CN117233397A - 一种鼻咽癌生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检验医学技术领域，具体涉及一种鼻咽癌生物标志物及其应用。本发明发现鼻咽癌患者血清中BLRF2‑IgA、BLRF2‑IgG、BDLF1‑IgA、BDLF1‑IgG、BLLF3‑IgA的整体抗体水平显著高于鼻咽部良性疾病对照和健康对照。进一步分析发现这五个抗体的组合可替换VCA‑IgA抗体与EBNA1‑IgA的组合，可有效用于鼻咽癌的诊断，并能克服EBV‑VCA天然蛋白生产过程中需要严格的生物安全条件以及批次间试剂稳定性差等方面的问题。此外，发明人还发现BLLF3‑IgA和BDLF1‑IgA抗体水平低的鼻咽癌患者的无病生存概率越大，说明这两个标志物在鼻咽癌预后评估方面的潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及检验医学技术领域，具体涉及一种鼻咽癌生物标志物，特别是BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA，及其应用。
背景技术
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种发生于鼻咽黏膜被覆上皮和陷窝柱状上皮的恶性肿瘤。在高发病地区鼻咽癌多属于低分化鳞癌，该病对放射治疗具有较高的敏感性，因此临床上常以其为主要的治疗方法。研究证明鼻咽癌早期患者的放疗五年生存率显著高于鼻咽癌晚期患者。但由于鼻咽癌发病部位较为隐蔽，早期症状并不明显，大多数患者被确诊时已处于中晚期。
EB病毒(EBV)，又称人类疱疹病毒4型(HHV4)，是第1个被证实与人类肿瘤发生有关的病毒。已有研究显示，EBV感染与Burkitt淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和鼻咽癌等恶性肿瘤相关。其中鼻咽癌的发生与EBV感染最为密切。研究发现，几乎所有的未分化型的NPC肿瘤细胞中，均可检测到EBV。鉴于EBV感染与鼻咽癌形成和发展密切相关，临床上常通过检测EBV壳抗原(VCA)-IgA、Rta-IgA、早期抗原(EA)-IgA、和EBV核抗原-1(EBNA1)-IgA等EBV相关抗体标志物来对鼻咽癌进行诊断和筛查。这些手段检测手段具有无创伤性、患者依从性高等优点，有利于高发病地区鼻咽癌的早期诊断、预后和疗效评价。但这些标志物仍然无法完全满足目前临床检测的需求。例如，EBV衣壳抗原VCA是由BFRF3(p18)、BLRF2(p23)、BDRF1(p40)、BNRF1(p143)、BCLF1(p150)、BALF4(gp125)等多种蛋白组成的多聚蛋白，体外不易完整表达。目前用于EBV VCA-IgA抗体检测试剂盒所用的VCA包被抗原有两种形式：(1)纯化自EB病毒感染细胞裂解物的VCA天然蛋白，(2)多个VAC组分的重组蛋白的联合使用。研究发现，使用VCA天然蛋白作为包被抗原的VCA-IgA抗体检测试剂盒的敏感性显著高于以重组蛋白作为包被抗原的VCA-IgA抗体检测试剂盒。但在VCA天然蛋白生产过程中需要严格的生物安全条件，并且各厂家间试剂检测结果的一致性及批次间试剂的稳定性等方面仍有待解决。因此，筛选和鉴定特异性和敏感度更好，并且易于制备和标准化的病毒相关血清抗体标志物仍是亟待解决的问题。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种鼻咽癌生物标志物，特别是BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA，及其应用。
在本发明第一方面，提供BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的组合作为标志物在制备鼻咽癌的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、药物筛选的产品中的应用。
具体地，上述免疫球蛋白作为唯一的标志物或与其他标志物联合作为伴随诊断标志物；在本发明的一些实施例中，所述其他标志物为EBNA1-IgA。
在本发明的一些实施例中，所述标志物为BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG和BLLF3-IgA的组合。
在本发明的一些实施例中，所述标志物为BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA和EBNA1-IgA的组合。
在本发明的一些实施例中，所述应用为上述免疫球蛋白作为标志物在制备鼻咽癌的诊断产品中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述应用为BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA和EBNA1-IgA的组合在制备鼻咽癌的诊断产品中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述应用为上述免疫球蛋白作为标志物在制备鼻咽癌的病情严重程度评估产品中的应用。
具体地，在上述应用中，所述鼻咽癌的病情严重程度评估为判断其为早期(Ⅰ期和Ⅱ期)或晚期(Ⅲ期和IV期)。
在本发明的一些实施例中，所述应用为BLRF2-IgA和/或BDLF1-IgG(特别是BLRF2-IgA)作为标志物在制备鼻咽癌的病情严重程度评估产品中的应用。检测样本中BLRF2-IgA和/或BDLF1-IgG(特别是BLRF2-IgA)水平较高时，受试者的鼻咽癌为晚期的概率较高。
具体地，上述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、芯片等，其可以包含能够结合抗体蛋白的物质(例如抗体或其片段)；也可以为仪器平台，如蛋白质组学分析产品；蛋白质组学分析产品可以包含测量模块(用于测量待测样本中抗体蛋白的含量)，还可以包含分析模块(用于分析待测样本与参比样本中抗体蛋白的含量差异)。
具体地，上述产品的检测样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
在本发明第二方面，提供检测BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的组合的试剂在制备鼻咽癌的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、药物筛选的产品中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述应用为检测上述免疫球蛋白的试剂在制备鼻咽癌的诊断产品中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述应用为检测BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA和EBNA1-IgA的组合的试剂在制备鼻咽癌的诊断产品中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述应用为检测上述免疫球蛋白的试剂在制备鼻咽癌的病情严重程度评估产品中的应用。
具体地，在上述应用中，所述鼻咽癌的病情严重程度评估为判断其为早期(Ⅰ期和Ⅱ期)或晚期(Ⅲ期和IV期)。
在本发明的一些实施例中，所述应用为检测BLRF2-IgA和/或BDLF1-IgG(特别是BLRF2-IgA)的试剂在制备鼻咽癌的病情严重程度评估产品中的应用。检测样本中BLRF2-IgA和/或BDLF1-IgG(特别是BLRF2-IgA)水平较高时，受试者的鼻咽癌为晚期的概率较高。
具体地，所述检测可以为定性检测或定量检测，特别是定量检测。
具体地，所述检测试剂可以包括能够结合上述免疫球蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
具体地，检测上述免疫球蛋白的试剂可基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA法、免疫印迹法、间接免疫荧光法、酶免疫斑点法、免疫发光法、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹、蛋白质组学(例如抗体芯片、质谱(例如数据非依赖采集(Data Independent Acquision，DIA)质谱)等。
具体地，用于免疫球蛋白检测的样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
具体地，上述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、芯片、蛋白质组学分析产品(例如抗体芯片、DIA-MS)等。
在本发明第三方面，提供BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)作为标志物在制备鼻咽癌预后产品中的应用。
具体地，所述预后包括对鼻咽癌患者的无病生存(DFS)概率的预测，例如对DFS概率超过0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.99的预判。
具体地，BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9、0.95甚至0.99的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BLLF3-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9、0.95甚至0.99的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BLLF3-IgA水平高时，鼻咽癌患者的DFS概率低于0.85、0.8的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BDLF1-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BDLF1-IgA水平高时，鼻咽癌患者的DFS概率低于0.8的概率较高。
具体地，上述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、芯片等，其可以包含能够结合抗体蛋白的物质(例如抗体或其片段)；也可以为仪器平台，如蛋白质组学分析产品；蛋白质组学分析产品可以包含测量模块(用于测量待测样本中抗体蛋白的含量)，还可以包含分析模块(用于分析待测样本与参比样本中抗体蛋白的含量差异)。
具体地，上述产品的检测样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
在本发明第四方面，提供检测BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)的试剂在制备鼻咽癌预后产品中的应用。
具体地，所述预后包括对鼻咽癌患者的无病生存(DFS)概率的预测，例如对DFS概率超过0.8、0.85、0.9、0.95、0.99的预判。
具体地，BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9、0.95甚至0.99的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BLLF3-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9、0.95甚至0.99的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BLLF3-IgA水平高时，鼻咽癌患者的DFS概率低于0.85、0.8的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BDLF1-IgA水平低时，鼻咽癌患者的DFS概率超过0.9的概率较高。
在本发明的一些实施例中，BDLF1-IgA水平高时，鼻咽癌患者的DFS概率低于0.8的概率较高。
具体地，所述检测可以为定性检测或定量检测，特别是定量检测。
具体地，所述检测试剂可以包括能够结合BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的物质(例如抗体或其片段)。
具体地，检测BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的试剂可基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹、蛋白质组学(例如抗体芯片、质谱(例如数据非依赖采集(Data Independent Acquision，DIA)质谱)等。
具体地，用于BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA检测的样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
具体地，上述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、芯片、蛋白质组学分析产品(例如抗体芯片、DIA-MS)等。
在本发明第五方面，提供影响BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)的水平或活性的试剂在制备鼻咽癌的预防、治疗、疗效评估产品中的应用。
具体地，所述影响为降低受试者体内BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或蛋白活性，特别是血清中的水平或蛋白活性，其有利于提高鼻咽癌患者的无病生存期(DFS)概率。
具体地，所述影响BLLF3-IgA、BDLF1-IgA的试剂为BLLF3-IgA、BDLF1-IgA抑制剂，其可降低受试者体内(特别是血清中)BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或蛋白活性。
在本发明的一些实施例中，上述产品为药物制剂，其用于预防或治疗鼻咽癌。
具体地，上述药物制剂还可包括一种或多种药学上可接受的辅料，例如，填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、香味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂等。
具体地，上述药物制剂可以为任何合适的剂型，例如，口服剂型(例如，片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、皮肤外用剂型(例如，软膏剂、霜剂、洗剂、涂膜制剂等)，特别是口服剂型、注射剂。
具体地，上述各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种药学上可接受的辅料混合，然后将其制成所需的剂型。
在本发明第六方面，提供BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)抑制剂在制备预防和/或治疗鼻咽癌的药物中的应用。
具体地，所述抑制剂可以为小分子化合物或其药学上可接受的盐、大分子如抗体等。
具体地，所述药物可以采用任何合适的剂型，例如，口服剂型(例如，片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、皮肤外用剂型(例如，软膏剂、霜剂、洗剂、涂膜制剂等)，特别是口服剂型、注射剂。
在本发明第七方面，提供一种鼻咽癌的诊断、病情严重程度评估、疗效评估、药物筛选的产品，其包含检测BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的试剂。
具体地，所述产品还包含检测其他标志物如EBNA1-IgA的试剂。
具体地，所述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片、蛋白质组学分析产品(例如抗体芯片、DIA-MS)等。
在本发明第八方面，提供一种鼻咽癌的预后产品，其包含检测BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)的试剂。
具体地，所述产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片、蛋白质组学分析产品(例如抗体芯片、DIA-MS)等。
在本发明第九方面，提供一种预防和/或治疗鼻咽癌的药物，其包含影响BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)水平或活性的试剂。
具体地，所述影响为降低受试者体内BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或蛋白活性，特别是血清中的水平或蛋白活性，其有利于提高鼻咽癌患者的无病生存期(DFS)率。
具体地，所述影响BLLF3-IgA、BDLF1-IgA的试剂为BLLF3-IgA、BDLF1-IgA抑制剂，其可降低受试者体内(特别是血清中)BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或蛋白活性。
在本发明第十方面，提供一种鼻咽癌的诊断方法，其包含检测BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的步骤。
具体地，所述方法可包括如下步骤：
(1)获取受试者样本；
(2)检测受试者样本中上述免疫球蛋白的水平；
(3)将检测结果与受试者的患病与否或患病风险关联起来。
特别是，与正常对照相比，所述免疫球蛋白的水平升高，则该受试者可被诊断为鼻咽癌或患鼻咽癌的风险高。需要说明的是，具体疾病风险、严重程度，还需临床医生结合该受试者的其他检测指标综合评估。
具体地，所述受试者为人类。
具体地，所述样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
在本发明第十一方面，提供一种鼻咽癌的预后判断方法，其包含检测BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA(特别是BDLF1-IgA)的步骤。
具体地，所述方法可包括如下步骤：
(1)获取受试者样本；
(2)检测受试者样本中上述免疫球蛋白的水平；
(3)将检测结果与受试者的预后情况关联起来。
特别是，与正常对照相比，所述免疫球蛋白的水平升高，则该受试者被确定为预后不良(DFS概率较低)。需要说明的是，具体疾病的预后情况，还需临床医生结合该受试者的其他检测指标综合评估。
具体地，所述受试者为人类。
具体地，所述样本可以使用例如自活检受试者获得的血液(特别是外周血)或其级分(例如血清、血浆)，特别是血清。
本发明的发明人通过ELISA检测发现鼻咽癌患者血清中BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA 5个标志物抗体(5antibodies)以及EBNA1-IgA的整体抗体水平显著高于鼻咽部良性疾病对照和健康对照(P<0.05)，并且多数抗体在早期鼻咽癌患者血清中同样高水平存在。进一步逻辑回归分析发现5antibodies组合可替换VCA-IgA抗体，与EBNA1-IgA抗体联合使用可有效用于鼻咽癌的诊断，并能克服EBV-VCA天然蛋白生产过程中需要严格的生物安全条件以及批次间试剂稳定性差等方面的问题。此外，发明人还发现BLLF3-IgA和BDLF1-IgA抗体水平高的鼻咽癌患者的无病生存期越长，说明这两个标志物抗体在鼻咽癌预后评估方面的潜在价值。
附图说明
图1所示为ELISA法检测队列1(cohort 1)中BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA、EBNA1-IgA抗体的含量对比。
图2所示为标志物抗体区分鼻咽癌患者组与鼻咽部良性疾病对照组和健康对照组的敏感性和特异性。
图3所示为标志物抗体与无病生存期的生存分析。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
根据TNM分期，鼻咽癌通常分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，分别代表从早期到晚期的鼻咽癌分期。Ⅰ期：肿瘤局限于鼻咽或侵犯口咽或鼻腔，无咽旁间隙累及，无区域淋巴结转移，未见癌远处转移。Ⅱ期：肿瘤侵犯了鼻咽旁间隙和邻近的软组织，可见单侧颈部淋巴结转移，未见远处转移。Ⅲ期：即肿瘤侵犯颅底骨质、颈椎翼状结构和鼻窦旁，双侧淋巴结转移，最大径≤6cm，环状软骨以上水平，未见远处转移。肿瘤侵犯到颅内颅神经、下咽部、颞下窝、眼眶，属于Ⅳ期病变。Ⅳa期：肿瘤侵犯颅内累及颅神经，下咽部、眼眶腮腺广泛的软组织浸润并超过翼外侧肌，单侧和双侧淋巴结转移最大径＞6cm，但未见远处转移。Ⅳb期：肿瘤有远处转移，通常通过鼻咽加颈部增强磁共振，胸部增强CT、上腹部CT、全身骨扫描或PET-CT来确定分期。在本发明中，Ⅰ、Ⅱ期为早期，Ⅲ、Ⅳ期为晚期。
“免疫球蛋白”是指具有抗体活性的动物蛋白。主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。
在本发明中，“诊断鼻咽癌”既包括判断受试者是否已经患有鼻咽癌，也包括判断受试者是否存在患鼻咽癌的风险。
在本发明中，“预后”是对于疾病发展过程和后果的预测。按照疾病发生或发展过程中是否接受治疗，预后可分为自然预后和治疗预后；自然预后是在未经治疗的情况下，对疾病发展过程及其后果的预测；治疗预后就是通过医学干预，对疾病发展过程及其最终后果的预测；本发明中所述预后通常是指治疗预后。例如，本发明所述预后包括对鼻咽癌患者的无病生存(DFS)概率的预测，例如对(例如接受治疗10年、8年、7年、6年、5年、4年、3年、2年、1年内)DFS概率超过0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.99的预判。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、样本收集
样本收集于广州医科大学附属第二医院、广州医科大学肿瘤中心和中山大学肿瘤防治中心，所有患者均获得知情同意书。血清样本共1665例，样本类型包括：鼻咽癌患者血清(早期样本(Ⅰ期和Ⅱ期)和晚期样本(Ⅲ期和IV期))、鼻咽部良性疾病患者血清和健康对照血清。
根据鼻咽癌样本的来源不同，分为三个临床队列。
Cohort 1样本，共594例，全部来自广州医科大学附属第二医院，包括鼻咽癌患者血清240例(早期样本54例，晚期样本156例)，鼻咽部良性疾病患者血清254例，健康人血清100例。
Cohort 2样本，共774例，包括鼻咽癌患者血清501例(来自中山大学肿瘤防治中心，早期样本61例，晚期样本433例)，鼻咽部良性疾病患者血清(来自中山大学肿瘤防治中心和广州医科大学附属第二医院)111例，健康人血清(来自中山大学肿瘤防治中心)162例。
Cohort 3样本，共297例，包括鼻咽癌患者血清108例(来自广州医科大学附属肿瘤医院，早期样本16例，晚期样本88例)，鼻咽部良性疾病患者血清100例(来自广州医科大学附属第二医院)，健康人血清89例(来自广州医科大学附属第二医院)。
具体信息见下表：
表1Cohort 1样本来源信息
表2Cohort 2样本来源信息
表3Cohort 3样本来源信息
2、检测方法
进行酶联免疫吸附试验(ELISA)以评估血清各标志物抗体的浓度，具体步骤如下：
(1)病毒蛋白包被：使用ELISA包被液(本实验室自主配制，主要成分为pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液)稀释表达纯化后的后候选标志物蛋白，加入到ELISA板微孔中，贴好封板膜封后，4℃孵育过夜。
(2)弃去包被液，用PBST洗板，拍干，加入5％milk，贴好封板膜封后，37℃条件下孵育1h。
(3)弃去ELISA板中的液体，用PBST洗板，拍干。加入用5％milk稀释后的血清样本，37℃条件下孵育1h。
(4)弃去ELISA板中的液体，用PBST洗板，拍干。加入用5％milk稀释后的HRP标记的抗人IgG和IgA抗体(Jackson ImmunoResearch)，37℃条件下孵育1h。
(5)用PBST洗板，拍干。将TMB底物显色试剂盒(康为世纪CW0050S)中的TMB-A和1×TMB-B以1：19的比例混合，加入ELISA板中，室温避光孵育后，添加ELISA终止液(北京索莱宝C1058)，终止反应。将ELISA板放入酶标仪内，450nm波长下检测。
按照抗EB病毒衣壳抗原抗体IgA检测试剂盒(酶联免疫吸附法，购自欧蒙医学诊断(中国)有限公司)的使用方法，检测血清样本中的VCA-IgA抗体。
3、统计分析
ELISA结果的差异比较采用graphpad prism软件中的t检验，以p<0.05表示达到统计学差异。以Cohort 2的ELISA结果为训练集，Cohort 1和Cohort3的ELISA结果为测试集，对标志物抗体进行Logistic回归分析建模。根据鼻咽癌病人的无病生存期(Disease freesurvival，DFS)信息，采用Kaplan-Meier方法分析标志物抗体对对鼻咽癌的预后判断价值，生存差异采用Log-rank检验。
4、实验结果
使用ELISA方法分析Cohort 1中鼻咽癌患者与鼻咽部良性疾病患者和健康个体的血清样品的各标志物抗体的表达水平，用450nm处吸光值表示。结果参如图1所示，无论是在早期鼻咽癌患者(Early-NPC)血清中还是在晚期鼻咽癌患者(Advanced-NPC)血清中BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA、EBNA1-IgA等标志物抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)。
基于每个标志物抗体在三个验证队列中的ELISA检测结果，我们绘制了受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)，进一步分析了每个标志物抗体区分鼻咽癌患者组与健康对照组(NPC vs Health control)以及区分鼻咽癌患者组与鼻咽部良性疾病对照组(NPC vs Benign control)的能力。结果参见图2，在95％特异性条件下，5antibodies(BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG和BLLF3-IgA)+EBNA1-IgA的抗体组合区分鼻咽癌患者组与健康对照组以及良性疾病对照组的敏感性与已知标志物组合VCA-IgA+EBNA1-IgA相近，说明5antibodies可替换VCA-IgA抗体，与EBNA1-IgA抗体联合可有效用于鼻咽癌的诊断，并能克服EBV-VCA天然蛋白生产过程中需要严格的生物安全条件以及批次间试剂的稳定性差等方面的问题。
为了评价本研究筛选获得的标志物抗体对鼻咽癌的预后判断价值，我们随访了Cohort 1中136名鼻咽癌患者的疾病进展和预后信息。我们将各标志物抗体的ELISA检测结果分为高(前25％)和低(后25％)两组，对这两组进行生存分析，比较两组的无病生存期(Disease free survival，DFS)。结果如图3所示，BLLF3-IgA和BDLF1-IgA抗体水平低的鼻咽癌患者DFS的概率越大(P值分别为0.035和0.0056)，体现了这两个标志物抗体在鼻咽癌预后判断方面的潜在价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
Claims (10)
1.BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的组合作为标志物在制备鼻咽癌的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、药物筛选的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA中的一种或多种的组合作为唯一的标志物或与其他标志物联合作为伴随诊断标志物；
优选地，所述其他标志物为EBNA1-IgA。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为鼻咽癌诊断产品；
优选地，所述应用为BLRF2-IgA、BLRF2-IgG、BDLF1-IgA、BDLF1-IgG、BLLF3-IgA和EBNA1-IgA的组合在制备鼻咽癌的诊断产品中的应用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为鼻咽癌病情严重程度评估产品；
所述应用为BLRF2-IgA和/或BDLF1-IgG作为标志物在制备鼻咽癌的病情严重程度评估产品中的应用。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂、试剂盒、试纸、芯片或蛋白质组学分析产品；
优选地，所述产品的检测样本为自活检受试者获得的血液或其级分，优选为血清。
6.BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA作为标志物在制备鼻咽癌预后产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预后包括对鼻咽癌患者的无病生存期概率的预测。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂、试剂盒、试纸、芯片或蛋白质组学分析产品；
优选地，所述产品的检测样本为自活检受试者获得的血液或其级分，优选为血清。
9.影响BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或活性的试剂在制备鼻咽癌的预防、治疗、疗效评估产品中的应用；
优选地，所述影响为降低体内BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA的水平或蛋白活性；
优选地，所述产品为药物制剂，其用于预防或治疗鼻咽癌；
更优选地，所述药物制剂为口服剂型或注射剂。
10.BLLF3-IgA和/或BDLF1-IgA抑制剂在制备预防和/或治疗鼻咽癌的药物中的应用；
优选地，所述药物为口服剂型或注射剂。
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