JP7398226B2 - 大腸がん罹患のリスクを評価するための方法 - Google Patents
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Description
[1]
被験者由来の試料中のリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素を定量する工程を含む、被験者の大腸がん罹患のリスクを評価するための方法。
[2]
被験者由来の試料中のリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素を定量する工程を含む、被験者が大腸がんに罹患している、又は、被験者が大腸がんに罹患している可能性があると判定するためのデータを収集する方法。
[3]
被験者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量と、非大腸がん対照者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量とを比較する工程をさらに備え、被験者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量が、非大腸がん対照者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量よりも低いことは、被験者が大腸がんに罹患している、又は被験者が大腸がんに罹患している可能性が高いことを示す、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
被験者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量と、予め設定された参照値とを比較する工程をさらに備え、被験者由来の試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量が、前記参照値よりも低いことは、被験者が大腸がんに罹患している、又は被験者が大腸がんに罹患している可能性が高いことを示す、[1]又は[2]に記載の方法。
[5]
試料に含まれる基準物質の濃度が規定の濃度になるように、又は、試料に含まれる基準物質の量が規定の量になるように、試料を調製する工程をさらに含む、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
基準物質が総タンパク質である、[5]に記載の方法。
[7]
試料が、尿試料である、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
リポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素の、大腸がん検査マーカーとしての使用。
[9]
抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体を備える、大腸がんの検査用キット。
上述のように、被験者由来の試料中におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量は、非大腸がん対照者由来の試料中におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量よりも低いため、リポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素は、大腸がんを検査するためのマーカーとして使用することができる。すなわち、本発明は、リポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素の、大腸がん検査マーカーとしての使用を提供する。
本発明は、大腸がんの検査に用いることが可能なキットを提供し、該キットは、抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体を備える。該抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体は、上述したものを同様に挙げることができる。該抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体は、酵素、蛍光色素、又は放射性物質等で標識されていてもよい。また、該抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体は、マイクロプレート等の担体に固定されていてもよい。
がん検診受診者より検診受診当日に随時尿を採取し、直ちに3000×g、4℃で10分間、遠心分離を行い、その上清を小分けして、-80℃の冷凍庫で保存した。検診受診後2年以内に大腸がんが確定した受診者3名(大腸がん陽性群:CC-01、CC-02、CC-03)と、がんに罹患していなかった受診者3名(コントロール群:N-17、N-18、N-19)の尿試料について、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質としてプロテインアッセイ(BIO-RAD)にて尿試料に含まれる総タンパク質を定量した。定量結果とそれぞれの受診者の年齢、性別(男性:M、女性:F)、がんの種類及びがんの進行度(ステージ)を表1に示した。がんの進行度(ステージ)は、国際対がん連合(UICC:Union Internationale Contre le Cancer)が採用している悪性腫瘍の病期分類(TNM分類)における進行度(ステージ)分類である。数字が大きいほどがんが進行し、0およびIは初期段階のがんであることを意味している。
-80℃の冷凍庫で保存されている尿試料を解凍後、直ちに1.5mlエッペンチューブを用いてオンアイスにて、尿試料150μlに対して氷冷したアセトンを9倍量(1350μl)添加して激しく混和後、-80℃に保存した。解凍後、遠心分離操作(20600×g、20分間、4℃)にて上層のアセトンを除去し、得られた沈殿を風乾後、抽出液(7M尿素、2Mチオ尿素、32.5mM CHAPS、100mM DTT及び2.5% Pharmalyte pH3-10の混合液)50μlを添加してピペッテイング操作にて可溶化後、別のチューブに回収した。この操作を計2回行い、計100μlの試料を調製した。
上記試料を用いて、まず広域pH勾配(pH3-10)を一次元目とする二次元ゲル電気泳動(2D-PAGE)を行った。2D-PAGEに供する総タンパク質量が同量になるように、先に測定した尿中総タンパク質量に基づいてアプライ量を調整した各試料を一次元目の等電点電気泳動(Immobiline DryStrip(pH3-10)、18cm)に供し、続いて二次元目のゲル電気泳動に供した。
次に5スポットの等電点領域に合わせた狭域pH勾配(pH4-7)を一次元目とする2D-PAGEを行った。一次元目の等電点電気泳動で狭域pH勾配のImmobiline DryStrip(pH4-7)を用いたこと以外は広域pH勾配2D-PAGEと同様に分析した。その結果、一次元目を狭域pH勾配としたことで分離されたスポットもあり、大腸がん陽性群とコントロール群と比較して差異が認められたスポットは797個となり、そのうち、大腸がん陽性群とコントロール群とでタンパク質量が異なるスポットが13スポット存在することが明らかとなった。
上記の狭域pH勾配の2D-PAGEのゲルより目的スポットを切り出し、トリプシン消化(ゲル内消化)後にLC-MS/MSによる分析を行った。解析ソフト(Scaffold)を使用してLC-MS/MS分析データを読み込み、リストアップされたタンパク質についてペプチド断片のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列を含むタンパク質についての相同性を検討した。その結果、目的スポットはプロスタグランジンD2合成酵素と相同性が高かった。
上述した大腸がん陽性群(CC-01、CC-02、CC-03)と、コントロール群(N-17、N-18、N-19)の尿試料からアセトン沈殿法によりタンパク質ペレットを得て、変性還元処理により試料を調製した。試料は、総タンパク質の定量結果に基づいて、各試料中総タンパク質濃度が100ng/μlとなるように調製した。各ウェルに8ul(総タンパク質量:800ng)をアプライしてSDS-PAGEを行い、PVDF膜に転写して抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った。プロスタグランジンD2合成酵素には造血器型とリポカリン型の2種類があるため、それぞれに対する抗体を一次抗体として用い、一次抗体に対する蛍光標識した二次抗体を用いた。その結果、大腸がん陽性群とコントロール群の試料について、抗造血器型プロスタグランジンD2合成酵素抗体に対しては3つ全ての試料で全くバンドが観察されず、抗リポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素抗体に対してはコントロール群、大腸がん陽性群の全てにおいてバンドが確認された。よって、目的スポットのタンパク質はリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素であることが確認された。
上述した大腸がん陽性群(CC-01、CC-02、CC-03)と、コントロール群(N-17、N-18、N-19)の尿試料からアセトン沈殿法によりタンパク質ペレットを得て、変性還元処理により試料を調製した。試料は、総タンパク質の定量結果に基づいて、各試料中総タンパク質濃度が50ng/μlとなるように調製した。各ウェルに8ul(総タンパク質量:400ng)をアプライしてSDS-PAGEを行い、PVDF膜に転写して抗リポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素/ヤギ抗体を一次抗体、蛍光色素(ATTO 532)で標識した抗ヤギIgG/ウサギ抗体を二次抗体とした蛍光ウェスタンブロット分析を行った。二次抗体による反応後のPVDF膜に対して蛍光イメージャー(Typhoon 8600、GEヘルスケア)を用いて蛍光像を取得し、画像解析ソフト(ImageQuant)を用いて蛍光バンドのシグナル量/面積であるVolume値を求めた。
Claims (8)
- 被験者由来の尿試料中のリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素を定量する工程を含む、
被験者の大腸がん罹患のリスクを評価するための方法。 - 被験者由来の尿試料中のリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素を定量する工程を含む、
被験者が大腸がんに罹患している、又は、被験者が大腸がんに罹患している可能性があると判定するためのデータを収集する方法。 - 被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量と、非大腸がん対照者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量とを比較する工程をさらに備え、被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量が、非大腸がん対照者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量よりも低いことは、被験者が大腸がんに罹患している、又は被験者が大腸がんに罹患している可能性が高いことを示す、請求項1又は2に記載の方法。
- 被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量と、予め設定された参照値とを比較する工程をさらに備え、被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素量が、前記参照値よりも低いことは、被験者が大腸がんに罹患している、又は被験者が大腸がんに罹患している可能性が高いことを示す、請求項1又は2に記載の方法。
- 尿試料に含まれる基準物質の濃度が規定の濃度になるように、又は、尿試料に含まれる基準物質の量が規定の量になるように、尿試料を調製する工程をさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 基準物質が総タンパク質である、請求項5に記載の方法。
- 被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD2合成酵素の、大腸がん検査マーカーとしての使用。
- 抗プロスタグランジンD2合成酵素抗体を備える、被験者由来の尿試料におけるリポカリン型プロスタグランジンD 2 合成酵素量に基づく大腸がんの検査用キット。
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