KR20140059170A - 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 ｈｄｌ의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

역 콜레스테롤 수송을 지지하는 ｈｄｌ의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140059170A
KR20140059170A KR1020137031606A KR20137031606A KR20140059170A KR 20140059170 A KR20140059170 A KR 20140059170A KR 1020137031606 A KR1020137031606 A KR 1020137031606A KR 20137031606 A KR20137031606 A KR 20137031606A KR 20140059170 A KR20140059170 A KR 20140059170A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
spin
apoa
hdl
oxyl
lipoprotein
Prior art date
Application number
KR1020137031606A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 엔. 오다
Original Assignee
칠드런즈 하스피틀 앤드 리써치 센터 앳 오클랜드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 칠드런즈 하스피틀 앤드 리써치 센터 앳 오클랜드 filed Critical 칠드런즈 하스피틀 앤드 리써치 센터 앳 오클랜드
Publication of KR20140059170A publication Critical patent/KR20140059170A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/10—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using electron paramagnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/12—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using double resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/24—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance for measuring direction or magnitude of magnetic fields or magnetic flux
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/60—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using electron paramagnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/62—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using double resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

본 발명은 고밀도 지단백질 (HDL)-특이적 스핀 표지된 지단백질 프로브의 교환 측정 및 전자 상자성 (paramagnetic) 분광법에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 심혈관 질환의 위험이 있는 개체를 확인하는 방법, 심혈관 질환의 치료를 모니터링하는 방법, 및 심혈관 질환을 치료하기 위한 치료제의 개발을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 알츠하이머 질환의 위험이 있는 개체를 확인하는 방법, 알츠하이머 질환의 치료를 모니터링하는 방법, 및 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 개발을 위한 방법을 제공한다.

Description

역 콜레스테롤 수송을 지지하는 ＨＤＬ의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS TO ASSESS THE CAPACITY OF HDL TO SUPPORT REVERSE CHOLESTEROL TRANSPORT}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본원은 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2011년 12월 2일 출원된 미국 특허 가출원 61/566,581, 및 2011년 4월 29일 출원된 미국 특허 가출원 61/481,148을 기초로 한 우선권을 주장한다.
<발명의 분야>
본 발명은 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위해 전자 상자성 공명 (EPR) 분광법을 사용하는 분야에 관한 것이다. EPR 분광법은 개체에서 관상 동맥 질환의 위험을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
<연방 지원 연구 또는 개발에 대한 언급>
본 발명은 부분적으로는 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 승인 번호 2 RO1 HL077268-05에 의해 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
인간 [1-5] 및 유전적으로 변형된 뮤린 모델 시스템 [6-9] 둘 모두에서의 연구는 혈장 고밀도 지단백질 콜레스테롤 (HDL-C)과 미국에서 주요 사망 원인인 관상 동맥 질환 (CAD) 사이의 강력한 연관성을 입증하였다. 집단 연구는 HDL-C 수준이 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C)의 수준보다 CAD에 대한 보다 강력한 독립적인 위험 인자임을 일관되게 입증하였다 [1]. 혈장 HDL-C의 수준은 종단적 집단 연구에서 CAD와 분명하게 연관되지만, HDL-C의 수준은 개체를 기준으로 할 때 CAD에 대한 환자 소인의 양호한 예측 인자가 아니다. 또한, 프래밍엄 폽스프링 (Framingham Offspring) 연구 및 MESA 연구 둘 모두는 거의 40%의 CAD 환자가 정상적인 또는 상승된 HDL-C 수준을 갖는다는 것을 보여주었다 [10, 11]. 유사하게, IDEAL 시험에서, 가장 높은 위험 추정치는 HDL-C 수준이 70 mg/dL을 초과하는 환자에서 관찰되었다 [12, 13]. 이들 연구는 비정상적으로 높은 HDL-C 및/또는 CAD을 야기할 수 있는 고밀도 지단백질 (HDL)의 기능장애성 풀 (pool)이 존재할 수 있음을 제시한다. HDL-C 측정치를 결정하기 위한 현재의 방법이 건강한 및 기능장애성 HDL 입자를 포함한다는 깨달음은 CAD에 대한 진단 및 예후 마커로서 HDL-C의 유효성에 의문을 제기한다. 따라서, 현재 결정되는 바와 같이 HDL-C 수준 단독은 개체의 수준에서 CAD 위험에 대한 정확한 예후 또는 CAD에 대한 치료를 생성하기에 필요한 모든 정보를 제공하지는 못한다.
건강한 HDL이 CAD를 억제한다고 생각되는 1차 수단은 역 콜레스테롤 수송 (RCT)을 통한 것이다 (도 1). 1970년대에, 로스 (Ross) 및 글롬세트 (Glomset)는 RCT를 통한 콜레스테롤 이동이 아테롬성동맥경화증의 발병 억제에 중요하다고 가정하였다 [14]. 그로부터 얼마 후에, HDL은 RCT의 1차 매개체로서 확인되었고, 항-아테롬성 동맥경화성 지질 복합체로서 제안되었고 [15], 여기서 아테롬성 동맥경화성 보호는 대식세포를 LDL-유도된 세포자멸로부터 보호하고 내피 기능을 보존함으로써 부여된다 [16-19]. RCT를 통해, HDL은 CAD의 기초를 이루는 주요 병리학적 상태인, 아테롬성 동맥경화성 플라크를 함유하는 괴사 코어의 형성을 개시하고 진행시키는 거품 (foam) 세포의 생성 및 축적을 방지한다.
연령, 당뇨병 상태, 고혈압, 및 비만과 같은 인자에 의해 혼동되지만, 만성 염증의 지표 (C-반응성 단백질, 피브리노겐, 백혈구 수치, 및 혈소판 활성화 인자 아세틸 히드롤라제)는 CAD의 위험 증가와 유의하게 연관된다 [20-23]. 만성 염증은 주로 동맥 내막 (intima) 내의 산화 효소 미엘로퍼옥시다제 (MPO)의 생산에 의해 산화적 환경을 생성할 수 있는 대식세포의 활성화를 수반한다 [24-26]. 내막 내의 산화적 환경의 생성은 HDL의 산화적 변형을 야기하고 [27], 여기서 HDL의 주요 단백질 성분인 아포지단백질 A-I (apoA-I)은 MPO에 의한 HDL에 대한 산화의 1차 표적이다 [28, 29]. apoA-I의 MPO-유도 산화적 변형은 ABCA1을 통한 콜레스테롤 이동을 손상시켰고 [28, 30-32], 이것은 CAD에서 만성 염증의 하나의 결과는 그의 콜레스테롤 유출 능력이 손상된 기능장애성 HDL을 생성시키는 것이라는 결론을 지지한다.
흥미롭게도, 레디어 (Rader) 및 로쓰블라트 (Rothblat) 박사의 실험실은 최근에 배양된 대식세포로부터 스테롤 유출을 촉진하는 인간 혈장 HDL의 능력이 HDL-C 및 apoA-I의 유사한 수준에도 불구하고 개별 대상체 사이에서 유의하게 상이함을 입증하였다 [33]. 또한, 이들은 혈장 HDL의 스테롤 유출 능력이 HDL-C와 무관하게 CAD 상태와 강하게 연관된다고 결정하였다 [34]. 상기 HDL 기능의 계량은 HDL-C (0.85; 95% CI)보다 더 큰 역의 상관관계의 교차비 (odds ratio) (0.75; 95% CI)를 보였고, 각각 p<0.002 대 p<0.09로 HDL-C보다 CAD의 보다 정확한 예측 인자로 보인다. 유망하지만, 인간 혈장의 HDL 스테롤 유출 능력의 측정은 배양된 세포를 사용하는 힘들고 비용이 많이 드는 과정이다. 상기 방식은 유용한 정보를 제공할 수 있지만, 이것은 반드시 큰 샘플 수 또는 효율적인 처리를 위해 쉽게 규모가 확대될 수 있는 것은 아니다.
RCT를 통한 HDL의 수송 동안, 이것은 그의 지질 및 단백질 함량의 변화에 의한 일련의 재형성 (remodeling) 사건 (예를 들어 apoA 결합/대체)을 겪는다. 각각의 HDL 하위클래스는 특유한 안정성, 콜레스테롤 유출 능력, 및 효소 및 수용체 친화도 특성을 갖는다 [35-37]. 상기 하위클래스 변화를 통해, apoA-I은 상당한 입체형태적 적응을 거치고, 이러한 적응성은 ABCA1 매개된 콜레스테롤 유출에 필수적이다. 연구는 apoA-I의 MPO-매개 산화가 상기 과정을 손상시키면서, ABCA1을 통한 콜레스테롤 이동을 매개하는 HDL의 능력에 영향을 줌을 보여주었다 [28, 30]. 최근에, apoA-I 결합/대체의 HDL 비율에 대한 MPO 산화의 효과를 측정하는 형광-기반 검정이 개발되었다 [38]. 이 방법은 콜레스테롤을 유출하는 HDL의 능력에 대한 산화 사건의 효과를 평가할 때 유용한 정보를 제공하는 것으로 밝혀졌지만, 생물학적 샘플에서 HDL의 유출 능력의 평가시에 사용이 제한된다. 불운하게도, 혈장을 포함하는 복잡한 생물학적 유체의 고유한 형광 때문에, 상기 형광 방법은 임상적으로 관련된 샘플, 예컨대 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 인간 시험관내 혈액 샘플에 직접 적용될 수 없다.
필요한 것은 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위한 감도가 우수한 검정이다. 그러한 검정은 CAD, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환 및 졸중을 포함하는 심혈관 질환의 위험 결정; CAD, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환 및 졸중을 포함하는 심혈관 질환의 치료의 진행 모니터링; CAD, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환 및 졸중을 포함하는 심혈관 질환의 치료제 개발에 유용할 수 있다.
특허 출원 및 공개를 포함하는 모든 참고문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 샘플 (예를 들어 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 스펙트럼을 양성 대조군 및/또는 음성 대조군과 비교함으로써 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 음성 대조군은 지질-미함유 또는 지질-소량함유 (lipid-poor) 환경에서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이다. 몇몇 실시양태에서, 양성 대조군은 디미리스토일포스파티딜 콜린에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송은 콜레스테롤 유출 잠재력이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭이 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼에 비해 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 차이는 HDL에 대한 지단백질의 결합의 차이를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 증가는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 증가는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 감소는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 감소는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 변화는 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합시에 변하지 않는 가까운 피크 및/또는 먼 피크의 진폭에 관하여 측정된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼의 프로파일의 변화는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 중앙 피크의 이동은 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타낸다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 샘플은 체액; 예를 들어, 혈액 또는 뇌척수액 (CSF)이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 스핀 표지된 지단백질 프로브의 첨가 전에 1회 또는 2회 냉동 및 해동되었다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 비-인간 포유동물 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, CSF는 비-인간 포유동물 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, CSF는 인간 포유동물 CSF 샘플이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 단일 부위에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 제1 스핀 표지 및 제2 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제1 스핀 표지는 지단백질 상의 제1 단일 부위에 위치하고, 제2 스핀 표지는 지단백질 상의 제2 단일 부위에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 다른 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 98, 111 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이고, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가는 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이고, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가는 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다.
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 통상적인 아미노산 합성에 의해 단백질에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 아미노산 잔기는 시험관내 발현 시스템 또는 생체내 발현 시스템을 사용하여 폴리펩티드 내에 도입된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-II 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질은 apoE3 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체 (mimetic)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실(PROXYL); 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 (perdeuterated) 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 모이어티 (moiety)를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 (spacer) 모이어티를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서 모이어티는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다.
본 발명은 샘플 (예를 들어 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플)에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 최종 농도로 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.3 mg/ml의 최종 농도로 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.8 mg/ml의 최종 농도로 첨가된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 하나 이상의 시점에서 수집된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 시험관내 혈액 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 하나 이상의 시점에서 수집된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 시험관내 혈액 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 1.5분, 4분, 6분, 8분, 10분, 30분 또는 60분 중의 하나 이상의 시간에서 모니터링된다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 평형에 도달하기 위한 10분 이상의 시간은 HDL이 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력을 갖는다는 것을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 시험관내 혈액 샘플의 평형에 도달하기 위한 시간보다 적어도 2배 더 긴, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 평형에 도달하기 위한 시간은 감소된 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 평가는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 정의 결정이다. 몇몇 실시양태에서, 초기의 결합 속도의 기울기는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL에 대한 친화도의 결정이다. 몇몇 실시양태에서, 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합에 비해 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL에 대한 80% 이하의 결합 평형도는 감소된 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합에 비해 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL에 대한 80% 이하의 결합 정도는 감소된 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타낸다.
본 발명은 샘플 (예를 들어 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플)에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력은 HDL의 전이 온도의 결정에 의해 평가되고, 25℃ 이상의 HDL의 전이 온도는 역 콜레스테롤 수송 능력의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 0℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수집된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 37℃에서 수집된 후, 20℃ 및/또는 0℃에서 수집된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 0℃에서 수집된 후, 20℃ 및/또는 37℃에서 수집된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 4℃에서 수집된 후, 37℃에서 수집된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 시험관내 혈액 샘플은 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 제1 개체에서 심혈관 질환의 발생 위험을 결정하는 방법을 제공하고; 이 방법은 a) 임의의 상기 실시양태에 따라 제1 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 단계 a)의 역 콜레스테롤 수송 능력을 심혈관 질환의 분명한 위험이 없는 하나 이상의 제2 개체로부터의 혈액 샘플의 역 수송 능력과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 제2 개체에 비해 제1 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력의 감소는 심혈관 질환의 증가된 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 제1 및 제2 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 제1 개체는 당뇨병이 있고/있거나 비만이다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 제2 개체의 스펙트럼은 과거 (historical) 스펙트럼이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환의 치료를 받고 있는 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 모니터링하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 임의의 하나의 상기 실시양태에 따라 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 방법은 b) 요법을 개체에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 개체로부터의 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 요법을 개체에게 시행하기 전에 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 임의의 상기 실시양태에 따라 시험 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 시험 동물은 요법이 적용된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물은 요법을 시험 동물에게 시행함으로써 요법에 적용되었다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 b) 요법을 시험 동물에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 임의의 상기 실시양태에 따라 시험 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 치료제는 개체로부터 제거된 후 분석 전에 혈액 샘플에 첨가되었다. 몇몇 실시양태에서, 시험 치료제는 다수의 혈액 샘플에 상이한 농도로 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 혈액은 비제한적인 예를 들어 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 또는 10 min 초과 동안 시험 치료제와 함께 인큐베이팅된다. 상기 실시양태의 추가의 실시양태에서, 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 상기 실시양태에 따라 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하고, b) 요법을 시험 동물에게 시행하고, c) 요법을 시험 동물에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 및 돼지로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고밀도 지단백질 (HDL)에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 시험관내 혈액 샘플에서 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 스핀 표지 및 지단백질을 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 시험관내 혈액 샘플에서 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 지단백질은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송은 콜레스테롤 유출 잠재력이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가되기 위해 제제화되고 EPR에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가되기 위해 제제화되고 EPR에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 전혈 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, 개체에서 알츠하이머 (Alzheimer) 질환에 대한 요법의 과정을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 개체로부터의 뇌척수액에 첨가되기 위해 제제화되고 EPR에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 뇌척수액과 함께 사용하기 위해 제제화된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 생물학적 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 혈장 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 혈청 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 첨가 전에 적어도 1회 또는 2회 냉동 및 해동된 시험관내 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 포유동물 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 인간 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 CSF 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 합성 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 측면에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 키트에 용기 내로 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 튜브, 플랫셀 튜브 (flatcell tube) 또는 모세관이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 키트에 건조 분말로서 제공된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 추가로 사용 지침서를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 또는 그의 단편을 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 98, 111 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질 또는 그의 단편은 apoE3 지단백질 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 스핀 표지된 지단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 최종 농도로 첨가되도록 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.3 mg/ml의 최종 농도로 첨가되도록 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.8 mg/ml 초과의 최종 농도로 첨가되도록 제제화된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 측면의 키트는 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 시린지 (syringe)를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 apoA-II 지단백질은 스핀 표지를 포함하고, apoA-II 지단백질 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖고 스핀 표지를 포함하는 apoA-I 모방체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지를 포함하는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 또는 (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 98, 111 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 1회 또는 2회 냉동 및 해동되었다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 비-인간 포유동물 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 뇌척수액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 1회 또는 2회 냉동 및 해동되었다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 뇌척수액 샘플은 비-인간 포유동물 뇌척수액 샘플 (예를 들어, 래트, 마우스, 비-인간 영장류)이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 뇌척수액 샘플은 인간 뇌척수액 샘플이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 측면에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 98, 111 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질 또는 그의 단편은 apoE3 지단백질 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다.
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL3에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL3에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험 스트립을 포함하는, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서 시험 스트립은 스핀 표지된 지단백질 프로브 및 고체 지지체를 포함하고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송은 유체의 콜레스테롤 유출 잠재력이다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플로부터 선택되는 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 포유동물 혈액 샘플이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물 샘플은 인간 혈액 샘플이다.
몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 스핀 표지된 지단백질을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다. 추가의 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243에 위치한 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합한다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질 또는 그의 단편은 apoE3 지단백질 또는 그의 단편이다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 apoA-I 모방체를 포함하는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 apoA-I 모방체는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
임의의 상기 실시양태의 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 추가의 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질은 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 스페이서는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브 및 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 고체 지지체는 낮은 상자성 (paramagnetic) 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 공유, 이온, 소수성 상호작용, 또는 정전기적 상호작용에 의해 흡착성 물질에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 흡착성 물질은 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스이다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 소수성 상호작용에 의해 시험 스트립에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질 내에 포획된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체 또는 흡착성 물질 상에서 건조된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 제공하고, 여기서 시험 스트립은 스핀 표지된 참조 프로브를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 참조 프로브는 HDL의 존재에 의해 영향받지 않는 스핀-프로브이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 참조 프로브는 테트라메틸피페리딘 (템포 (TEMPO); 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 템폴 (TEMPOL) (4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 타민 (TAMINE) (4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), BZONO (4-(벤조일옥시)-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), SLPEO (폴리(에틸렌 옥시드)-2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-옥실), 및 테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ; (2,5-시클로헥사디엔-1,4-디일리덴)디말로노니트릴, 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄)으로부터 선택된다.
상기 실시양태의 몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 한 종류 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 상기 실시양태의 몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 치료제 또는 치료제 후보를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 치료제 또는 치료제 후보는 CETP 억제제이다. 몇몇 실시양태에서, 치료제 또는 치료제 후보는 토르세트라피브, 아나세트라피브, 달세트라피브 또는 에바세트라피브이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 포함하는, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 시험관내 혈액 샘플에서 EPR에 의해 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 포함하는, 콜레스테롤 유출 잠재력을 조정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체, 스핀 표지된 지단백질 프로브, 및 치료제를 포함하는 시험 스트립을 포함하는, 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체, 스핀 표지된 지단백질 프로브, 및 치료제를 포함하는 시험 스트립을 포함하는, 개체에서 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체 상에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 추가의 시험 스트립을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 시험 스트립은 상이한 양의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립과 별개의 용기에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 튜브, 플랫셀 튜브 또는 모세관이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 건조 분말로서 제공된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트는 스핀 표지 참조 프로브를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지 참조 프로브는 고체 지지체 상에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지 참조 프로브는 시험 스트립과 별개의 용기에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지 참조 프로브는 건조 분말로서 제공된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송은 유체의 콜레스테롤 유출 잠재력이다. 몇몇 실시양태에서, 키트의 시험 스트립은 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플로부터 선택되는 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 포유동물 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 샘플은 인간 혈액 샘플이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 apoA-I 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243에 위치한 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질 또는 그의 단편은 apoE3 지단백질 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질은 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다. 몇몇 실시양태에서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 낮은 상자성 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 공유, 이온, 소수성 상호작용, 또는 정전기적 (전하) 상호작용 또는 이들의 조합에 의해 고체 지지체에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 흡착성 물질은 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스이다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 소수성 상호작용에 의해 시험 스트립에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질 내에 포획된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체 또는 흡착성 물질 상에서 건조된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트의 시험 스트립은 스핀 표지된 참조 프로브를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 스핀 표지된 참조 프로브는 HDL의 존재에 의해 영향받지 않는 스핀-프로브이다. 몇몇 측면에서, 스핀 표지된 참조 프로브는 테트라메틸피페리딘 (템포; 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 템폴 (4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 타민 (4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), BZONO (4-(벤조일옥시)-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), SLPEO (폴리(에틸렌 옥시드)-2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-옥실), 및 테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ; (2,5-시클로헥사디엔-1,4-디일리덴)디말로노니트릴, 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄)으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 키트는 한 종류 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 치료제 또는 치료제 후보를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료제 또는 치료제 후보는 CETP 억제제이다. 몇몇 실시양태에서, 치료제 또는 치료제 후보는 토르세트라피브, 아나세트라피브, 달세트라피브 또는 에바세트라피브이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 키트는 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 사용 지침서를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낸다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖고, b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 요법을 받고 있는 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 치료 효능을 최적화하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 요법 시행 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 개체가 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 요법에 반응하여 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가가 나타나면 계속될 것이다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 요법에 대한 반응에 의한 콜레스테롤 유출 잠재력의 변화로 인해 조정된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 요법을 받고 있는 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 치료 효능을 최적화하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 요법 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 개체가 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 요법에 반응하여 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가가 나타나면 계속될 것이다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 요법에 대한 반응에 의한 콜레스테롤 유출 잠재력의 변화로 인해 조정된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 알츠하이머 질환을 갖고 있을 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 CSF 샘플이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 알츠하이머 질환을 갖고 있을 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 CSF 샘플이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체의 콜레스테롤 유출 능력의 조정을 위한 후보 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 낮은 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 샘플을 후보 치료제와 접촉시키고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 치료제가 콜레스테롤 유출 능력의 조정에 유용할 수 있음을 나타낸다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체의 콜레스테롤 유출 능력의 조정을 위한 후보 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 낮은 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험관내 샘플을 후보 치료제와 접촉시키고, c) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고; d) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 치료제가 콜레스테롤 유출 능력의 조정에 유용할 수 있음을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a), b) 및 c)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 콜레스테롤 유출 잠재력의 행동 조절제를 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 행동 조절을 받고 있는 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 행동 조절 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 행동 조절이 콜레스테롤 유출 능력에 유익함을 제공한다는 것을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 행동은 식습관, 운동 또는 흡연이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 콜레스테롤 유출 잠재력의 행동 조절제를 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 행동 조절을 받고 있는 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것이고, b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되고, c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 행동 조절 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 행동 조절이 콜레스테롤 유출 능력에 유익함을 제공한다는 것을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 단계 a) 및 b)는 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 행동은 식습관, 운동 또는 흡연이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 포유동물 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 샘플은 인간 혈액 샘플이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 시험관내 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 하나 이상의 시점에서 수집된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 시험관내 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 1.5분, 4분, 6분, 8분, 10분, 30분, 60분 중의 하나 이상의 시간에서 모니터링된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 0℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수집된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243에 위치하는 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 44의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 64의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 98의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 101의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 167의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 226의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시양태에서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 가진다. 몇몇 실시양태에서, apoE 지단백질 또는 그의 단편은 apoE3 지단백질 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질은 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스페이서는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄이다. 몇몇 실시양태에서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 낮은 상자성 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질이다. 몇몇 실시양태에서, 흡착성 물질은 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스이다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 고체 지지체는 흡착성 물질을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 흡착성 물질 내에 포획된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 고체 지지체 또는 흡착성 물질 상에서 건조된다.
상기 측면의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 샘플은 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다.
도 1은 역 콜레스테롤 수송 경로를 보여준다.
도 2는 내막 내의 역 콜레스테롤 수송을 보여준다. 콜레스테롤 적재 (laden) 대식세포로부터 콜레스테롤 유출을 용이하게 하기 위해, 지질-소량함유/지질 미함유 apoA-I은 ABCA1에 결합한다. ABCA1에 대한 결합 동안, apoA-I은 유리 콜레스테롤 (FC) 및 인지질 (PL)을 획득하여 원반상 (discoidal) 프리β HDL을 형성한다. 이들 입자는 LCAT의 작용에 의해 콜레스테롤 에스테르 코어 함유 알파 HDL로 전환된다. ApoA-I은 인지질 전달 단백질 (PLTP), 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP), 지단백질 리파제 (LPL) 및 간 리파제 (HL)의 작용(들)에 의해 알파 HDL로부터 방출된다 (문헌 [Curtiss et al., 2006]으로부터 변형됨).
도 3은 EPR 스펙트럼에 반영되는 바와 같이 EPR 스핀 커플링에 대한 거리 효과를 보여준다.
도 4는 폴리펩티드의 구조적 특징을 확인하기 위한 스캐닝 EPR을 보여준다. 스핀 표지는 단백질 내의 단일 부위의 수치에 위치하였다. EPR 스펙트럼의 차이는 단백질의 구조적 특징을 반영한다 (본원에 참고로 포함된 문헌 [Lagerstedt, JO (2007) J. Biol Chem 282:9143-9149]으로부터 변형됨).
도 5는 EPR 스펙트럼의 샘플링 및 이들이 제시하는 각각의 구조적 요소 (삽입 도면)를 보여준다. 각각의 구조적 요소의 선 형태는 메탄티오술포네이트 (MTS) 스핀 표지의 이동성을 나타낸다. MTS 스핀 표지는 보다 규칙적인 구조로 속박되기 때문에, 스핀 표지의 이동성은 특징적인 방식으로 제한된다. 이 결과는 근역 (near-field) 및 원역 (far-field) 피크의 폭 확대 및 평탄화를 동반하는, 피크 대 피크 대칭의 독특한 상실이다.
도 6a는 스핀 표지 용매 접근성 (accessibility)이 2차 구조를 확인하는 방식을 보여주는 개략도이다.
도 6b는 스핀 표지 용매 접근성이 알파 나선 및 베타 시트 (sheet)를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 보여주는 개략도이다.
도 6c는 스핀 표지의 용매 접근성이 단백질의 구조적 특징을 보여주기 위해 사용될 수 있음을 보여주는 그래프이다. 스핀 표지 apoA-I 분자의 라이브러리는 단백질의 서열 전체에 걸쳐 단일 아미노산 위치에 위치하게 함으로써 제조하였다.
도 7은 지질에 결합되거나 지질-미함유 환경에서 부위-특이적으로 위치하는 스핀 표지를 갖는 apoA-I 단백질의 EPR 스펙트럼을 보여준다.
도 8은 혈장 내의 HDL의 EPR 분석을 보여준다. 스핀 표지된 apoA-I은 4명의 환자의 혈장에 0.3 mg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. EPR 스펙트럼은 1.5, 4, 6, 8, 및 10분에 수집하였다 (패널 A). 지질-미함유 apoA-I의 스펙트럼은 청색에서 제시된다. 지질-결합된 apoA-I 참조 샘플의 중앙 필드 진폭은 녹색 막대로 제시된다. 기준틀로서, 녹색 막대의 길이는 모든 패널 (panel)에서 동일하다. 데이타는 그래프 형태로 제시되고 (패널 B), 여기서 샘플 중앙 필드 피크 진폭 대 지질 결합된 참조 중앙 필드 진폭의 비 (녹색 막대, 패널 A)를 시간에 대해 플로팅하였다.
도 9는 apoA-I 교환의 EPR-기반 분석을 보여준다. 교환을 위한 2개의 시나리오가 조사될 것이다: A) 대체, 또는 apoA-I이 rHDL 입자를 이탈하는 척도, 여기서 rHDL은 스핀 표지된 (도트) apoA-I을 보유함 (위치 K133에서). B) apoA-I의 rHDL에 대한 부가, 여기서 지질-미함유 apoA-I은 스핀 표지됨 (위치 G217에서). 이들 2가지 시나리오를 검사함으로써, 대체 및 삽입의 상대적인 비율이 결정된다.
도 10은 지질-미함유 환경에서 지질에 결합된 apoA-I을 보여주는 모델이다. FRET는 지질-미함유 환경에서 관찰되었지만, apoA-I이 지질에 결합될 때에는 그렇지 않았다. 도 12에 그래프로 제시된다.
도 11은 rHDL로부터 apoA-I의 대체을 보여준다. 9.6 nm POPC rHDL을 Alexa350 표지된 apoA-I을 사용하여 생성하였다. rHDL을 5:1 비율의 지질-미함유 비표지된 apoA-I 대 rHDL apoA-I의 존재 및 부재 하에 37℃에서 인큐베이팅하고, NDGGE에 의해 분석하였다. 5시간 후에, rHDL로부터 apoA-I의 유의한 대체가 존재하고, 이것은 형광 지질-미함유 apoA-I의 출현에 의해 제시되었다. 최소 재형성 (다른 상이한 크기의 rHDL의 출현)은 24시간 후에도 관찰되었고, 이것은 상기 반응이 한 apoA-I의 또 다른 apoA-I에 대한 교환이고, rHDL 입자 재형성의 산물이 아님을 시사한다. 외인성 apoA-I의 부재 하에, 지질 미함유 apoA-I은 생성되지 않고, 이것은 이것이 대체 반응임을 추가로 나타낸다.
도 12는 여기된 공여자로부터 방출된 광이 수용자 모이어티로 전달될 때 FRET가 발생함을 보여주는 그래프이다 (그래프 내의 실선). 공여자 및 수용자가 75Å을 초과하여 떨어져 있을 때, FRET는 관찰되지 않는다 (그래프 내의 밝게 음영진 영역). 에너지 전달 효율은 공여자 형광의 양 (어둡게 음영진 영역)에 의해 측정된다.
도 13은 apoA-I 교환의 산화 동역학의 효과를 보여주는 그래프이다. apoA-IW19:A136을 보유하는 rHDL을 6시간 이하 동안 37℃에서 1:5 몰비의 비표지된 apoA-I (Trp 눌 (Null) apoA-I)과 함께 인큐베이팅하였다. 미처리된 Trp 눌 apoA-I (음영진 원)은 형광 표지된 apoA-I을 rHDL로부터 τ = 0.94 h로 대체하였다. Trp 눌 apoA-I을 퍼옥시니트라이트 및 MPO로 산화시켰다. 퍼옥시니트라이트 산화 (비음영진 원)는 τ = 0.67 h로 apoA-I의 교환 비율을 유의하게 변경하지 않았다. Trp 눌 apoA-I의 MPO 산화 (흑색 원)는 τ1 = 0.92 h 및 τ2 = 18.8 h로 2상 교환 동역학을 생성하였다. 이것은 2개의 apoA-I 집단, 즉 영향받지 않은 집단 (42.7%) 및 교환 손상된 집단 (57.3%)의 존재 하에 가장 쉽게 설명된다. rHDL로부터 apoA-I 대체의 최대 수준 (평형시에 1:5 비율의 표지 대 비표지)이 표시된다 (파선; 83%). 데이타는 6개의 별개의 실험으로부터의 평균을 나타낸다.
도 14는 apoA-I의 인간 혈장에 대한 결합을 보여준다. Alexa350 표지된 apoA-I을 인간 헤파린 처리된 혈장에 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 및 0.8 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 외인성 apoA-I과 함께 혈장을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하고, NDGGE에 의해 분석하였다. 겔에 혈장 단백질을 과도하게 로딩하지만, 겔의 알부민, HDL, LDL 및 VLDL (하부) 영역이 분명하게 나타난다. 5 ㎍의 정제된 혈장 LDL 및 HDL을 대조군으로서 이동시켰다. apoA-I에 대한 형광 신호는 HDL 분획에서는 나타나지만, 알부민, LDL 또는 VLDL에서는 그렇지 않았다.
도 15A는 apoA-I의 부위 특이적 스핀 표지를 보여준다. 시스테인 치환은 안정한 니트록시드 라디칼 스핀 표지를 도입하는 것이 요구되는 위치에서 apoA-I 내에 이루어진다. ApoA-I 시스테인 치환 돌연변이체는 시스테인 치환 부위에 스핀 표지를 도입하기 위해 시스테인 잔기의 술프히드릴기와 특이적으로 반응하는, 니트록시드 연결된 MTS와 RT (30 min)에서 인큐베이팅한다.
도 15B는 EPR 스펙트럼에 대한 지질-결합의 효과를 보여준다. apoA-I 내의 잔기는 지질의 존재에 대해 상이한 정도로 반응한다. 위치 A176은 지질에 의해 유의하게 변경되지 않는 반면, 위치 G217은 크게 영향받는다. 상기 차이 (화살표)는 HDL 결합의 척도로서 기능하기 위해 이용될 수 있다.
도 16은 마우스 혈장의 EPR 분광을 보여준다. 상부 패널은 4℃ 및 37℃에서 스핀 표지된 apoA-I의 스펙트럼이고, 여기서 스핀 표지는 잔기 217에 위치하였다. 중앙 패널은 상부 패널의 샘플에 대해 시간에 걸친 신호의 변화를 보여주는 그래프이다. 하부 패널은 4℃ 및 37℃에서 스핀 표지된 apoA-I의 스펙트럼이고, 여기서 스핀 표지는 잔기 111에 위치하였다.
도 17은 C57Bl/6 마우스 및 CH3 마우스로부터의 혈장 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 반응 비율을 보여주는 그래프이다.
도 18은 HDL에 대한 apoA-I 결합을 모니터링하기 위한 EPR 스펙트럼 위치를 보여준다.
도 19는 인간 혈장에서 HDL에 대한 ApoA-I 결합을 보여준다.
도 20은 대조군 인간 혈장 샘플에서 HDL에 대한 apoA-I 결합의 자취를 보여준다.
도 21은 당뇨병/대사 증후군 상태가 확인된 9명의 개체로부터의 혈장에서 HDL 기능 검정의 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이 방법은 a) HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고, b) 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 것을 포함한다. EPR 스펙트럼은 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력과 상관관계가 있는, HDL에 대한 지단백질의 결합의 정도 및/또는 속도를 평가하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법은 심혈관 질환, 예컨대 관상 동맥 질환, 졸중 및 말초 혈관 질환의 위험이 있는 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 당뇨병이 있거나 당뇨병 위험 (예를 들어 당뇨병 전기 상태)이 있는 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 알츠하이머 질환의 위험이 있는 개체를 확인하기 위해 또는 알츠하이머 질환의 초기 단계에 대한 진단을 위해 사용될 수 있다. 또한, 혈액 또는 뇌척수액 (CSF) 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력의 결정에 사용하기 위한 조성물 및 키트도 제공된다.
본 발명은 부분적으로는 apoA-I이 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 결합하기 때문에 EPR 분광법이 apoA-I의 구조의 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견을 기초로 한다. 본원의 실시예에서 제시되는 바와 같이, EPR 분광법은 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 결합시에 apoA-I의 구조적 변화를 측정하는 것으로 성공적으로 밝혀졌고, 시험관내 혈액 샘플에 존재하는 HDL의 콜레스테롤 유출 능력에 상관관계가 있을 수 있다. 본 발명의 방법은 따라서 심지어 그의 통상적인 혈액 시험에 의해 얻은 지질 패널 (예를 들어 HDL, LDL, VLDL의 수준)이 정상으로 보이는 특정 개체에 대해, 감소된 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들 EPR 방법은 CSF에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 결정하고 CSF의 감소된 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 개체를 확인하기 위해서 사용될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집된다. 수집된 EPR 스펙트럼은 이어서 하나 이상의 음성 대조군 및/또는 하나 이상의 양성 대조군과 비교된다. 음성 대조군은 지질-미함유 또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼일 수 있고, 여기서 스핀 표지 및 지단백질은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 형성하는 스핀 표지 및 지단백질과 동일하다. 양성 대조군은 지질, 예컨대 디미리스토일포스파티딜 콜린에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼일 수 있거나, 또는 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 하나 이상의 과거 스펙트럼일 수 있다 (여기서, 스핀 표지 및 지단백질은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 형성하는 스핀 표지 및 지단백질과 동일하다). 몇몇 실시양태에서, 양성 대조군은 심혈관 질환의 위험이 낮은 것으로 확인된 집합체로부터 유래된 샘플 또는 개체 또는 개체의 군의 단일 샘플로부터 유래된 샘플이고, 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력은 대체 수단 (즉, 세포 기반 콜레스테롤 유출 검정)에 의해 높은 것으로 결정된다. 양성 대조군(들)에 비해 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력의 감소는 심혈관 질환의 위험을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 심혈관 질환의 위험이 있는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 당뇨병을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 인간이 당뇨병을 갖거나 당뇨병이 발생할 위험이 있는지 결정하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 비만인 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 이상지질혈증으로 고통받는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 심혈관 질환의 가족력을 갖는다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 모니터링하는 방법을 제공하고, 여기서 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 혈관 질환에 대한 요법을 받고 있는 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 과정 동안 시간에 걸쳐 모니터링한다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 개시 전에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법 전, 동안 및/또는 후에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환 또는 졸중이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 치료제를 평가하는 방법을 제공하고, 여기서 요법에 적용된 시험 동물로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집된다. 역 콜레스테롤 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지이다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물은 비-인간 영장류이다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 하나 이상의 제약물질의 투여를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 식습관 및/또는 신체 활동 수준의 변화를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 요법은 식습관 및/또는 신체 활동 수준의 변화와 조합하여 하나 이상의 제약물질의 투여를 포함할 수 있다. 요법을 받고 있는 시험 동물로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 과정 동안 시간에 걸쳐 모니터링한다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 개시 전에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법 전, 동안 및/또는 후에 측정된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 a) 임의의 상기 실시양태에 따라 시험 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 치료제는 개체로부터 제거된 후 분석 전에 혈액 샘플에 첨가되었다. 몇몇 실시양태에서, 시험 치료제는 다수의 혈액 샘플에 상이한 농도로 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 혈액은 비제한적인 예를 들어 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 또는 10 min 초과 동안 시험 치료제와 함께 인큐베이팅된다. 상기 실시양태의 추가의 실시양태에서, 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시험 개체는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지)이다. 몇몇 실시양태에서, 시험 동물은 비-인간 영장류이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 첨가되고, EPR에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 개체는 당뇨병, 비만, 고혈압 또는 흡연 중의 하나 이상의 위험 인자를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 개체에서 당뇨병을 검출하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 심혈관 질환에 대한 치료의 과정을 모니터링하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 심혈관 질환의 동물 모델에서 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 치료 효능을 측정하기 위해 사용된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 CSF 샘플 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 CSF 샘플에 첨가되고, EPR에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 개체에서 알츠하이머 질환의 발생 위험을 결정하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 알츠하이머 질환에 대한 치료 과정을 모니터링하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 알츠하이머 질환의 동물 모델에서 알츠하이머 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 치료 효능을 측정하기 위해 사용된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoA-I 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoA-I이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 또는 (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 기재, 예컨대 셀룰로스 또는 플라스틱 중합체의 용도를 제공한다. 스트립은 샘플 (예를 들어, 혈장, CSF 등)의 첨가 전에 EPR 프로브에 함침될 수 있거나 또는 EPR 프로브와 샘플 (예를 들어, 혈장, CSF 등)의 혼합물이 스트립과 접촉된다. 스트립은 EPR 스핀 프로브에 특유한 스펙트럼을 갖는 공지량의 EPR 참조 표준물에 함침될 수 있다. 상기 표준물은 EPR 기기를 보정하기 위해 사용된다. 샘플 (예를 들어, 혈장, CSF 등) 또는 샘플/프로브를 시험 스트립에 첨가한 후, 반응시키고, 스펙트럼 수집을 위해 EPR 기기 내에 삽입하였다. 기기는 스핀 표지된 지단백질 프로브 (예를 들어, apoA-I EPR 스핀 프로브)의 EPR 스펙트럼 특성을 측정할 것이다. 혈장 대 인산염 완충 염수, pH 7.4의 존재 하에 스핀 표지된 지단백질 프로브 (예를 들어, apoA-I EPR 스핀)의 차별적인 스펙트럼 특성은 HDL 기능 (예를 들어, 역 콜레스테롤 수송 능력)의 측정치를 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 혈액 또는 척수액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 용기를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 튜브, 플랫셀 튜브 또는 모세관이다. 몇몇 실시양태에서, 용기 내의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 건조 분말의 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 용기 내의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 동결건조된다. 몇몇 실시양태에서, 용기 내의 스핀 표지된 지단백질 프로브는 유체 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 뇌척수액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 유체 샘플은 용기 내의 스핀 표지된 지단백질 프로브에 첨가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유체 샘플이 존재하거나 존재하지 않으면서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 용기로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 EPR 분광계와 함께 사용될 수 있는 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 용기는 본원에서 설명되는 키트 내에 존재한다.
달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어의 의미는 본 발명 속하는 기술의 당업자에 의해 통상 이해되는 것이다. 문헌 [Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley and Sons, New York (2002)], 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991)]은 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다. 본 발명은 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 및 시약으로 제한되지 않음을 이해하여야 하고, 그 이유는 이들이 변할 수 있기 때문이다. 본 기술 분야의 당업자는 또한 본원에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실시하거나 시험하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
"고밀도 지단백질" 또는 "HDL"은 콜레스테롤 및 트리글리세리드와 같은 지질이 수성 혈류 내로 수송될 수 있도록 하는 순환하는 양친매성 단백질의 비-공유 회합체이다. HDL은 유리 콜레스테롤 (~4%)로 포매된 인지질 단일층 (~25%), 및 트리글리세리드 (~3%) 및 콜레스테롤 에스테르 (~12%)의 코어로 이루어진 지질 에멀젼을 안정화하는 ~50 질량% 양친매성 단백질을 포함한다. HDL의 하위클래스는 HDL2 및 HDL3을 포함한다. HDL2 입자는 더 크고 보다 높은 함량의 지질을 함유하는 반면, HDL3 입자는 더 작고 보다 적은 지질을 함유한다. 추가의 하위클래스는 가장 큰 입자로부터 가장 작은 입자 순으로 HDL2b, HDL2a, HDL3a, HDL3b, 및 HDL3c를 포함한다.
"HDL-C"는 HDL 입자 내의 콜레스테롤을 의미한다. HDL-C의 농도는 인간에서 HDL 상에서 운반되는 콜레스테롤의 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기능장애성 HDL"은 역 콜레스테롤 수송을 위한 능력이 감소된 HDL을 의미한다. 몇몇의 예에서, 기능장애성 HDL은 심혈관 질환의 위험이 없는 건강한 개체로부터의 HDL의 콜레스테롤 유출에 비해 감소된 콜레스테롤 유출을 갖는 HDL을 의미한다.
"역 콜레스테롤 수송" (RCT)은 과량의 콜레스테롤이 말초 조직으로부터 간 또는 스테로이드생성 조직으로 수송되는 과정이다. 역 콜레스테롤 수송 경로는 일반적으로 다음과 같은 3개의 주요 단계를 갖는 것으로 간주된다: (i) 콜레스테롤 유출, 말초 세포의 다양한 풀로부터 콜레스테롤의 초기 제거; (ii) 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT)의 작용에 의한 콜레스테롤 에스테르화, 따라서 유출된 콜레스테롤의 세포 내로의 재도입의 억제; 및 (iii) HDL에 의한 콜레스테릴 에스테르 흡수 및 HDL-콜레스테릴 에스테르 복합체의 간 세포로의 전달.
"콜레스테롤 유출 잠재력"은 지질-적재 조직, 예컨대 대식세포로부터 콜레스테롤을 수용함으로써 역 콜레스테롤 수송을 촉진하는 HDL의 능력이다. CSF 내의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 알츠하이머 질환 또는 알츠하이머 질환의 발생 위험을 나타낼 수 있다.
"전자 상자성 공명 (EPR) 분광법"은 쌍을 형성하지 않은 전자를 갖는 화학물질종을 검출하는 분광 기술이다. EPR은 또한 "전자 스핀 공명" (ESR) 또는 "전자 자기 공명" (EMR)으로도 알려져 있고, 이들 용어는 교환가능하게 사용될 수 있다. EPR은 정적 자기장의 존재 하에 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 전자 스핀을 갖는 상자성 이온 또는 분자에 의한 마이크로파 방사선의 공명 흡수 과정이다. 강한 자기장을 상자성 종을 함유하는 물질에 인가함으로써, 쌍을 형성하지 않은 전자의 전자 "스핀"을 통해 발생하는 개별적인 자기 모멘트는 인가된 자기장에 평행하게 또는 역-평행하게 배향될 수 있다. 이것은 쌍을 형성하지 않은 전자에 대해 별개의 에너지 수준을 생성하고, 이에 의해 전자기 방사선 (마이크로파의 형태)의 순수한 흡수가 발생할 수 있다. 공명 상태는 자기장 및 마이크로파 주파수가, 마이크로파의 에너지가 한 쌍의 수반된 스핀 상태의 에너지 차이에 대응하도록 하는 것일 때 발생한다.
"스핀 표지"는 쌍을 형성하지 않은 전자를 갖는 유기 분자이다. 몇몇 예에서, 스핀 표지는 또 다른 분자; 예를 들어, 단백질에 결합하는 능력을 갖는다. 스핀 표지는 EPR 분광법을 사용하여 단백질 또는 생물학적 막 공간 역학 (local dynamics)을 프로빙하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 부위-지정 스핀 표지는 단백질 내의 특이적 영역의 모니터링을 가능하게 하고; 예를 들어, 단백질 구조 조사시에 아미노산-특이적 스핀 표지가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "스핀 표지된 지단백질 프로브"는 적어도 하나의 스핀 표지를 포함하는 지단백질이다. 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 예에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 단일 부위에, 예를 들어 단일 아미노산 잔기에 위치할 수 있다. 몇몇의 예에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL 입자와 결합한다. 몇몇의 예에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL 입자 내의 지단백질을 자유롭게 교환할 수 있다. 교환은 지질 및 입자 친화도를 기초로 한다. 더 높거나 동등한 친화도를 갖는 단백질은 같거나 더 작은 친화도의 또 다른 단백질을 대체할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 스핀 표지된 지단백질의 지단백질 부분은 하나 이상의 지질 분자가 부착된 단백질로 제한되지 않는다. 일반적으로, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 지단백질 부분은 지질과 결합하는 능력을 갖는다. 또한, 스핀 표지된 지단백질의 지단백질 부분은 전장 단백질로 제한되지 않고 폴리펩티드 및 펩티드 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지단백질"은 하나 이상의 지질 분자가 부착되거나 부착될 수 있는 일군의 단백질을 의미한다. 몇몇의 경우에, 지단백질은 4개 이하의 인지질 분자가 결합된 "지질-소량함유 지단백질"일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지단백질은 지질이 부착되지 않았지만 HDL 입자에서 교환될 수 있는 단백질 (예를 들어 아포지단백질)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "평형 결합"은 한 분자의 또 다른 분자에 대한 결합 속도가 2개의 분자의 해리 속도와 동일한 상태를 의미한다. 몇몇의 예에서, 평형 결합은 시간에 걸쳐 2개의 분자의 결합을 모니터링함으로써; 예를 들어 시간에 걸쳐 EPR 스펙트럼을 모니터링함으로써 결정할 수 있다. 평형 결합은 결합된 분자의 비율이 거의 항정 상태 (steady state)에서 유지될 때 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질의 "전이 온도"는 지질이 고체 또는 겔상으로부터 액체상으로 전이 또는 용융되는 온도이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"은 시험되는 더 큰 전체의 일부를 의미한다. 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 뇌척수액, 소변, 타액 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혈액 샘플"은 전혈 샘플 또는 그로부터 유래된 혈장 또는 혈청 분획을 의미한다. 몇몇의 예에서, 시험관내 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플, 예컨대 전혈 또는 그로부터 유래된 혈장 또는 혈청 분획을 의미한다. 몇몇의 예에서, 시험관내 혈액 샘플은 비-인간 포유동물 ("동물") 혈액 샘플, 예컨대 전혈 또는 그로부터 유래된 혈장 또는 혈청 분획을 의미한다. 또한, 혈액 샘플은 시험 동물 (예를 들어, 제약물질 효능 또는 독성의 생체내 실험에 사용되는 동물), 애완동물, 가축 등으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전혈"은 분획화되지 않고 세포 및 유체 성분을 모두 함유하는 혈액 샘플을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전혈"은 새로 채혈한 혈액 또는 임의로 항응고제를 함유할 수 있는 통상적으로 채혈된 혈액 샘플을 의미한다. 몇몇의 예에서, 전혈은 진공채혈기 내로 채혈될 수 있다. 또한, 전혈은 시험 동물 (예를 들어, 제약물질 효능 또는 독성의 생체내 실험에 사용되는 동물), 애완동물, 가축 등으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혈장"은 전혈의 비-세포 성분인 유체를 의미한다. 사용되는 분리 방법에 따라, 혈장은 세포 성분이 완전히 존재하지 않을 수 있거나, 또는 다양한 양의 혈소판 및/또는 소량의 다른 세포 성분을 함유할 수 있다. 혈장은 다양한 응고 인자, 예컨대 피브리노겐을 포함하기 때문에, 용어 "혈장"은 아래에서 제시되는 "혈청"과 구분된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혈청"은 전체 포유동물 혈청, 예컨대, 예를 들어, 전체 인간 혈청, 시험 동물로부터 유래된 전체 혈청, 애완동물로부터 유래된 전체 혈청, 가축으로부터 유래된 전체 혈청 등을 의미한다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "혈청"은 응고 인자 (예를 들어, 피브리노겐)가 제거된 혈장을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뇌척수액" 또는 "CSF"는 포유동물 뇌척수액, 예컨대, 예를 들어, 인간 뇌척수액을 의미한다. CSF는 뇌 및 척수 주위 및 내의 지주막하강 및 뇌실 시스템을 채우는 체액이다. 뇌척수액은 뇌 또는 척수액으로부터 채취될 수 있다. 또한, 이 용어는 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 비-인간 영장류 등으로부터의 CSF를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 치료제는 치료 효과를 갖거나 가질 수 있는 임의의 화합물에 대해 사용된다. 치료제의 예는 소분자, 단백질, 펩티드, 항체, 핵산, 지질, 탄수화물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잠재적인 치료 효과에 대해 시험되고 있는 화합물은 치료제; 예를 들어, 실험적 치료제 또는 실험적 약물로 간주된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지쇄일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 사이에 개재할 수 있다. 또한, 이 용어는 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 상기 정의에는 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 및 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 용어 폴리펩티드 및 단백질은 또한 문맥상 다른 내용을 분명히 나타내지 않으면 전장 폴리펩티드 또는 단백질의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "apoA-I"은 HDL의 주성분인 지단백질을 의미한다. apoA-I 단백질의 예는 인간 apoA-I 단백질 (예를 들어 NM_000039.1)이다. 인간 apoA-I 단백질의 다른 예는 apoA-1밀라노 단백질 및 apoA-I아이오와 단백질이다. 또한, 이 용어는 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 비-인간 영장류 등으로부터의 apoA-I 단백질을 포함한다. 또한, 이 용어 "apoA-I"에는 apoA-I의 상동체가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "apoA-II"는 HDL의 두 번째로 풍부한 성분인 지단백질을 의미한다. apoA-II 단백질의 예는 인간 apoA-II 단백질 (예를 들어 NP_001634) 단백질이다. 또한, 이 용어는 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지 등으로부터의 apoA-II 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "apoE"는 지질 대사 및 콜레스테롤 수송에 관여하는 지단백질을 의미한다. apoE 단백질의 예는 인간 apoE 단백질 (예를 들어 NM_000041.2) 단백질이다. 인간 apoE 단백질의 3개의 이소형, 즉 ApoE2, ApoE3, ApoE4가 존재한다. ApoE3은 apoE의 우세한 형태이고, apoE2 및 apoE4는 지단백질 입자 (HDL, LDL, VLDL) 사이에서 별개의 분포를 보인다. 또한, 이 용어는 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 비-인간 영장류 등으로부터의 apoE 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 "모방체"는 단백질 2차 구조의 요소를 모방하는 펩티드-함유 분자이다. 단백질 모방체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용할 것으로 기대된다. 예를 들어, 몇몇의 apoA-I 모방체는 모 apoA-I 단백질의 HDL-결합 특성을 모방한다 ([Garber, DW et al. (1992) Arterioscler Thromb Vase Biol 12:886-894]; [Wool, GD et al. (2009) J Lipid Res 50:1889-1900). 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다.
본원에서 사용하기 위해, 다른 내용을 분명하게 나타내지 않으면, 용어 부정관사 ("a", "an") 등의 사용은 하나 이상을 의미한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함한다 (그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다.
본원에서 설명되는 본 발명의 측면 및 실시양태는 그 측면 및 실시양태를 "포함하는", 이로 "이루어지는", 이로 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것이 이해된다.
HDL 및 역 콜레스테롤 수송
HDL의 항-아테롬 발생 특성은 주로 과도한 콜레스테롤이 말초 조직으로부터 간 또는 스테로이드생성 조직으로 수송되는 과정인 RCT에서의 그의 역할에 기인한다 [40, 41]. 혈장에서, 거의 대다수의 apoA-I은 구형 HDL, 아포지단백질, 인지질, 트리글리세리드 (TG), 유리 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르의 복합체와 결합한다 [42]. 그러나, 대식세포로부터의 콜레스테롤 및 인지질의 1차 수용자는 지질-미함유 또는 지질-소량함유 apoA-I (4개 이하의 인지질 분자 함유)이고 [43], 이것은 콜레스테롤 유출의 1차 매개체인 ABCA1의 바람직한 기질이다 [44-49]. apoA-I는 주로 간에서 합성되기 때문에, 내막에서 지질-미함유 apoA-I의 가장 가능성 있는 공급원은 HDL로부터 대체된 apoA-I 분자이다. 증가하는 증거는 성숙 HDL로부터 지질-미함유/지질-소량함유 apoA-I의 생산 및 ABCA1에 의한 그의 재-지질화가 대식세포에서 내피 건강 및 콜레스테롤 균형의 유지에 중요한, 동맥 벽에서 진행되는 과정 (도 1 및 2)이라는 개념을 지지한다. 콜레스테롤 적재 대식세포로부터 콜레스테롤 유출을 용이하게 하기 위해, 지질-소량함유/지질 미함유 apoA-I은 ABCA1에 결합한다. ABCA1에 대한 그의 결합 동안, apoA-I은 유리 콜레스테롤 (FC) 및 인지질 (PL)을 획득하여 원반상 프리β HDL을 형성한다. 이들 입자는 LCAT의 작용에 의해 콜레스테롤 에스테르 코어 함유 알파 HDL로 전환된다. ApoA-I은 인지질 전달 단백질 (PLTP), 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP), 지단백질 리파제 (LPL) 및 간 리파제 (HL)의 작용(들)에 의해 알파 HDL로부터 방출된다.
전자 상자성 공명
전자 상자성 공명은 자기장에 위치하는 상자성 물질의 마이크로파- 또는 라디오파 방사선에 대한 공명 반응의 연구이다. 상자성 물질은 정상적으로는 홀수의 전자 또는 쌍을 형성하지 않은 전자를 갖지만, 몇몇 경우에, EPR은 짝수의 전자를 갖는 이온 또는 이가 라디칼에서 관찰된다. 강한 자기장을 상자성 종을 함유하는 물질에 인가함으로써, 쌍을 형성하지 않은 전자의 전자 "스핀"을 통해 발생하는 개별적인 자기 모멘트는 인가된 자기장에 평행하게 또는 역-평행하게 배향될 수 있다. 이것은 쌍을 형성하지 않은 전자에 대해 별개의 에너지 수준을 생성하고, 이에 의해 전자기 방사선 (마이크로파의 형태)의 순수한 흡수가 발생할 수 있다. 공명 상태로 언급되는 상황은 마이크로파의 에너지가 한 쌍의 수반된 스핀 상태의 에너지 차이 △E에 대응하도록 하는 것일 때 발생한다.
EPR을 책임지는 자기 쌍극자 천이의 고유한 낮은 감수성을 극복하기 위해서, 샘플을 공명강 (resonance cavity)에 배치한다. 일반적으로, 스펙트럼은 자기장을 공명을 통해 서서히 쓸어냄으로써 약 9 기가헤르츠의 X-대역 마이크로파 주파수에서 항정 상태에서 수집한다. 자유 전자는 9.1081 GHz의 마이크로파 주파수에서 3250 가우스 (325 밀리세틀라)의 자기장에서 공명하는 반면, 유기 자유 라디칼은 각각의 특정 분자에 특징적인 약간 상이한 자기장에서 공명한다. X-대역 마이크로파가 가장 통상적이지만, EPR 분광계는 다른 주파수; 예를 들어 표 1에 제시된 주파수에 대해 이용가능하다.
Figure pct00001
공명강으로부터 다시 반사된 마이크로파 (전력이 흡수될 때 보다 작음)는 다이오드 검출기로 전송되고, 다이오드로부터 반사된 임의의 전력은 로드 (Load)에 의해 완전히 흡수된다. 다이오드는 평면 편광 마이크로파의 E-벡터를 따라 설치되고, 따라서 공명강으로부터 반사된 마이크로파 전력에 비례하는 전류를 생성한다. 원칙적으로, 샘플에 의한 마이크로파의 흡수는 마이크로전류계에서 전류의 감소를 감지함으로써 검출될 수 있지만, 실제로는 상기 직류 (d.c.) 측정치는 노이즈가 너무 많아서 사용할 수 없을 것이다.
신호 대 노이즈 비 문제에 대한 해결책은 작은 진폭 자기장 변조를 도입하는 것이다. 진동하는 자기장은 대체로 공명강 벽 내에 설치된 작은 코일에 의해 d.c. 전기장에 포개진다. 자기장은 공명선 부근에 존재할 때, 공명선의 일부를 통해 앞뒤로 휩쓸리고, 이것은 다이오드 전류에 교류 (a.c.) 성분을 생성한다. 상기 a.c. 성분은 주파수 선택적 증폭기를 사용하여 증폭되고, 따라서 매우 많은 노이즈를 제거한다. 변조 진폭은 선폭 (line width)보다 작다. 따라서, 검출된 a.c. 신호는 샘플 흡수의 변화에 비례한다. 스펙트럼은 검출된 신호 대 자기장으로 플로팅된다.
화학에서 EPR의 적용 분야는 자유 라디칼의 특성 결정, 유기 반응의 연구, 및 상자성 무기 분자의 전자적 특성의 조사를 포함한다. 얻어진 정보는 분자 구조의 조사에 사용된다. EPR은 금속 단백질의 연구시의 생물학에서, 니트록시드 스핀 표지를 위해, 및 단백질 및 다른 생체거대분자에서 반응 과정 동안 생산되는 라디칼의 조사에 널리 사용된다. EPR은 구조적 환경 (영역 적응성 및 용매 접근성) 및 스핀 표지 사이의 상호작용 거리를 보고한다 (도 3).
스핀 표지된 지단백질 및 이들이 나타내는 각각의 구조적 요소 (삽입 도면)의 EPR 스펙트럼의 예는 도 4 및 5에 제시된다. 질소 핵 스핀과의 초미세 상호작용 때문에, 니트록시드 스핀 표지 스펙트럼은 왼쪽에서 오른쪽으로 다음과 같은 3개의 피크를 함유한다; 근역 피크, 중앙 피크 및 원역 피크. 3개의 공명 피크의 선 형태 (폭)는 실험 자기장 내의 초미세 요소의 배향에 의해 결정된다. 초미세 요소의 운동 평균화는 각각의 EPR 피크의 형태 (선)에 반영되어서, 10-10 내지 10-6 sec의 시간 규모에서 발생하는 스핀 표지 이동은 스펙트럼 선폭에 영향을 준다. 스핀 표지는 보다 규칙적인 구조로 속박되기 때문에, 스핀 표지의 이동성은 특징적인 방식으로 제한된다. 이 결과는 근역 및 원역 피크의 폭 확대 및 평탄화를 동반하는, 피크 대 피크 대칭의 독특한 상실이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR은 apoA-I 구조의 조사 수단으로서 사용된다. EPR을 사용하여, 지질-미함유 또는 지질-소량함유 및 지질-결합된 상태의 apoA-I의 구조를 조사하였다 (예를 들어, 9.6 nm 재구성된 원반상 HDL 상의 apoA-I의 N-말단 구조에 대한 EPR 분석) [61, 65]. 구체적으로, 니트록시드 스핀 표지로 표적화된 영역/도메인의 입체형태는 EPR에 의해 측정가능한 다음과 같은 3개의 주요 파라미터로부터 유도될 수 있다: 속박된 스핀 표지의 측쇄 이동성 및 그의 펩티드 백본 공간 역학 (도 5), 스핀 표지의 용매 접근성, 및 그의 쌍극성 커플링이 3차 및 4차 구조적 요소를 확인할 수 있는 가까운 (여기서 사용되는 지속파 EPR에 대해 <22Å) 스핀의 근접성. 허벨 (Hubbell)과 그의 동료들은 EPR 스펙트럼 선 형태의 조정을 특성화하였고 이들 변화와 연관된 특이적인 단백질 구조적 특징을 확인하였다 [73, 74]. 각각의 구조적 요소에 대한 선 형태는 스핀 표지의 이동성을 나타내고, 예를 들어 스핀 표지는 보다 규칙적인 구조로 속박되기 때문에, 스핀 표지의 이동성은 특징적인 방식으로 제한된다. 이 결과는 근역 및 원역 피크의 폭 확대 및 평탄화를 동반하는, 피크 대 피크 대칭의 독특한 상실이다. 마찬가지로, 가까운 스핀 사이의 쌍극성 커플링은 독특한 스펙트럼 폭 확대를 야기한다 (이동 제한에 의한 폭 확대와 독립적으로 평가될 수 있음, 참고문헌 [61] 참조). 따라서, 쌍극성 커플링 (즉, 표지의 공간적 근접성)의 변화에 의해 발생하는 EPR 스펙트럼 변화도, 보고된 스핀 표지는 특이적 도메인을 표적화하기 때문에 단백질 내의 입체형태적 재배열을 검출하기 위해 이용될 수 있다 (도 6). 따라서, 위에서 예시된 바와 같이, 상기 종류의 EPR 스펙트럼 분석으로부터 단백질 내의 스핀 표지된 부위의 EPR 스펙트럼의 형태로부터 신뢰할 수 있는 구조적 결론을 내릴 수 있다. 따라서, 스핀 표지가 지질-미함유/지질-소량함유 대 지질 결합된 상태에서 특유한 입체형태를 보유하는 apoA-I의 부분에 위치할 경우, EPR 스펙트럼은 사용되는 이들 2가지 형태의 apoA-I 또는 다른 스핀 표지된 지단백질 프로브를 구분하기 위해 사용될 수 있다 (도 7).
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 피크 선폭의 함수인 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭을 측정함으로써 정량된다. 중앙 피크의 진폭은 기준선 및 기준선 상의 최대 신호 사이의 거리이다 (예를 들어, 도 8 참조). 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 중앙 피크의 선폭 변화를 측정함으로써 정량된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 중앙 피크의 중앙선과 스펙트럼이 기준선으로 복귀하는 지점 사이의 폭을 측정함으로써 정량된다. 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼은 중앙 피크의 진폭 대 근역 피크 및/또는 원역 피크의 진폭의 비를 측정함으로써 정량된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 변화는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 음성 및 양성 대조군의 EPR 스펙트럼과 비교함으로써 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 변화는 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크 진폭을 지질에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크 진폭 및/또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크 진폭과 비교함으로써 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 변화는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 폭을 지질에 결합된 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 폭 및/또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 폭과 비교함으로써 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 변화는 중앙 피크의 진폭 대 EPR 스펙트럼의 근역 피크 및/또는 원역 피크의 진폭의 비를 중앙 피크의 진폭 대 지질에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 근역 피크 및/또는 원역 피크의 진폭의 비 및/또는 중앙 피크의 진폭 대 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 근역 피크 및/또는 원역 피크의 진폭의 비를 비교함으로써 측정된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 변화는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 공명 스펙트럼을 지질에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼 내의 스핀 표지의 공명 및/또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼 내의 니트록시드의 공명과 비교함으로써 측정된다. 스핀 표지의 공명은 스펙트럼의 X축 (자기장)을 따라 중앙 피크의 주파수에 의해 결정될 수 있다.
정량적 EPR은 문헌 [Eaton, GR et al., Quantiative EPR, SpringerWien New York (2010)]에 기재되어 있다.
지단백질
본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 수집함으로써 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 부분적으로는 HDL 입자 내의 지단백질을 교환하는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 능력을 기초로 한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 약 40%, 30%, 20% 또는 10% 또는 그 미만이 저밀도 지단백질 (VLD) 또는 초저밀도 지단백질 (VLDL)과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE4 단백질이 아니다.
스핀 표지된 지단백질 프로브는 지질에 결합될 때 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 지질-소량함유 환경에서 동일한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼과 상이하도록 설계된다. 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 스핀 표지된 지단백질 프로브가 샘플에 존재하는 HDL에 결합하는지의 여부를 나타낸다. 지질에 결합된 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼에 보다 근접하게 유사한, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합함을 나타낸다. 지질-소량함유 환경에서 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 동일한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼에 보다 근접하게 유사한, 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 브로브의 EPR 스펙트럼은 스핀 표지된 지단백질 프로브가 샘플 내의 HDL에 결합하지 않음을 나타낸다. 시험관내 혈액 샘플 중 HDL에 대한 스핀 표지된 프로브의 결합은 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력과 상관관계가 있다. HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 수준이 높으면 높을수록 더 높은 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타낸다.
아포지단백질은 일반적으로 클래스 A 양친매성 α-나선 구조적 모티프 (문헌 [Segrest et al. (1994) Adv. Protein Chem. 45:303-369]), 및/또는 β-시트 모티프를 갖는다. 아포지단백질은 일반적으로 소수성 표면에 결합하는 능력을 갖는 α-나선 2차 구조의 높은 함량을 포함한다. 이들 단백질의 특유한 특징은 특정 지질 이중층 소포와 상호작용하여 이를 원반형 복합체로 전환하는 능력이다 (검토를 위해, 문헌 [Narayanaswami and Ryan (2000) Biochimica et Biophysica Acta 1483: 15-36] 참조). 지질과 접촉시에, 단백질은 입체형태적 변화를 겪고, 지질 상호작용을 수용하기 위해 그의 구조를 조정한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지된 apoA-I 단백질 또는 그의 단편이다. ApoA-I은 HDL의 주성분이다. 혈장에서, 거의 대부분 (정상적인 인간에서 98%)의 apoA-I은 구형 HDL과 결합한다. 그러나, 말초 조직으로부터의 콜레스테롤 및 인지질의 1차 수용자는 혈장 막 수송체 ATP-결합 카세트 A1 (ABCA1)의 바람직한 기질인 지질-미함유 또는 지질-소량함유 apoA-I이다. 지질의 부재 하에서 apoA-I은 치밀한 4-나선 다발을 취할 수 있다 (도 9) (문헌 [Cavigiolio, G et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:18847-18857]). 지질화 (지질과 결합)시에, 양친매성 α-나선은 나선 다발의 개방부에 대응하는 단백질-지질 상호작용을 단백질-단백질 접촉으로 대체하여 연장된 벨트-유사 α-나선을 형성하고, 이것은 신생 HDL 입자의 주위를 감싼다 (도 10).
몇몇 실시양태에서, apoA-I은 인간 apoA-I이고; 예를 들어, apoA-I은 GenBank 기탁 No. NM_000039.1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 apoA-I이다.
인간 apoA-I 단백질은 다음과 같다:
Figure pct00002
몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 apoA-I 펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 188 내지 243을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 188 내지 243으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 220-241을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 220-241로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 61-67을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 61-67로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 83-91을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 83-91로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 96-103을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 96-103으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 116-124를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 116-124로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 139-146을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 139-146으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 162-169를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 162-169로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 182-190을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 182-190으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 204-212를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 204-212로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 216-221을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 216-221로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-186을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-186으로 이루어진다.
몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I 단백질의 단백질 분해 절단에 의해 생산된 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I을 키모트립신으로 소화시킴으로써 생산된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 (chymotryptic) 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-229를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-192를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 19-243을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 58-243을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-223을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-212를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 키모트립신 분해 단편은 apoA-I 단백질의 잔기 1-35-243을 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 apoA-I의 구조적 도메인을 포함하는 apoA-I의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, aponA-I 단편은 apoA-I 단백질의 α-나선 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 랜덤 코일 (random coil) 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단편의 β-시트 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단편은 apoA-I 단백질의 2개의 상태의 α-나선/랜덤 코일 도메인을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 프로브는 각각 apoA-I 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-I 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 이것은 무작위 방식으로 스핀 표지의 일부가 apoA-I 단백질에 부착된 스핀 표지된 apoA-I 단백질을 생성할 위험을 감소시키면서 스핀 표지를 apoA-I 단백질 상의 단일 부위에 특이적으로 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 유전적으로 조작된 단일 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 apoA-I의 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 유전적으로 조작된 시스테인에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 apoA-I 단백질의 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 217에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 217에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 217의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 26에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 26에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 26에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 44에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 44에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 44에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 64에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 64에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 64의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 101에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 101에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 101의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 111에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 111에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 111의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 167에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 167에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 167에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 226에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 226에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 226의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
위치 217에 시스테인 잔기를 갖는 유전적으로 조작된 apoA-I 단백질의 서열은 다음과 같다.
Figure pct00003
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 α-나선 도메인에 위치한다. α-나선 도메인은 고정된 것이 아니다. 지질-미함유 apoA-I에서, α-나선 도메인은 위치 8-14, 30-40, 51-85, 92-137, 146-187, 200-210, 및 223-239를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 랜덤 코일 도메인에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단편의 β-시트 도메인에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 2개의 상태인 α-나선/랜덤 코일 도메인에 위치한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지된 apoA-II 단백질 또는 그의 단편이다. ApoA-II는 HDL의 두 번째로 풍부한 지단백질 성분이다. 단백질은 단량체, 동종이량체 또는 아포지단백질 D와의 이종이량체로서 혈장에서 발견된다. 상기 유전자의 결함은 아포지단백질 A-II 결핍 또는 고콜레스테롤혈증을 야기할 수 있다. 본 발명의 몇몇 측면에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다. 인간 apoA-II 아미노산 서열의 예는 다음과 같다:
Figure pct00004
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoA-II 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-II 단백질은 신호 펩티드에 위치하는 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 성숙 apoA-II 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 성숙 apoA-II 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 24 내지 잔기 100의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 전구체는 신호 펩티드 내의 천연 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질의 조작된 시스테인 잔기에 부착된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지된 apoE 단백질 또는 그의 단편이다. ApoE는 트리글리세리드-풍부 지단백질 구성분의 정상적인 이화에 필수적이다. 본 발명의 몇몇 측면에서, apoE 단백질은 인간 apoE 단백질이다. 인간 apoE 단백질의 3개의 이소형, 즉 ApoE2, ApoE3, ApoE4가 존재한다. ApoE3은 apoE의 우세한 형태이고, apoE2 및 apoE4는 지단백질 입자 사이에서 상이한 분포로 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질의 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE3 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE4 단백질이 아니다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE2 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE2 단백질 또는 apoE4 단백질이 아니다.
인간 apoE 아미노산 서열의 예는 다음과 같다:
Figure pct00005
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoE 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoE 단백질은 하나는 신호 펩티드에 위치하고 하나는 성숙 apoE 단백질에 위치하는 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 천연 시스테인 잔기를 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 지단백질의 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질의 모방체는 apoA-I의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F 및 4f-Pro-4F이다. ApoA-I 모방체 18A는 서열 DWLKAFYDKVAEKLKEAF (서열 5)로 이루어진다 (문헌 [Garber, DW et al. (1992) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 12:886-894)]. 모방체 18A-Pro-18A는 프롤린에 의해 연결된 18A의 직렬 이량체이다 (Wool, GD et al. (2009) J. Lipid Res. 50:1889-1900). 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체 내의 단일 부위에서 모방체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체의 중앙에 위치한다. ApoA-I 모방체 4F는 Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2 (서열 6)의 아미노산 서열을 갖고, 4F-Pro-4F는 프롤린 잔기에 의해 연결된 4F의 직렬 이량체이다 (문헌 [Wool, GD et al. (2009) J. Lipid Res. 50:1889-1900]).
스핀 표지
스핀 표지는 그 구조 내에 쌍을 형성하지 않은 전자의 존재 때문에 상자성인 화학적 화합물이다. 따라서, 이 표지는 자유 라디칼 종류이지만, 정상적인 온도 (100℃ 미만) 및 생리학적 pH 근처의 조건 하에서 반드시 안정하고, 그의 자유 라디칼 모이어티에 영향을 주지 않으면서 특정 화학 반응 또는 실험을 수용한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위해 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소 원자이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 니트록시드이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 및 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼로부터 선택된다.
HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위해 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 그러한 스페이서는 스핀 표지와 지단백질 사이의 거리를 조정할 수 있고, 지단백질에 부착될 때 스핀 표지의 구속에 영향을 줄 수 있다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다.
본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 사용하여 EPR 분광법에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL 입자 내의 지단백질을 교환하기 때문에, 입체형태 변화를 겪는다. 상기 변화는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질 프로브 상의 스핀 표지의 EPR 스펙트럼의 변화에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 스핀 표지된 apoA-I 지단백질 프로브는 치밀한 4-나선 다발로부터 연장된 벨트-유사 α-나선으로 전환되고, 이것은 지질화시에 신생 HDL 입자의 주위를 감싼다. 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 결합시에 이들 구조적 변화를 검출하도록 설계될 수 있다. 스핀 표지된 지단백질 프로브 상의 스핀 표지의 부위는 지단백질이 지질 미함유/지질-소량함유 상태일 때 또는 지질에 결합될 때 스핀 표지의 상이한 스펙트럼을 기초로 하여 선택된다. 스핀 표지는 지단백질 상의 임의의 부위에 위치할 수 있다. 예를 들어, 지단백질은 스핀 표지된 지단백질 프로브의 개발을 위한 그의 유용성을 시험하기 위한 지단백질의 라이브러리를 생성하기 위해 지단백질의 각각의 위치에 특유한 시스테인 잔기를 위치시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이어서, 스핀 표지는 라이브러리 내의 각각의 유전적으로 조작된 지단백질 내의 특유한 시스테인에 부착된다. 이어서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 후보 스핀 표지된 지단백질 프로브의 라이브러리는 지질에 결합되거나 또는 지질-미함유/지질-소량함유 후보 프로브의 EPR 스펙트럼을 수집함으로써 시험된다. 지질-결합된 대 지질-미함유 상태의 EPR 스펙트럼에서 검출가능한 차이를 보이는 후보 스핀 표지된 지단백질 프로브가 본 발명의 방법에 사용하기 위해 선택된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질은 건조 분말의 형태; 예를 들어 스핀 표지된 지단백질 프로브의 동결건조된 제제이다.
샘플
스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 샘플 내의 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 본원에서 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 체액이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 뇌척수액이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 약물 개발 또는 건강 진단제 개발에 사용되는 합성에 의해 제조된 샘플이다.
혈액 샘플
본 발명은 스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 시험관내 혈액 샘플 중 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 추가의 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 항응고제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 개체로부터 진공용기 (vacucontainer) 내로 수집된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 개체로부터 수집 후에 본 발명의 방법에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 분석 전에 동결된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 분석 전에 1회 또는 2회 사이클의 동결 및 해동을 거친다.
역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL 의 능력의 측정 방법
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 샘플에 첨가하고 샘플 (예를 들어 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, CSF 등) 또는 합성 샘플)의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하고 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플의 EPR 스펙트럼은 음성 및/또는 양성 대조군의 EPR 스펙트럼과 비교된다. 몇몇 실시양태에서, 음성 대조군은 지질-미함유 또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브이다. 몇몇 실시양태에서, 양성 대조군은 지질; 예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 콜린에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플의 EPR 스펙트럼은 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 개체로부터의; 예를 들어 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플의 EPR 스펙트럼은 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 개체로부터의; 예를 들어 당뇨병이 없는 개체로부터의 혈액 샘플에 첨가된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이다. 몇몇 실시양태에서, CSF 샘플의 EPR 스펙트럼은 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 개체로부터의; 예를 들어 알츠하이머 질환의 위험이 없는 개체로부터의 CSF 샘플에 첨가된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송 능력은 콜레스테롤 유출 잠재력이다.
스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질을 포함한다. HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 적어도 60%의 지단백질이 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)에 첨가될 때 HDL에 결합하는 지단백질이다. HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 적어도 60%의 지단백질이 시험관내 혈액 샘플에 첨가될 때 HDL에 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 적어도 70%의 지단백질이 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)에 첨가될 때 HDL에 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 적어도 70%의 지단백질이 시험관내 혈액 샘플에 첨가될 때 HDL에 결합하는 지단백질이다.
EPR 분광 방법은 당업계에 알려져 있다. EPR 수행에 대한 일반적인 지침은 문헌 [Klug, CS and Feix, JB (2008) Methods Cell Bio. 84:617-657)], [Fanucci GE and Cafiso, DS (2006) Curr. Opin. Struct. Bio. 16:644-653], 및 [EMX User's Manual]에 제시되어 있다. EPR 분광법의 비제한적인 예시적인 방법은 다음과 같이 문헌 [Tetali, SD et al. (2010 J. Lipid Res. 51:1273-1283)]을 기초로 한다. EPR 측정은 루프-갭 (loop-gap) 공명기가 구비된 JEOL X-대역 분광계를 사용하여 수행한다. TBS (10 mM 트리스 (Tris), pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.005% 나트륨 아지드) 내의 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한다. 샘플을 일면 (one-sided) 밀봉 유리 모세관에 로딩하고, EPR에 의해 스캐닝한다. 비히클 대조군을 사용한다. 스펙트럼은 실온 또는 37℃에서 2 mW의 마이크로파 전력 및 1G의 변조 진폭으로서 100 G에 걸쳐 3회 스캔 (각각 2분)의 평균에 의해 얻는다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 샘플은 교환전 신호를 확립하기 위해 4℃에서 스캐닝한다. 이어서, 샘플을 37℃로 승온하고, 2분, 4분, 6분, 10분 또는 10분 초과의 시간 동안 스캐닝을 계속한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 농도로 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)에 첨가된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 농도로 첨가된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)에 약 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml 또는 1.1 mg/ml 초과의 임의의 농도로 첨가된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml 또는 1.1 mg/ml 초과의 임의의 농도로 첨가된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 (예를 들어, 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, CSF 등), 합성 샘플) 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 시험관내 혈액 샘플 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 생물학적 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 샘플은 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 합성 샘플이다. 추가의 실시양태에서, 샘플은 항응고제를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 항응고제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 진공용기 내로 수집된다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수집 후에 본 발명의 방법에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 개체로부터 수집 후에 본 발명의 방법에 의해 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)은 분석 전에 동결된다. 몇몇 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는)은 분석 전에 1회 또는 2회 사이클의 동결 및 해동을 거친다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 분석 전에 동결된다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 분석 전에 1회 또는 2회 사이클의 동결 및 해동을 거친다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후 시간에 걸쳐 모니터링한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, 1.0 min, 1.5 min, 2.0 min, 3.0 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 30 min, 60 min, 또는 60 min 초과 중의 하나 이상의 시간에서 모니터링한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭이 측정된다. 중앙 피크의 진폭은 기준선과 중앙 피크에 대해 검출된 기준선으로부터의 최대 신호 사이의 거리의 척도이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 음성 대조군의 EPR 스펙트럼에 비해 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는) 내의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 차이는 HDL에 대한 지단백질의 결합의 차이를 나타낸다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 음성 대조군의 EPR 스펙트럼에 비해 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 차이 HDL에 대한 지단백질의 결합의 차이를 나타낸다. 스핀 표지된 지단백질 프로브 상의 스핀 표지의 위치에 따라, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 중앙 피크의 진폭의 증가 또는 중앙 피크의 진폭의 감소에 의해 표시된다. 지단백질 상의 특이적 부위에서 스핀 표지의 EPR 스펙트럼에 영향을 주는 인자는 영역 적응성 및 용매 접근성을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 증가는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 증가는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 감소는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 감소는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는, apoA-I 단백질의 잔기 219에 위치한 시스테인 잔기에 공유 연결된 니트록시드 스핀 표지를 갖는 apoA-I 단백질인 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 그의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가에 의해 표시된다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는, apoA-I 단백질의 잔기 111에 위치한 시스테인 잔기에 공유 연결된 니트록시드 스핀 표지를 갖는 apoA-I 단백질인 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 그의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가에 의해 표시된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 중앙 피크의 진폭의 변화는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합시에 변하지 않는 EPR 스펙트럼의 가까운 피크 및/또는 먼 피크의 진폭에 대해 측정된다. 따라서, 가까운 피크 또는 먼 피크의 진폭은 예를 들어 스핀 표지의 켄칭 여부를 나타냄으로써 내부 대조군으로 기능할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, EPR 스펙트럼의 프로파일의 변화는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 자기장 강도에 대한 중앙의 이동은 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 증가된 자기장 강도 (스펙트럼의 X축을 따라 우측으로 이동)에 의해 표시된다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 감소된 자기장 강도 (스펙트럼의 X축을 따라 좌측으로 이동)에 의해 표시된다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 결합 속도로서 측정된다. EPR 스펙트럼은 시간에 걸쳐 수집되고, 예를 들어 중앙 피크의 진폭의 변화에 의해 측정된 EPR 스펙트럼의 변화는 시간에 대해 플로팅된다. 플롯의 곡선의 기울기는 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 속도를 나타낸다. 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL에 대한 빠른 결합 속도는 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 높은 능력을 반영한다. 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL에 대한 느린 결합 속도는 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 반영한다. 혈액 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 속도는 시험 혈액 샘플 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 평가하기 위해서 심혈관 질환의 위험이 낮거나 높은 개체로부터의 혈액 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 속도와 비교될 수 있다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 평형 결합까지의 시간으로서 측정된다. EPR 스펙트럼은 시간에 걸쳐 수집되고, 예를 들어 중앙 피크의 진폭의 변화에 의해 측정된 EPR 스펙트럼의 변화는 시간에 대해 플로팅된다. 평형 결합까지의 시간은 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 결합 속도가 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 결합의 해리 속도와 동일한 시간으로 측정된다. 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 평형 결합까지의 시간은 양성 대조군 또는 정상적인 역 콜레스테롤 수송을 보이는 하나 이상의 개체, 예를 들어 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 혈액 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합 정도와 비교될 수 있다. 약 5 min의 평형 결합까지의 시간은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 정상적인 능력을 나타낸다. 약 10 min 이상의 평형 결합까지의 시간은 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합은 HDL 결합의 정도로서 측정된다. 상기 측정은 종점 측정이다. EPR 스펙트럼은 시간에 걸쳐 수집되고, 예를 들어 중앙 피크의 진폭의 변화에 의해 측정된 EPR 스펙트럼의 변화는 시간에 대해 플로팅된다. 결합 정도는 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 결합 속도가 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 결합의 해리 속도와 동일한 평형 결합으로 측정된다. 스핀 표지된 지단백질의 HDL에 대한 결합 정도는 양성 대조군 또는 정상적인 역 콜레스테롤 수송을 보이는 하나 이상의 개체, 예를 들어 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 혈액 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합 정도와 비교될 수 있다. HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합의 정도는 양성 대조군 또는 정상적인 역 콜레스테롤 수송을 보이는 하나 이상의 개체, 예를 들어 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 샘플 내의 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질의 결합 정도와 비교될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 80% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 80% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 80% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 70% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 70% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 60% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 60% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 50% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 50% 이하의, 시험 샘플로부터의 HDL에 대해 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 HDL 결합의 정도는 시험관내 혈액 샘플 중 HDL의 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL의 전이 온도가 결정된다. HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 상이한 온도, 예를 들어, 0℃, 4℃, 10℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃ 또는 37℃에서 샘플에 첨가되고, EPR 스펙트럼이 수집된다. HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 상이한 온도, 예를 들어, 0℃, 4℃, 10℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃ 또는 37℃에서 샘플에 첨가되고, EPR 스펙트럼이 수집된다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브가 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브는 시험관내 혈액 샘플에 첨가된다. 동일한 샘플의 EPA 스펙트럼을 온도를 증가시키거나 감소시킴으로써 상이한 온도에서 수집한다. 예를 들어, EPR 스펙트럼은 0℃에서 수집할 수 있고, 이어서 온도를 10℃로 상승시키고 EPR 스펙트럼을 수집하고, 이어서 온도를 20℃로 상승시키고 EPR 스펙트럼을 수집하고, 이어서 온도를 37℃로 상승시키고 EPR 스펙트럼을 수집한다. 몇몇 실시양태에서, 단일 샘플로부터의 EPR 스펙트럼은 37℃에서 수집한 후, 20℃에서, 이어서 10℃에서, 이어서 0℃에서 수집한다. 온도의 임의의 조합에서의 EPR 스펙트럼의 수집이 고려된다. HDL의 전이 온도는 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합하는 최저 온도에 의해 표시되고, 이것은 EPR 스펙트럼의 변화에 의해 반영된다. 약 25℃ 이사으이 전이 온도는 역 콜레스테롤 수송의 감소된 능력을 갖는 HDL 또는 기능장애성 HDL을 나타낸다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 포유동물로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 본원에 설명된 바와 같은 인간 생물학적 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 인간 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비-인간 포유동물로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 비-인간 포유동물로부터의 것이다.
본 발명은 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가한 후, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼을 측정함으로써 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 비-인간 포유동물로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 심혈관 질환의 위험이 있는 개체로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 개체는 당뇨병이 있다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 개체는 비만이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집된다. 이어서, 수집된 EPR 스펙트럼을 하나 이상의 음성 대조군 및/또는 하나 이상의 양성 대조군에 비교한다. 음성 대조군은 지질-미함유 또는 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼일 수 있다 (예를 들어, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 ESR 스펙트럼은 혈액 샘플에 존재하는 프로브에서 수집되지 않고; 예를 들어, 프로브는 예를 들어, 적합한 완충제 또는 다른 용매 시스템에 존재한다). 양성 대조군은 지질, 예컨대 디미리스토일포스파티딜 콜린에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브일 수 있거나 (예를 들어, 여기서 프로브 및 지질은 ESR 스펙트럼이 수집될 때 예를 들어 적합한 완충제 또는 다른 용매 시스템에 존재한다) 또는 심혈관 질환의 위험이 없는 개체로부터의 혈액 샘플 중 HDL에 결합한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 과거 스펙트럼일 수 있다. 양성 대조군에 비해 개체로부터의 혈액 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송의 보다 낮은 능력은 심혈관 질환의 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상의 80%의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 심혈관 질환의 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상의 70%의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 심혈관 질환의 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상의 60%의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 심혈관 질환의 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 정상의 50%의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 심혈관 질환의 위험을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 심혈관 질환의 위험이 있는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 당뇨병을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환의 위험이 있는 인간은 비만인 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 아테롬성동맥경화증이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 말초 혈관 질환이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 졸중이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 모니터링하는 방법을 제공하고, 여기서 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 심혈관 질환에 대한 요법을 받고 있는 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 과정 동안 시간에 걸쳐 모니터링한다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 개시 전에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법 전, 동안 및/또는 후에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환 또는 졸중이다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시간에 걸쳐 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력의 감소는 치료 효능의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시간에 걸쳐 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력의 감소는 질환 병태의 재발을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 심혈관 질환에 대한 요법을 받고 있는 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 심혈관 질환의 재발 또는 재발 위험을 평가하기 위해서 요법의 과정 후에 시간에 걸쳐 본 발명의 방법에 의해 모니터링된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 요법의 과정을 모니터링하는 방법을 제공하고, 여기서 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 CSF 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 알츠하이머 질환에 대한 요법을 받고 있는 개체로부터의 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 과정 동안 시간에 걸쳐 모니터링한다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 CSF 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법의 개시 전에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체로부터의 CSF 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 측정된 요법 전, 동안 및/또는 후에 측정된다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시간에 걸쳐 HDL의 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 능력의 감소는 치료 효능의 감소를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 시간에 걸쳐 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력의 감소는 질환 병태의 재발을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 알츠하이머 질환에 대한 요법을 받고 있는 개체로부터의 CSF 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 알츠하이머 질환의 재발 또는 재발 위험을 평가하기 위해서 요법의 과정 후에 시간에 걸쳐 본 발명의 방법에 의해 모니터링된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 치료제를 평가하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 혈액 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집되고, 시험 동물은 요법에 적용되었다. 몇몇 실시양태에서, 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)은 요법의 시행에 의해 요법에 적용되었다. 역 콜레스테롤 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 결정되고, 여기서 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 비-인간 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 치료제를 평가하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 샘플 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체로부터의 CSF 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼이 수집되고, 시험 동물은 요법에 적용되었다. 몇몇 실시양태에서, 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)은 요법의 시행에 의해 요법에 적용되었다. 역 콜레스테롤 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력은 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 결정되고, 여기서 시험 동물로부터의 CSF 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 비-인간 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 혈액 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하고, 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 비-인간 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 내의 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 샘플에 첨가함으로써 측정되고, 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하고, 요법을 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하고, 여기서 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)로부터의 CSF 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 비-인간 시험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이 또는 돼지이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다.
키트
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 역 콜레스테롤 수송은 콜레스테롤 유출 잠재력이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 약 40%, 30%, 20% 또는 10% 또는 그 미만이 저밀도 지단백질 (VLD) 또는 초저밀도 지단백질 (VLDL)과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE4 또는 apoE2이 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE2가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE4가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 인간 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 비-인간 포유동물 지단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 개체에서 요법의 과정을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)의 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE4 단백질이 아니다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 CSF 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 개체에서 알츠하이머 질환이 발생하거나 존재할 위험을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 CSF 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 개체에서 요법의 과정을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 개체 (예를 들어, 비-인간 시험 동물)의 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정함으로써 알츠하이머 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법을 평가하기 위한 키트를 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 인간 apoA-I 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 은 서열 1의 서열 또는 그의 단편을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 프로브는 각각 apoA-I 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-I 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 이것은 무작위 방식으로 스핀 표지의 일부가 apoA-I 단백질에 부착된 스핀 표지된 apoA-I 단백질을 생성할 위험을 감소시키면서 스핀 표지를 apoA-I 단백질 상의 단일 부위에 특이적으로 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 유전적으로 조작된 단일 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 apoA-I의 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 유전적으로 조작된 시스테인에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 apoA-I 단백질의 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 217에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 217에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 217의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 26에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 26에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 26의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 44에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 44에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 44의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 64에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 64의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 64의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 101에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 101의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 101의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 111에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 111에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 111의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 98에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 98에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 98의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 167에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 167에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 167의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 226에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 226에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 226의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 샘플 (예를 들어 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoA-II 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoA-II 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-II 단백질은 신호 펩티드에 위치하는 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 성숙 apoA-II 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 성숙 apoA-II 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 24 내지 잔기 100의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 전구체는 신호 펩티드 내의 천연 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질의 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoE 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 인간 apoE 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE3 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE4 단백질이 아니다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE2 단백질이 아니다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoE 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoE 단백질은 하나는 신호 펩티드에 위치하고 하나는 성숙 apoE 단백질에 위치하는 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 천연 시스테인 잔기를 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질은 지단백질의 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질의 모방체는 apoA-I의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F 및 4f-Pro-4F이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체 내의 단일 부위에서 모방체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체의 중앙에 위치한다. ApoA-I 모방체 4F는 Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2 (서열 6)의 아미노산 서열을 갖고, 4F-Pro-4F는 프롤린 잔기에 의해 연결된 4F의 직렬 이량체이다 (문헌 [Wool, GD et al. (2009) J. Lipid Res. 50:1889-1900]). 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 비-인간 포유동물 apoE 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소 원자이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 니트록시드이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 및 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트가 아니다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위해 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 혈액 내에서 HDL의 역 콜레스테롤 수송 능력을 측정하기 위해 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 그러한 스페이서는 스핀 표지와 지단백질 사이의 거리를 조정할 수 있고, 지단백질에 부착될 때 스핀 표지의 구속에 영향을 줄 수 있다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 농도로 제공하도록 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 약 0.3 mg/ml의 농도로 제공하도록 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 약 0.8 mg/ml 초과의 농도로 제공하도록 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 항응고제 및/또는 혈액 샘플의 수집을 위한 진공채혈기를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 키트의 스핀 표지된 지단백질은 스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법에 사용하기 위해 제제화된다. 몇몇 실시양태에서, 키트의 스핀 표지된 지단백질은 스핀 표지된 지단백질의 EPR 분광법에 의해 시험관내 혈액 샘플에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법에 사용하기 위해 제제화된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 샘플은 합성 샘플이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비-인간 포유동물로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 진공용기 내로 수집된다. 몇몇 실시양태에서, 혈액 샘플은 개체로부터 진공용기 내로 수집된다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플)의 EPR 분석에 적합한 완충제, 시린지 등을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 혈액 샘플의 EPR 분석에 적합한 완충제, 시린지 등을 추가로 포함한다.
본원에서 설명되는 조성물에 적합한 용기는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 바이알 (예를 들어, 밀봉 바이알), 통 (vessel), 앰퓰, 병, 단지, 신축성 용기 (예를 들어, sealed Mylar 또는 플라스틱 bags) 등을 포함한다. 또한, 조성물을 위한 용기는 모세관 또는 플랫셀 튜브를 포함할 수 있다. 이들 제품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 지침서는 일반적으로 라벨 또는 포장 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기기 판독가능 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 저장된 지침서)도 허용된다. HDL에 대한 높은 친화도를 갖는 스핀 표지된 지단백질의 사용에 대한 지침서는 일반적으로 사용에 대한 정보를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본원에서 설명되는 스핀 표지된 지단백질은 동결건조되고 모세관 또는 플랫셀 튜브 (예를 들어, 유리 모세관 또는 당업계에 공지된 다른 튜브) 내에 제공될 수 있다. 모세관 또는 플랫셀 튜브는 또한 임의로 본원에서 설명되는 EPR 참조 표준물을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 튜브는 비-상자성 물질로 제조된다. 몇몇 실시양태에서, 튜브는 유리, 플라스틱, 중합체 또는 석영을 포함한다. 튜브의 내부는 임의의 치수일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 튜브의 내부는 원형이다. 몇몇 실시양태에서, 튜브의 내부는 직사각형이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 튜브의 내부는 평평한 직사각형이다. 몇몇 실시양태에서, 튜브는 단일-구멍 튜브이다. 몇몇 실시양태에서, 튜브는 다중-구멍 튜브이다.
조성물
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질은 약 40%, 30%, 20% 또는 10% 또는 그 미만이 저밀도 지단백질 (VLD) 또는 초저밀도 지단백질 (VLDL)과 결합하는 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, HDL은 HDL3이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE4 또는 apoE2가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE2가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 apoE4가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 인간 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 비-인간 포유동물 지단백질이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 인간 apoA-I 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I는 서열 1의 서열 또는 그의 단편을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 프로브는 각각 apoA-I 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-I 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 이것은 무작위 방식으로 스핀 표지의 일부가 apoA-I 단백질에 부착된 스핀 표지된 apoA-I 단백질을 생성할 위험을 감소시키면서 스핀 표지를 apoA-I 단백질 상의 단일 부위에 특이적으로 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 유전적으로 조작된 단일 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 apoA-I의 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 유전적으로 조작된 시스테인에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 apoA-I 단백질의 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 217에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 217에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 217의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 26에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 26에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 26의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 44에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 44에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 44의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 64에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 64의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 64의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 98에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 98에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 98의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 101에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 101의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 101의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 111에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 111에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 111의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 167에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 167에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 167의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 226에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 226에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트 또는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이고, apoA-I 단백질 (서열 2)의 위치 226의 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 비-인간 apoA-I이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoA-II 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoA-II 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoA-II 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-II 단백질은 신호 펩티드에 위치하는 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 성숙 apoA-II 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 성숙 apoA-II 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 24 내지 잔기 100의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 전구체는 신호 펩티드 내의 천연 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질의 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 비-인간 apoA-II 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoE 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 apoE 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 인간 apoE 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE3 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE4 단백질이 아니다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 apoE2 단백질이 아니다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoE 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoE 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoE 단백질은 하나는 신호 펩티드에 위치하고 하나는 성숙 apoE 단백질에 위치하는 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 천연 시스테인 잔기를 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, apoE 단백질은 비-인간 apoE 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질은 지단백질의 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질은 지단백질의 모방체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질의 모방체는 apoA-I의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F 및 4f-Pro-4F이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체 내의 단일 부위에서 모방체에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체의 중앙에 위치한다. ApoA-I 모방체 4F는 Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2 (서열 6)의 아미노산 서열을 갖고, 4F-Pro-4F는 프롤린 잔기에 의해 연결된 4F의 직렬 이량체이다 (문헌 [Wool, GD et al. (2009) J. Lipid Res. 50:1889-1900]).
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소 원자이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 니트록시드이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 및 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유부착된다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 인간 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 비-인간 포유동물 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 인간 지단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질은 비-인간 포유동물 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 샘플 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 합성 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈장 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 혈청 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 CSF 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 돼지 등)이다. 몇몇 실시양태에서, 시험관내 혈액 샘플은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그 또는 돼지로부터의 것이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 돼지 등)이다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 항응고제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-II 단백질 또는 그의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질 또는 그의 단편은 각각 apoA-II 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질 또는 그의 단편 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-II 단백질은 신호 펩티드에 위치하는 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 성숙 apoA-II 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 성숙 apoA-II 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 24 내지 잔기 100의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-II 전구체는 신호 펩티드 내의 천연 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하도록 조작되고 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 또 다른 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-II 단백질의 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 비-인간 apoA-II 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소 원자이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 니트록시드이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 및 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트가 아니다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유부착된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-II 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-II 단백질은 인간 apoA-II 단백질이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F 및 4f-Pro-4F이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 모방체 내의 단일 부위에서 모방체에 공유적으로 부착된다. ApoA-I 모방체 4F는 Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2 (서열 6)의 아미노산 서열을 갖고, 4F-Pro-4F는 프롤린 잔기에 의해 연결된 4F의 직렬 이량체이다 (문헌 [Wool, GD et al. (2009) J. Lipid Res. 50:1889-1900]).
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 자유 전자를 보유하는 원자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 자유 전자를 보유하는 원자는 질소 원자이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 니트록시드이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 및 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 과중수소화된 스핀 표지이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 모방체는 인간 apoA-I 단백질의 모방체이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 인간 apoA-I 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I는 서열 1의 서열 또는 그의 단편을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편 상의 단일 잔기에 위치한다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 프로브는 각각 apoA-I 단백질 내의 단일 아미노산 잔기에 위치하는 2개의 스핀 표지를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 또는 그의 단편에 비-공유적으로 부착되거나 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 내의 시스테인 잔기에 부착된다. 천연 apoA-I 단백질은 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I은 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된다. 이것은 무작위 방식으로 스핀 표지의 일부가 apoA-I 단백질에 부착된 스핀 표지된 apoA-I 단백질을 생성할 위험을 감소시키면서 스핀 표지를 apoA-I 단백질 상의 단일 부위에 특이적으로 유도하는 수단을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 단일 시스테인 잔기를 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에 위치하도록 조작된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위에서 유전적으로 조작된 단일 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 잔기 188 내지 잔기 243의 임의의 부위의 잔기에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 유전적으로 조작된 시스테인에 부착된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 부위 98, 111 또는 217에서 apoA-I 단백질의 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기는 시스테인 잔기에 의해 대체되었다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 217에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 217에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 26에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 26에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 44에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 44에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 64에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 64에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 98에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 98에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 101에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 101에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 111에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 111에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 167에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 167에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질의 잔기 226에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 apoA-I 단백질 (서열 2)의 부위 226에서 유전적으로 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질에 비-공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질과 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 티오술포네이트 연결을 통해 지단백질 상의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 본원에서 설명되는 생물학적 또는 합성 샘플) 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 시험관내 혈액 샘플 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 지단백질은 apoA-I 또는 그의 단편이고, 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트이다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 사용하여 지단백질에 공유 속박된다. 스페이서 모이어티의 예는 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 스핀 표지는 메틸티오술포네이트 연결, 에틸티오술포네이트 연결, 프로필티오술포네이트 연결, 또는 부틸티오술포네이트 연결을 통해 지단백질에 공유적으로 부착된다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 비-인간 포유동물 apoA-I 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, apoA-I 단백질은 인간 apoA-I 단백질이다.
시험 스트립
몇몇 측면에서, 본 발명은 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 결정하기 위한 시험 스트립을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 시험 스트립을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 시험 스트립은 스핀 표지된 지단백질 프로브 및 고체 지지체를 포함하고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 본원에서 설명되는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고, 스핀 표지된 지단백질 프로브는 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 스트립은 중합체 또는 셀룰로스 베이스로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 스트립은 관찰되는 자기장 범위 (3000 내지 4000 가우스)에서 고유한 낮은 EPR 시그너처 (signature)를 보유한다. 몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 고체 지지체를 포함한다. 몇몇의 예에서, 중합체는 흡수성일 수 있거나 또는 흡수성 시약 패드가 중합체에 부착된다. 예를 들어, 흡수성 시약 패드는 셀룰로스 스트립만큼 간단하거나 또는 친수성 중합체만큼 복잡하고, 여기서 EPR 스핀 프로브 및 EPR 참조 표준물이 흡수되거나 공유적으로 부착된다. 시험 스트립을 위해 사용될 수 있는 물질의 예는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 시험 스트립에 사용하기 위한 물질은 상업적으로 이용가능한 흡착성 물질, 예컨대 밀리포어 (Millipore), 와트만 (Whatman) 또는 폴 (Pall)로부터 상업적으로 이용가능한 것을 포함한다. 본 발명의 시험 스트립은 EPR 분광계에 사용하기 위해 설계된다. 본 발명의 시험 스트립은 EPR 분광계에 사용하기 적합하다면 임의의 특정 형태 또는 크기로 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 시약 스트립은 EPR 스핀 프로브 및 EPR 참조 표준물을 흡수하여 고정시키고, 프로브를 인간 혈장 샘플에 효율적으로 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 규정량의 EPR 참조 표준물은 중합체 또는 흡수성 시약 패드 상에 함침된다. 또한, EPR 스핀 프로브는 스트립의 중합체 또는 흡수성 시약 패드에 함침되거나, 흡수되거나 또는 흡착될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, EPR 참조 표준물 및 EPR 스핀 프로브 둘 모두가 중합체 또는 흡수성 시약 패드 내로 함침된다. 유사한 스트립 조성물의 다소 유사한 예는 포도당 시험 스트립 또는 케톤 시험 스트립이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 니트록시드 스핀 표지를 보유하는 apoA-I 단백질 또는 HDL-특이적 펩티드 또는 중합체를 포함하는 EPR 스핀 프로브를 제공한다. 니트록시드 프로브는 지질-미함유시와 HDL 결합시에 상이한 EPR 스펙트럼을 보유할 수 있다. 차이의 정도는 HDL 기능의 척도이다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 시험 스트립 상에서 건조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 물질은 공유 연결을 통해 그의 표면에 화학적으로 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, 물질은 정전기적 연결을 통해 그의 표면에 화학적으로 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, 물질은 소수성 연결을 통해 그의 표면에 화학적으로 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, 물질은 공유, 정전기적, 및 소수성 연결의 임의의 조합을 통해 그의 표면에 화학적으로 부착될 수 있다.
본 발명은 그의 검출 변화가 니트록시드 프로브의 검출 변화에 반영되도록 EPR 스핀 프로브 상의 니트록시드 표지와 유사한 특성을 갖는 니트록시드 프로브와 별개의 EPR 스펙트럼을 갖는 안정한 상자성 라디칼일 수 있는 EPR 참조 표준물을 제공한다. 몇몇 측면에서, EPR 참조 표준물의 목적은 검정의 정규화를 위한 것이다. 예를 들어, 잘 규정된 양의 EPR 참조 표준물은 스트립의 중합체 또는 흡수성 시약 패드 내로 함침된다. 이 예에서, EPR 참조 표준물은 시험자로 하여금 EPR 기기의 동적 범위를 공지의 반응으로 보정할 수 있도록 한다. EPR 스핀 대조군의 예는 테트라메틸피페리딘 (템포, 템폴, 타민), TCNQ (테트라시아노퀴노디메탄), BZONO, SLPEO 및 유사한 변이체이다. 비-피롤린 니트록시드 스핀 표지가 EPR 스핀 프로브에 대해 사용될 경우, 피롤린-기반 스핀 표지가 참조 표준물로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 스트립의 중합체 또는 흡수성 시약 패드 상으로 건조되거나 화학적으로 부착될 수 있다.
시험 스트립 판독에 사용되는 기기는 EPR 분광계의 공명강 내의 특이적 위치에 EPR 스트립을 위치시키는 부착기가 설치된 EPR 분광계이다. 몇몇 경우에, 기기 내의 스트립의 위치는 시험 스트립의 특이적 절편을 정확한 기하학적 위치에서 조사할 때 매우 중요하다. 일반적으로, 기기는 전자기 스펙트럼의 X-대역 (7.0 내지 12 GHz) 및 3000 내지 4000 가우스의 자기장 강도의 신호를 검출할 것이다.
적어도 2가지 방식의 용법이 고려된다. 제1의 비제한적인 예에서, 스트립은 EPR 스핀 대조군 시약 단독으로 함침된다. EPR 프로브는 샘플, 예컨대 혈장 (또는 본원에 설명되는 다른 샘플)과 조합되고, 특정 부피로 스트립에 투입된다. 몇몇 예에서, 혼합물은 스트립 상에서 실온에서 5분 (최소) 동안 반응하고, EPR 분광계 내로 삽입되고, 스펙트럼을 얻는다. 본 발명의 제2의 비제한적인 측면에서, 특정량의 혈장을 EPR 스핀 프로브 및 EPR 스핀 대조군으로 함침된 시험 스트립에 첨가하고, 스트립 상에서 실온에서 5분 동안 반응시킨다. 두 경우 모두에서, EPR 스핀 대조군은 상대적인 신호 강도를 확립할 수 있고, 이것은 기기를 보정하기 위해 사용될 것이다. EPR 스핀 프로브로부터 신호는 혈장 내의 HDL에 대한 EPR 스핀 프로브의 상대적인 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 시험 스트립은 또한 규정량의 HDL 변형 치료제 (예를 들어, 효능에 대해 시험되는 치료 조성물, 감수성 등에 대해 시험되는 진단 조성물)의 존재 하에 사용될 수 있다. 치료제는 EPR 스핀 프로브 또는 EPR 참조 표준물이 규정량으로 인간 혈장에 첨가될 때 스트립 내에 도입될 수 있고, 스트립에 대한 EPR 분광분석을 통해 후속적으로 분석된다.
2상 용기
몇몇 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 용기를 제공하고, 여기서 용기의 내부는 2상이다. 몇몇 실시양태에서, 2상 용기는 고체 물질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 샘플 내의 고체 또는 고체-유사 물질의 포획을 위한 물질을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용되는 샘플이 용기에 첨가되고 샘플 내의 고체 또는 고체-유사 물질이 샘플 내의 하나 이상의 액체로부터 분리되는 2상 용기를 제공한다. 예를 들어, 물질은 세포를 혈장 또는 혈청으로부터 분리할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 용기 내의 물질은 샘플 내의 하나 이상의 액체로부터의 하나 이상의 고체 또는 고체-유사 물질에 결합하거나, 이를 포획하거나, 다른 방식으로 분리한다.
몇몇 실시양태에서, 용기 내의 물질은 공간-충전 물질, 예컨대 필터, 메쉬 (mesh), 스폰지, 또는 스폰지 유사 물질이다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 고체 대역 및 액체 대역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 면화, 셀룰로스, 또는 중합체, 예컨대 비닐이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 용기 내의 물질은 샘플 내의 하나 이상의 고체를 샘플 내의 하나 이상의 액체로부터 분리한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 용기 내부의 일부를 차지한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 용기의 제1 말단부를 차지한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 용기의 제2 말단부를 차지한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 용기의 중앙부를 차지한다. 몇몇 실시양태에서, 물질은 용기의 내부 전체에 걸쳐서 발견된다.
몇몇 실시양태에서, 물질은 항응고제로 함침된다. 몇몇 실시양태에서, 항응고제는 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트이다.
몇몇 실시양태에서, 용기는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 약물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 스핀 표지된 지단백질 프로브 및 약물을 포함한다. 상기 실시양태의 추가의 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브 및/또는 약물은 건조 분말 형태 (예를 들어 동결건조된)로 존재한다. 상기 실시양태의 다른 실시양태에서, 스핀 표지된 지단백질 프로브 및/또는 약물은 액체 제제로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하기 전에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가한 후에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하는 것과 동시에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하기 전에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 샘플에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하기 전에 약물을 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가한 후에 약물을 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하는 것과 동시에 약물을 용기에 첨가한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플을 용기에 첨가하기 전에 약물을 샘플에 첨가한다.
몇몇 실시양태에서, 용기는 튜브, 플랫셀 튜브 또는 모세관이다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 비-상자성 물질로 제조된다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 유리, 플라스틱, 중합체 또는 석영을 포함한다. 튜브의 내부는 임의의 치수일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 용기의 내부는 원형이다. 몇몇 실시양태에서, 용기의 내부는 직사각형이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 용기의 내부는 평평한 직사각형이다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 단일-구멍 용기이다. 몇몇 실시양태에서, 용기는 다중-구멍 용기이다.
예시적인 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 별도의 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명백하게 달리 언급하지 않으면, 개시된 각각의 특징은 단지 포괄적인 일련의 동등한 또는 유사한 특징의 예이다.
<실시예>
전적으로 본 발명을 예시하려고 의도되고 따라서 어떠한 식으로도 본 발명을 제한하려고 간주되지 않아야 하는 실시예는 상기 논의된 본 발명의 측면 및 실시양태들을 서술하게 상세히 기재한다. 달리 지시되지 않으면, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 상기한 예 및 상세한 설명은 예시로 제공되고 제한하지 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 및 특허는 각각의 개별 공개, 특허 출원, 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 특히, 본원에 언급된 모든 공개는 본 발명과 연관되어 사용될 수도 있는 조성물 및 방법을 설명하고 개시하는 목적으로 명백하게 본원에 참고로 포함된다. 상기한 발명은 이해의 명확성을 위한 예시 및 예에 의해 약간 상세히 설명되지만, 당업자는 본 발명의 교시내용에 비추어 첨부된 특허청구범위의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다.
실시예 1: ApoA -I 결합/대체의 겔-기반 분석.
ApoA-I은 하나의 지단백질 풀로부터 다른 것으로 이동시키고 또한 지질-소량함유 단백질로서 지단백질 풀을 빠져나올 수 있는 단백질의 클래스인 아포지단백질의 교환가능한 패밀리의 구성원이다 [50]. 지단백질 입자들 사이에서 아포지단백질의 교환은 지질 대사의 중심 요소이다. apoA-I의 교환이 대체 반응이라는 유의한 증거가 있지만, HDL 입자로부터 apoA-I의 직접 결합 및 대체는 직접적으로 입증되지 않았다. HDL 상의 잔류 apoA-I이 외부 첨가된 지질-미함유/지질-소량함유 apoA-I과 평형을 이룰 수 있는지 여부를 검사하였다. Alexa350 표지된 apoA-I 변이체 (위치 E136에서 표지된)를 사용하여 형광 rHDL을 생성하였다. 상이한 크기의 rHDL 입자 (7.8, 8.4 및 9.6 nm)를 Alexa350 표지된 apoA-I로 재구성하고, 이전에 설명된 바와 같이 정제하였다 [51]. 정제된 rHDL을 37℃에서 7일까지 동안 1:5의 단백질:단백질 몰비에서 비표지된 지질-미함유 apoA-I과 함께 인큐베이팅하였다. 지단백질을 비-변성 구배 겔 전기영동 (NDGGE)에 의해 검사하였다. 처음 5시간 이내에, 지질-미함유 단백질 풀 내로 90% 초과의 Alexa350 표지된 apoA-I의 급속한 방출이 존재하였다 (도 11). 입자는 37℃에서 24시간까지 안정하였고, 이것은 HDL로부터 apoA-I 결합/대체가 HDL 입자의 분해 또는 광범한 재형성 때문이 아님을 나타낸다. 외인성 지질 미함유 apoA-I이 Alexa350 표지될 때 유사한 결과가 얻어졌다 [51]. apoA-I 결합/대체의 속도는 ABCA1을 통해 콜레스테롤을 유출하는 그 rHDL의 상대적인 능력을 반영하였다. 9.6 nm 입자는 가장 느린 속도의 apoA-I 결합/대체를 보이고, 7.8 nm 입자는 가장 빠른 속도의 apoA-I 결합/대체를 보였다. 7.8 nm 입자는 ABCA1 매개된 콜레스테롤 유출에 대한 바람직한 기질이다. 상기 apoA-I 대체 과정은 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP) [53], 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT) [54, 55], 인지질 전달 단백질 (PLTP) [56, 57] 및 간 리파제 [58]와 같은 혈장 인자의 존재에 의해 유의하게 가속화되었다 (~5 min) [41, 52].
실시예 2: ApoA -I 교환의 FRET -기반 분석.
apoA-I 결합/대체의 겔-기반 평가가 정보를 주기는 하지만, 상기 방안의 시간척도 및 분해능은 산화 상태 및 HDL 입자 조성물에서 변경으로부터 생기는 결합/대체 동역학에서 복잡한 차이를 해석할 수 없다. 겔-기반 방안의 상기 단점을 처리하기 위해, 지질-미함유 상태 및 지질-결합된 상태의 apoA-I 입체형태에 기반한 형광 공명 에너지 전달 (FRET)-기반 검정이 개발되었다. FRET는 잔기들이 한 입체형태에서 근위이고 또 다른 입체형태에서 원위인 경우에 단백질의 입체형태적 상태를 추론하기 위해 유용한, 단백질 내의 잔기간 거리를 결정할 수 있는 강력한 기술이다. FRET의 유효 범위는 10 - 75 Å이고, 이것은 지질-미함유 apoA-I 대 지질-결합된 apoA-I에 대해 적합하다. 원자 거리는 공여자 형광단으로부터 수용자 형광단으로 에너지 교환의 정도에 의해 측정한다. 트립토판의 형광 특징을 이용하였고, 그의 방출 스펙트럼 (330 내지 350 nm)은 N-아이오도아세틸-N'-(5-술포-1-나프틸) 에틸렌디아민 (AEDANS)의 흡수 스펙트럼과 겹친다. 4개의 내인성 트립토판이 페닐알라닌으로 치환된 apoA-I 변이체를 생성하였다 (Trp 눌 apoA-I). WT의 대등한 ABCA1-매개 콜레스테롤 유출 활성에 의해 입증되는 바와 같이 [60], apoA-I에서 이들 Trp에서 Phe로의 치환은 단백질 구조 [59] 또는 기능을 유의하게 해를 끼치지 않았다. 트립토판 형광 공여자에서 AEDANS 형광 수용자 모이어티 사이의 거리는 440 nm에서 AEDANS 형광의 상대적인 수준에 의해 결정하였고 (도 12), 이것은 에너지 전달의 정도를 대표한다.
지질-미함유 상태 [61-63] 및 지질-결합된 상태 [64, 65]에서 apoA-I 구조의 이전의 조사에서는 아미노산 위치 19 및 136이 지질-미함유 apoA-I의 구조에서 근위이고 지질 결합된 apoA-I 구조에서 원위인 것으로 나타냈다 (도 12A 및 B). 원반상 HDL 상에서 연장된 나선 내로 지질-미함유 apoA-I 다발의 개방률을 측정하기 위해, Trp을 Trp 눌 apoA-I에서 위치 19에서 Val로 치환하고 (apoA-IW19), Cys를 위치 136에서 Glu로 치환하였다. 말레이미드 티올 화학을 이용하여, 도입된 시스테인을 AEDANS로 표지하기 위해 apoA-I 내의 내인성 시스테인의 부재를 이용하였다. 생성된 apoA-IW19:A136을 사용하여 rHDL을 생성하였다. 실시예 1에 설명된 겔-기반 검정에 유사하게, 형광 표지된 rHDL을 1:5 단백질:단백질 몰비에서 비표지된 apoA-I (Trp 눌 apoA-I)과 함께 인큐베이팅하였다. rHDL로부터 apoA-IW19:A136의 대체는 λmax (440 nm)에서 AEDANS 형광의 증가로서 관찰되었다. 이로부터, apoA-I 결합/대체의 비율 (용어 "교환 비율")을 결정하였다. 0 h에서 교환 반응 혼합물의 방출 스펙트럼을 0% 교환 및 최종 평형 상태에서 72 h에서 스펙트럼에 대한 참조로서 사용하였다 (최대 교환; 6개 실험의 평균) (도 13). 단일-지수 (Mono-exponential) 데이타-피팅 (fitting) 분석은 0.94 h의 지수 이완 시간 (50% 최대 교환까지 시간, τ)을 생성하였고, 이 측정치는 NDGGE에 의해 관찰된 apoA-I 결합/대체의 정성적 평가와 일치한다 (도 11). 형광 표지된 rHDL의 방출 스펙트럼은 단독으로 인큐베이팅할 때 동일한 기간 동안 변화를 보이지 않았고, 이것은 형광 방출 스펙트럼의 변화가 rHDL의 자발적 재형성의 결과가 아님을 추가로 나타낸다.
실시예 3. 교환 비율에 대한 산화의 효과.
apoA-I의 교환 비율에 대한 퍼옥시니트라이트 및 MPO에 의한 산화의 효과. 지질-미함유 Trp 눌 apoA-I을 MPO-H2O2-니트라이트 시스템 (반응성 질소 종의 강력한 공급원 [66])에 의해 산화시켰다. 지질-미함유 Trp 눌 apoA-I을 또한 퍼옥시니트라이트에 의해 산화시켰다. 이들 2가지 산화 방식 사이의 차이는 MPO-매개된 산화가 ABCA1에 의해 콜레스테롤을 유출하는 apoA-I의 능력의 심하게 감소시키는 [28, 30] 3-클로로티로신 및 3-니트로티로신의 강력한 공급원인 반면, apoA-I의 퍼옥시니트라이트 산화는 apoA-I의 ABCA1-매개 유출 능력의 유의한 감소를 일으키지 않는다는 것이다 [67]. 퍼옥시니트라이트 산화의 효과를 시험할 때, apoA-I 교환 비율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 5) [38]. 이와 반대로, MPO 산화는 2가지 집단의 apoA-I을 생성하였고, 여기서 하나는 정상적인 교환 정도를 갖고, 제2 집단 (57%)은 HDL-잔류 apoA-I과 교환하는 그의 능력이 심하게 손상되었다 [38]. 흥미롭게도, 유사한 조건 하에 apoA-I의 MPO 산화는 ABCA1에 의한 콜레스테롤 유출을 촉진하는 apoA-I의 능력의 현저하게 대등한 감소 (~50%)를 일으켰다 [31]. 이들 데이타는 HDL의 apoA-I 교환 비율 (달리 apoA-I HDL 결합/대체으로 언급한)이 그의 콜레스테롤 유출 능력을 반영함을 제안한다.
FRET-기반 검정은 HDL 기능에 대한 산화의 효과에 대한 통찰력을 제공한다. apoA-I 교환을 손상시키는 산화 반응은 ABCA1을 통해 콜레스테롤을 유출하는 apoA-I의 능력을 또한 억제하는 반면, apoA-I 교환에 해를 끼치지 않는 산화 반응은 ABCA1 매개된 콜레스테롤 유출을 또한 손상시키지 않는다. apoA-I 교환 비율을 측정하는 잠재적인 CAD 예측은 apoA-I의 교환 비율을 손상시키는 화학적 변형이 CAD의 증가된 발병률과 연관되는 당뇨병 [29, 68, 69], 비만, 및 흡연 [70-72]에서 관찰된 것과 유사하다는 사실에 의해 추가로 검증된다.
실시예 4. EPR 방법
EPR을 이용하여, 지질-미함유 상태 및 지질-결합된 상태의 apoA-I의 구조를 조사하였다. 9.6 nm의 apoA-I의 N-말단 구조에 대한 EPR 분석은 원반상 HDL을 재구성하였다 [65]. 상기 방법은 NMR과 유사하고, 스핀 표지의 구조적 미세-환경 (~10-15Å)에 대한 정보를 제공한다. 구체적으로, 상기 영역의 입체형태는 EPR에 의해 측정가능한 다음과 같은 3가지 주요 파라미터로부터 유도될 수 있다: 펩티드 백본 이동성 (도 5), 스핀 표지의 용매 접근성, 및 환경의 상대적인 유동성. 후자는 막 결합 단백질 및 근접 지질의 유동성을 조사하기 위해 가장 잘 적용될 수 있다. 허벨과 그의 동료들은 EPR 스펙트럼 선 형태의 조정을 특성화하였고 이들 변화와 연관된 특이적인 단백질 구조적 특징을 확인하였다 [73, 74]. 이로부터, 단백질 내의 스핀 표지된 부위의 EPR 스펙트럼의 형태로부터 구조적 결론을 내릴 수 있다. 따라서, 스핀 표지가 지질-미함유 상태 대 지질 결합된 상태에서 특유한 입체형태를 보유하는 apoA-I의 부분에 위치하는 경우에, EPR 스펙트럼은 이들 2가지 형태의 apoA-I을 구분하기 위해 사용될 수 있다.
인간 혈장 HDL 에 대한 ApoA -I의 결합. HDL로부터 apoA-I 결합/대체를 평가하기 위해 이전에 사용된 Alexa350 표지된 apoA-I (도 11)을 사용하여, 인간 혈장 내에서 지질-미함유 apoA-I의 결합 선호도를 조사하였다. 건강한 공복 상태의 여성 지원 공여자로부터 헤파린 처리된 인간 혈장에 Alexa350 표지된 apoA-I을 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 및 0.8 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 외인성 apoA-I을 갖는 혈장을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하고 NDGGE에 의해 분석하였다 (도 14). apoA-I의 1차 결합은 HDL 지단백질 분획에 제한된다. apoA-I의 유의한 부분이 직경 약 8.0 nm의 입자와 결합하지만, apoA-I은 또한 보다 큰 HDL 입자에 결합한다. 프리β HDL에 상응하는 겔의 영역 내에 몇몇 apoA-I이 존재한다. 본 실험에서 이루어진 중요한 관찰은 인간 혈장에 첨가된 apoA-I이 겔의 VLDL (최상부), LDL, 또는 알부민 부분에서 발견될 수 없다는 것이다. apoA-I은 NDGGE 상에서 HDL 지단백질 분획과 동시-이동하고 apoA-I은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것으로 보고되었기 때문에 [39], apoA-I은 HDL에 결합하고 스핀 표지로부터 모아진 데이타는 HDL의 보고 측면인 것 같다.
실시예 5. EPR 에 의한 인간 혈장 HDL 의 검사.
혈장 내의 HDL을 직접 평가하는 수단으로서 EPR을 사용하는 실행가능성을 평가하기 위해, 다음을 검사한다: 1) 상기 분석을 위한 새로 개선된 EPR 기기의 예민성; 2) 혈장 HDL에 대한 apoA-I의 특이성; 및 3) EPR 스펙트럼이 정상적인 및 CAD의 "위험이 있는" 환자로부터 수집된 인간 혈장 샘플들에서 차이를 밝힐 것인지 여부. 초기에, JEOL TE-100 EPR 분광계의 향상된 예민성이 생리학상 관련된 농도에서 apoA-I의 구조적 특징을 측정하기 위해 충분한지 여부를 시험하였다. ApoA-I 참조 샘플 (다양한 잘 특성화된 위치에서 스핀 표지된 apoA-I)을 재현가능한 신호가 검출될 수 없을 때까지 감소하는 농도에서 평가하였다. 상기 역치는 0.1 mg/ml이고, 이것은 혈장 내의 apoA-I의 생리학적 농도 미만이었다. 이들 연구를 위해, 0.3 mg/ml 스핀 표지된 apoA-I을 사용하였고, 이것은 최적 정도의 HDL 특이성을 제공하고 EPR 분광계 상에 강력하고 재현가능한 신호를 보유하기 때문이다.
표지를 특이적 위치에 놓기 위해 apoA-I 내에서 내인성 시스테인의 부재를 이용함으로써, 시스테인 치환된 변이체를 사용하여 ApoA-I을 표지한다 (도 15A). 상기 검정은 지질-미함유 및 지질-결합된 apoA-I 사이를 구분하는 능력에 의존적이므로, apoA-I 내의 위치 G217은 스핀 표지 부위로서 선택된다. apoA-I의 243개 아미노산의 240에서 apoA-I의 구조를 검사하였고, 단백질의 전체 길이를 따라 아래로 apoA-I 구조에 대한 지질 회합의 효과를 결정하였다. 잔기 G217의 EPR 스펙트럼은 지질 결합에 의해 영향을 받는다 (도 15B). 지질 결합 시에 EPR 스펙트럼의 상기 이동은 HDL 회합에 대한 매우 예민한 리포터 (reporter)로서 역할을 한다. 이것은 또한 apoA-I 내에서 그 위치에서 apoA-I 입체형태의 표시자로서 역할을 한다. 이와 반대로, 위치 A176은 지질에 의해 유의하게 영향을 받지 않고, 따라서 대다수의 apoA-I 잔기와 마찬가지로 지질 결합을 보고하기 위해 불량한 위치이다. 반응의 동적 범위는 G217에서 최대이지만, 지질화 시에 다른 잔기가 대등하게 변경되고 또한 리포터 위치로서 기능을 할 수 있다. 위치 G217에서 스핀 표지된 ApoA-I (apoA-ISL217)은 WT apoA-I과 거의 동일한 구조적 특성을 보유하고, WT apoA-I과 구분불가능한 방식으로 콜레스테롤을 유출하고 HDL을 형성한다. 결합을 정량하기 위해, 지질 결합된-apoA-I에 비해 중심 EPR 피크의 최대 진폭을 측정한다 (도 15, 화살표). 이것은 지질 회합의 정도의 신뢰가능한 측정치이다.
실시예 6. 건강한 및 위험이 있는 환자로부터 인간 혈장의 EPR 스펙트럼의 비교.
EPR 분광법이 혈장 내에서 환자의 HDL의 품질을 직접 평가하기 위해 실행가능한 방안인지 여부를 조사하기 위해, 4명의 환자의 혈장에서 apoA-ISL217의 EPR 스펙트럼을 비교하였다 (표 2). 2명의 개체는 정상적 지질 및 CAD 위험 프로파일을 갖는 것으로 특성화되었고, 다른 2명의 개체는 CAD에 대한 위험이 큰 것으로 특성화되었다. 환자는 결과 해석을 돕기 위해 HDL-C 및 apoA-I의 농도에 기반하여 일치된 환자였다.
Figure pct00006
샘플은 CHORI에서 기존의 혈장 은행으로부터 얻었다. 모든 기밀유지 및 인간 안전성 문제를 그들의 수집 동안 관찰하였다. 환자는 성별, 상대적인 HDL 수준, 및 채집/저장 방법에 기초하여 일치시켰다. 혈장은 헤파린 처리된 튜브에 수집하고 분석 전에 단지 1회 동결시켰다. 샘플 품질 대조군은 샘플 수집 및 취급의 차이가 결과에 최소로 기여하도록 보장하기 위해 면밀히 조사하였다.
검정에서, apoA-ISL217을 6.3 mg/ml의 농도에서 1:20 비 (v/v)로 혈장에 첨가하여, 혈장 내에 0.3 mg/ml apoA-ISL217을 생성하였다. 샘플을 즉시 JEOL TE-100 EPR 분광계에서 검사하고, 1.5, 4, 6, 8, 및 10분에 모니터링하였다. 사전의 EPR-기반 조사에서는 혈장 내에 재형성 효소의 존재 때문에 혈장 HDL에 대한 apoA-I 결합 속도가 빠른 것으로 결정하였다 [41, 52-58]. 모든 샘플에 대한 최대 회합은 10분 내에 일어났다 (4시간 후에 스펙트럼 변화의 결여에 의해 확인됨). 환자 N1 (매우 건강한 생활방식 및 지질 프로필을 가짐), 및 환자 D1 및 M1 (각각 당뇨병 및 대사 증후군이 있고 둘 모두 병적으로 비만임) 사이에 유의한 차이가 관찰되었다. ApoA-ISL217은 처음 5분 내에 환자 N1의 혈장의 HDL에 빠르게 결합하였고, 환자 D1 및 M1에서 결합은 훨씬 더 느리고, 각각 10 및 8분 후 최대였다 (도 8). 최대 HDL 결합의 정도는 또한 유사하게 영향을 받았고, 여기서 환자 N1은 apoA-I 결합에 대한 최대 능력을 나타내고 D1은 최저 능력을 나타냈다. apoA-ISL217의 포화 농도가 달성될 때까지 검정에서 apoA-ISL217 농도의 증가가 유사한 반응 정도를 일으키기 때문에, 이것은 이용가능한 HDL의 함수가 아니었다. apoA-ISL217의 포화 농도가 모든 개체에 대해 대등하다 (~1.9 mg/ml)는 것은 관찰된 상이한 반응이 환자 혈장 내의 HDL의 포화 때문이 아님을 지시한다.
환자 N2의 데이타는 CAD에 대한 위험이 낮은 것으로 나타났지만 결합 속도 및 반응의 정도는 환자 D1 및 M1 사이에 중간이었음에 주목한다. 상기 개체의 가족력이 이용가능하고, 적어도 1명의 부모 및 2명의 조부모가 CAD의 발병을 겪었다. 상기 환자는 이용가능한 임상 지표에 기반하여 상기 개체에서 본 검정에 대한 "위험이 있는" 반응을 관찰하는 것으로 예상되지 않았다. 그러나, 가족력은 가능한 유전적 성분이 존재하고 CAD의 임의의 임상 징후가 나타날 수 있기 전에 검출가능할 수 있음을 제안한다. 이와 반대로, 환자 N1은 심장 질환의 가족력이 없다. 연구가 통계상 유의하기 위해 충분히 크지 않지만, 상기 성과는 명백한 임상 징후의 부재에서도 CAD 위험에 대한 바이오마커가 될 가능성을 지시한다.
검정 결과에 대한 샘플 취급 및 수집 절차의 효과. 3가지 방식의 샘플 수집 (헤파린, 시트레이트 및 EDTA)의 효과를 관찰하였지만, 방법들 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 동결-해동 취급은 효소 및 수용체 상호작용과 같은 HDL 활성에 유의하게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 검정에 대한 반복된 동결-해동 사이클의 효과를 검사하였다. 동결-해동 사이클은 apoA-I 결합의 속도 및 정도를 모두 약 10% 감소시켰다. 흥미롭게도, 제3 동결-해동 후에, 상기 효과는 약 20%로 증가하였다. 보다 높은 TG 농도를 갖는 혈장 샘플이 각각 15 및 25%의 EPR 관찰가능한 결합에서 감소를 가지면서 동결-해동 변화에 보다 감수성이 있다는 것에 주목한다.
실시예 7. C57B1 /6 마우스 및 CH3 마우스로부터 EPR 스펙트럼의 비교.
C57B1/6 마우스는 유전적으로 정상이지만 심장 질환에 취약한 한편, C3H 마우스는 유전적으로 정상적이지만 심장 질환에 취약하지 않다. 역 콜레스테롤 수송에 대한 HDL의 감소된 능력을 확인하는 apoA-ISL217의 능력을 평가하기 위해, 이들 2가지 동물주로부터의 혈장을 분석하였다. C57B1/6 마우스에게 정상 식이를 제공한 한편, C3H 마우스에게 고-지방 식이를 제공하였다. 혈장 샘플을 마우스로부터 제거하고, apoA-ISL217을 1.4 mg/ml의 최종 농도로 혈장에 첨가하고, 즉시 EPR 스펙트럼을 수집하였다. 수집을 먼저 4℃에서 시작하여 기준선을 제공한 후, 온도를 37℃로 이동시키고, 스펙트럼을 300초까지 연속적으로 수집하였다. 샘플 스펙트럼을 도 16에 제시한다. 결과를 도 17에 그래프로 제시한다. C57B1/6 마우스로부터의 혈장 샘플은 C3H 마우스로부터의 혈장 샘플에 비해 스핀 표지된 프로브에 대한 감소된 결합을 보여주었다. 1마리의 C3H 마우스는 극도의 아웃라이어 (outlier)이었고 분석에 포함되지 않았음에 주목한다. 상기 아웃라이어에 대한 이유는 알려지지 않았다. 두 마우스 동물주에 대한 반응 시간은 낮았음에 또한 주목하고, 이것은 아마도 마우스 혈장에서 인간 apoA-I 프로브의 사용을 반영한다.
위치 111에서 스핀 표지를 갖는 제2 프로브를 지질에 결합 시에 apoA-I 구조의 변화를 검출하기 위한 위치 111에서 스핀 표지의 효용성을 보여주는 몇몇 샘플 (도 16, 하부 패널)에서 사용하였다.
실시예 8. HDL 에 대한 apoA -I 결합을 모니터링하기 위한 EPR 스펙트럼 위치
HDL에 대한 apoA-I 결합을 모니터링하기 위한 EPR 스펙트럼 위치는 등흡수점 (isobestic point)의 자기 강도를 확인함으로써 결정하였다. PBS 내의 15 ㎕ 양의 스핀 표지된 지단백질 프로브 (apoA-ISL217, 3 mg/ml)를 플랫셀 샘플 홀더 (holder)에서 인간 혈장의 45 ㎕ 샘플에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 유지하고, EPR 신호의 100 가우스 스윕 (sweep)을 얻었다 (2분에 걸쳐; X-대역에서). 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합을 모니터링하기 위한 위치를 결정하기 위해, 등흡수점의 0.15 m테슬라 업필드 (upfield)의 위치를 확인하였다. 등흡수점의 약 0.15 m테슬라 (1.5 가우스) 업필드의 피크를 연속적으로 관찰하고, 상기 위치의 반응을 시간에 따라 모니터링하였다.
실시예 9. HDL 에 대한 ApoA -I 결합
인간 혈장 내에서 HDL에 대한 ApoA-I 결합은 등흡수점의 약 0.15 m테슬라 (1.5 가우스) 업필드의 스펙트럼 위치를 연속적으로 모니터링함으로써 결정하였다. PBS 내의 15 ㎕ 양의 스핀 표지된 지단백질 프로브 (apoA-ISL217, 3 mg/ml)를 45 ㎕ 혈장 샘플에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 유지하고 37℃로 이동시켰다. 온도가 증가함에 따라, 등흡수점의 약 0.15 m테슬라 업필드 위치를 10분 동안 연속적으로 모니터링하였다. 상기 분석으로부터 HDL에 대한 apoA-I 결합의 다수 파라미터, 즉, 반응의 진폭 및 결합의 초기 속도의 기울기가 구분가능하였다. 보다 큰 진폭 및 결합의 초기 속도의 보다 큰 기울기는 보다 큰 유출 능력과 연관되었다. 고응답군은 건강한 개체로부터의 혈장이었다. 저응답군은 건강하지 않은 개체로부터의 혈장이었다.
실시예 10. 양성 및 음성 샘플의 반응.
대조군 인간 혈장 샘플 내에서 HDL에 대한 ApoA-I 결합의 자취. PBS 내의 15 ㎕ 양의 스핀 표지된 지단백질 프로브 (apoA-ISL217, 3 mg/ml)를 45 ㎕ 혈장 샘플에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 유지하고 37℃로 이동시켰다. 온도가 증가함에 따라, 등흡수점의 약 0.15 m테슬라 업필드의 위치를 4분 동안 연속적으로 모니터링하였다. 인간 혈장 대조군 A 및 B의 콜레스테롤 유출 능력을 세포 기반 대식세포 유출 측정에 의해 실험 전에 결정하였다. 대조군 A는 대조군 B의 50%의 콜레스테롤 유출 능력을 가졌다. 유사하게, 대조군 B는 대조군 A보다 약 2배의 preBeta HDL의 수준을 함유하였다.
실시예 11. 정상, 대사 증후군 및 당뇨병 개체로부터 혈장의 역 콜레스테롤 수송 능력
당뇨병/대사 증후군 상태가 확인된 9명의 개체로부터 혈장을 HDL-기능 검정에 의해 검사하였다. 간단히 설명하면, 그의 당뇨병 상태가 잘 특성화된 한 세트의 공복 상태의 개체 (5명의 여성 및 4명의 남성)로부터 혈장을 수집하였다. 45 ㎕의 혈장을 15 ㎕의 apoA-I 프로브에 첨가하였다 (3 mg/ml). apoA-I 프로브는 G217C 돌연변이를 보유하는 apoA-I로 구성되었다. 상기 돌연변이는 시스테인을 그의 천연 서열이 시스테인 잔기를 갖지 않는 apoA-I 내로 도입하였다. 도입된 시스테인 (위치 217에서)의 술프히드릴을 티오술포네이트 연결된 니트록시드 스핀 표지로 유도체화하였다. 생성된 스핀 표지된 단백질을 3 mg/ml로 농축하였다. 프로브를 혈장에 첨가한 후, EPR 시그너처 스펙트럼을 8℃ 및 37℃에서 모두 모니터링하였다. 중앙 필드 피크의 진폭을 참조 샘플에 상대적인 % 반응으로서 보고하였다. 이 경우에, 참조 샘플은 최대 지질-유사 반응을 생성시키는 0.1% SDS에 대한 프로브의 반응이었다. 환자는 연령 일치시켰다. 내부 표준물 (브루커 (Bruker) 특허 등록 내부 표준물)을 판독에 포함시키고 (제시하지 않음), 기기 성능에 대해 제어하기 위해 사용하였다. 그러나, 염화망간과 같은 내부 표준물이 충분할 것이다.
인용된 참고문헌
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018

Claims (383)

  1. a) 고밀도 지단백질 (HDL)에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 첨가하는 단계, 및
    b) 샘플의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하는, 혈액 내에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, c) 단계 b)의 스펙트럼을 양성 대조군 및/또는 음성 대조군과 비교함으로써 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 음성 대조군이 지질-미함유 또는 지질-소량함유 환경에서의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 양성 대조군이 디미리스토일포스파티딜 콜린에 결합된 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 역 콜레스테롤 수송이 콜레스테롤 유출 잠재력인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭을 측정하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 지질-소량함유 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼에 비해 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 차이가 HDL에 대한 지단백질의 결합 차이를 나타내는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 중앙 피크의 진폭의 증가가 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타내는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 중앙 피크의 진폭의 증가가 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타내는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 중앙 피크의 진폭의 감소가 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타내는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 중앙 피크의 진폭의 감소가 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 감소를 나타내는 것인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중앙 피크의 진폭의 변화를 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합시에 변하지 않는 가까운 피크 및/또는 먼 피크의 진폭에 관하여 측정하는 것인 방법.
  13. 제6항에 있어서, EPR 스펙트럼의 프로파일의 변화가 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타내는 것인 방법.
  14. 제6항에 있어서, 중앙 피크의 이동이 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 변화를 나타내는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 전혈 샘플인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 혈장 샘플인 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 혈청 샘플인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 스핀 표지된 지단백질 프로브의 첨가 전에 1회 또는 2회 냉동 및 해동된 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 비-인간 포유동물 혈액 샘플인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 인간 혈액 샘플인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 지단백질 상의 단일 부위에 위치하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 제1 스핀 표지 및 제2 스핀 표지를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 스핀 표지가 지단백질 상의 제1 단일 부위에 위치하고, 제2 스핀 표지가 지단백질 상의 제2 단일 부위에 위치하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 지단백질에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 지단백질에 비-공유적으로 부착되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I의 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 방법.
  34. 제33항에 있어서, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가가 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타내는 것인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 방법.
  36. 제35항에 있어서, EPR 스펙트럼의 중앙 피크의 진폭의 증가가 시험관내 혈액 샘플 내에서 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합의 증가를 나타내는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, apoE 지단백질이 apoE3 지단백질인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 방법.
  49. 제29항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실(PROXYL); 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트 모이어티를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 방법.
  52. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서 모이어티를 추가로 포함하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 스페이서 모이어티가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, HDL이 HDL3인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 최종 농도로 첨가하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 약 0.3 mg/ml의 최종 농도로 첨가하는 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브를 시험관내 혈액 샘플에 약 0.8 mg/ml의 최종 농도로 첨가하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, EPR 스펙트럼이 시험관내 혈액 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 하나 이상의 시점에서 수집되는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, EPR 스펙트럼이 시험관내 혈액 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 1.5분, 4분, 6분, 8분, 10분, 30분, 60분 중의 하나 이상의 시간에서 모니터링되는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 평형에 도달하기 위한 10분 이상의 시간이, HDL이 역 콜레스테롤 수송에 대한 감소된 능력을 가짐을 나타내는 것인 방법.
  61. 제57항 또는 제59항에 있어서, 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 시험관내 혈액 샘플의 평형에 도달하기 위한 시간보다 적어도 2배 더 긴, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 평형에 도달하기 위한 시간이, 감소된 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타내는 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 평가가 HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합 정도의 결정인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 정상적인 역 콜레스테롤 수송 능력을 갖는 시험관내 혈액 샘플 중 스핀 표지된 지단백질 프로브의 결합에 비해, HDL에 대한 스핀 표지된 지단백질 프로브의 80% 이하의 결합 평형도가, 감소된 역 콜레스테롤 수송 능력을 나타내는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 평가가 HDL의 전이 온도의 결정이고, 여기서 25℃ 이상의 HDL의 전이 온도는 역 콜레스테롤 수송 능력의 감소를 나타내는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, EPR 스펙트럼을 0℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수집하는 것인 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, EPR 스펙트럼을 37℃에서 수집한 후, 20℃ 및/또는 0℃에서 수집하는 것인 방법.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서, EPR 스펙트럼을 0℃에서 수집한 후, 20℃ 및/또는 37℃에서 수집하는 것인 방법.
  68. 제64항 또는 제65항에 있어서, EPR 스펙트럼을 4℃에서 수집한 후, 37℃에서 수집하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 항응고제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트인 방법.
  71. a) 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따라 제1 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 제1 개체에서 심혈관 질환의 발생 위험을 결정하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, b) 단계 a)의 역 콜레스테롤 수송 능력을 심혈관 질환의 분명한 위험이 없는 하나 이상의 제2 개체로부터의 혈액 샘플의 역 수송 능력과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 제2 개체에 비해 제1 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력의 감소는 심혈관 질환의 증가된 위험을 나타내는 것인 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 제1 및 제2 개체가 인간인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 심혈관 질환이 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 제1 개체가 당뇨병이 있고/있거나 비만인 방법.
  76. a) 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따라 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 치료를 받고 있는 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 모니터링하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, b) 요법을 개체에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 개체로부터의 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타내는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
  79. 제76항 또는 제78항에 있어서, 심혈관 질환이 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택되는 것인 방법.
  80. a) 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따라 시험 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 시험 동물은 요법이 적용된 것인, 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 요법을 시험 동물에게 시행함으로써 요법이 시험 동물에 적용된 것인 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서,
    b) 요법을 시험 동물에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타내는 것인 방법.
  83. a) 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따라 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계,
    b) 요법을 시험 동물에게 시행하는 단계, 및
    c) 요법을 시험 동물에게 시행하는 동안 및/또는 시행한 후에 1회 이상 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 단계
    를 포함하고, 여기서 시험 동물로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 수송 능력의 증가는 치료 효능을 나타내는 것인, 심혈관 질환에 대한 공지의 또는 잠재적인 요법의 효능을 결정하는 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 동물이 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 및 돼지로부터 선택되는 것인 방법.
  85. 고밀도 지단백질 (HDL)에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 시험관내 혈액 샘플에서 측정하기 위한 키트.
  86. 스핀 표지, 및 고밀도 지단백질 (HDL)에 대한 높은 특이성을 갖는 지단백질을 포함하는, EPR에 의해 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 시험관내 혈액 샘플에서 측정하기 위한 키트.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 역 콜레스테롤 수송이 콜레스테롤 유출 잠재력인 키트.
  88. 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가되기 위해 제제화되고 EPR에 의해 분석되는 것인, 개체에서 심혈관 질환이 발생할 위험을 결정하기 위한 키트.
  89. 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플에 첨가되기 위해 제제화되고 EPR에 의해 분석되는 것인, 개체에서 심혈관 질환에 대한 요법의 과정을 결정하기 위한 키트.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 개체가 인간인 키트.
  91. 제88항 또는 제89항에 있어서, 개체가 비-인간 포유동물인 키트.
  92. 제90항에 있어서, 심혈관 질환이 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 혈관 질환, 및 졸중으로부터 선택되는 것인 키트.
  93. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 전혈 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  94. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 혈장 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  95. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 혈청 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  96. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 스핀 표지된 지단백질 프로브의 첨가 전에 1회 또는 2회 냉동 및 해동된 시험관내 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  97. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 포유동물 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  98. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 인간 혈액 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  99. 제85항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  100. 제85항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 키트.
  101. 제100항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I의 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 키트.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  103. 제100항 또는 제101항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  104. 제100항 또는 제101항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  105. 제104항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  106. 제105항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  107. 제106항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 키트.
  108. 제104항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 키트.
  109. 제85항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 키트.
  110. 제109항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  111. 제110항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  112. 제85항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 키트.
  113. 제112항에 있어서, apoE 지단백질 또는 그의 단편이 apoE3 지단백질 또는 그의 단편인 키트.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  115. 제114항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  116. 제85항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 것인 키트.
  117. 제116항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 키트.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  119. 제85항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 키트.
  120. 제119항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 키트.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 키트.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 키트.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 키트.
  124. 제120항에 있어서, 스핀 표지가 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함하는 것인 키트.
  125. 제124항에 있어서, 스페이서가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 키트.
  126. 제85항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합하는 것인 키트.
  127. 제126항에 있어서, HDL이 HDL3인 키트.
  128. 제85항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험관내 혈액 샘플에 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.1 mg/ml의 최종 농도로 첨가되도록 제제화되는 것인 키트.
  129. 제128항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험관내 혈액 샘플에 약 0.3 mg/ml의 최종 농도로 첨가되도록 제제화되는 것인 키트.
  130. 제128항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험관내 혈액 샘플에 약 0.8 mg/ml 초과의 최종 농도로 첨가되도록 제제화되는 것인 키트.
  131. 제85항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 항응고제를 추가로 포함하는 키트.
  132. 제131항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트인 키트.
  133. 제85항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 시린지를 추가로 포함하는 키트.
  134. HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 지단백질은 스핀 표지를 포함하는 것인 조성물.
  135. 제134항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  136. 제135항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  137. HDL에 대한 높은 특이성을 갖고 스핀 표지를 포함하는 apoA-I 모방체를 포함하는 조성물.
  138. 제137항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  140. 스핀 표지를 포함하는 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 스핀 표지는 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 또는 (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트를 포함하는 것인 조성물.
  141. 제140항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  143. 제142항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  144. 제143항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  145. 시험관내 혈액 샘플, 및 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 조성물.
  146. 제145항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 전혈 샘플인 조성물.
  147. 제145항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 혈장 샘플인 조성물.
  148. 제145항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 혈청 샘플인 조성물.
  149. 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 1회 또는 2회 냉동 및 해동된 것인 조성물.
  150. 제145항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 혈액 샘플이 비-인간 포유동물 혈액 샘플인 조성물.
  151. 제145항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 혈액 샘플이 인간 혈액 샘플인 조성물.
  152. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I의 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 조성물.
  154. 제152항 또는 제153항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  155. 제152항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243의 apoA-I 지단백질의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  156. 제152항 또는 제153항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  157. 제156항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  158. 제157항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  159. 제158항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 조성물.
  160. 제157항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 조성물.
  161. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 조성물.
  162. 제161항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  163. 제161항 또는 제162항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  164. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 조성물.
  165. 제164항에 있어서, apoE 지단백질 또는 그의 단편이 apoE3 지단백질 또는 그의 단편인 조성물.
  166. 제163항 또는 제164항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  167. 제166항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  168. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하고, 여기서 apoA-I 모방체는 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  169. 제167항 또는 제168항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  170. 제145항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 조성물.
  171. 제170항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 조성물.
  172. 제170항 또는 제171항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 조성물.
  173. 제171항 또는 제172항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 조성물.
  174. 제171항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 조성물.
  175. 제174항에 있어서, 스핀 표지가 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  176. 제175항에 있어서, 스페이서가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 조성물.
  177. 제145항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL3에 결합하는 것인 조성물.
  178. 제177항에 있어서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL3에 결합하는 것인 조성물.
  179. 제145항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 항응고제를 추가로 포함하는 조성물.
  180. 제179항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트인 조성물.
  181. 제73항 또는 제74항에 있어서, 하나 이상의 제2 개체의 스펙트럼이 과거 (historical) 스펙트럼인 방법.
  182. 제77항에 있어서, 요법을 개체에게 시행하기 전에 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  183. 제80항에 있어서, 시험 개체가 시험 동물인 방법.
  184. 제83항에 있어서, 요법을 시험 동물에 시행하기 전에 개체로부터의 시험관내 혈액 샘플의 역 콜레스테롤 수송 능력을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  185. 스핀 표지된 지단백질 프로브 및 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하기 위한 조성물.
  186. 제185항에 있어서, 역 콜레스테롤 수송이 유체의 콜레스테롤 유출 잠재력인 조성물.
  187. 제185항에 있어서, 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플로부터 선택되는 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 조성물.
  188. 제187항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택되는 것인 조성물.
  189. 제187항에 있어서, 샘플이 포유동물 혈액 샘플인 조성물.
  190. 제188항에 있어서, 포유동물 샘플이 인간 혈액 샘플인 조성물.
  191. 제185항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것인 조성물.
  192. 제191항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 조성물.
  193. 제191항 또는 제192항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  194. 제193항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243에 위치한 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  195. 제193항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  196. 제195항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  197. 제195항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  198. 제195항에 있어서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  199. 제195항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  200. 제198항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  201. 제200항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 조성물.
  202. 제198항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 조성물.
  203. 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 조성물.
  204. 제203항에 있어서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 것인 조성물.
  205. 제203항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  206. 제205항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  207. 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 조성물.
  208. 제207항에 있어서, apoE 지단백질 또는 그의 단편이 apoE3 지단백질 또는 그의 단편인 조성물.
  209. 제207항 또는 제208항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  210. 제209항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 조성물.
  211. 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 것인 조성물.
  212. 제211항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  213. 제211항 또는 제212항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  214. 제185항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 조성물.
  215. 제214항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 조성물.
  216. 제214항 또는 제215항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 조성물.
  217. 제215항 또는 제216항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 조성물.
  218. 제214항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 조성물.
  219. 제214항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질이 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  220. 제219항에 있어서, 스페이서가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 조성물.
  221. 제185항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합하는 것인 조성물.
  222. 제221항에 있어서, HDL이 HDL3인 조성물.
  223. 제185항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 낮은 상자성 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택되는 것인 조성물.
  224. 제185항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질인 조성물.
  225. 제224항에 있어서, 흡착성 물질이 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스인 조성물.
  226. 제185항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  227. 제185항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 고체 지지체에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  228. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 공유적으로 부착되는 것인 조성물.
  229. 제185항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 정전기적으로 부착되는 것인 조성물.
  230. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 정전기적으로 부착되는 것인 조성물.
  231. 제185항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 부착되는 것인 조성물.
  232. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 부착되는 것인 조성물.
  233. 제185항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착되는 것인 조성물.
  234. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착되는 것인 조성물.
  235. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질 내에 포획되는 것인 조성물.
  236. 제226항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 고체 지지체 또는 흡착성 물질 상에서 건조되는 것인 조성물.
  237. 제185항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 스핀 표지된 참조 프로브를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  238. 제237항에 있어서, 스핀 표지된 참조 프로브가 HDL의 존재에 의해 영향받지 않는 스핀-프로브인 조성물.
  239. 제237항에 있어서, 스핀 표지된 참조 프로브가 테트라메틸피페리딘 (템포 (TEMPO); 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 템폴 (TEMPOL) (4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 타민 (TAMINE) (4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), BZONO (4-(벤조일옥시)-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), SLPEO (폴리(에틸렌 옥시드)-2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-옥실), 및 테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ; (2,5-시클로헥사디엔-1,4-디일리덴)디말로노니트릴, 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄)으로부터 선택되는 것인 조성물.
  240. 제185항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 한 종류 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  241. 제185항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 치료제 또는 치료제 후보를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  242. 제241항에 있어서, 치료제 또는 치료제 후보가 CETP 억제제인 조성물.
  243. 제242항에 있어서, 치료제 또는 치료제 후보가 토르세트라피브, 아나세트라피브, 달세트라피브 또는 에바세트라피브인 조성물.
  244. 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인, 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 시험관내 샘플의 능력을 EPR에 의해 측정하기 위한 키트.
  245. 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인, 콜레스테롤 유출 잠재력의 조정을 위한 치료제의 효능을 시험하기 위한 키트.
  246. 고체 지지체, 스핀 표지된 지단백질 프로브, 및 치료제를 포함하는 시험 스트립을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인, 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하기 위한 키트.
  247. 고체 지지체, 스핀 표지된 지단백질 프로브, 및 치료제를 포함하는 시험 스트립을 포함하고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인, 개체에서 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하기 위한 키트.
  248. 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 고체 지지체 상에 존재하는 것인 키트.
  249. 제248항에 있어서, 하나 이상의 추가의 시험 스트립을 추가로 포함하는 키트.
  250. 제249항에 있어서, 하나 이상의 추가의 시험 스트립이 상이한 양의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 것인 키트.
  251. 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립과 별개의 용기에 존재하는 것인 키트.
  252. 제251항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 건조 분말로서 제공되는 것인 키트.
  253. 제244항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지 참조 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  254. 제253항에 있어서, 스핀 표지 참조 프로브가 고체 지지체 상에 존재하는 것인 키트.
  255. 제253항에 있어서, 스핀 표지 참조 프로브가 시험 스트립과 별개의 용기에 존재하는 것인 키트.
  256. 제255항에 있어서, 스핀 표지 참조 프로브가 건조 분말로서 제공되는 것인 키트.
  257. 제244항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 역 콜레스테롤 수송이 유체의 콜레스테롤 유출 잠재력인 키트.
  258. 제244항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플로부터 선택되는 샘플과 함께 사용하기 위해 제제화되는 것인 키트.
  259. 제258항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택되는 것인 키트.
  260. 제258항에 있어서, 샘플이 포유동물 혈액 샘플인 키트.
  261. 제260항에 있어서, 포유동물 샘플이 인간 혈액 샘플인 키트.
  262. 제244항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것인 키트.
  263. 제262항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 키트.
  264. 제262항 또는 제263항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  265. 제264항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243에 위치한 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  266. 제265항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  267. 제266항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  268. 제266항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  269. 제266항에 있어서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  270. 제266항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  271. 제269항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  272. 제271항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 키트.
  273. 제269항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 키트.
  274. 제244항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 키트.
  275. 제274항에 있어서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 것인 키트.
  276. 제274항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  277. 제276항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  278. 제244항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 키트.
  279. 제278항에 있어서, apoE 지단백질 또는 그의 단편이 apoE3 지단백질 또는 그의 단편인 키트.
  280. 제278항 또는 제279항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  281. 제280항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 키트.
  282. 제244항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 것인 키트.
  283. 제282항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 키트.
  284. 제282항 또는 제283항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  285. 제244항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 키트.
  286. 제285항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 키트.
  287. 제285항 또는 제286항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 키트.
  288. 제286항 또는 제287항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 키트.
  289. 제286항 내지 제288항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 키트.
  290. 제285항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질이 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함하는 것인 키트.
  291. 제290항에 있어서, 스페이서가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 키트.
  292. 제244항 내지 제291항 중 어느 한 항에 있어서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합하는 것인 키트.
  293. 제292항에 있어서, HDL이 HDL3인 키트.
  294. 제244항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 낮은 상자성 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택되는 것인 키트.
  295. 제244항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질인 키트.
  296. 제295항에 있어서, 흡착성 물질이 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스인 키트.
  297. 제244항 내지 제294항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질을 추가로 포함하는 것인 키트.
  298. 제244항 내지 제286항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 고체 지지체에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  299. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 공유적으로 부착되는 것인 키트.
  300. 제244항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 정전기적으로 부착되는 것인 키트.
  301. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 정전기적으로 부착되는 것인 키트.
  302. 제244항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 부착되는 것인 키트.
  303. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 부착되는 것인 키트.
  304. 제244항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 시험 스트립에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착되는 것인 키트.
  305. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질에 소수성 상호작용에 의해 및 정전기적으로 부착되는 것인 키트.
  306. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 흡착성 물질 내에 포획되는 것인 키트.
  307. 제297항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 고체 지지체 또는 흡착성 물질 상에서 건조되는 것인 키트.
  308. 제244항 내지 제307항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 스핀 표지된 참조 프로브를 추가로 포함하는 것인 키트.
  309. 제308항에 있어서, 스핀 표지된 참조 프로브가 HDL의 존재에 의해 영향받지 않는 스핀-프로브인 키트.
  310. 제309항에 있어서, 스핀 표지된 참조 프로브가 테트라메틸피페리딘 (템포; 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 템폴 (4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 타민 (4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), BZONO (4-(벤조일옥시)-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), SLPEO (폴리(에틸렌 옥시드)-2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-옥실), 및 테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ; (2,5-시클로헥사디엔-1,4-디일리덴)디말로노니트릴, 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄)으로부터 선택되는 것인 키트.
  311. 제244항 내지 제310항 중 어느 한 항에 있어서, 한 종류 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 키트.
  312. 제244항 내지 제311항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 스트립이 치료제 또는 치료제 후보를 추가로 포함하는 것인 키트.
  313. 제312항에 있어서, 치료제 또는 치료제 후보가 HDL 변형 치료제 또는 치료제 후보인 키트.
  314. 제312항에 있어서, 치료제 또는 치료제 후보가 CETP 억제제인 키트.
  315. 제314항에 있어서, 치료제 또는 치료제 후보가 토르세트라피브, 아나세트라피브, 달세트라피브 또는 에바세트라피브인 키트.
  316. 제244항 내지 제315항 중 어느 한 항에 있어서, 응고제를 추가로 포함하는 키트.
  317. 제316항에 있어서, 응고제가 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트인 키트.
  318. 제244항 내지 제317항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  319. a) 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계, 및
    b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 능력을 측정하는 방법.
  320. a) 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 고밀도 지단백질 (HDL)에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되는 것인 단계, 및
    c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 HDL의 능력을 측정하는 방법.
  321. 제320항에 있어서, 단계 a) 및 b)를 순차적으로 또는 동시에 수행하는 것인 방법.
  322. a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계, 및
    b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 것인, 개체에서 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하는 방법.
  323. a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계, 및
    b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 알츠하이머 질환을 갖고 있을 수 있음을 나타내는 것인, 개체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
  324. a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되는 것인 단계, 및
    c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 정상적인 개체로부터의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 감소는 개체가 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 것인, 개체에서 고콜레스테롤혈증 또는 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료제의 유익성을 결정하는 방법.
  325. 제324항에 있어서, 단계 a) 및 b)를 순차적으로 또는 동시에 수행하는 것인 방법.
  326. a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계, 및
    b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 요법 시행 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 개체가 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 것인, 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 요법을 받고 있는 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 치료 효능을 최적화하는 방법.
  327. a) 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되는 것인 단계, 및
    c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 요법 시행 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 개체가 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 치료제로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는 것인, 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 요법을 받고 있는 개체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 치료제의 치료 효능을 최적화하는 방법.
  328. 제327항에 있어서, 단계 a) 및 b)를 순차적으로 또는 동시에 수행하는 것인 방법.
  329. 제325항 또는 제326항에 있어서, 요법에 반응하여 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가가 입증되면 요법이 계속되는 것인 방법.
  330. 제326항 내지 제329항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 대한 반응에 의한 콜레스테롤 유출 잠재력의 변화로 인해 요법이 조정되는 것인 방법.
  331. a) 낮은 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 샘플을 후보 조성물과 접촉시키는 단계, 및
    c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 조성물이 콜레스테롤 유출 능력의 조정에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, 개체의 콜레스테롤 유출 능력의 조정을 위한 후보 치료제를 스크리닝하는 방법.
  332. a) 낮은 콜레스테롤 유출 능력을 갖는 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 시험관내 샘플을 후보 치료제와 접촉시키는 단계,
    c) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되는 것인 단계, 및
    d) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 조성물이 콜레스테롤 유출 능력의 조정에 유용할 수 있음을 나타내는 것인, 개체의 콜레스테롤 유출 능력의 조정을 위한 후보 치료제를 스크리닝하는 방법.
  333. 제332항에 있어서, 단계 a), b) 및 c)를 순차적으로 또는 동시에 수행하는 것인 방법.
  334. a) 행동 조절을 받고 있는 개체로부터의 시험관내 샘플을 고체 지지체 및 스핀 표지된 지단백질 프로브를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계, 및
    b) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 행동 조절 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 행동 조절이 콜레스테롤 유출 능력에 이익을 제공함을 나타내는 것인, 콜레스테롤 유출 잠재력의 행동 조절제를 결정하는 방법.
  335. a) 행동 조절을 받고 있는 개체로부터의 시험관내 샘플을 스핀 표지된 지단백질 프로브와 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브는 스핀 표지 및 지단백질을 포함하고 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 단계,
    b) 시험관내 샘플을 고체 지지체를 포함하는 시험 스트립과 접촉시키고, 여기서 스핀 표지된 지단백질 프로브의 일부 또는 전부는 시험 스트립에 부착되는 것인 단계, 및
    c) 시험 스트립 상의 스핀 표지된 지단백질 프로브의 전자 상자성 공명 (EPR) 스펙트럼을 수집하는 단계
    를 포함하고, 여기서 행동 조절 전의 개체로부터의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력에 비해 개체의 샘플의 콜레스테롤 유출 잠재력의 증가는 행동 조절이 콜레스테롤 유출 능력에 이익을 제공함을 나타내는 것인, 콜레스테롤 유출 잠재력의 행동 조절제를 결정하는 방법.
  336. 제335항에 있어서, 단계 a) 및 b)를 순차적으로 또는 동시에 수행하는 것인 방법.
  337. 제334항 내지 제336항 중 어느 한 항에 있어서, 행동이 식습관, 운동 또는 흡연인 방법.
  338. 제318항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플인 방법.
  339. 제338항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  340. 제339항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플로부터 선택되는 것인 방법.
  341. 제340항에 있어서, 샘플이 포유동물 혈액 샘플인 조성물.
  342. 제341항에 있어서, 포유동물 샘플이 인간 혈액 샘플인 조성물.
  343. 제318항 내지 제342항 중 어느 한 항에 있어서, EPR 스펙트럼이 시험관내 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 하나 이상의 시점에서 수집되는 것인 방법.
  344. 제343항에 있어서, EPR 스펙트럼이 시험관내 샘플에 스핀 표지된 지단백질 프로브를 첨가한 후에 1.5분, 4분, 6분, 8분, 10분, 30분, 60분 중의 하나 이상의 시간에서 모니터링되는 것인 방법.
  345. 제318항 내지 제344항 중 어느 한 항에 있어서, EPR 스펙트럼을 0℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수집하는 것인 방법.
  346. 제318항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  347. 제346항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-I 단편을 포함하고, 여기서 apoA-I 단편은 apoA-I의 HDL-결합 영역을 포함하는 것인 방법.
  348. 제346항 또는 제347항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  349. 제348항에 있어서, 스핀 표지가 잔기 188 내지 잔기 243에 위치한 apoA-I 지단백질의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  350. 제348항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 98, 101, 111, 167, 217, 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  351. 제350항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 98, 111 또는 217의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  352. 제350항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 지단백질의 위치 26, 44, 64, 101, 167 또는 226의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  353. 제350항에 있어서, 위치 98, 111, 또는 217의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  354. 제350항에 있어서, 위치 26, 44, 64, 101, 167, 또는 226의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  355. 제353항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  356. 제355항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 217의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 방법.
  357. 제353항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 단백질의 위치 111의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되며 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트인 방법.
  358. 제318항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoA-II 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 방법.
  359. 제358항에 있어서, apoA-II 또는 그의 단편의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 총 지단백질 분자가 HDL과 결합하는 것인 방법.
  360. 제358항 또는 제359항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-II 지단백질 또는 그의 단편 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  361. 제360항에 있어서, apoA-II 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  362. 제318항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 apoE 지단백질 또는 그의 단편을 포함하고, 여기서 apoE 또는 그의 단편은 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 것인 방법.
  363. 제362항에 있어서, apoE 지단백질 또는 그의 단편이 apoE3 지단백질 또는 그의 단편인 방법.
  364. 제362항 또는 제363항에 있어서, 스핀 표지가 apoE 지단백질 상의 단일 부위에서의 아미노산에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  365. 제364항에 있어서, apoE 단백질 내의 단일 부위에서의 천연 아미노산 잔기가 시스테인 잔기에 의해 대체된 것인 방법.
  366. 제318항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 대한 높은 특이성을 갖는 apoA-I 모방체를 포함하는 것인 방법.
  367. 제366항에 있어서, apoA-I 모방체가 18A, 18A-Pro-18A, 4F, 및 4f-Pro-4F로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  368. 제366항 또는 제367항에 있어서, 스핀 표지가 apoA-I 모방체 상의 단일 부위에 공유적으로 부착되는 것인 방법.
  369. 제318항 내지 제368항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 자유 전자를 보유하는 원자를 포함하는 것인 방법.
  370. 제369항에 있어서, 자유 전자를 보유하는 원자가 질소인 방법.
  371. 제369항 또는 제370항에 있어서, 스핀 표지가 (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N; 1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트-15N,d15; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (-)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; (+)-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄술포네이트; 3-(2-아이오도아세트아미도)-프록실; 3-아이오도메틸-(1-옥시-2,2,5,5-테트라메틸피롤린); 1-옥실-3-(말레이미도메틸)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리딘; (1-옥실-2,2,3,5,5-펜타메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; N-(1-옥실-2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디닐)말레이미드; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-3-일) 메틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도에틸 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도헥실 메탄티오술포네이트; (1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤린-3-일)카르바미도프로필메탄 메탄티오술포네이트; 3-(2-브로모아세트아미도)-2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시, 자유 라디칼; 4-브로모-3-히드록시메틸-1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-δ3-피롤린; 3-브로모메틸-2,5-디히드로-2,2,5,5-테트라메틸-1H-피롤-1-일옥시; 4-브로모-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-Δ3-피롤린-3-메틸) 메탄티오술포네이트; 3-[2-(2-말레이미도에톡시)에틸카르바모일]-프록실; 3-말레이미도-PROXL, 3-(2-말레이미도에틸-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(3-(2-아이오도-아세트아미도)-프로필-카르바모일)-프록실, 자유 라디칼; 3-(2-브로모-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼; 또는 3-(2-아이오도-아세트아미도-메틸)-프록실, 자유 라디칼인 방법.
  372. 제371항 또는 제373항에 있어서, 스핀 표지가 과중수소화된 스핀 표지인 방법.
  373. 제370항 내지 제372항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지가 티오술포네이트를 통해 지단백질 상의 아미노산에 부착되는 것인 방법.
  374. 제370항 내지 제372항 중 어느 한 항에 있어서, 스핀 표지된 지단백질이 스핀 표지와 지단백질 사이에 스페이서를 추가로 포함하는 것인 방법.
  375. 제374항에 있어서, 스페이서가 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄인 방법.
  376. 제318항 내지 제375항 중 어느 한 항에 있어서, 60% 초과의 스핀 표지된 지단백질 프로브가 HDL에 결합하는 것인 방법.
  377. 제376항에 있어서, HDL이 HDL3인 방법.
  378. 제318항 내지 제377항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 낮은 상자성 특성을 갖는 중합체 또는 셀룰로스 물질로부터 선택되는 것인 방법.
  379. 제318항 내지 제377항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질인 방법.
  380. 제379항에 있어서, 흡착성 물질이 폴리비닐리딘 플루오라이드 (PVDF), 나일론 또는 니트로셀룰로스인 방법.
  381. 제318항 내지 제378항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 흡착성 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  382. 제318항 내지 제381항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 샘플이 항응고제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  383. 제382항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 쿠마딘, 와파린, EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트인 방법.
KR1020137031606A 2011-04-29 2012-04-27 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 ｈｄｌ의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법 KR20140059170A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161481148P 2011-04-29 2011-04-29
US61/481,148 2011-04-29
US201161566581P 2011-12-02 2011-12-02
US61/566,581 2011-12-02
PCT/US2012/035663 WO2012149473A2 (en) 2011-04-29 2012-04-27 Compositions and methods to assess the capacity of hdl to support reverse cholesterol transport

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140059170A true KR20140059170A (ko) 2014-05-15

Family

ID=47073110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137031606A KR20140059170A (ko) 2011-04-29 2012-04-27 역 콜레스테롤 수송을 지지하는 ｈｄｌ의 능력을 평가하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20140162376A1 (ko)
EP (1) EP2702400A4 (ko)
JP (2) JP6258849B2 (ko)
KR (1) KR20140059170A (ko)
AU (1) AU2012249393B2 (ko)
CA (1) CA2834631A1 (ko)
IL (1) IL229084A0 (ko)
MX (1) MX2013012406A (ko)
WO (1) WO2012149473A2 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10151764B2 (en) * 2014-05-15 2018-12-11 The Cleveland HeartLab Compositions and methods for purification and detection of HDL and ApoA1
KR102456013B1 (ko) * 2014-07-30 2022-10-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 고밀도 지질단백질(hdl)-상승 제제 또는 hdl-모방 제제에 의한 치료법에 대한 반응성을 예측하기 위한 유전 표지
KR102392947B1 (ko) * 2016-07-21 2022-05-03 클리블랜드 하트랩, 아이엔씨. Hdl-관련 단백질 바이오마커 패널 검출
CN112630252B (zh) * 2020-11-05 2022-04-01 浙江大学 含有抗氧化剂丁基羟基茴香醚的片剂稳定性无损检测方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806311A (en) * 1985-08-28 1989-02-21 Miles Inc. Multizone analytical element having labeled reagent concentration zone
AU662885B2 (en) * 1990-06-07 1995-09-21 Scripps Research Institute, The APO AI polypeptides, antibodies, and immunoassays
WO2002016934A1 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Queen Mary & Westfield College Assay for s-nitrosothiol compounds
US7592008B2 (en) * 2000-11-20 2009-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois, A Body Corporate And Politic Of The State Of Illinois Membrane scaffold proteins
EP2306192B1 (en) * 2003-12-05 2015-10-14 The Cleveland Clinic Foundation Risk Markers For Cardiovascular Disease
WO2006001806A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Duke University Method for non-invasive thermometry using elastin-like polypeptide conjugates
JP2008039761A (ja) * 2006-06-15 2008-02-21 Shiseido Co Ltd 角層の評価方法
EP2241619A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-20 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Development of fluorescently P-loop labeled kinases for screening of inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
US20140162376A1 (en) 2014-06-12
WO2012149473A3 (en) 2012-12-27
EP2702400A2 (en) 2014-03-05
IL229084A0 (en) 2013-12-31
MX2013012406A (es) 2014-06-05
EP2702400A4 (en) 2015-06-17
CA2834631A1 (en) 2012-11-01
JP2014513795A (ja) 2014-06-05
WO2012149473A2 (en) 2012-11-01
JP2018087815A (ja) 2018-06-07
JP6258849B2 (ja) 2018-01-10
US20160305967A1 (en) 2016-10-20
AU2012249393A1 (en) 2013-05-09
AU2012249393B2 (en) 2017-04-06
US20180074079A1 (en) 2018-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1242822B1 (en) Methods of detection of amyloidogenic proteins
Ulrich Solid state 19F NMR methods for studying biomembranes
De León-Rodríguez et al. Magnetic resonance imaging detects a specific peptide− protein binding event
Hiller et al. Solid‐state magic‐angle spinning NMR of outer‐membrane protein G from Escherichia coli
Kinpara et al. Lipoprotein (a)-cholesterol: a significant component of serum cholesterol
Fendos et al. Aspartate Embedding Depth Affects pHLIP’s Insertion p K a
JP2018087815A (ja) Ｈｄｌの逆コレステロール輸送支持能力を評価するための組成物および方法
Ahmed et al. Solid-state NMR spectroscopy of membrane-associated myelin basic protein—conformation and dynamics of an immunodominant epitope
Nielsen et al. A ruler for determining the position of proteins in membranes
JP2004536296A (ja) 欠陥折畳み蛋白質センサー方法
Luo et al. Side-chain conformation of the M2 transmembrane peptide proton channel of influenza a virus from 19F solid-state NMR
Araç et al. Facile detection of protein− protein interactions by one-dimensional NMR spectroscopy
Kay et al. Decreased cerebrospinal fluid apolipoprotein E after subarachnoid hemorrhage: correlation with injury severity and clinical outcome
Kleinfeld et al. Flip-flop is slow and rate limiting for the movement of long chain anthroyloxy fatty acids across lipid vesicles
Ceccon et al. Decorrelating kinetic and relaxation parameters in exchange saturation transfer NMR: A case study of N-terminal huntingtin peptides binding to unilamellar lipid vesicles
Salnikov et al. Alamethicin topology in phospholipid membranes by oriented solid-state NMR and EPR spectroscopies: a comparison
Shaw et al. Structure, orientation, and dynamics of the C-terminal hexapeptide of LRAP determined using solid-state NMR
Voinov et al. Mapping local protein electrostatics by EPR of pH-sensitive thiol-specific nitroxide
Lagerstedt et al. EPR assessment of protein sites for incorporation of Gd (III) MRI contrast labels
JP2014513795A5 (ko)
Petrlova et al. Molecular crowding impacts the structure of apolipoprotein A‐I with potential implications on in vivo metabolism and function
Lee et al. Site-selective intramolecular hydrogen-bonding interactions in phosphorylated serine and threonine dipeptides
Boland et al. Insights into the interactions between a drug and a membrane protein target by fluorine cross‐polarization magic angle spinning NMR
Ghosh et al. Apolipoprotein E interacts with amyloid-β oligomers via positively cooperative multivalent binding
WO2021200797A1 (ja) 変性ｈｄｌの定量方法、及びそれに用いる分析用試薬

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid