WO2021132544A1 - 癌の予後バイオマーカー - Google Patents

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WO2021132544A1
WO2021132544A1 PCT/JP2020/048650 JP2020048650W WO2021132544A1 WO 2021132544 A1 WO2021132544 A1 WO 2021132544A1 JP 2020048650 W JP2020048650 W JP 2020048650W WO 2021132544 A1 WO2021132544 A1 WO 2021132544A1
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prognosis
protein
amino acid
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美和子 本間
整 野水
好 本間
優子 橋本
雄一郎 喜古
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公立大学法人福島県立医科大学
公益財団法人星総合病院
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Definitions

  • the present invention relates to a marker for predicting the prognosis of a cancer patient, a method for predicting the prognosis of a cancer patient, a kit for use in the method, and the like.
  • cancer is the leading cause of death and accounts for about 30%.
  • breast cancer is the leading cause of death in women aged 30-64 years, with approximately 14,000 deaths from breast cancer in 2018.
  • the survival rate of breast cancer patients has improved due to advances in breast cancer detection methods and / or treatment methods, there are still patients with a poor prognosis who are at high risk of recurrence, metastasis, or death. Therefore, in order to improve the quality of treatment and / or prevention of breast cancer, it is very important to predict the prognosis of breast cancer patients and to manage the breast cancer patients individually according to the results.
  • Non-Patent Document 1 reports the relationship between the HER2 gene and protein and prognosis. However, it cannot be said that the HER2 gene and protein alone can predict the prognosis of breast cancer with sufficient accuracy.
  • the present inventors have found that the CK2 ⁇ protein in the nucleolus can be used as a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients such as breast cancer patients, and completed the present invention.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • (1) Use of the CK2 ⁇ protein in the nucleolus or a fragment thereof as a marker for predicting the prognosis of cancer patients.
  • (2) The CK2 ⁇ protein has the amino acid sequence of any of the following (a) to (c): (a) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (b) Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (c) 90% or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the use according to (1) which comprises an amino acid sequence having the same identity.
  • the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, gastric cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, liver cancer, renal cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, thyroid cancer, and glioma. Use according to any one of (1) to (3).
  • the cancer is breast cancer, and the marker is combined with at least one of the classification by stage, the classification by hormone receptor expression status, and the classification by HER2 gene and / or protein expression status to determine the prognosis of breast cancer patients. Predict, use as described in (4). (6) A method for predicting the prognosis of cancer patients.
  • Steps to detect CK2 ⁇ protein or fragments thereof in nucleoli in cancer cells or tissues obtained from cancer patients, and predict poor prognosis if CK2 ⁇ protein or fragments thereof are detected, and / or CK2 ⁇ A method comprising the step of predicting a good prognosis if a protein or fragment thereof is not detected.
  • a method for predicting the prognosis of cancer patients In cancer cells or tissues obtained from cancer patients, the step of detecting the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof in the nucleolus, and the detection of the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof in the nucleolus more highly than other cell fractions.
  • the CK2 ⁇ protein has the amino acid sequence of any of the following (a) to (c): (a) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (b) Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (c) 90% or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the method according to (6) or (7) which comprises an amino acid sequence having the same identity.
  • the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, gastric cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, liver cancer, renal cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, thyroid cancer, and glioma.
  • the cancer is breast cancer, and the presence or absence of detection of the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof is classified into at least one of the classification by stage, the classification by the expression status of hormone receptors, and the classification by the expression status of the HER2 gene and / or protein.
  • This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2019-234099, which is the basis of the priority of the present application.
  • the present invention provides a biomarker for predicting the prognosis of cancer patients such as breast cancer patients.
  • FIG. 1 shows a representative image of immunohistochemical staining evaluation of CK2 ⁇ protein in breast cancer tissue.
  • FIG. 1A is an image ( ⁇ 100) in which the cancer infiltrated part and the normal part are adjacent to each other on one section.
  • FIG. 1B is a ⁇ 400 image of the cancer infiltrate. In FIG. 1B, an example of a stained image in which the nucleolus is significantly positive is shown by an arrow.
  • FIG. 2 shows an exemplary image of the specimens with staining ratings IV (I: whole cell staining, but nuclear staining is not clear. II: nuclear staining (+), nuclear staining is clearer than cytoplasm. . III: Nuclear staining (++), nuclear staining is higher than II.
  • FIG. 4 shows recurrence-free survival in breast cancer stage I, II, and III patients.
  • Figure 4 shows disease-specific survival in patients with breast cancer stages I, II, and III.
  • FIG. 5 shows the recurrence-free survival rate when CK2 ⁇ staining is divided into three stages, I + II, III, and IV + V, in patients with breast cancer stages I to III.
  • FIG. 6 shows recurrence-free survival in hormone receptor-positive / HER2-negative patients.
  • FIG. 7 shows recurrence-free survival in triple-negative patients.
  • FIG. 8 shows the recurrence-free survival rate in patients with breast cancer stages I and II.
  • FIG. 9 shows recurrence-free survival in breast cancer stage III patients.
  • FIG. 10 shows the recurrence-free survival rate in patients with lymph node metastasis.
  • FIG. 11 shows the results of immunohistochemical staining for CK2 ⁇ protein in various cancer tissues.
  • FIG. 11A is an example of staining for glioma ( ⁇ 400).
  • FIG. 11B shows an example of bladder cancer staining ( ⁇ 400).
  • FIG. 11C shows an example of staining for renal cancer ( ⁇ 400).
  • FIG. 11D shows an example of staining for thyroid cancer ( ⁇ 400).
  • positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 11A to 11D positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 12 shows the results of immunohistochemical staining for CK2 ⁇ protein in various cancer tissues.
  • FIG. 12A shows an example of pancreatic cancer staining ( ⁇ 400). An example in which one nucleolus is detected in the nucleus and an example in which two nucleoli are detected in the nucleus are shown.
  • FIG. 12B is an example of staining for esophageal cancer ( ⁇ 400).
  • FIG. 12C shows an example of staining for biliary tract cancer ( ⁇ 400).
  • FIG. 12D shows an example of staining for uterine cancer ( ⁇ 400).
  • positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 13 shows the results of immunohistochemical staining of the CK2 ⁇ protein in the liver.
  • FIG. 12A shows an example of pancreatic cancer staining ( ⁇ 400). An example in which one nucleolus is detected in the nucleus and an example in which two nucleoli are detected in the nucleus are shown.
  • FIG. 13A is an example of staining the liver of a healthy person ( ⁇ 400).
  • FIG. 13B is an example of liver cancer staining ( ⁇ 400). Positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 14 shows the results of immunohistochemical staining for CK2 ⁇ protein in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung.
  • FIG. 14A shows an example of lung staining ( ⁇ 400) of a healthy person.
  • FIG. 14B shows an example of staining for lung adenocarcinoma ( ⁇ 400).
  • FIG. 14C shows an example of staining for squamous cell carcinoma of the lung ( ⁇ 400).
  • positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 14B and 14C positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 15 shows the results of immunohistochemical staining of the CK2 ⁇ protein in the stomach.
  • FIG. 15A is an example of staining the stomach of a healthy person ( ⁇ 400).
  • FIG. 15B is an example of staining for gastric cancer ( ⁇ 400).
  • positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • FIG. 16 shows the results of immunohistochemical staining for the CK2 ⁇ protein in the rectum.
  • FIG. 16A is an example of staining of the non-cancerous part of the rectum ( ⁇ 400).
  • FIG. 16B is an example of staining for rectal cancer ( ⁇ 400).
  • FIG. 16C shows an example of staining of the non-cancerous part of the colon ( ⁇ 400).
  • FIG. 16D shows an example of colon cancer staining ( ⁇ 400).
  • positive examples of nucleoli are indicated by arrows.
  • the present invention relates to a marker for predicting the prognosis of a cancer patient containing or consisting of the CK2 ⁇ protein in the nucleolus or a fragment thereof.
  • the type of “cancer” is not limited, and examples thereof include adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, and large cell carcinoma.
  • the types of cancer include, for example, malignant melanoma, oral cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer (including colon cancer and rectal cancer).
  • Small bowel cancer bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, uterine body cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, gastric cancer, renal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer (including bile sac cancer and bile duct cancer), brain cancer , Head and neck cancer, mesenteric tumor, osteosarcoma, glioma, pediatric tumors such as neuroblastoma, leukemia, lymphoma and the like.
  • Cancers are preferably breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, biliary tract cancer (eg, bile sac cancer or cholangiocarcinoma), renal cancer, colon cancer (eg, rectal cancer or colon cancer), bladder cancer, lung cancer.
  • biliary tract cancer eg, bile sac cancer or cholangiocarcinoma
  • renal cancer eg, rectal cancer or colon cancer
  • bladder cancer e.
  • lung cancer for example, lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma
  • thyroid cancer eg, stellate cell tumor
  • glioma eg, stellate cell tumor
  • breast cancer is not limited, for example, non-invasive ductal carcinoma in situ, invasive ductal carcinoma in situ, invasive lobular carcinoma, non-invasive lobular carcinoma, and medullary carcinoma and mucinous carcinoma as special types of cancer. Examples include cancer and tubular cancer.
  • prognosis refers to a predicted course (for example, presence or absence of recurrence or life or death) in a cancer patient such as a breast cancer patient.
  • Prediction of prognosis is the risk of recurrence (eg, recurrence-free survival), survival, or a period of time after surgery (eg, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, 5 years, 10 years, 15 years, or It may be a prediction of survival rate (at 20 years or more), recurrence-free survival rate (RFS), or disease-specific survival rate (Disease-free survival, DFS).
  • RFS recurrence-free survival rate
  • DFS disease-specific survival rate
  • prediction of prognosis includes prediction of recurrence risk (eg, recurrence-free survival).
  • recurrence-free survival rate is the proportion of patients who do not develop recurrent cancer such as cancer associated with the initial cancer
  • disease-specific survival rate is the proportion of patients who have no death associated with the initial cancer. means. Prediction of prognosis can also be said to determine, evaluate, or diagnose prognosis, or to assist them.
  • the CK2 (Casein kinase 2) protein is a type of serine / threonine kinase and is known to be involved in pro-survival pathway and the like.
  • the CK2 protein typically exists as a tetramer composed of the ⁇ subunit, the ⁇ 'subunit, and the two ⁇ subunits.
  • the “CK2 ⁇ protein” is intended as an ⁇ subunit of CK2, and is also referred to as casein kinase 2 alpha 1 or casein kinase II subunit alpha: CK2 ⁇ , CK2 ⁇ 1 or CSNK2A1.
  • the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof derived from an endogenous gene of a cancer patient such as a breast cancer patient can be a biomarker.
  • the patient is human
  • the human CK2 ⁇ protein or a fragment thereof can be a biomarker.
  • CK2 ⁇ protein examples include a human-derived CK2 ⁇ (human CK2 ⁇ ) protein containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the CK2 ⁇ protein also includes a CK2 ⁇ variant having functionally equivalent activity as the CK2 ⁇ protein shown in SEQ ID NO: 2 and a CK2 ⁇ ortholog of another species. Specifically, 80% or more and 90% of the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 As described above, CK2 ⁇ proteins having 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more amino acid identity are included.
  • “several pieces” means, for example, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4 or 2 to 3.
  • Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution.
  • “Conservative amino acid substitution” refers to a substitution between amino acids having similar properties such as charge, side chain, polarity, and aromaticity.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), non-polar amino acids.
  • sex amino acids leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine
  • branched amino acids leucine, valine, isoleucine
  • aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine
  • amino acid identity refers to the sequence number when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary to maximize the degree of amino acid matching between the two amino acids.
  • Amino acid identity can be calculated using a protein search system using BLAST or FASTA. For details on how to determine identity, see, for example, Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. ..
  • the CK2 ⁇ protein is encoded by the CK2 ⁇ gene.
  • Specific examples of the CK2 ⁇ gene include the human CK2 ⁇ gene encoding a human CK2 ⁇ protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. More specifically, the CK2 ⁇ gene includes a gene containing or consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the CK2 ⁇ gene also includes a CK2 ⁇ variant having an activity functionally equivalent to that of the CK2 ⁇ protein encoded by the CK2 ⁇ gene shown in SEQ ID NO: 1 and a CK2 ⁇ gene encoding a CK2 ⁇ ortholog of another species. Specifically, 80% or more and 90% of the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 As described above, the CK2 ⁇ gene having 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more base identity is included.
  • the CK2 ⁇ protein contains a base sequence that hybridizes under highly stringent conditions with a nucleic acid fragment containing a part of the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is functionally equivalent to the CK2 ⁇ protein.
  • a gene encoding an active protein is included.
  • base identity refers to a sequence number when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two bases is the highest.
  • hybridizing under high stringent conditions means performing hybridization and washing under low salt concentration and / or high temperature conditions. For example, incubate with probe in 6 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt reagent, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / mL denatured fragmented salmon sperm DNA at 65 ° C-68 ° C, then in a wash solution of 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. It is exemplified by starting from room temperature at room temperature, lowering the salt concentration in the cleaning solution to 0.1 ⁇ SSC, and raising the temperature to 68 ° C. until no background signal is detected. The conditions for high stringent hybridization are described in Green, MR and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. It can be used as a reference.
  • Such base sequence information of the CK2 ⁇ gene can be searched from public databases (GenBank, EMBL, DDBJ). For example, a gene having high base identity can be searched and obtained from a database based on the known base sequence information of the CK2 ⁇ gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the "fragment" of the CK2 ⁇ protein is a peptide fragment containing or consisting of a part of the amino acid sequence constituting the CK2 ⁇ protein, and is a fragment of the CK2 ⁇ protein from the amino acid sequence constituting the fragment. It means something that can be identified.
  • a "fragment” is a contiguous amino acid residue of 5 or more, 8 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more of the full-length amino acid sequence of the CK2 ⁇ protein. It may be a group or a peptide consisting of 200 or less, 150 or less, 120 or less, 100 or less, or 80 or less consecutive amino acid residues.
  • a "fragment” may be a peptide consisting of 5 to 200, 10 to 120, 50 to 80 consecutive amino acid residues.
  • nucleolus refers to a region having a high molecular density in the nucleus of a eukaryotic cell and in which rRNA transcription and ribosome production are performed.
  • the nucleolus is generally observable with a light microscope. Normally, one nucleolus is observed in the nucleus, but multiple nucleoli may be observed.
  • the present invention relates to the use of the CK2 ⁇ protein in the nucleolus or a fragment thereof as a marker for predicting the prognosis of a cancer patient.
  • the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, biliary tract cancer, renal cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, thyroid cancer, and glioma. ..
  • the present invention predicts the prognosis of a cancer patient by combining the markers with factors such as stage classification, tumor diameter, presence or absence of lymph node metastasis, and histological grade.
  • the cancer is breast cancer and the markers are classified according to stage, hormone receptor expression, and at least one of the HER2 gene and / or protein expression, eg. Predict the prognosis of breast cancer patients in combination with two, preferably all three.
  • the marker is combined with other factors such as tumor diameter, presence or absence of lymph node metastasis, histological grade, etc. in addition to or apart from the above classification to predict the prognosis of breast cancer patients. I do. When combined with other classifications or factors, it can have the effect of enabling better prognosis prediction.
  • the classification by stage is based on the TNM classification (UICC International Code, LH Sobin, MK Gospodarowicz and Ch. Wittekind, TNM Classification of Malignant Tumors, 7th edition) of the Union for International Cancer Control (UICC). It is a stage classification.
  • the above Union for International Cancer Control (UICC) TNM classification is referred to herein as the UICC-TNM classification.
  • UICC-TNM classification breast cancer is classified into stages 0, I, II, III and IV from the least advanced.
  • the UICC-TNM classification classifies the progression of cancer lesions according to three factors: lump size and spread in the breast (T classification), lymph node metastasis (N classification), and distant metastasis (M classification).
  • T classification lump size and spread in the breast
  • N classification lymph node metastasis
  • M classification distant metastasis
  • the staging based on the UICC-TNM classification can be made according to the usual knowledge of those skilled in the art.
  • stage 0 is when the breast cancer remains in the breast duct
  • stage I is when the breast cancer tumor diameter is within 2 cm and there is no axillary lymph node metastasis, or when it is micrometastasis within 0.2 mm, and when the tumor diameter exceeds 2 cm.
  • Stage III if there are 10 or more axillary lymph node metastases, or axillary and thoracic lymph node metastases, or ipsilateral supraclavicular lymph node metastases. If there is distant metastasis, it will be stage IV. In the examples described later, all are represented by the stage (p stage) after the postoperative pathological diagnosis is made.
  • the classification according to the expression status of the hormone receptor is the classification according to the expression status of the estrogen receptor (ER) and / or the progesterone receptor (PgR), for example, the presence / absence (positive or negative) or the expression level.
  • the expression status of ER and PgR may be the expression status of genes encoding these proteins, but is preferably the expression status of these proteins.
  • the classification based on the expression status of the HER2 gene and / or the protein may be based on the presence / absence (positive or negative) of the expression of the HER2 gene and / or the protein or the expression level.
  • nucleic acid detection method examples include a nucleic acid amplification method using a primer and a hybridization method using a probe (for example, FISH (Fluorescence In situ Hybridization) method).
  • ER When classifying by combining ER, PgR, and HER2, they can be classified into the following three groups: (1) Hormone receptor positive / HER2 negative in which ER and / or PgR is expressed but HER2 is not expressed; (2) HER2 positive with or without ER and PgR expression; (3) Triple negative with neither ER, PgR, or HER2 expression.
  • the presence or absence or level of expression of the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof in the nucleolus is used as a marker for predicting the prognosis of cancer patients such as breast cancer patients.
  • the presence or absence of expression or the level of expression will be described in detail below.
  • the present invention relates to a method of predicting the prognosis of a cancer patient.
  • This method predicts that the prognosis is poor when the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof is detected in a nucleolus in a cancer cell or tissue obtained from a cancer patient, and when the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof is detected.
  • the detection step can be performed in vitro.
  • the present invention relates to a method of predicting the prognosis of a cancer patient.
  • This method is a step of detecting the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof in the nucleolus in cancer cells or tissues obtained from a cancer patient, and the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof is highly nucleated as compared with other cell fractions.
  • the "other cell fraction” is not limited as long as it is a cell fraction other than the nucleolus, and may be, for example, cytoplasm or nucleoplasm (nucleoplasm).
  • "when the CK2 ⁇ protein or its fragment is not detected in the nucleolus at a high degree compared to other cell fractions” means that the CK2 ⁇ protein or its fragment is in the nucleolus to the same extent as other cell fractions.
  • the detection step can be performed in vitro.
  • stage of cancer affected by the patient subject to the present invention is not limited.
  • the breast cancer affected by a patient subject to the present invention may be stage I-IV, such as stage I-III or stage III breast cancer.
  • the cancer patient in the present invention is, for example, a mammal, preferably a primate, more preferably a human.
  • the cancer cells or tissues used in the present invention are not particularly limited, but can be obtained from cancer patients by, for example, biopsy or excision surgery.
  • the cell or tissue may be used as it is for detecting a marker, or may be appropriately pretreated for measurement.
  • a paraffin-embedded section may be prepared from a sample derived from a patient.
  • nuclei or nucleoli may be separated from a sample derived from a patient to prepare a protein extract.
  • the marker detected by this method may be either the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof. Detection includes measurement of the presence or absence of expression, the amount of expression, the magnitude of expression concentration, and the like. As used herein, the term “detection” includes both measurement, qualitative, quantitative and semi-quantitative.
  • the method for detecting the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof may be any known protein detection method, and is not particularly limited, and examples thereof include an immunological detection method.
  • the "immunological detection method” is a method of measuring the amount of a target molecule using an antibody or antibody fragment that specifically binds to the target molecule that is an antigen.
  • the antibody can be derived from any animal, including mammals and birds. Examples include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, donkeys, sheep, camels, horses, chickens or humans.
  • the antibody used in the immunological detection method is not particularly limited, but a monoclonal antibody or a polyclonal antibody may be used.
  • monoclonal antibody refers to a group of clones of a single immunoglobulin. Each immunoglobulin constituting a monoclonal antibody contains a common framework region and a common complementarity determining region, and can recognize and bind to the same epitope of the same antigen. Monoclonal antibodies can be obtained from hybridomas derived from a single cell.
  • polyclonal antibody refers to a group of multiple immunoglobulins that recognize and bind to different epitopes of the same antigen.
  • the polyclonal antibody can be obtained from the serum of an animal after immunizing the animal with the target molecule as an antigen.
  • each class of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD is known as an immunoglobulin molecule, but the antibody of the present invention may be in any class. , For example, IgG.
  • the method for producing a polyclonal antibody that recognizes and binds to the CK2 ⁇ protein or a hybridoma that produces a monoclonal antibody may be carried out according to an antibody production method known in the art using the CK2 ⁇ protein or a fragment thereof as an antigen. Antibodies may also be obtained from the manufacturer.
  • antibody fragment refers to a polypeptide chain or a complex thereof that is a partial fragment of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody and has an activity substantially equivalent to the antigen-specific binding activity of the antibody. ..
  • an antibody moiety that includes at least one antigen-binding site that is, a polypeptide chain having at least one set of VL and VH, or a complex thereof.
  • Specific examples include a large number of well-characterized antibody fragments produced by cleaving immunoglobulins with various peptidases. More specific examples include Fab, F (ab') 2 , Fab'and the like. All of these antibody fragments include an antigen-binding site and have the ability to specifically bind to a target molecule that is an antigen.
  • Immunological detection methods include, for example, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (including ELISA and EIA), western blot, radioimmunoassay (RIA), immunoprecipitation, or flow cytometry.
  • enzyme-linked immunosorbent assay including ELISA and EIA
  • western blot including ELISA and EIA
  • RIA radioimmunoassay
  • immunoprecipitation or flow cytometry.
  • flow cytometry flow cytometry.
  • immunohistochemical staining method A known method can be adopted as the "immunohistochemical staining method". For example, a patient-derived sample may be fixed in formalin, embedded in paraffin, sliced into tissue pieces, and attached to a slide glass, which may be used as a section sample. Immunohistochemical staining is optionally performed on section samples with a primary antibody that recognizes the CK2 ⁇ protein or fragments thereof, and a labeled secondary antibody that recognizes the primary antibody, after heat treatment to activate the antigen. Good.
  • the expression of the CK2 ⁇ protein or its fragment in the nucleolus can be confirmed by performing it on a sample from which the nucleolus has been separated in advance.
  • each of the above-mentioned measurement methods is a technique known in the art. Therefore, the specific measurement method may be performed according to a known method. For example, the method described in Green, M.R. and Sambrook, J., 2012 (described above) can be referred to.
  • the prognosis of cancer patients is predicted based on the measurement results obtained in the measurement step.
  • the step comprises determining whether the cancer cell or tissue is positive or negative for a marker from the results obtained in the detection step. If the cancer cells or tissues are negative for the marker, the prognosis of the cancer patient can be predicted to be good. On the other hand, if the cancer cells or tissues are positive for the marker, the prognosis of the cancer patient can be predicted to be poor.
  • the immunohistochemical staining method when one or more cells or cell clusters are stained, it can be determined as positive, and when the number of stained tumor cells does not exist, it can be determined as negative. Alternatively, if the number of stained tumor cells exceeds a certain ratio (for example, 10%, 15%, or 20%) to the total number of tumor cells, it is judged as positive, and the number of stained tumor cells relative to the total number of tumor cells is If it is less than a certain ratio, it may be determined to be negative. In the immunohistochemical staining method, for example, the sections can be classified into the following five stages of I, II, III, IV and V.
  • a certain ratio for example, 10%, 15%, or 20%
  • the prediction step comprises determining whether the expression level of the marker in the cancer cells or tissues obtained in the detection step is high or low (eg, below a predetermined threshold). Prognosis of cancer patients (eg, for populations with expression levels above a given threshold) when marker expression levels in cancer cells or tissues are below a predetermined threshold (eg, statistically significantly lower) Can be predicted to be good. On the other hand, if the expression level of a biomarker in a cancer cell or tissue is higher than a predetermined threshold (eg, statistically significantly higher), the cancer patient (eg, for a population having an expression level lower than the predetermined threshold). The prognosis of is poor.
  • the predetermined threshold value may be a control amount measured in a control sample (control cell or tissue, for example, control mammary cell or mammary tissue).
  • the control sample may be derived from a healthy individual (eg, a healthy person), a benign tumor of the mammary gland, or a breast cancer patient (eg, a stage II breast cancer patient).
  • the "healthy individual” refers to a healthy individual of the same species as the test individual, which is not affected by cancer.
  • the median value, average value, upper limit level, lower limit level, or a certain range of values of the expression level in these individuals or the expression level in a plurality of individuals can be used as a predetermined threshold value.
  • the threshold value can be appropriately set according to the accuracy of prediction and the like, and can be determined by, for example, ROC (receiver operating characteristic curve) analysis.
  • the term "statistically significant” means that when the risk factor (significance level) of the obtained value is small, specifically, p ⁇ 0.05 (less than 5%) and p ⁇ 0.01 (less than 1%). ) Or p ⁇ 0.001 (less than 0.1%).
  • the statistical test method a known test method capable of determining the presence or absence of significance may be appropriately used, and is not particularly limited. For example, the Student's t-test method, the multiple comparison test method, and the log rank test method can be used.
  • poor prognosis means poor clinical outcome (eg, after surgical resection), high recurrence risk or high recurrence rate of cancers such as breast cancer, and recurrence-free survival. Low, low disease (cancer) specific survival rate, or low overall survival rate). If the prognosis is poor, recurrence-free survival or disease-specific survival after 5 years may be 95% or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, or 70% or less. In the present invention, the survival rate means the cumulative survival rate.
  • good prognosis means that the clinical outcome is good. If the prognosis is good, the recurrence-free survival rate or survival rate 5 years after the cancer resection surgery may be 90% or more, 95% or more, or 100%.
  • the prognosis of a cancer patient can be predicted, and based on the result, a treatment policy (for example, type of anticancer drug, dose, dosing interval, etc.) is determined, or cancer recurrence and metastasis are examined. Interval can be determined.
  • a treatment policy for example, type of anticancer drug, dose, dosing interval, etc.
  • the present invention when the prognosis of a cancer patient is predicted to be poor, the patient is given drug therapy and / or radiation therapy in order to prevent the recurrence of the cancer, improve the prognosis, or improve the survival rate. Is also good. Therefore, the present invention also prevents or improves the recurrence of cancer, including giving at least one of drug therapy and radiation therapy to a cancer patient predicted to have a poor prognosis by the method of the present invention. Alternatively, a method for improving the survival rate is provided. In addition, if the prognosis of a cancer patient is predicted to be poor, the frequency of tests can be increased in order to detect the recurrence of cancer at an early stage.
  • Drugs include, but are not limited to, anti-cancer agents such as doxorubicin, cyclophosphamide, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabin, oxaliplatin, and irinotecan; anti-estrogen agents (eg, tamoxyphene), LH-RH agonist preparations.
  • anti-cancer agents such as doxorubicin, cyclophosphamide, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabin, oxaliplatin, and irinotecan
  • anti-estrogen agents eg, tamoxyphene
  • Hormone therapeutic agents such as (eg, leuprin), aromatase inhibitors (eg, anastrozole), and progesterone preparations
  • antibody agents such as HER2 antibody (eg, trastuzumab).
  • the drugs can be used alone or in combination.
  • the drug can be administered by routes such as injection, intravenous administration, oral
  • the methods described herein combine the presence or absence of detection of the CK2 ⁇ protein or fragments thereof with factors such as stage classification, tumor diameter, presence or absence of lymph node metastasis, histological grade, and the like in cancer patients. Predict the prognosis of.
  • the cancer is breast cancer and the presence or absence of detection of the CK2 ⁇ protein or fragment thereof is classified by stage, hormone receptor expression, and HER2 gene and / or Predict the prognosis of breast cancer patients in combination with at least one of the protein expression classifications. Classification by stage, classification by hormone receptor expression status, and HER2 gene and / or protein expression status are as described in the section (Use as a marker for prognosis prediction).
  • the methods described herein determine the presence or absence of detection of the CK2 ⁇ protein or fragment thereof in addition to or apart from the above classification, tumor diameter, presence or absence of lymph node metastasis, histology. Predict the prognosis of breast cancer patients in combination with other factors such as grade. When combined with other classifications or factors, it can have the effect of enabling better prognosis prediction.
  • kits In one aspect, the invention also provides a kit for predicting the prognosis of a cancer patient, comprising reagents for measuring the amount of markers according to the invention described above.
  • kits for measuring the amount of the marker include the above-mentioned antibody or antibody fragment.
  • the kit includes known immunohistochemical staining, ELISA, reagents for Western blots, etc., such as labeling reagents, buffers, chromogenic substrates, secondary antibodies, blocking agents, equipment and controls required for testing, and at least instructions. One may be further included.
  • Example 1 Immunohistochemical staining of CK2 ⁇ protein in breast cancer tissue (Materials and methods) Breast cancer tissue formalin-fixed paraffin-embedded specimens resected from 117 patients with primary breast cancer who underwent radical resection between 2007 and 2014 at Hoshi General Hospital were used. Tumor stages were determined according to the TNM classification of malignant tumors (UICC International Convention, LH Sobin, MK Gospodarowicz and Ch. Wittekind, TNM Classification of Malignant Tumours, 7th edition). This study was approved by the review committee of Hoshi General Hospital and Fukushima Medical University.
  • the formalin block was cut out to a thickness of 4 ⁇ m and mounted on a glass plate. Deparaffinize and rehydrate using Tissue Tech Prisma 6120 (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.) according to a conventional method, and autoclave at 105 ° C for 10 minutes in 10 mM sodium bicarbonate buffer (pH 8.0). The antigen was activated in. Sections were blocked at room temperature for 30 minutes with goat serum diluted 200-fold in 10 mM phosphate buffered saline (PBS) containing 1% bovine serum albumin (BSA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the sections were washed with PBS and then diluted 1,000-fold in PBS containing BSA and 0.05% Tween® 20 with mouse monoclonal anti-CK2 ⁇ (ab70774, Abcam, UK) (antigen is CK2 ⁇ full-length protein) and 4
  • the reaction was carried out at ° C overnight. 16 hours later, biotin-conjugated anti-mouse IgG (BA-9200, Vector Laboratories, US) for 30 minutes at room temperature, and avidin-horseradish peroxidase complex using Vectastain TM Elite ABC HRP kit (PK-6102, Vector Laboratories, US). It was incubated with the body for 30 minutes, after which the anti-CK2 ⁇ antibody was visualized by DOJINDO, Japan under acidic conditions. Successive sections were counterstained with hematoxylin.
  • Immunohistochemistry slides with CK2 ⁇ antibody were evaluated by two independent pathologists who did not know patient information on a scale of I, II, III, IV, and V based on the following criteria.
  • I Staining of whole cells, but nuclear staining is not clear
  • II Nuclear staining (+), nuclear staining is clearer than cytoplasm III: Nuclear staining (++), nuclear staining is higher than II
  • IV Nuclear staining (+, ++)
  • V Nucleus staining (-), Nucleolus staining (+)
  • FIG. 1A is an image ( ⁇ 100) in which the cancer infiltrated part and the normal part are adjacent to each other on one section, and CK2 ⁇ protein expression is observed in the whole cell body in the normal part, while the cell nucleus is in the other in the cancer infiltrated part. It was observed darker than the cell body part.
  • FIG. 1B is a ⁇ 400 image of the cancer infiltrate. In the cancer infiltrated part, a stained image was observed in which the "nucleolus" part, which is a structure in the cell nucleus, was remarkably positive (an example is shown by an arrow in FIG. 1B).
  • Figure 2 shows an exemplary image of the specimens with staining evaluations IV.
  • 25 (21.4%) IVs were positive for nucleolus staining and 18 (15.4%) were V, and 36.8% of the total were positive for nucleolus staining.
  • 16 were from stage I, 19 from stage II, 7 from stage III, and 1 from stage IV breast cancer patients.
  • the nucleolus staining negative staining evaluation I was 7 (6.0%), II was 15 (12.8%), and III was 52 (44.4%).
  • the 22 sections of staining ratings I and II with low nuclear staining levels 13 were from stage I, 8 were from stage II, and 1 was from stage III patients.
  • CK2 ⁇ protein is present throughout the cell in normal cells, but it is often observed that it is highly expressed in the nucleus in breast cancer cells, and CK2 ⁇ in some breast cancer patients (a little less than 40%). It was shown that the protein is localized in the nucleolus in the nucleus, and that the higher the nuclear expression level and the nucleolus staining level of the CK2 ⁇ protein, the higher the proportion of cases with a higher stage of breast cancer.
  • Example 2 Evaluation of prognosis after excision surgery for breast cancer patients Among the breast cancer patients described in Example 1, the prognosis of 113 patients with stage I to III excluding stage IV was evaluated. The determination of the tumor stage is as described in Example 1. Patient clinical information was obtained retroactively by reviewing medical records. The patient background is shown in Table 1.
  • the survival curves of CK2 ⁇ nucleolus staining positive (IV + V) and negative (I + II + III) were analyzed by the Kaplan-Meier method. Relapse-free survival, disease-specific survival, and overall survival were analyzed. Recurrence-free survival, disease-specific survival, and overall survival are defined as the period from surgery to recurrence, from the date of surgery to death from breast cancer, and from surgery to death from any cause, respectively.
  • the significant difference between the two survival curves of CK2 ⁇ nucleolus staining positive (IV + V) and negative (I + II + III) was tested by the log rank test, and the hazard ratio and its 95% confidence interval were calculated. All statistical analyzes were performed using Graphpad Prism 7.0.
  • Table 2 shows which CK2 ⁇ staining assessments belonged to recurrence, breast cancer mortality and all-cause mortality.
  • 9 cases were CK2 ⁇ nucleolar staining positive IV or V, and 3 cases were nuclear strong staining III.
  • 4 were nucleolar staining positive IV or V and 1 was nuclear strong staining III.
  • Figure 3 shows the results of recurrence-free survival rate.
  • Breast cancer patients positive for CK2 ⁇ nucleolus staining showed significantly lower recurrence-free survival compared to patients negative for nucleolus staining. This indicates that the risk of recurrence in CK2 ⁇ nucleolus staining positive cases is significantly higher than that in negative cases.
  • Fig. 4 The 10-year survival rate for CK2 ⁇ nucleolus staining-positive cases was 89.8%, which was significantly lower than 98.5% for negative cases. In addition, the overall survival rate showed the same tendency as the disease-specific survival rate (results not shown).
  • stage I-III breast cancer patients CK2 ⁇ staining is divided into three stages, I + II, III, and IV + V, and the results of recurrence-free survival rate are shown in Fig. 5. This result indicates that the risk of recurrence in patients with positive CK2 ⁇ nucleolus staining is higher than in cases with high levels of nuclear staining.
  • FIGS. 6 to 10 The results of non-regenerative survival in the subgroups are shown in FIGS. 6 to 10.
  • hormone receptor positive / HER2 negative Fig. 6
  • triple negative Fig. 7
  • stage I or II Fig. 8
  • stage III Fig. 9
  • lymph node metastasis Fig. 10
  • Breast cancer patients positive for CK2 ⁇ nucleolus staining showed significantly lower recurrence-free survival compared to patients negative for nucleolus staining.
  • stage I or II with a relatively good prognosis, hormone receptor positive / HER2-negative cases, and triple negative with a relatively poor prognosis, stage III, or with lymph node metastasis.
  • the presence or absence of nucleolar localization of the CK2 ⁇ protein indicates that it is a predictive predictor of recurrence.
  • the difference in recurrence-free survival between nucleolus positive and nucleolus negative was significant in patients with triple negative, stage III, and lymph node metastasis, so it was more accurate to combine with these factors. It was suggested that the prognosis could be predicted.
  • Example 3 Comparison with other recurrence predictors (Method) Other predictors of recurrence were analyzed by the Kaplan-Meier method described in Example 2 using information from 113 stage I-III patients with primary breast cancer used in Example 2. (result) Table 3 shows a comparison with other recurrence predictors. As shown in Table 3, CK2 ⁇ nucleolar staining positive (IV + V) had a greater hazard ratio than tumor size, stage 3, histological grade, and triple negative. This indicates that the presence or absence of nucleolar localization of the CK2 ⁇ protein is a strong predictor of recurrence.
  • Example 4 Immunohistochemical staining of CK2 ⁇ protein in various cancer tissues (Purpose) Immunohistochemical staining of CK2 ⁇ protein is performed on various cancer tissues other than breast cancer to examine the localization of CK2 ⁇ protein.
  • FIGS. 11 to 12 The results of immunohistochemical staining are shown in FIGS. 11 to 12. Glioloma (Fig. 11A), bladder cancer (Fig. 11B), renal cancer (Fig. 11C), thyroid cancer (Fig. 11D), pancreatic cancer (Fig. 12A), esophageal cancer (Fig. 12B), biliary tract cancer (Fig. 12C), and Stained images with positive nuclei were observed in all uterine cancers (Fig. 12D). Examples of staining of nucleoli are shown by arrows in FIGS. 11 to 12. In addition to the nucleolus, the nuclear envelope was sometimes positive.
  • the FDA standard tissue array (BioChain Institute Inc., product number T8234701-1) was used for liver specimens of healthy subjects. Immunohistochemical staining of the CK2 ⁇ protein was performed using an anti-CK2 ⁇ matrix (ab70774, Abcam, UK) as in Example 1.
  • FIGS. 13 to 16 The results of immunohistochemical staining are shown in FIGS. 13 to 16. Nucleolus in all of liver cancer (Fig. 13B), lung adenocarcinoma (Fig. 14B), squamous cell lung cancer (Fig. 14C), gastric cancer (Fig. 15B), rectal cancer (Fig. 16B), and colon cancer (Fig. 16D). A stained image positive for was observed. Examples of staining of nucleoli are shown by arrows in FIGS. 13 to 16. In addition to the nucleolus, the nuclear envelope was sometimes positive.

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Abstract

一実施形態において、本発明は、乳癌患者等の癌患者の予後を予測するためのバイオマーカーを提供することを課題とする。　一実施形態において、本発明は、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の、癌患者の予後予測のためのマーカーとしての使用、当該マーカーを用いて癌患者の予後を予測する方法、又は当該マーカーを測定するための試薬を含むキットに関する。

Description

癌の予後バイオマーカー
　本発明は、癌患者の予後予測のためのマーカー、癌患者の予後を予測する方法、及び当該方法において使用するためのキット等に関する。
　わが国において、癌は死亡原因全体の中で第1位であり、約3割を占めている。例えば、乳癌は30～64歳の女性において死亡原因のトップであり、2018年の乳癌による死亡数は約14000人である。乳癌の検出方法及び／又は治療方法等の進歩によって、乳癌患者の生存率は改善しているが、依然として再発、転移、又は死亡等のリスクが高い予後不良の患者も存在する。したがって、乳癌の治療及び／又は予防の質を高めるためには、乳癌患者の予後を予測し、その結果に応じて乳癌患者の個別的なマネージメントを行うことが非常に重要である。
　非特許文献１には、HER2遺伝子及びタンパク質と予後の関連について報告されている。しかしながら、HER2遺伝子及びタンパク質単独では、十分な精度で乳癌の予後予測を行うことができるとは言えない。
Ross J.S. et al., Oncologist, 2003, 8(4), pp.307-25.
　一実施形態において、本発明は、乳癌患者等の癌患者の予後を予測するためのバイオマーカーを提供することを課題とする。別の実施形態において、本発明は、当該バイオマーカーを用いて乳癌患者等の癌患者の予後を予測する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、核小体中のCK2αタンパク質が、乳癌患者等の癌患者の予後予測のためのバイオマーカーとして使用し得ることを見出し、本願発明を完成させた。
　本発明は、以下の実施形態を包含する。
（１）核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の、癌患者の予後予測のためのマーカーとしての使用。
（２）CK2αタンパク質が、以下の(a)～(c)のいずれかのアミノ酸配列：
　(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列、
　(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
　(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
を含む、（１）に記載の使用。
（３）予後が再発リスクを含む、（１）又は（２）に記載の使用。
（４）前記癌が、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、胆道癌、膵癌、肝癌、腎癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、甲状腺癌、及び神経膠腫からなる群から選択される、（１）～（３）のいずれかに記載の使用。
（５）前記癌が乳癌であり、前記マーカーを、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する、（４）に記載の使用。
（６）癌患者の予後を予測する方法であって、
　癌患者から得られた癌細胞又は組織において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を検出する工程、及び
　CK2αタンパク質又はその断片が検出された場合に予後が悪いと予測する、及び／又はCK2αタンパク質又はその断片が検出されない場合に予後が良いと予測する工程を含む、方法。
（７）癌患者の予後を予測する方法であって、
　癌患者から得られた癌細胞又は組織において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を検出する工程、及び
　CK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出された場合に予後が悪いと予測する、及び／又はCK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出されない場合に予後が良いと予測する工程を含む、方法。
（８）CK2αタンパク質が、以下の(a)～(c)のいずれかのアミノ酸配列：
　(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列、
　(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
　(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）予後が再発リスクを含む、（６）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記癌が、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、胆道癌、膵癌、肝癌、腎癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、甲状腺癌、及び神経膠腫からなる群から選択される、（６）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記癌が乳癌であり、CK2αタンパク質又はその断片の検出の有無を、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する、（１０）に記載の方法。
（１２）CK2αタンパク質又はその断片の量を測定するための試薬を含む、（６）～（１１）のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-234099号の開示内容を包含する。
　本発明により、乳癌患者等の癌患者の予後を予測するためのバイオマーカーが提供される。
図1は、乳癌組織におけるCK2αタンパク質の免疫組織化学染色評価についての代表的な画像を示す。図1Aは一枚の切片上に癌浸潤部と正常部が隣り合う画像(×100)である。図1Bは、癌浸潤部の×400の画像である。図1Bにおいて、核小体が著しく陽性となる染色像の一例を矢印で示す。 図2は、染色評価I～Vの標本の例示的画像を示す(I：細胞全体の染色があるが、核染色が明瞭でない。II：核染色(＋)、細胞質より核染色が明瞭である。III：核染色(＋＋)、核染色がIIより高いレベルである。IV：核染色(＋、＋＋)、さらに核小体染色(＋)。V：核染色(－)、核小体染色(＋))。 図3は、乳癌ステージI、II、IIIの患者における無再発生存率を示す。 図4は、乳癌ステージI、II、IIIの患者における疾患特異的生存率を示す。 図5は、乳癌ステージI～IIIの患者において、CK2α染色をI+II、III、IV+Vの3段階に分けた場合の無再発生存率を示す。 図6は、ホルモン受容体陽性/HER2陰性の患者における無再発生存率を示す。 図7は、トリプルネガティブの患者における無再発生存率を示す。 図8は、乳癌ステージI、IIの患者における無再発生存率を示す。 図9は、乳癌ステージIIIの患者における無再発生存率を示す。 図10は、リンパ節転移ありの患者における無再発生存率を示す。 図11は、様々な癌組織におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図11Aは神経膠腫の染色例（×400）である。図11Bは膀胱癌の染色例（×400）である。図11Cは腎癌の染色例（×400）である。図11Dは甲状腺癌の染色例（×400）である。図11A～図11Dでは、核小体の陽性例を矢印で示す。 図12は、様々な癌組織におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図12Aは膵癌の染色例（×400）である。核内に1個の核小体が検出された例、及び核内に2個の核小体が検出された例を示す。図12Bは食道癌の染色例（×400）である。図12Cは胆道癌の染色例（×400）である。図12Dは子宮癌の染色例（×400）である。図12A～図12Dでは、核小体の陽性例を矢印で示す。 図13は、肝臓におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図13Aは健常人の肝臓の染色例（×400）である。図13Bは肝癌の染色例（×400）である。核小体の陽性例を矢印で示す。 図14は、肺腺癌及び肺扁平上皮癌におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図14Aは健常人の肺の染色例（×400）である。図14Bは肺腺癌の染色例（×400）である。図14Cは肺扁平上皮癌の染色例（×400）である。図14B及び図14Cでは、核小体の陽性例を矢印で示す。 図15は、胃におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図15Aは健常人の胃の染色例（×400）である。図15Bは胃癌の染色例（×400）である。図15及び図15Bでは、核小体の陽性例を矢印で示す。 図16は、直腸におけるCK2αタンパク質に対する免疫組織化学染色の結果を示す。図16Aは直腸非癌部の染色例（×400）である。図16Bは直腸癌の染色例（×400）である。図16Cは結腸非癌部の染色例（×400）である。図16Dは結腸癌の染色例（×400）である。図16B及び図16Dでは、核小体の陽性例を矢印で示す。
(マーカー)
　一態様において、本発明は、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を含む、又はからなる癌患者の予後予測のためのマーカーに関する。
　本明細書において、「癌」の種類は限定しないが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌及び大細胞癌等が挙げられる。具体的には、癌の種類としては、例えば、悪性黒色腫、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌（結腸癌及び直腸癌を含む）、小腸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮体癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、腎癌、肝癌、膵癌、胆道癌（胆嚢癌及び胆管癌を含む）、脳腫瘍、頭頸部癌、中皮腫、骨肉腫、神経膠腫、神経芽腫を始めとする小児腫瘍、白血病、リンパ腫等が挙げられる。癌は、好ましくは乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌（例えば、胆嚢癌又は胆管癌）、腎癌、大腸癌（例えば、直腸癌又は結腸癌）、膀胱癌、肺癌（例えば、肺腺癌又は肺扁平上皮癌）、甲状腺癌、又は神経膠腫（例えば、星状細胞腫）であり、より好ましくは乳癌である。
　本明細書において、「乳癌」の種類は限定されず、例えば非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、また特殊型癌として髄様癌、粘液癌、管状癌等が挙げられる。
　本明細書において、「予後」は、乳癌患者等の癌患者における予測される経過(例えば、再発の有無又は生死)を指す。「予後の予測」は、再発リスク(例えば無再発生存率)、生存期間、又は手術から一定期間後(例えば、1年、2年、3年、4年、5年、10年、15年若しくは20年後又はそれ以上の時点)の生存率、無再発生存率(Relapse-free survival、RFS)、又は疾患特異的生存率(Disease-free survival、DFS)の予測であってもよい。一実施形態において、予後の予測は、再発リスク(例えば無再発生存率)の予測を含む。なお、本明細書において無再発生存率は、初発癌と関連付けられる癌等の再発癌発症のない患者の割合であり、疾患特異的生存率は、初発癌と関連する死亡のない患者の割合を意味する。予後の予測は、予後の判定、評価、又は診断、又はこれらの補助ということもできる。
　CK2(Casein kinase 2)タンパク質は、セリン・スレオニンキナーゼの一種であり、pro-survival pathway等に関与することが知られている。CK2タンパク質は、典型的にαサブユニット、α’サブユニット、及び二つのβサブユニットで構成される四量体として存在する。本明細書において、「CK2αタンパク質」は、CK2のαサブユニットを意図し、casein kinase 2 alpha 1又はcasein kinase II subunit alpha: CK2α、CK2α1又はCSNK2A1とも称される。
　本明細書において、乳癌患者等の癌患者の内在遺伝子に由来するCK2αタンパク質又はその断片がバイオマーカーとなり得る。例えば、前記患者がヒトであれば、ヒトCK2αタンパク質又はその断片がバイオマーカーとなり得る。
　CK2αタンパク質の具体例として、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む、又はからなるヒト由来のCK2α(ヒトCK2α)タンパク質が挙げられる。
　また、CK2αタンパク質には、配列番号2で示されるCK2αタンパク質と機能的に同等の活性を有するCK2αバリアントや他生物種のCK2αオルソログも包含される。具体的には、配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、あるいは配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して80%以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上のアミノ酸同一性を有するCK2αタンパク質が包含される。
　本明細書において「数個」とは、例えば、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン、ヒスチジン)、酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性アミノ酸(グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン)、無極性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン)、分枝鎖アミノ酸(ロイシン、バリン、イソロイシン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン)等に分類することができる。
　本明細書において「アミノ酸同一性」とは、2つのアミノ酸配列を整列(アラインメント)し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むCK2αタンパク質の全アミノ酸残基に対する2つのアミノ酸配列間で同一アミノ酸残基の割合(％)をいう。アミノ酸同一性は、BLASTやFASTAによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
　CK2αタンパク質は、CK2α遺伝子によりコードされる。CK2α遺伝子の具体例として、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むヒトCK2αタンパク質をコードするヒトCK2α遺伝子が挙げられる。より具体的には、CK2α遺伝子は、配列番号1で示される塩基配列を含む、又はからなる遺伝子が挙げられる。
　また、CK2α遺伝子には、配列番号1で示されるCK2α遺伝子がコードするCK2αタンパク質と機能的に同等の活性を有するCK2αバリアントや他生物種のCK2αオルソログをコードするCK2α遺伝子も包含される。具体的には、配列番号1で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列、あるいは配列番号1で示される塩基配列に対して80%以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の塩基同一性を有するCK2α遺伝子が包含される。さらに、配列番号1で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列の一部を含む核酸断片と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつCK2αタンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が包含される。
　本明細書において「塩基同一性」とは、2つの塩基配列を整列(アラインメント)し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号2で示される塩基配列を含むCK2α遺伝子の全塩基に対する2つの塩基配列間で同一塩基の割合(％)をいう。
　本明細書において「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、低塩濃度及び/又は高温の条件下でハイブリダイゼーションと洗浄を行うことをいう。例えば、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS、100μg/mL変性断片化サケ精子DNA中で65℃～68℃にてプローブと共にインキュベートし、その後、2×SSC、0.1％SDSの洗浄液中で室温から開始して、洗浄液中の塩濃度を0.1×SSCまで下げ、かつ温度を68℃まで上げて、バックグラウンドシグナルが検出されなくなるまで洗浄することが例示される。高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件については、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されているので参考にすることができる。
　このようなCK2α遺伝子の塩基配列情報は、公共のデータベース(GenBank、EMBL、DDBJ)より検索可能である。例えば、配列番号1で示されるCK2α遺伝子の既知塩基配列情報に基づいて、塩基同一性の高い遺伝子をデータベースから検索し、入手することができる。
　本明細書において、CK2αタンパク質の「断片」とは、CK2αタンパク質を構成するアミノ酸配列の一部を含む、又はからなるペプチド断片であって、その断片を構成するアミノ酸配列からCK2αタンパク質の断片であることを同定することができるものをいう。例えば、「断片」は、CK2αタンパク質の全長アミノ酸配列のうちの5個以上、8個以上、10個以上、20個以上、30個以上、40個以上、又は50個以上の連続するアミノ酸酸残基であってよく、また、200個以下、150個以下、120個以下、100個以下、又は80個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであってよい。例えば、「断片」は、5個～200個、10個～120個、50個～80個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであってよい。
　本明細書において、「核小体」とは、真核生物細胞の核に存在する分子密度の高く、rRNAの転写やリボソームの生成が行われる領域を指す。核小体は、一般に光学顕微鏡で観察可能である。通常は核内に1つの核小体が観察されるが、複数の核小体が観察される場合もある。
(予後予測のためのマーカーとしての使用)
　一態様において、本発明は、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の、癌患者の予後予測のためのマーカーとしての使用に関する。
　一実施形態において、癌は、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、腎癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、甲状腺癌、及び神経膠腫からなる群から選択される。
　一実施形態において、本発明は、前記マーカーを、ステージによる分類、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード等の因子と組み合わせて癌患者の予後予測を行う。
　一実施形態において、本発明では、癌は乳癌であり、前記マーカーを、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つ、例えば2つ、好ましくは3つ全てと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する。一実施形態において、前記マーカーを、上記分類に加えて、又は上記分類とは別に、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード等の等の他の因子と組み合わせて乳癌患者の予後予測を行う。他の分類又は因子と組み合わせることで、より優れた予後予測が可能になるという効果を奏し得る。
　本明細書において、ステージによる分類とは、国際対癌連合(UICC)のTNM分類(UICC国際規約、L.H. Sobin, M.K. Gospodarowicz and Ch. Wittekind, TNM Classification of Malignant Tumours, 7th edition)に基づいて行われるステージ分類である。上記の国際対癌連合(UICC)のTNM分類を、UICC-TNM分類と本明細書で称する。UICC-TNM分類では、乳癌は、進行度の低い方からステージ0、I、II、III及びIVに分類される。UICC-TNM分類では、しこりの大きさと乳房内での広がり(T分類)、リンパ節転移(N分類)及び遠隔転移(M分類)の3つの因子により、癌病変の進行度を分類する。UICC-TNM分類に基づく病期の決定は当業者の通常の知識に従って行うことができる。
　具体的には、乳癌が乳管内にとどまる場合をステージ0、乳癌腫瘍径が2cm以内で腋窩リンパ節転移のないものあるいは0.2ミリ以内の微小転移のものをステージI、腫瘍径が2cmを超える場合で腋窩リンパ節転移がないものあるいは、腫瘍径が5cm以内で腋窩リンパ節転移が3個以内のものをステージII、腫瘍径にかかわらず腋窩リンパ節転移4－9個のもの（腋窩リンパ節転移がなくても臨床的に明らかに胸骨旁リンパ節転移があるものを含む）あるいは腫瘍径が5cmを超える場合で腋窩リンパ節転移が9個以内のものあるいは、腫瘍径にかかわらず腫瘍が胸壁浸潤、皮膚潰瘍・皮膚衛星結節・皮膚の浮腫を認める場合や炎症性乳癌の場合はリンパ節転移のいかんにかかわらずステージIIIとする。腋窩リンパ節転移10個以上あるいは腋窩リンパ節および胸骨旁リンパ節転移、同側の鎖骨上リンパ節転移のある場合はいかなる腫瘍の状態でもステージIIIとする。遠隔転移がある場合はステージIVとする。なお後述の実施例においては、すべて術後の病理診断がついた後のステージ（pステージ）で表される。
　ホルモン受容体の発現状況による分類とは、エストロゲン受容体(ER)及び／又はプロゲストロン受容体(PgR)の発現状況、例えば発現有無(陽性又は陰性)又は発現高低による分類である。ER及びPgRの発現状況は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現状況であってもよいが、好ましくはこれらのタンパク質の発現状況である。HER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類は、HER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現有無(陽性又は陰性)又は発現高低による分類であってよい。ER、PgR、及びHER2の発現状況の測定方法は当業者には公知であり、限定するものではないが、例えばタンパク質の検出方法であれば、免疫組織化学染色法等の免疫学的検出法、核酸の検出方法であれば、プライマーを用いる核酸増幅法又はプローブを用いるハイブリダイゼーション法(例えばFISH(Fluorescence In Situ Hybridization)法)が挙げられる。
　ER、PgR、及びHER2を組み合わせて分類を行う場合、以下の3つのグループに分類することができる：(1)ER及び／又はPgRが発現し、HER2が発現しないホルモン受容体陽性/HER2陰性；(2)ER及びPgRの発現有無に関わらず、HER2が発現するHER2陽性；(3)ER、PgR、及びHER2のいずれも発現しないトリプルネガティブ。
　一実施形態において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の発現の有無又は高低を、乳癌患者等の癌患者の予後予測のためのマーカーとして使用する。発現の有無又は高低については、以下において詳細に記載する。
　一態様において、本発明は、癌患者の予後を予測する方法に関する。本方法は、癌患者から得られた癌細胞又は組織において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を検出する工程、及びCK2αタンパク質又はその断片が検出された場合に予後が悪いと予測する、及び／又はCK2αタンパク質又はその断片が検出されない場合に予後が良いと予測する工程を含む。検出工程は、インビトロで行うことができる。
　一態様において、本発明は、癌患者の予後を予測する方法に関する。本方法は、癌患者から得られた癌細胞又は組織において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を検出する工程、及びCK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出された場合に予後が悪いと予測する、及び／又はCK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出されない場合に予後が良いと予測する工程を含む。ここで「他の細胞画分」は核小体以外の細胞画分であれば限定せず、例えば細胞質や核質（核液）であってもよい。また、「CK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出されない場合」とは、CK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と同程度に核小体に検出された場合（CK2αタンパク質又はその断片が細胞全体で一様に検出された場合を含む）や、CK2αタンパク質又はその断片が核小体と比して高度に他の細胞画分に検出された場合等を含む。検出工程は、インビトロで行うことができる。
　以下に各工程について具体的に説明する。
(1)検出工程
　本発明の対象となる患者が患う癌のステージは限定しない。例えば、乳癌の場合には、本発明の対象となる患者が患う乳癌は、ステージI～IV、例えばステージI～III又はステージIIIの乳癌であってよい。
　本発明における癌患者は、例えば哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。
　本発明において使用する癌細胞又は組織は、特に限定されないが、例えば、生検又は切除手術によって癌患者から得ることができる。当該細胞又は組織は、そのままマーカーの検出に用いてもよいが、測定のために適宜前処理してもよい。例えば、免疫組織化学染色法でマーカーを検出する場合は、患者由来の試料からパラフィン包埋切片を調製してもよい。また、例えば、ウエスタンブロット法によってバイオマーカーを検出する場合は、患者由来の試料から核又は核小体を分離し、タンパク質抽出液を調製してもよい。
　本方法で検出されるマーカーは、CK2αタンパク質又はその断片のいずれであってもよい。検出は、発現の有無、発現量若しくは発現濃度の大小等の測定を包含する。本明細書において、「検出」という用語には、測定、定性、定量及び半定量のいずれもが包含される。
　CK2αタンパク質又はその断片の検出方法は、公知のタンパク質検出方法であればよく、特に限定はしないが、例えば、免疫学的検出法が挙げられる。
　「免疫学的検出法」は、抗原である標的分子と特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いて、標的分子の量を測定する方法である。
　抗体は、哺乳動物及び鳥を含めたいずれの動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。
　免疫学的検出法で使用する抗体は、特に限定されないが、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用してよい。
　本明細書において「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体を構成する各免疫グロブリンは、共通するフレームワーク領域及び共通する相補性決定領域を含み、同一抗原の同一エピトープを認識し、それに結合することができる。モノクローナル抗体は、単一細胞由来のハイブリドーマから得ることができる。
　本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識し結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。
　抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子には、IgG、IgM、IgA、IgE、及びIgDの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであってもよく、例えばIgGであってよい。
　CK2αタンパク質を認識し結合するポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法は、CK2αタンパク質又はその断片を抗原として当該分野で公知の抗体作製方法に準じて行えばよい。抗体はまた、製造業者から得てもよい。
　本明細書において「抗体断片」とは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の部分断片であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、抗原結合部位を少なくとも1つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも1組のVLとVHを有するポリペプチド鎖、又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Fab、F(ab')2、Fab'等が挙げられる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原である標的分子と特異的に結合する能力を有している。
　免疫学的検出法としては、例えば、免疫組織化学染色法、酵素免疫測定法(ELISA法、EIA法を含む)、ウエスタンブロット法、放射免疫測定(RIA)法、免疫沈降法、又はフローサイトメトリー法が挙げられる。
　「免疫組織化学染色法」は、公知の方法を採用することができる。例えば、患者由来の試料をホルマリン固定後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用してよい。免疫組織化学染色は、場合により熱処理して抗原を賦活化し、その後、CK2αタンパク質又はその断片を認識する一次抗体、及び一次抗体を認識する標識された二次抗体を用いて、切片試料について行ってよい。
　また、ウエスタンブロット法等の発現部位の確認ができない方法については、予め核小体を分離した試料について行うことで、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の発現を確認することができる。
　上述の各測定法は、いずれも当該分野に公知の技術である。したがって、具体的な測定方法については、公知の方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012(前述)に記載の方法を参考にすることができる。
(2)予測工程
　本工程では、前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、癌患者の予後を予測する。
　一実施形態において、本工程は、前記検出工程で得られた結果から、前記癌細胞又は組織がマーカーについて陽性であるか又は陰性であるか判定することを含む。癌細胞又は組織がマーカーについて陰性である場合、癌患者の予後は良いと予測し得る。一方、癌細胞又は組織がマーカーについて陽性である場合、癌患者の予後は悪いと予測し得る。
　免疫組織化学染色法を用いる場合、例えば、一つ又は複数の細胞又は細胞クラスターが染色された場合、陽性と判定し、染色された腫瘍細胞数が存在しない場合、陰性と判定することができる。あるいは、腫瘍細胞総数に対して染色された腫瘍細胞数が一定割合(例えば10％、15％又は20％)を超える場合、陽性と判定し、腫瘍細胞総数に対して染色された腫瘍細胞数が前記一定割合以下の場合、陰性と判定してもよい。免疫組織化学染色法では、例えば、以下のI、II、III、IV、Vの5段階に切片を分類することができる。
I：細胞全体の染色があるが、核染色が明瞭でない
II：核染色(＋)、細胞質より核染色が明瞭である
III：核染色(＋＋)、核染色がIIより高いレベルである
IV：核染色(＋、＋＋)、さらに核小体染色(＋)
V：核染色(－)、核小体染色(＋)
　上記分類において、IV及びVを核小体におけるCK2αタンパク質又はその断片が陽性であると判定することができる。
　一実施形態において、予測工程は、前記検出工程で得られた前記癌細胞又は組織におけるマーカーの発現レベルが、(例えば所定の閾値より)高いか低いかを判定することを含む。癌細胞又は組織におけるマーカーの発現レベルが、所定の閾値より低い(例えば、統計学的に有意に低い)場合、(例えば、所定の閾値より高い発現レベルを有する集団に対して)癌患者の予後は良いと予測し得る。一方、癌細胞又は組織におけるバイオマーカーの発現レベルが所定の閾値より高い(例えば、統計学的に有意に高い)場合、(例えば、所定の閾値より低い発現レベルを有する集団に対して)癌患者の予後は悪いと予測し得る。
　所定の閾値は、対照試料(対照細胞又は組織、例えば対照乳腺細胞又は乳腺組織)において測定した対照量であってもよい。対照試料は、健常個体(例えば健常人)、乳腺の良性腫瘍、又は乳癌患者(例えばステージII乳癌患者)に由来してもよい。本発明において「健常個体」とは、被験個体と同じ生物種の、癌に罹患していない健康な個体をいう。
　例えば、これらの個体における発現量、又は複数の個体における発現量の中央値、平均値、上限レベル、下限レベル、又は一定範囲の値を所定の閾値として用いることができる。閾値は、予測の精度等に応じて適宜設定することができ、例えば、ROC(receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線)解析により定めることができる。
　本明細書において「統計学的に有意」とは、得られた値の危険率(有意水準)が小さい場合、具体的には、p＜0.05(5％未満)、p＜0.01(1％未満)又はp＜0.001(0.1％未満)の場合を指す。統計学的検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法、ログランク検定法を用いることができる。
　本明細書において、「予後が悪い」とは、(例えば外科的手術による切除後の)臨床転帰が不良である(例えば、乳癌等の癌の再発リスク又は再発率が高い、無再発生存率が低い、疾患(癌)特異的生存率が低い、又は全生存率が低い)ことをいう。予後が悪い場合、5年後の無再発生存率又は疾患特異的生存率は95%以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、又は70％以下であってよい。本発明では生存率は、累積生存率を意味する。
　本明細書において、「予後が良い」とは、臨床転帰が良好であることをいう。予後が良い場合、癌の切除手術後の5年後の無再発生存率又は生存率は90％以上、95％以上又は100%であってよい。
　本発明によれば、癌患者の予後を予測することができ、その結果に基づき、治療方針(例えば、抗癌剤の種類、投与量、投与間隔など)を決定し、又は癌の再発及び転移の検査の間隔を決定することができる。
　本発明により、癌患者の予後が悪いと予測された場合、癌の再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善するために、患者に薬物療法及び／又は放射線療法を行っても良い。したがって、本発明はまた、本発明の方法により予後が悪いと予測された癌患者に薬物療法及び放射線療法の少なくとも一つを行うことを含む、癌の再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善する方法を提供する。また、癌患者の予後が悪いと予測された場合、癌の再発を早期発見するために、検査頻度を上げることもできる。
　薬物としては、以下に限定されないが、ドキソルビシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン、オキサリプラチン、及びイリノテカン等の抗癌剤；抗エストロゲン剤(例えばタモキシフェン)、LH-RHアゴニスト製剤(例えばリュープリン)、アロマターゼ阻害剤(例えばアナストロゾール)、及びプロゲステロン製剤等のホルモン療法薬剤；HER2抗体(例えばトラスツズマブ)等の抗体薬剤が挙げられる。薬物は、単独で又は組みあわせて使用できる。薬物は、注射、静脈内投与、経口投与などの経路で投与され得る。
　一実施形態において、本明細書に記載の方法は、CK2αタンパク質又はその断片の検出の有無を、ステージによる分類、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード等の因子と組み合わせて癌患者の予後予測を行う。
　一実施形態において、本明細書に記載の方法では、癌は乳癌であり、CK2αタンパク質又はその断片の検出の有無を、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する。ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況については、(予後予測のためのマーカーとしての使用)の項目において記載した通りである。一実施形態において、本明細書に記載の方法は、CK2αタンパク質又はその断片の検出の有無を、上記分類に加えて、又は上記分類とは別に、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード等の等の他の因子と組み合わせて乳癌患者の予後予測を行う。他の分類又は因子と組み合わせることで、より優れた予後予測が可能になるという効果を奏し得る。
(キット)
　一態様において、本発明は、上述の本発明に係るマーカーの量を測定するための試薬を含む、癌患者の予後を予測するためのキットも提供する。
　マーカーの量を測定するための試薬としては、例えば、上述のような抗体若しくは抗体断片が挙げられる。キットは、公知の免疫組織化学染色、ELISA、ウエスタンブロット用の試薬等、例えば、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、試験に必要な器具及びコントロール、並びに説明書の少なくとも一つをさらに含んでもよい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1：乳癌組織におけるCK2αタンパク質の免疫組織化学染色
(材料と方法)
　星総合病院で2007年から2014年の間に根治的切除術を受けた原発性乳癌患者117人の患者から切除された乳癌組織ホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いた。腫瘍のステージは悪性腫瘍のTNM分類(UICC国際規約、L.H. Sobin, M.K. Gospodarowicz and Ch. Wittekind, TNM Classification of Malignant Tumours, 7th edition)に従って決定した。なお本研究は、星総合病院及び福島県立医科大学の審査委員会の承認を受けた。
　ホルマリンブロックを4μm厚に切り出してガラスプレート上にマウントした。ティシュー・テックプリズマ6120(サクラファインテックジャパン株式会社)を用いて常法に従って脱パラフィン、再水和処理し、10mM重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中で105℃、10分間オートクレーブ処理することで抗原を賦活化した。ヤギ血清を、1%牛血清アルブミン(BSA)を含有する10mM リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で200倍に希釈した液で、30分間室温で切片をブロック処理した。切片をPBS洗浄後、BSAと0.05%Tween(登録商標) 20を含有するPBS中で1,000倍に希釈したマウスモノクローナル抗CK2α坑体(ab70774, Abcam, UK)(抗原はCK2αの全長タンパク)と4℃で一晩反応させた。16時間後にビオチン結合坑マウスIgG(BA-9200, Vector Laboratories, US)と室温で30分、さらにVectastainTMElite ABC HRP kit(PK-6102, Vector Laboratories, US)を用いてアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と30分インキュベートし、その後酸性条件下でジアミノベンジジン(DOJINDO, Japan)により坑CK2α抗体を可視化した。連続する切片をヘマトキシリンで対比染色した。
　CK2α抗体による免疫組織化学スライドは、患者情報を知らない2人の独立した病理専門医によって以下の基準でI、II、III、IV、Vの5段階で評価した。
I：細胞全体の染色があるが、核染色が明瞭でない
II：核染色(＋)、細胞質より核染色が明瞭である
III：核染色(＋＋)、核染色がIIより高いレベルである
IV：核染色(＋、＋＋)、さらに核小体染色(＋)
V：核染色(－)、核小体染色(＋)
(結果：免疫組織化学染色)
　組織化学的知見として、癌浸潤部では正常部と比較して核内染色レベルが優位なCK2α染色像が顕著に見られ、さらに核内構造体である核小体部分が濃染色する例も見出された。なおCK2αは全ての真核細胞に発現が認められる分子であるため細胞体部分の染色は常に観察される。
　CK2αタンパク質の免疫組織化学染色評価についての代表的な画像を図1に示す。図1Aは一枚の切片上に癌浸潤部と正常部が隣り合う画像(×100)であり、CK2αタンパク質発現は正常部では細胞体全体に観察され、一方、癌浸潤部では細胞核が他の細胞体部分より濃く観察された。図1Bは、癌浸潤部の×400の画像である。癌浸潤部では、細胞核内構造体である「核小体(Nucleolus)」部分が著しく陽性となる染色像が観察された(一例を、図1Bにおいて矢印で示す)。
　なお、別の抗体(非市販品、ウサギポリクローナル、抗原はCK2αのC末端の16アミノ酸からなるペプチド)でも同様の染色像が観察された。このことは、CK2αを認識する抗体であれば、広く評価に使用できることを示している。
　図2には染色評価I～Vの標本の例示的画像を示す。117個の乳癌切片のうち、核小体染色陽性のIVは25個(21.4%)、Vは18例(15.4%)であり、全体の36.8%が核小体染色陽性であった。核小体染色陽性であった43個の切片のうち、16個はステージI、19個はステージII、7個はステージIII、1個はステージIVの乳癌患者に由来した。また、核小体染色陰性の染色評価Iは7個(6.0%)、IIは15個(12.8%)、IIIは52個(44.4%)であった。核内染色レベルの低かった染色評価I及びIIの22個の切片のうち、13個はステージI、8個はステージII、1個はステージIIIの患者に由来した。
　これらの結果から、正常細胞ではCK2αタンパク質は細胞全体に存在するが、乳癌細胞では核で高発現している例が多く観察されること、乳癌患者の一部(約4割弱)においてはCK2αタンパク質が核の中でも核小体に局在すること、及びCK2αタンパク質の核内発現レベル及び核小体染色レベルが高いほど乳癌のステージが高い症例の割合が多いことが示された。
実施例2：乳癌患者の切除手術後の予後評価
　実施例1に記載された乳癌患者のうち、ステージIVを除いたステージI～IIIの113人の原発性乳癌患者の予後を評価した。腫瘍のステージの決定は実施例1記載のとおりである。患者の臨床情報は、医療記録を再調査することによって遡及的に得た。患者背景を表1に示す。
　予後のイベントは、再発、乳癌による死亡及び全死亡とし、CK2α染色評価との関連を検討した。
　さらに、CK2α核小体染色陽性(IV+V)及び陰性(I+II+III)の生存曲線をカプランマイヤー法により解析した。無再発生存(relapse-free survival)、疾患特異的生存(disease-specific survival)及び全生存(overall survival)を解析した。無再発生存、疾患特異的生存及び全生存は、それぞれ、手術から再発までの期間、手術日から乳癌による死亡までの期間、手術から任意の原因による死亡までの期間と定義される。CK2α核小体染色陽性(IV+V)及び陰性(I+II+III)の２つの生存曲線の有意差をログランク検定により検定し、ハザード比及びその95％信頼区間を算出した。すべての統計解析はGraphpad Prism 7.0を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(結果)
(全症例)
　再発、乳癌による死亡及び全死亡がどのCK2α染色評価に帰属したかを表2に示す。再発12例のうち、9例がCK2α核小体染色陽性のIV又はV、3例が核強染色のIIIであった。乳癌による死亡5例のうち、4例が核小体染色陽性のIV又はV、1例が核強染色のIIIであった。
　無再発生存率の結果を図3に示す。CK2α核小体染色陽性の乳癌患者は、核小体染色陰性患者と比較して有意に低い無再発生存率を示した。このことはCK2α核小体染色陽性症例の再発リスクが陰性症例と比較して有意に高いことを示している。
　次に疾患特異的生存率の結果を図4に示す。CK2α核小体染色陽性症例の10年生存率は89.8％で、陰性症例の98.5％と比較して有意に低かった。また、全生存率でも疾患特異的生存率と同様の傾向が認められた(結果示さず)。
　以上から、CK2αタンパク質の核小体局在は、再発及び生命予後の両方において、相対危険度が高いことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、ステージI～IIIの乳癌患者において、CK2α染色をI+II、III、IV+Vの3段階に分けて無再発生存率の結果を図5に示す。この結果は、CK2α核小体染色陽性症例の再発リスクが、核染色のレベルが高い症例と比較しても高いことを示している。
(サブグループ)
　サブグループにおける無再生生存率の結果を図6から図10に示す。ホルモン受容体陽性/HER2陰性(図6)、トリプルネガティブ(図7)、ステージI又はII(図8)、ステージIII(図9)、リンパ節転移あり(図10)のいずれのサブグループでも、CK2α核小体染色陽性の乳癌患者は、核小体染色陰性患者と比較して有意に低い無再発生存率を示した。
　このことは、相対的に予後が良いとされるステージI又はIIやホルモン受容体陽性/HER2陰性症例、及び相対的に予後が悪いとされるトリプルネガティブ、ステージIII、リンパ節転移ありのいずれにおいても、CK2αタンパク質の核小体局在の有無は予測力のある再発予測因子であることを示している。また、トリプルネガティブ、ステージIII、リンパ節転移ありの患者で、核小体陽性と核小体陰性の無再発生存率の差が顕著であったことから、これらの因子と組み合わせることでより正確に予後を予測できることが示唆された。
実施例3：他の再発予測因子との比較
(方法)
　他の再発予測因子について、実施例2で用いたステージI～IIIの113人の原発性乳癌患者の情報を用いて、実施例2に記載したカプランマイヤー法により解析した。
(結果)
　他の再発予測因子との比較を表3に示す。表3に示す通り、CK2α核小体染色陽性(IV＋V)は、腫瘍径、ステージ3、組織学的グレード、及びトリプルネガティブより大きいハザード比を有していた。これは、CK2αタンパク質の核小体局在の有無が強力な再発予測因子であることを示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例4：様々な癌組織におけるCK2αタンパク質の免疫組織化学染色
(目的)
　乳癌以外の様々な癌組織について、CK2αタンパク質の免疫組織化学染色を行い、CK2αタンパク質の局在を検討する。
(方法と結果)
（１）神経膠腫、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、膵癌、食道癌、胆道癌、及び子宮癌におけるCK2αタンパク質の免疫組織化学染色
　Multiple organ cancer tissue array（US Biomax, Inc.、製品番号BC000111b）を用いて、様々な癌組織（神経膠腫、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、膵癌、食道癌、胆道癌、及び子宮癌）由来のホルマリン固定パラフィン包埋標本について免疫組織化学染色を行った。CK2αタンパク質の免疫組織化学染色は、実施例１と同様に抗CK2α坑体(ab70774, Abcam, UK)を用いて行った。
　免疫組織化学染色の結果を図11～図12に示す。神経膠腫（図11A）、膀胱癌（図11B）、腎癌（図11C）、甲状腺癌（図11D）、膵癌（図12A）、食道癌（図12B）、胆道癌（図12C）、及び子宮癌（図12D）のいずれにおいても核小体が陽性となる染色像が観察された。図11～図12において核小体の染色例を矢印で示す。また、核小体に加えて核膜が陽性となる場合もあった。
（２）肝癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌、直腸癌、及び結腸癌におけるCK2αタンパク質の免疫組織化学染色
　星総合病院で根治的切除術を受けた原発性癌（肝癌、胃癌、肺腺癌、直腸癌、及び結腸癌）患者、及び福島県立医科大学呼吸器外科学講座で根治的切除術を受けた原発性癌（肺扁平上皮癌）から切除された癌組織ホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いた。健常人の肝臓標本については、FDA standard tissue array(BioChain Institute Inc., 製品番号T8234701-1)を用いた。CK2αタンパク質の免疫組織化学染色は、実施例１と同様に抗CK2α坑体(ab70774, Abcam, UK)を用いて行った。
　免疫組織化学染色の結果を図13～図16に示す。肝癌（図13B）、肺腺癌（図14B）、肺扁平上皮癌（図14C）、胃癌（図15B）、直腸癌（図16B）、及び結腸癌（図16D）のいずれにおいても核小体が陽性となる染色像が観察された。図13～図16において核小体の染色例を矢印で示す。また、核小体に加えて核膜が陽性となる場合もあった。
　上記（１）及び（２）の結果から、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、胆道癌、膵癌、肝癌、腎癌、大腸癌（直腸癌及び結腸癌）、膀胱癌、肺癌（肺腺癌及び肺扁平上皮癌）、甲状腺癌、及び神経膠腫を含む癌全般でCK2αタンパク質が核小体に局在し得ることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　核小体中のCK2αタンパク質又はその断片の、癌患者の予後予測のためのマーカーとしての使用。
  2. 　CK2αタンパク質が、以下の(a)～(c)のいずれかのアミノ酸配列：
    　(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列、
    　(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
    　(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１に記載の使用。
  3. 　予後が再発リスクを含む、請求項１又は２に記載の使用。
  4. 　前記癌が、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、胆道癌、膵癌、肝癌、腎癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、甲状腺癌、及び神経膠腫からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
  5. 　前記癌が乳癌であり、前記マーカーを、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する、請求項４に記載の使用。
  6. 　癌患者の予後を予測する方法であって、
    　癌患者から得られた癌細胞又は組織において、核小体中のCK2αタンパク質又はその断片を検出する工程、及び
    　CK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出された場合に予後が悪いと予測する、及び／又はCK2αタンパク質又はその断片が他の細胞画分と比して高度に核小体に検出されない場合に予後が良いと予測する工程を含む、方法。
  7. 　CK2αタンパク質が、以下の(a)～(c)のいずれかのアミノ酸配列：
    　(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列、
    　(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
    　(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　予後が再発リスクを含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記癌が、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、胆道癌、膵癌、肝癌、腎癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、甲状腺癌、及び神経膠腫からなる群から選択される、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記癌が乳癌であり、CK2αタンパク質又はその断片の検出の有無を、ステージによる分類、ホルモン受容体の発現状況による分類、並びにHER2遺伝子及び／又はタンパク質の発現状況による分類の少なくとも一つと組み合わせて乳癌患者の予後を予測する、請求項９に記載の方法。
  11. 　CK2αタンパク質又はその断片の量を測定するための試薬を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
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