて多量の感染試料を必要とし、オフサイトテストまたは高設備コストを必要とする。
【0018】
以下に記載するのはヨーロッパ連合(EU)において現在受容され認められているプリオン検知テストの概観である。
【0019】
プリオン−スイス。このテストは単クローン性抗体(MABs)のウエスタン法を含んでおり7〜8時間中の死亡動物からの脳組織中のPrPを検知するものである。
【0020】
エンフェル(Enfer)科学−アイルランド。このテストは4時間下の死亡動物からの脊髄組織についてのELISA基テストを含んだものである。
【0021】
CEA−フランス。このテストは24時間下に死後採取された脳組織についての2個の単クローンを用いたサンドイッチ免疫分析を含むものである。
【0022】
EU委員会の評価プロトコルは敏感さ、特殊性および検知限界とタイターを有したものである。テストの敏感さは分析においてそのテストが陽性であった感染した基準動物の比率である。この要素を査定するには個々の動物からの300試料を以前は使用した。テストの特殊性は分析におけるテストが陰性であった非感染基準動物の比率である。この目的のためには従来個々の動物からの1000試料が用いられた。
【0023】
検知限界をテストすべく、陽性脳ホモジェネートの100〜10-5に亙る種々の希釈剤が使われた。図12にEUテスト結果の評価を示す表が示されている。しかし敏感さと特殊性が高くとも、これらのテストは死後に行われなければならなく、多量の高度に感染性の生物学的有害物質を用いて作業する必要があるという事実は残るのである。
【0024】
疾病制御センター(CDC)はプリオンを生物学的安全度2(ΒSL2)抑制危険グループ2剤と分類している。その結果上記した活動の多くはBSL2物理抑制でBSL3 labにより典型的な高い安全作業で行われている。新鮮な家庭用漂白剤、1モルNaOH、4モルグアニジン試薬または132℃で4.5時間オートクレーブ処理のフェノールでプリオンは不活性化できる。
【0025】
神経系退行性不調患者からの脳組織を含む処置は特別な危険を来すものであり、HIV+人間組織と同じ予防措置をもって臨むべきである。多量なそのような生物学的有害物質を扱う業務は大量のまたは流れ作業の試料の迅速で単純なテストの障害となっており、また少量の適用でも厄介なものとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0026】
比較的大量の生物学的有害物質を扱う作業および検知に数時間〜数週間掛かることに加えて、従来技術の方法は死後に行われるという追加的な難しさがある。かくして従来技術は顕著な問題に直面しており、上記したような努力は多とするものではあるものの、より洗練したものにする余地があり、ここにこの発明の目的が存するのである。
【課題を解決するための手段】
【0027】
この発明は、異常蛋白質粒子の低濃度レベルとテスト試料中に最初から存在する異常蛋白質粒子に結合したプローブの変態と増殖を誘発するペプチド片またはプローブとの間の相互作用、に基づいたものである。つまり好ましき実施例にあっては、テスト試料の感染レベルは低濃度からでも増殖され得るものである。
【0028】
この発明は触媒増殖を使って、伝染性のスポンジ形態脳病(TSE)のような特定の病気を伴った蛋白質中における構造的変化を開発するものである。触媒増殖は基本的には現存の蛋白質片の数を増加させて集合の形成を起因する。構造的に変化した蛋白質片の集合は普通の分析手法により容易に検知できる。
【0029】
この結果、この発明によれば迅速でコスト効果のよい分析手法を使って従来検知が困難であった小さな試料サイズでさえもテストをすることができ、しかも脳に限らず組織や体液にも広く適用できるのである。この発明の結果は手慣れた分析装置を使って容易かつ即座に解明することができる。加えて、この発明は弱い信号を増幅でき、体液などに伴う小さいまたは弱い試料に成功裡に適用できる。これにより上記したような分かりにくい病気についての組織と体液の分析への扉を開くのである。さらにこれにより方法は非侵襲的であり、死後に行う必要もなく、発症前に適用することができるのである。
【0030】
以上はこの発明を非常に広く記載したものである。しかしそのような広い概念においても従来技術で直面した諸問題を解決できるのである。この発明によれば非常に低レベルの感染剤を有する試料を使っての検知が可能となり全ての潜在的に感染性の蛋白質に対向してペプチドプローブを増幅するので、従来の生物学的有害物質取り扱いの関与が低減される。
【0031】
さらにこの発明の別の面での好ましき実施例を考えてみると、ペプチドプローブは所望の配列を検知するために設計されており、方法に組み込まれた適用可能なレベルの選択性と特殊性とを有している。またピレンなどの本来固有の光学フルオロをペプチドプローブ中に設計することにより、異常蛋白質粒子の光学的検知が可能となる。以下図面を参照してこの発明について更に詳しく説明する。
【好ましき実施例の説明】
【0032】
ここに使用する全ての用語は、特に定義しない限りは、当業者周知の意味を持つものである。また諸引用文献はこの発明の実施に参考となるものである。
【0033】
この発明は触媒増殖を利用する方法に基づいて異常蛋白質および蛋白質粒子を検知するものである。異常蛋白質または蛋白質粒子を含有する試料とこの発明のペプチドプローブとの相互作用により、ペプチドプローブは構造的変化を行って集合を形成する。異常蛋白質および蛋白質粒子の添加は集合の形成に触媒作用を及ぼして、構造的転移の増殖を促す。結果として得られる集合は普通の分析機器と手法を使って容易に検知できる。
【0034】
この発明が的としている異常蛋白質および蛋白質粒子は蛋白質、プリオンまたはペプチドなどの蛋白質サブユニットなどの蛋白質基化学構造体であって、構造変化を起こすことが可能で集合の形成に至り、最終的には病気症状に至るのである。
【0035】
これらの蛋白質および蛋白質粒子は単量体から多重結合体へと移行することにより集合を形成する。ある状態から他の異なる状態への移行は駆動力を必要とし、この駆動力は図7に示すように2通りの構造状態間のエネルギー差に見合うものである。
【0036】
そのような蛋白質粒子の好ましき例としてはプリオン蛋白質がある。プリオンは二次蛋白質構造を有することを特徴とする2個の異なる構造のひとつで存在できる。該構造とは優勢的なα−螺旋構造または優勢的なβシートである。優勢βシート構造は多重結合状態をより高く好むものである。その結果、優勢βシート(または豊β)二次構造は異常に折畳みされたまたは病気誘発蛋白質粒子により一般的なものとなる。なぜならそれらが集合を好むが故にインビボ(in vivo)環境では分裂し易いからである。
【0037】
図1はTSE配座異性体(またはそれに代わる二次構造)のα−螺旋単量体10とβシート二量体12形態を示すものである。研究によれば、プリオン蛋白質(PrPC)の正常なワイルドタイプ(wt)形態は単量状態をとり易く、異常・病気誘発形態(PrPSC)は多重結合状態をより容易にとるものである。4
【非特許文献5】
4 Fred E. Cohen他、「Pathologic Conformations of Prion Proteins(Annu. Rev. Biochem. 1998)」67:793−819。
【0038】
この発明においては、このプリオン蛋白質の正常形態の二次構造と異常形態および集合を誘発するその傾向との違いを利用して、非常に低レベルの感染性異常蛋白質を含んだ試料でさえも異常形態の検知を可能としたものである。
【0039】
この発明のメカニズムを図2に示す。最上行はβシート12を含んでいるものとして代表されたTSE蛋白質の未知試料の一例である。βシートは超音波処理などの公知の分解方法に掛けることにより分解される。これに続いてラベルペプチドプローブ14が添加されて、これが試料12と結合できる。
【0040】
試料12中にβシート構造が存在することにより、ペプチドプローブのβシート構造体16への移行が誘発される。かくしてβシートへの転移がペプチドプローブ14間で増殖されて新たな集合18が形成される。この結果としての優勢βシート形態への転移と増殖集合形成とが、光散乱や円偏光二色性(CD)などの一般的な分析方法を使って、容易に検知され得る。特にペプチドプローブが蛍光ラベルされている好ましき実施例では、蛍光検知機器も使用できる。
【0041】
図2に最下行は代わりの例を示すもので、TSE蛋白質の未知試料がその正常なα−螺旋形態10で示されている。整合のために試料は上記したと同じ分解プロセスに掛けられている。ラベルペプチドプローブ14の添加により、βシート形態への転移も未知試料への結合も起きないのである。この結果、ラベルペプチドプローブの場合には集合蛍光信号はなく、他の分析ツールによる集合形成の検知もないのである。この図式に基づいて、異常蛋白質構造体または配列の存在・不在について未知の試料がテストされ得るのである。
【0042】
この発明の好ましい実施例はつぎのような過程を含むものである。後の過程で未知またはテスト試料20に添加されるためにペプチドプローブ14が選択される。ペプチドプローブ14は蛋白質またはペプチド配列であって、優勢α−螺旋またはランダムコイルの二次構造を有することが望ましい。特に好ましい実施例にあっては、ペプチドプローブ14はリシンに見られるように螺旋−ループ−螺旋構造からなるペプチド片である。
【0043】
他の特に好ましい実施例においては、ペプチドプローブはワイルドタイプ(wt)TSEから、所望の種−特定TSEペプチド配列、または非安定化および非感染性化するように弱められた選択弱化TSE配列から選ばれたペプチド配列から作ることができる。加えてピレンなどのエクストリンシック蛍石をペプチドプローブに添加または指名して、一般の蛍光検知技術を使って予見された構造変化の検知を可能とすることもできる。
【0044】
ペプチドプローブ14が一旦選択されたら、テスト試料20に添加される。しかしペプチドプローブ14の添加前に試料20を超音波処理などの周知の技術で分解しておくのが望ましい。分解するといかなる潜在的に集合した試料20も崩壊して、分解済み試料22はより自由に新たに導入されたペプチドプローブ14と再結合して、予見された触媒的増殖を促進するのである。
【0045】
テスト試料20または分解済みテスト試料22はペプチドプローブ14と相互作用するようになった後。結果として得られた混合物は周知の分析手法に掛けられて集合の検知をするかまたは、蛍光ペプチドプローブ14が用いられた場合には蛍光測定に掛けられる。
【0046】
優勢なβシート構成物を含み異常に折畳みされたまたは病気誘発蛋白質を含んだ未知またはテスト試料20はβシート構成物の増加を招き、したがってテスト試料20とペプチドプローブ14とを含んだ最終混合物中の集合形成の増加を招く。反対に優勢なβシート二次構造を欠いた未知またはテスト試料20はβシート構造体16への転移を触媒することもなければ、集合18の形成を増殖することもない。
【0047】
初期の構造変化をテスト試料20中で引き起こす手段は下記の例に示すように変化させることができる点は評価すべきである。金属リガンドの結合は蛋白質土台中の変化を指向しかつ集合を好む。異なるペプチド配列の発現または分裂は増加集合を促進し、細繊維およびプラーク形成に至る。
【0048】
点突然変異は2種の異なる構造に求められる相対エネルギーレベルを変更し、構造転移における中間点移行を結果する。さらに濃度レベルの増加は構造転移を好むのに充分である。しかし初期の引き起こしメカニズムのいかんに拘わらず、プリオン関連病気などの多くの異常蛋白質構造における病気プロセスは常に異常構造の触媒増殖を含んでおり、以前の正常蛋白質の変化を来すのである。
【0049】
多くの一般的な蛋白質集合検知技術があり、その多くは光学的な測定に基づいている。限定されるものではないが、そのような光学的検知技術としては光散乱または疎水性検知があり、1−アニリノ−8−ナフタリンサルフォネート(ANS)またはコンゴレッドステイン、ペプチド片上の蛍光近接プローブなどのエクストリンシック螢石を用いており、単量体の構造変化またはα−β異質二量体のインターフェイスにおける結合などを通しての蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)および内在トリプトファン蛍光のクエンチングなども含んでいる。
【0050】
N−端末ループ領域はこの点で的とする蛋白質への選択的結合、実際の構造の円偏光二色性(CD)モニター、核磁気共鳴(NMR)に特に興味がある。他の検知技術としては平衡超遠心法または集合段階におけるサイズ排除クロマトグラフィーなどがある。
【0051】
該方法の説明は例えばFreifelder、Davidの「生物物理化学:生物化学と分子生物学への応用」(W.H.Freeman Press、New York 2巻 1982年)およびCopeland、Robertの「蛋白質についての分析的方法」(アメリカ化学協会ショートコース1994年)などの従来技術がある。これら列挙された光学的および構造的方法の多くは迅速であり、コスト効果があり、正確である。
【0052】
モデルシステムを用いていくつかの実験が行われ、優勢α―螺旋から豊β形態への転移に含まれる構造変化を示している。選ばれたモデルシステムは迅速に入手できるポリリシンおよびポリグルタミンなどの非神経毒ポリアミノ酸を用いていた。ポリアミノ酸は入手性の点から選ばれ、より大事なことには取り扱うのに安全で、特別の取扱いや保護衣などの必要がないからである。
【0053】
図3は、ペプチドプローブとしてポリ−L−リシン20マイクロモル(μM)52000分子量(MW)を用いた、実験の円偏光二色性のグラフである。このグラフはつぎの内容を示している。
【0054】
試料24はpH7、25℃に保たれ、ほぼ205nmにおいて最少ランダムコイル構造を示した。試料26はpH11、50℃に保たれ、ほぼ216nmにおいて最少βシート構造を示した。試料28はpH7、25℃とpH11、50℃に保たれた試料の1:1の組合せで、ほぼ216nmにおいて最少βシート構造を示した。試料30はpH7、50℃とpH11、50℃に保たれた試料の1:1組合せで、ほぼ216nmにおいて最少βシート構造を示した。
【0055】
図4に示すのはペプチドプローブとしてポリ−L−リシン70ミクロモル(μM)52000分子量(MW)を用いた実験の吸光度グラフである。結果は以下の通りである。
【0056】
pH11、25℃に保たれた試料32は安定状態においてほぼ0.12で優勢的なα―螺旋構造を示した。pH7、50℃に保たれた試料34は安定状態においてほぼ0.22でランダムコイル構造を示した。pH7、50℃とpH11、50℃に保たれた試料の10:1の組合せである試料36はほぼ0.22から0.33に急に傾斜して、ランダムコイルからβシート構造への促進された転移を示した。pH7、25℃とpH11、50℃に保たれた試料の10:1組合せである試料38はほぼ0.22から0.26に緩やかに傾斜して、ランダムコイルからβシート構造への転移を示した。
【0057】
図4に示すのは種々の温度とpHのポリ−L−リシンを用いた実験の円偏光二色性結果であって、変化する環境条件下でのランダムコイルからβシートへの転移の潜在性を示している。この結果は温度とpHとが転移において重要な役割を果たしていることを示している。
【0058】
上記したような全てのモデル実験の観察からして、ランダムコイル試料への比較的少量のβシートペプチドの添加が豊β構造への移行を招き、そのような変化が試料の温度およびpH環境に依存して促進されることを示している。
【0059】
図6に示すのは構造変化を経たα−螺旋束構造中の近接および遠隔場所における蛍光プローブとしてピレンを用いた実験結果である。ピレンエクシマー形成体42は480nmで示されており、優勢α―螺旋構造40についてのスペクトルが比較されている。またFITCなどの他の蛍光プローブも使用できる。
【0060】
この発明の主たる対象には構造変化の触媒増殖の利用も含まれており、異常プリオンの存在の測定と感染性レベルとを直接相関付けようとするものである。この理由からしてこの発明の実施に当たっては、増殖の結果として感染性製品の増加がないようにしたいのである。これを行うには、異常形態の感染、伝染および増殖の鎖の間のリンクに「破れ」を置くとよい。そのような「破れ」は集合の二量体と多量体形態間の転移段階において起きなければならない。
【0061】
多量体形態の物理的な形成は形成に至るステップを邪魔するだけで阻止できる。これには大きな付属プローブを用いるか中性「阻止体」片を用いるのが望ましいが、リンカーまたは「繋ぎ鎖」上のプローブは互いに遭遇し易く、したがって信号を増幅する結果となる。
【0062】
特に好ましい実施例においては、ペプチドプローブ14は上記したような機能を果たす。ペプチドプローブは「核」として作用し、ペプチドプローブ14が一旦テスト試料20または豊β構造12を持つと知られている試料に結合すると、ペプチドプローブ配座異性体16に変化し、これが他のペプチドプローブ14に結合する切っ掛けとして作用する容量を持ち、同じ構造変化を誘発する。
【0063】
この反応の増殖はペプチドプローブ14のために選ばれたペプチド配列および実験条件によって制御できる。感染レベルが低くテスト試料20中の存在異常蛋白質粒子を増幅する必要のある場合には、反応の迅速で連続的な増殖を行えるペプチドプローブ14が選ばれるのが望ましく、これによりテスト試料20を核にする。他方欠陥折畳み蛋白質粒子の検知と感染性レベルとを相関させることが望まれる場合には、選択されるペプチドプローブ14は集合し難いものが望ましい。
【0064】
1個を超えるβユニットが一緒の場合には、核として作用して二次構造の他の過渡的要素を引き付けて安定化する(Stryer、Lubertの「Biochemistry」、W.H.Freeman Press。(第3版、NY 1988年)p35参照。この反応の核となるペプチドプローブ14の選択に際しては、いくつかの考慮しなければならない点がある。ペプチドの会合はそれらが存在する溶液の熱力学、および無定形核の存在により制御できる。該無定形核は自己会合結晶性核であって、容易に集合する。集合する特定のペプチド配列は低濃度では集合せず、従来の手法では測定することが難しい。より大なるペプチド配列は既知のβシート構造または豊βプリオン蛋白質などの蛋白質に倣ってモデル化される。
【0065】
この発明のこの実施例を説明すべく、2種のペプチド配列が合成されてペプチドプローブ14として用いられた。このペプチド配列は図13に示す既知のプリオン蛋白質(PrP)配列に倣ってモデル化された。図13の配列は図示された種の間で非常に類似な結合領域に対応するものである。図14に2種の合成ペプチドのペプチド配列を示す。Seq.Id.No.19と呼ばれる19−マー配列は人間配列の残基104〜122に密接に倣ってモデル化される。Seq.Id.No.14と呼ばれる14−マー配列は人間PrP配列の残基109〜122に密接に倣ってモデル化される。合成ペプチドプローブ14も蛍光マーカーとしてピレンブチル酸を用いておよび用いずに用意された。
【0066】
合成ペプチドの性質を研究すべく、吸光度、種々の励起中の蛍光および励起蛍光などの技術において一般的な分析手法を用いて、多くの実験がなされた。1〜100ミクロモル(μM)の濃度および種々の緩衝液濃度、pH、温度およびイオン強度でペプチドが研究された。
【0067】
図15に示すのは異なるペプチド濃度における蛍光スペクトル結果である。該データは、24時間後に観察された実験的な変更なしに、1時間〜1週間の期間に亙って採取された。該グラフは次のことを示している。
【0068】
濃度5μMの試料46ではほぼ0.1で相対蛍光ピークを呈した。濃度10μMの試料48ではほぼ0.4で相対蛍光ピークを呈した。濃度150μMの試料50ではほぼ4.7で相対蛍光ピークを呈した。高濃度800μMの試料52についてもデータの採取は行われたが図示はしてない。
【0069】
図16は最初の走査のために強度378に標準化された試料46〜52についての蛍光スペクトルのグラフを示す。最高ペプチド濃度の試料52についてはスペクトルは顕著に異なることが観察され、最高ほぼ460nmでエクシマー放射があると結論される。
【0070】
図17はピレンの蛍光励起を示す実験結果を示すものである。実験は励起波長365nmで行われ、ほぼ460nmにおけるエクシマー放射を観察した。しかし348nmにおける励起は、他の変更または信号印加なしに、100倍ほど蛍光信号を増加する。398nmおよびほぼ460nm放射にピレン共役が関わりあることを確認すべく、398nmおよびほぼ460nmの蛍光についての励起スペクトルが記録されたものを図18に示す。両励起スペクトルともに365nm最高とほぼ等しく、ほぼ460nmにおける放射が以下の式のように2種のピレン基によるエクシマーの形成を伴うことが確認された。
【0071】
【数1】
【0072】
ここでPyrはピレン分子であり、Pyr*は励起形態のピレンである。(Pyr Pyr)*は励起二量体の形成を示す。エクシマーについてのより一般的な情報については、Freifelder、David.「Physical Biochemistry:生物化学および分子生物学への応用」(W.H.Freeman Press、New York、第2版 1982年)559を参照されたい。
【0073】
またペプチドの安定性を研究すべく実験が行われた。図19は種々の条件下における19−マーの円偏光二色性(CD)分析から取得された実験データを示す。ペプチド濃度20〜100mMの範囲に亙ってCDスペクトルが記録された。この結果によると、19−マーは大きくコイル状になっており、種々のpH、イオン強度および温度などの実験条件下で高い熱力学的安定性を呈した。
【0074】
予測されたように、アセトニトリルやトリフルオロエチレン(TFE)などの有機物の添加により二次構造の形成が促進される。図20に前の通りの結果および同様な実験の結果が示されている。該同様な実験においては、19−マーがそのより短い類似物、14−マー、と混合された。この実験では19−マーおよび14−マーは100:1で1時間に亙って組み合わされ、ミクロ分子範囲において希釈条件下で集合された。該混合物に対応する試料曲線60〜64は、オリゴマーの混合物が19−マーを代表する試料曲線52〜58のCDスペクトルとは顕著に異なることを、示しており、混合分子間の強い相互作用を示している。この結果、14−マーは19−マーからなるペプチドプローブ14中の構造変化を引き起こしている。
【0075】
Prusiner他による論文によれば、Seq.Id.No.19、19−マーはコイル状の構造を呈し、紙からの3mM濃度試料についてはSeq.Id.No.14、14マーは図21aに示すようにかなりβシートであることをCDデータは示している。しかし19−マーは、24時間に亙って行われた14−マーの極小片との相互作用により、図21bに示すようにそのコイル状構造からβシート構造に変態できる。Prusiner他によれば、プリオン蛋白質ペプチドはα−螺旋からβシートへの構造転移を誘発する。「Biochemistry」34:4186−92(1995年)。
【0076】
図22に、両合成ペプチド配列への種々の二次構造アルゴリズムの適用に基づいた、2種の合成ペプチド(C=コイル、H=螺旋)二次構造の概念的形状を示す。しかし結果された姿はCD結果と完全には一致しない。CD結果に基づいて、両合成ペプチドの構造は明らかに濃度に依存する。さらに、19−マーはかなりのコイル構造を呈し、該コイル構造はテストされた種々の実験条件下において非常に安定である。14−マーは濃度に応じてコイルまたはヘアピンからβシート構造への転移を呈する。
【0077】
19−マーが自己会合できる否かを決定すべく、さらなる実験が行われた。図23に示すのは蛍光結果のグラフであって、19−マーは試料曲線66に見られるように濃度の増加につれて自己会合することができ、試料曲線68に示すように充電をスクリーンする塩化カリウム(KCl)を用いると、pH変更を伴う低濃度では正味中性充電を与える。また前記したある種の核化剤の導入により19−マーは低濃度でも自己会合できる。したがって自己会合の条件は所望の検知に適合するべく最適化できる。
【0078】
同じ試料;図24にpH6〜9の0.1MのTRIS緩衝液を含む試料曲線66と100〜500mMのKCl存在のpH10〜11の0.1MのTRIS緩衝液を含む試料曲線68を示して、低濃度下におけるエクシマー形成の効率を反映する。378nm(IM)および460nm(IE)で測定された蛍光強度の比を選んで、25℃におけるペプチド濃度の関数としての自己会合をモニターした。静電的相互作用(pI=10)スクリーニングが極度の低濃度(10μM未満)でも自己会合を促進することが示された。
【0079】
19−マーの自己会合への核の効果をさらに研究すべく、少量の既自己会合19−マーユニットで核化した溶液中の19−マーについてもっと蛍光測定が行われた。試料溶液濃度は200〜800μMであり図25に示す。20μM希釈溶液中の会合の動力学もモニターされた。
【0080】
図26aに24時間後の水70、アセトニトリル72、TFE74中の19−マーの蛍光データを示す。図26bに24時間後の水76、アセトニトリル78、TFE80中の19−マーと14−マーとの100:1の組合せについての実験結果を示す。図26の両グラフにおいて、ほぼ460nmでのエクシマー放散の出現によりペプチド会合がモニターされた。
【0081】
図27a、b、c、dは24、48、144、336時間で採った蛍光データグラフを示す。19−マーモデルペプチドについて研究されたペプチド会合の動力学へのpH、温度、イオン強度、有機添加物の効果を定めるべく測定が行われた。単量ユニットについて378nmおよび会合について460nmで測定された蛍光強度がIE/IM比またはペプチドの自己会合特性化するのに用いられた。
【0082】
さらなる蛍光結果を図28に示す。ペプチドの非溶解性片が抽出され、メタノール/エタノール/ジメチルフォルムアニド含有有機溶媒中に溶解されて、分析された。「非溶解性」部分の蛍光検知結果は高レベルのペプチド会合を示しており、IE/IM比は2であった。「非溶解性」部分の小さなアリコートが核20μM19−マーペプチド溶液に添加・分析され、同じグラフに示されている。この結果からして、核化片の存在がペプチド会合の効率を顕著に増加させ、これが図28b中に150時間でより劇的に観察される。
【0083】
これらの実験観察から以下の結論に至る。実施例においてペプチドプローブ14に共有結合されたピレンの蛍光はこのモデルシステム中でのペプチド自己会合のモニターを可能とする。これはまた構造変化の指標としても使用できる。特に低濃度では非光学的手法ではペプチド会合が測定困難だからである。
【0084】
蛍光データからSeq.Id.No.19、19−マーの自己会合はpHまたはイオン強度を調整することにより促進されることが分かる。また構造変化の動力学は溶媒パラメータとペプチドプローブ配列を制御することにより加減できることも分かる。自己集合または集合過程は添加または既存核化集合形態により制御または調整できる。これにより強く結論付けられるのだが、19−マーの構造転移は自触反応的であり得るのである。
【0085】
特に好ましい実施例においては、ペプチドプローブ14を使ってプリオン状の構造であってコイルからβシートへの転移を呈する蛋白質粒子を検知できる。Prusiner他によれば、プリオンペプチドはα―螺旋からβシートへの構造転移を誘発する。「Biochemistry」34:4186−92(1995年)。この結果Seq.Id.No.19、19−マーなどの合成ペプチドプローブはこの構造移行を経たプリオン状物質の存在に構造的に敏感である。
【0086】
さらにピレンなどのイントリンシック光学的レポーターをペプチドプローブに添加できる。この実施例は、そうでなければ検知が困難である非常に低レベルの異常プリオン物質を一般に含有する血液、リンパ、CSF、脳ホモジェネート以外の組織などのテスト試料20中のそのようなプリオン状物質を検知できるという利点がある。イントリンシック光学的レポーターにより、異常プリオンなどの核化試料との相互作用により形成するペプチドプローブについて光学的な(蛍光)測定が可能となる。
【0087】
他の実施例においては、分枝状生物学的構造体の構造に基づいてペプチドプローブ14が合成される、この分枝状生物学的構造体は合成三次元高分枝状マクロ分子である。分子集合構造体プローブ15を用いる利点は多重折畳みである。分枝状生物学的構造体は分析動力学の速度を増して、より速いテスト結果を与える。これはこの発明を集約ラインに応用する時に特に有利であり、異常蛋白質粒子の存在について大量の製品または試料を迅速にテストすることができる。また検知結果に基づいて迅速な決定を行わなければならないときにも有利である。
【0088】
また分枝状生物学的構造体の高度に分枝した構造は異常蛋白質粒子または集合増殖を防止するので、この実施例は上記したような応用において有利である。そのような異常粒子の増殖を防止することにより、検知結果とテスト試料20中に存在する異常集合体のレベルとを相関づけることが非常に簡単になる。さらに合成プローブ自体が非神経毒性でありかつテスト試料20中に既存することのある高感染性粒子の増殖なしに信号を増幅するので、取り扱うのに安全である。したがって分析法の種々の段階において余分な注意や消毒の必要をなくするのである。分枝状生物学的構造体15の一般的な構造が図29に示されており、Seq.Id.No.20と命名されている。好ましき実施例においては、特殊な分枝状生物学的構造体が設計合成されており、これはSeq.Id.No.22と命名されて図30に示されている。
【0089】
図30において特定の分枝状生物学的構造体は図30aに示すように基本的にはループ−ターン−ループ構造である。図30bには、配列が図14に示す人間のPrP配列に倣って残基126〜104プラス109〜126においてモデル化されていること、が示されている。この構造は、右74の領域がPrP配列の反転した形態で、示している。これは疎水性ピレンを対応する疎水性領域に配置すべく、天然にループを形成する5種のアミノ酸を利用することにより行われる。
【0090】
またバリン−バリン片はβシート形成に必須であり、その故に配列に保たれている。図において緑は可能性のあるマウスの変異体を示している。アミロイドジェニック(amyloidogenic)・パリンドローム領域70はSSまたはSSS/AAAに変換できる。中央領域72は立体拘束のあるループ配列であって、立体的および蛍光的な配慮からトリプトファンを添加できるのである。
【0091】
分枝状生物学的構造体がβシート形成に必須なその分枝状ループ−ターン−ループ構造およびアミノ酸を保持しており、好ましくは光学的レポーターを含有しているならば、上に言及したように1以上の除去または挿入などのアミノ酸配列の変更が可能である。
【0092】
図10は、異常蛋白質またはプリオンテスト試料12の集合や生物学的有害物質や感染性の増加なしに、いかに分枝状生物学的構造体15が信号を増幅して、構造的変換を増殖するかを示している。図によれば、一旦分枝状生物学的構造体プローブ15が異常試料12と接触すると、分枝状生物学的構造体プローブ15が構造的な移行を経て、優勢βシート構造17となる。新たに形成された豊β分枝状生物学的構造体プローブ17は他の分枝状生物学的構造体プローブ15を核化して、同じ転移をさせる。そのようにして分枝状生物学的構造体プローブ15に随伴するいかなる光学的信号も、より多くのプローブ15が豊β状態17に移行するにつれて、増幅される。
【0093】
ピレンの検知可能な濃度が最少であっても作用できる種々のペプチドプローブ14濃度がいくつかあるが、それは観察されている蛍光集団の結果であるから、分析の検知限界はそれに左右されるものではない。換言すると、関心のある実際の測定と分析における速度制約ステップはペプチドプローブ14における配座異性体変換を引き起こすのに試料20中に必要な異常な例えばプリオン蛋白質の量である。免疫分析は一般に10-12モラー範囲において敏感である。にも拘わらず、単一のペプチドプローブ14中において一旦配座異性体の変化が引き起こされると、その豊β構造の触媒的増殖により検知するには低すぎる濃度の異常粒子12を有すると以前考えられていた試料中の検知が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【0094】
欠陥折畳み蛋白質、プリオン、集合および毒性プラーク形成に至る細繊維などの異常な蛋白質粒子を安全に、迅速にかつ非侵襲的に検知する能力の故に、この発明の方法は多くの産業に広範に応用できる。例えば動物健康、人間健康などの診療市場、食品産業、薬学分野、特に動物の副産物のスクリーニング、移植、輸血、ワクチン供給、TSEの化学療法、細菌戦病原菌のためのバイオセンサーの分野における国家安全保障などにおける研究開発がそれである。
【0095】
したがってこの発明の他の実施例にあっては、この発明の方法は図31に示すような簡単な検知機器の使用に応用されるのである。図31の装置は簡単な光学装置であって、青で示すランプやレーザーなどの光源80、グレーで示すT−フォーマット試料細胞82およびピンクで示す光電子増倍管84などを有している。応用によってはそのような簡単な装置を有した分析として方法を分布するのが望ましい。
【0096】
この発明は以上の開示に限定されるものではなく、種々の変更を導入することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1】伝染性スポンジ形態脳病の配座異性体(TSE)とラベル付きペプチドおよびラベル付き分枝状生物学的構造体を模型的に示す図である。
【図2】TSE蛋白質検知様式の模型的な図である。
【図3】円偏光二色性を用いたポリ−L−リシンテストペプチドにおける構造変化を示すグラフである。
【図4】異なる温度とpHとにおけるポリ−L−リシンテストペプチドの円偏光二色性結果を比較したグラフである。
【図5】異なる温度とpHとにおけるポリ−L−リシンテストペプチドの円偏光二色性結果を比較した表である。
【図6】構造変化を経過したα−螺旋束構造中の基部と端部についての蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)実験データのグラフである。
【図7】2個の間のエネルギー差を克服する駆動力のグラフである。
【図8】正常なPcP蛋白質、中枢神経およびリンパシステム中に発現しかつα−螺旋およびループ構造を特徴とする細胞表面金属グリコ蛋白質の構造図である。
【図9】優勢的なβ構造に移行してしばしばプラーク堆積に至る集合と神経毒性細繊維を形成し易いPcP蛋白質の構造図である。
【図10】信号の増幅とこの発明の分枝状生物学的構造体のテスト試料への添加による増加集合なしの構造的変化の増殖の模型図である。
【図11】現在の従来技術のプリオン診断市場に使われている蛋白質の構造図であって、左側の図11aはPrPsens蛋白質分子であり、右側の図11bはPrPres蛋白質分子である。
【図12】EU公認プリオン診断テストにおける現在の従来技術の評価の表である。
【図13】6個の異なるスペシー(species)間の選択されたPrP配列を示す比較である。
【図14】この発明の合成ペプチドプローブSeq.19およびSeq.14についてのペプチド配列を示す。
【図15】ペプチド濃度の効果を示す蛍光検知実験結果のグラフである。
【図16】ほぼ460ナノメーター(nm)におけるエクシマー放射を呈し易いペプチド濃度の効果を示す蛍光検知実験結果のグラフである。
【図17】蛍光のピレン励起を示す蛍光検知実験結果のグラフである。
【図18】398およびほぼ460nmにおける蛍光についてのピレン励起スペクトルを示す蛍光検知実験結果のグラフである。
【図19】濃度において20〜100ミリモル(mM)の範囲のいくつかのペプチドの変化する緩衝液条件下での円偏光二色性結果を比較するグラフである。
【図20】Seq.19およびSeq.14の合成ペプチドを含む種々のペプチドの変化する緩衝液条件下での円偏光二色性結果を比較したグラフである。
【図21】合成ペプチドの構造不安定性の実験結果を示す図であって、左側の図21aはより長いアナログ、Seq.19がコイル状に残っているβシート配座異性体を示し、右側の図21bはSeq.19へのSeq.14の添加がβシート形態への移行を開始させることを示している。
【図22】構造においてSeq.19とSeq.14が重複する比較の概念図である。
【図23】ペプチドが自己会合できることを示す実験結果のグラフである。
【図24】低濃度下でのエクシマー形成の効率を示す蛍光データのグラフである。
【図25】触媒的構造転移による自己会合への核の効果を示す蛍光実験結果のグラフである。
【図26】異なる比におけるSeq.19とSeq.14との相互作用を示す蛍光実験結果の2個のグラフであって、左側の図26aは1:1混合であり、右側の図26bは100:1混合の場合である。
【図27】自己会合への核の効果を示す蛍光実験結果の4個のグラフであって、図27a、b、c、dはそれぞれ24時間、48時間、144時間、336時間の場合の結果である。
【図28】触媒的構造転移による自己会合への核の効果を示す蛍光実験結果のグラフであって、左側の図28aは1時間、右側の図28bは150時間の場合である。
【図29】この発明の一般的分枝状生物学的構造体についてのペプチド配列を示す。
【図30】この発明の特定の分枝状生物学的構造体の好ましき実施例についてのペプチド配列を示す。
【図31】実験装置の概念図である。
【図32】この発明の好ましき実施例のシステム図である。
【符号の説明】
【0098】
10:α−螺旋単量体
12:βシート二量体
14:ペプチドプローブ
15:分枝状生物学的構造体
16:βシート構造体
18:集合
20:テスト試料
Claims (20)
- テスト試料を用意し、試料に増殖触媒を添加し、試料と触媒とを相互反応させて混合物を形成し、混合物中におけるβシート構成物の増加を観察することを特徴とする感染性構造変化蛋白質の発症前迅速検知方法。
- テスト試料を用意するに際して、テスト試料が採取される主体を身体的に損傷しないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- テスト試料の用意が非侵襲的であって、体液を引き出すが、組織また器官の生検を伴わないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 増殖触媒が蛋白質粒子との接触によりβシート構成物に向けて構造的に移行する処理剤であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 増殖触媒が光学検知可能ラベル付きペプチドであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ペプチドがSeq.Id.No.19のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 増殖触媒が分枝状生物学的構造体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 分枝状生物学的構造体がSeq.Id.No.20のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 分枝状生物学的構造体がSeq.Id.No.22のアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 蛋白質粒子が優勢的なβシート構造であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 蛋白質粒子がPrPSC粒子であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 選ばれた異常蛋白質粒子を含有するテスト試料への増殖触媒の添加が増殖触媒のβシート構成物を増加することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- PrPSCを含有するテスト試料への増殖触媒の添加が増殖触媒のβシート構成物を増加することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 増殖触媒が異常蛋白質粒子(PrPSC)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 実質的にPrPSCタイプのみの蛋白質粒子を含有するテスト試料への増殖触媒の添加が混合物のβシート構成物を増加することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- さらにテスト主体から採取されたテスト試料中の感染性構造変化蛋白質の検知に基づいて治療処置を必要とする主体を指名することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- テスト主体が人間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 取得と観察に際して、健康研究、薬学、食品産業および国家安全のためのバイオセンサーからなる群からの製品を受けてモニターすることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 観察するに際して、動物副産物、化学療法、移植、輸血およびワクチン供給からなる群からの製品をモニターすることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 光源とフローセル(訳注:液体または気体蒸気が出入り可能な細胞房室)と光電子増倍管とを有してなる感染性構造変化蛋白質の迅速発症前検知用装置を用いる方法。
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