CN117778309A - 动物干细胞外泌体的分离纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联合尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法分离外泌体亚群的新方法，首先从培养基或生物体液样品中分离纯化获得总外泌体悬液，然后分别依次采用尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法分离获得不同外泌体亚群，具体操作是将总外泌体悬液与抗外泌体标志物抗体‑磁珠混合，孵育后转移至色谱柱，并将色谱柱放置在具有强磁场的磁力架上，通过磁场强弱改变抗外泌体标志物抗体‑磁珠‑外泌体复合物在尺寸排阻色谱柱中运动速率，洗脱得到含有复合物的混合液，然后再将其置于免疫磁珠法的磁力架上，清洗得到剩余的复合物；最后，加入能将捕获的外泌体从磁珠上洗脱下来的洗脱剂，从而获得完整的、纯度高、表达量高、特异性强的外泌体亚群。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域。更具体地，涉及一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法
背景技术
外泌体是一种大小为40-160nm的细胞外囊泡，包含有多种诸如核酸、蛋白质、脂类、氨基酸、小分子代谢物等内容物，这些内容物可以反映其细胞来源。有研究通过分析肾单位不同节段的外泌体成分及其与肾脏生理和病理生理的相关性，验证了与肾脏疾病相关的来自血清、肾小管细胞、肾实质细胞、肾小球内皮细胞、间充质干细胞、泌尿系统干细胞、癌细胞和巨噬细胞的外泌体的来源与作用，说明外泌体广泛参与了多种肾脏疾病的发生与发展；
尺寸排阻法是液相色谱仪常用的检测方法，尺寸排阻色谱柱里面填充着一定分子孔径的填料，当样品流经色谱柱时，大粒径的颗粒率先流出色谱柱，小颗粒的样品后流出，因此可以达到不同粒径颗粒的分离效果，但是无法分析出与主成分物质颗粒大小相近的杂质，无法进一步分离外泌体亚群。
免疫磁珠法是利用外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡艀育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
目前，针对外泌体的提取纯化没有一个统一的标准，常用的方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫磁珠法、尺寸排阻色谱法等。超速离心法。虽然超速离心法是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工、回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐、重复性差、耗时很长、纯度不高、表达量低、回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，纯度不高、特异性差、严重影响下游应用。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有外泌体分离技术的缺陷和不足，提供一种联合免疫磁珠法和尺寸排阻色谱技术选择性分离外泌体亚群的新方法，该方法还可以用于特异性干细胞细胞分泌的外泌体。该方法能够从细胞培养基或生物体液中简单而快速的分离无杂蛋白的外泌体，且获得的不同外泌体子类中所包含的蛋白、miRNA和DNAs分子等分布情况几乎没有重叠。
本发明提供了一种联合尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法分离干细胞外泌体亚群的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：从干细胞样品中分离纯化获得总外泌体悬液；
S2：将总外泌体悬液依次采用尺寸排阻色谱柱和/或免疫磁珠分离得到外泌体亚群。
优选地，所述S2步骤为将总外泌体悬液依次采用尺寸排阻色谱柱和免疫磁珠法分离得到外泌体亚群；
优选地，所述尺寸排阻色谱柱为亲水硅胶柱、凝胶或经过修饰的凝胶的填充柱，优选为琼脂糖凝胶填充柱；
优选地，所述免疫磁珠为抗外泌体标志物抗体偶联的磁珠、结合外泌体标志物适配体偶联的磁珠、结合外泌体标志物配体偶联的磁珠；
优选地，所述干细胞为选自脂肪干细胞、人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞的一种或者多种。
在本发明的一个实施方式中，所述S2步骤为：
S2.1尺寸排阻色谱法：将步骤S1的总外泌体悬液转移到排阻色谱柱中，经洗脱液重复循环洗脱后收集得到外泌体滤液；
S2.2免疫磁珠法：将S2.1步骤外泌体滤液与包被抗外泌体标志物抗体-磁珠混合均匀后，旋转孵育得到抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；将旋转孵育后的复合物置于磁力架上，通过磁力架分离磁珠，加入清洗液，弃上清；得到清洗后的抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；在清洗后复合物中加入洗脱液，将捕获的外泌体从磁珠上洗脱下来，从而获得外泌体亚群。
优选地，S2.1步骤的洗脱液为PBS溶液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液，pH为7，缓冲液浓度为0.005～0.05mol/L；
优选地，S2.1步骤的外泌体标志物选自CD9、CD63、CD81和TSG101一种或者多种；
优选地，S2.2步骤的清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～3％，PBS缓冲液浓度为0.005～0.03mol/L；
优选地，S2.2步骤的洗脱液为pH2.8～3.8的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的浓度为0.1～0.4mol/L；
在本发明的另一个实施方式中，所述S2步骤为；
S2.1尺寸排阻色谱法：将步骤S1的总外泌体悬液与抗外泌体标志物抗体-磁珠混合，摇动条件下孵育后，转移至尺寸排阻色谱柱，并将尺寸排阻色谱柱放置在具有强磁场的磁力架上，通过磁场强弱改变抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物在尺寸排阻色谱柱中运动速率，经洗脱液重复循环洗脱后收集得到含有抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物的混合液，
S2.2免疫磁珠法：将S2.1步骤含有抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物的混合液置于磁力架上，通过磁力架分离磁珠，加入清洗液，弃上清，得到清洗后的抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；在清洗后复合物中加入洗脱液，将捕获的外泌体从磁珠上洗脱下来，从而获得外泌体亚群。
优选地，S2.1步骤的洗脱液为PBS溶液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液，pH为7，缓冲液浓度为0.005～0.05mol/L；
优选地，S2.1步骤的外泌体标志物选自CD9、CD63、CD81和TSG101一种或者多种；
优选地，S2.2步骤的清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～3％，PBS缓冲液浓度为0.005～0.03mol/L；
优选地，S2.2步骤的洗脱液为pH2.8～3.8的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的浓度为0.1～0.4mol/L；
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果
(1)本发明首次提出联合尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法选择性分离干细胞外泌体亚群的第一代方法，提取的干细胞外泌体与传统单一分离方法相比，能得到特定高聚集度、高纯度的外泌体亚群，同时制备得到的外泌体亚群具有高纯度、高蛋白、结构完整的特点。
(2)本发明首次将尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法融合处理来选择性分离干细胞外泌体亚群的第二代方法，其关键技术在于将含有磁珠-抗体-外泌体复合物的混合样本直接通过尺寸排阻色谱柱，同时将尺寸排阻色谱柱放置在具有强力磁场环境的磁力架上，同时利用磁场强弱和外泌体大小来实现分离纯化目的，具体机理如下：一方面，通过外泌体的表面吸附免疫磁珠改变其形状大小进而影响其在色谱柱内的排阻能力，实现与其他物质的分离；另一方面，将磁珠-抗体-外泌体复合物置于强力磁场环境的磁力架中通过磁场强弱的改变来调节复合物在尺寸排阻色谱柱中运动速率，从而实现与其他杂质的分离；采用本发明第二代技术所得到的外泌体亚群相比较第一代具有更高纯度、更高蛋白表达、更强特异性等多种优良效果，可满足临床诊断要求，操作简单、耗时短、成本低。
附图说明
图1通过流式细胞术分析Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3外泌体亚群的聚集度和特异性；
图2通过Western Blot检测对Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3的外泌体标志蛋白表达分析；
图3通过透射电镜(TEM)对Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3的外泌体形态分析。
具体实施方式
本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
实施例1基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法联合分离纯化间充质干细胞外泌体
本实施例提供的间充质干细胞外泌体的纯化方法包括如下步骤：
步骤1：参照专利CN107217034A中的方法获得含间充质干细胞外泌体的细胞培养液：将间充质干细胞用10％完全培养基培养至70％的密度后，更换为0.5％EV Free FBS培养基，48小时之后，收获含间充质干细胞外泌体的细胞培养液。
步骤2：取1L含有间充质干细胞外泌体的细胞培养液在转速为3000rpm的条件下离心30min以去除细胞，收集上清液，上清液在转速为7000rpm的条件下离心30min以去除大颗粒杂质及细胞碎片，收集上清液。
步骤3：将离心后的上清液通过0.22微米孔径滤膜过滤，除去部分杂质，7000rpm的条件下离心30min后，用0.04mol/L、pH值为7的磷酸钠重悬得到待上样的上清液。
步骤4：将步骤3的上清液转移到一个10～40ml的琼脂糖凝胶填充柱，上样速度控制在1～2ml/min，用0.04mol/L、pH值为7的磷酸钠洗脱液重复循环洗脱30次，将第10～14次的洗脱液合并，即经尺寸排阻色谱柱除杂蛋白质而获得外泌体滤液。
步骤5：将步骤4所得到的外泌体滤液与包被抗CD9抗体偶联磁珠混合均匀后，4℃、50rpm旋转孵育2h；将旋转孵育后的混合液置于磁力架上1min，通过磁力架分离磁珠，加入含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液的清洗液，其中牛血清白蛋白的质量体积分数为2％，PBS缓冲液浓度为0.02mol/L，弃上清，得到清洗后的抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物中，向复合物中加入50-500μL洗脱液，洗脱液为pH2.8～3.8的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的浓度为0.3mol/L；室温孵育5min后，置于磁力架上1min，吸取上清，即为所提取分离的外泌体产物Exo-way1，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。
实施例2基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法融合分离纯化间充质干细胞外泌体
步骤1：参照专利CN107217034A中的方法获得含间充质干细胞外泌体的细胞培养液：将间充质干细胞用10％完全培养基培养至70％的密度后，更换为0.5％EV Free FBS培养基，48小时之后，收获含间充质干细胞外泌体的细胞培养液。
步骤2：取1L含有间充质干细胞外泌体的细胞培养液在转速为3000rpm的条件下离心30min以去除细胞，收集上清液，上清液在转速为7000rpm的条件下离心30min以去除大颗粒杂质及细胞碎片，收集上清液。
步骤3：将离心后的上清液通过0.22微米孔径滤膜过滤，除去部分杂质，7000rpm的条件下离心30min后，用0.04mol/L、pH值为7的磷酸钠重悬得到待上样的上清液。
步骤4：将步骤3所得到的含有外泌体上清液与包被抗CD9抗体偶联磁珠混合均匀后，4℃、50rpm旋转孵育2h后，得到含有抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物的待上样液，将待上样液转移到一个10～40ml的琼脂糖凝胶填充柱，同时将琼脂糖凝胶填充柱放置在具有强磁场的磁力架上，通过磁场改变抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物在琼脂糖凝胶填充柱中运动速率，上样速度控制在2～4ml/min，用0.04mol/L、pH值为7的磷酸钠重复循环洗脱30次，将第16～20次的洗脱液合并即含抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物的悬液。
步骤5：将步骤4所得到的含抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物的悬液，离心弃上清，在剩余的抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物中加入含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液的清洗液的洗涤液，其中牛血清白蛋白的质量体积分数为2％，PBS缓冲液浓度为0.02mol/L，混匀得到混合液，再将该混合液置于磁力架上1min，弃上清，得到洗涤后的抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物；在洗涤后的抗CD9抗体-磁珠-外泌体复合物中加入50-500μL洗脱液，洗脱液为pH2.8～3.8的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的浓度为0.3mol/L，室温孵育5min后，置于磁力架上1min，吸取上清，即为所提取分离的外泌体产物Exo-way2，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。
实施例3基于超速离心方法分离纯化间充质干细胞外泌体
将实施例3作为对比例，提供的间充质干细胞外泌体的纯化方法采用超速离心的方法，具体包括如下步骤：参照专利CN107217034A中的方法准备间充质干细胞外泌体的细胞培养液，将间充质干细胞用10％FBS完全培养基培养至80％的密度后，更换为0.5％EVFree FBS培养基，36小时之后，收获细胞培养基上清100-600ml，对上清液进一步处理如下：4℃，500×g，10min，取上清。离心，4℃，2000×g，20min，取上清。离心，4℃，10000×g，40min，取上清。离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀。用PBS重悬后，离心，4℃，100000×g，90min，取沉淀，即为间充质干细胞外泌体，将外泌体用1ml PBS重悬，并将上述外泌体标记为Exo-way3，所得外泌体放置于-80℃冰箱内长期保存。
实施例4通过流式细胞术对Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3的外泌体亚群特异性和聚集度分析
取实施例1-3方法制备得到的Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3外泌体亚群进行特异性和聚集性分析，其中CD9和CD63的抗体来自Becton,Dickinson and Company(FranklinLakes,NJ)。在所有实验中，相应的同种型匹配抗体(Becton、Dickinson and Company)用作阴性对照。使用FACS Canto流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)收集数据(20,000个事件)并在FACSDiva软件(BD Biosciences)上进行分析并收集用于后续实验；
结果显示，Exo-way1外泌体中CD9+CD63+双阳性亚群达到90％以上，Exo-way2外泌体中CD9+CD63+双阳性亚群达到98％以上，而Exo-way3外泌体亚群只有49％，Exo-way1和Exo-way2外泌体亚群相比较Exo-way3外泌体亚群特异性更强，聚集度更高；此外，Exo-way2外泌体中CD9+CD63+双阳性亚群比Exo-way1外泌体中CD9+CD63+双阳性亚群百分比更高，即采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法融合纯化方法明显优于基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法联合纯化方法，Exo-way2所获得的外泌体亚群特异性更强。
实施例5通过Western Blot检测对Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3的外泌体标志物表达分析
取实施例1-3方法制备得到的Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3外泌体加入5×Loading buffer，100℃加热20min。通过10％SDS-PAGE凝胶，进行电泳2h。转膜，300mA，90min。封闭，1h。用抗外泌体标志物CD9、CD63、CD81、Alix、TSG-101的一抗在4℃进行孵育过夜。用二抗孵育2h后，其中β-Actin为阴性对照，用化学发光液孵育几分钟后用化学发光仪进行曝光，其检测结果如图2A和图2B所示。
Western blotting结果显示，外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81、Alix、TSG-101在Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3外泌体均检测出，β-Actin未在外泌体中检测出，其中Exo-way1和Exo-way2的外泌体标志物表达水平明显高于Exo-way3的外秘体标志物表达水平，这表明在外泌体亚群特异性和纯度方面，采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法的联合/融合分离纯化外泌体方法均明显优于超速离心的外泌体分离纯化方法；此外，Exo-way2的外泌体标志物表达水平明显高于Exo-way1的外秘体标志物表达水平，这表明在外泌体亚群特异性和纯度方面，采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法融合纯化方法明显优于基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法联合纯化方法。
实施例6通过透射电镜(TEM)对Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3的外泌体鉴定分析
将带有碳涂层Formvar膜的500目铜网格用镊子悬空固定，使其正面水平朝上，在网格上滴加20μL实施例1制备的EGF间充质干细胞外泌体的PBS重悬液，静置7min后小心吸走悬液，重复上述操作一次。在网格上滴加20μL 3％的多聚甲醛和2％的戊二醛进行固定，静置20min后小心吸走悬液。避光环境中，在网格上滴加15μL 2.5％乙酸铀溶液进行负染，静置6min后小心吸走染液。避光环境中，在网格上滴加15μL去离子水洗涤，小心吸走洗涤液，重复操作一次，风干。使用透射电镜观察外泌体的形态、大小和特征，并拍照记录。结果如图3所示，Exo-way1和Exo-way2外泌体在电镜下呈圆形，结构完整，而Exo-way3外泌体在电镜下呈不规则状，结构不完整。
实施例7评估Exo-way1、Exo-way2和Exo-way3不同提取方法对外泌体纯度的影响
采用BSA法检测外泌体的蛋白浓度，将收集的外泌体溶液中加入等体积的裂解液，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照BSA检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。采用纳米粒径示踪分析仪对外泌体溶液中颗粒浓度进行检测，根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度(颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高)。
表1
结果表明，如表1所示，Exo-way1外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值比Exo-way3超速离心法高出5倍，Exo-way2外泌体比值比Exo-way3超速离心法甚至高出10倍，这表明在外泌体纯度方面，采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法的联合/融合纯化外泌体方法明显优于超速离心的外泌体纯化方法；同时Exo-way2外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值比Exo-way1的比值至少高出2倍，这表明在外泌体纯度方面，采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法的融合纯化外泌体方法明显优于采用基于尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法的联合纯化外泌体方法。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种联合尺寸排阻色谱法和免疫磁珠法分离外泌体亚群的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：从干细胞样品中分离纯化获得总外泌体悬液；
S2：将总外泌体悬液依次采用尺寸排阻色谱柱和/或免疫磁珠分离得到外泌体亚群。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有以下特征的一种或多种组合：
A1)所述尺寸排阻色谱柱为亲水硅胶柱、凝胶或经过修饰的凝胶的填充柱或琼脂糖凝胶填充柱；
A2)所述免疫磁珠为抗外泌体标志物抗体偶联的磁珠、结合外泌体标志物适配体偶联的磁珠、结合外泌体标志物配体偶联的磁珠一种或多种；
A3)所述干细胞为选自脂肪干细胞、人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞的一种或者多种。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤S2的具体方法是：
S2.1尺寸排阻色谱法：将步骤S1的总外泌体悬液转移到排阻色谱柱中，经洗脱液重复循环洗脱后收集得到外泌体滤液；
S2.2免疫磁珠法：将S2.1步骤外泌体滤液与包被抗外泌体标志物抗体-磁珠混合均匀后，旋转孵育得到抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；将旋转孵育后的复合物置于磁力架上，通过磁力架分离磁珠，加入清洗液，弃上清；得到清洗后的抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；在清洗后复合物中加入洗脱液，将捕获的外泌体从磁珠上洗脱下来，从而获得外泌体亚群。
4.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤S2的具体方法是：
S2.1尺寸排阻色谱法：将步骤S1的总外泌体滤液与抗外泌体标志物抗体-磁珠混合，摇动条件下孵育后，转移至尺寸排阻色谱柱，并将尺寸排阻色谱柱放置在具有强磁场的磁力架上，通过磁场强弱改变抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物在尺寸排阻色谱柱中运动速率，经洗脱液重复循环洗脱后收集得到含有抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物的混合液，
S2.2免疫磁珠法：将S2.1步骤含有抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物的混合液置于磁力架上，通过磁力架分离磁珠，加入清洗液，弃上清，得到清洗后的抗外泌体标志物抗体-磁珠-外泌体复合物；在清洗后复合物中加入洗脱液，将捕获的外泌体从磁珠上洗脱下来，从而获得外泌体亚群。
5.根据权利要求3-4所述的方法，其特征在于，具有以下特征的一种或多种组合：
B1)S2.1步骤的洗脱液为PBS溶液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液，pH为7，缓冲液浓度为0.005～0.05mol/L；
B2)S2.1步骤的外泌体标志物选自CD9、CD63、CD81和TSG101一种或者多种；
B3)S2.2步骤的清洗液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液，所述清洗液中牛血清白蛋白的质量体积分数为0.5～3％，PBS缓冲液浓度为0.005～0.03mol/L；
B4)S2.2步骤的洗脱液为pH2.8～3.8的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的浓度为0.1～0.4mol/L。
6.权利要求1-5所述方法在分离、聚集和纯化外泌体方面的应用。
7.权利要求1-5所述方法在分离、聚集和纯化外泌体亚群方面的应用。
8.权利要求1-5所述方法在制备特异性干细胞的外泌体方面的应用。
9.一种外泌体亚群，其特征在于，其由权利要求1-5所述方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的外泌体亚群，其特征在于，所述外泌体的标志物蛋白具有高表达、高纯度、高特异性。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105934670A (zh) * | 2013-12-03 | 2016-09-07 | 拜奥默里克斯公司 | 用于分离外泌体的方法 |
| CN107446879A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-12-08 | 华南农业大学 | 一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法 |
| CN109294907A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-02-01 | 浙江大学 | 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用 |
| CN111474356A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 江西省达臻医疗科技有限公司 | 一种双免疫磁珠分选试剂及其制备方法和在体液外泌体富集中的应用 |
| CN114231523A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-03-25 | 西安交通大学 | 一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法 |
| WO2022092352A1 (ko) * | 2020-10-29 | 2022-05-05 | 연세대학교 산학협력단 | 질병 특이적 엑소좀의 분리 방법 |
| CN114487399A (zh) * | 2022-02-10 | 2022-05-13 | 上海交通大学 | 一种粒径与表面标志物联合分析的方法 |
-
2023
- 2023-12-26 CN CN202311800848.8A patent/CN117778309A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105934670A (zh) * | 2013-12-03 | 2016-09-07 | 拜奥默里克斯公司 | 用于分离外泌体的方法 |
| US20160370265A1 (en) * | 2013-12-03 | 2016-12-22 | bioMérieux | Method for isolating exosomes |
| CN107446879A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-12-08 | 华南农业大学 | 一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法 |
| CN109294907A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-02-01 | 浙江大学 | 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用 |
| CN111474356A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 江西省达臻医疗科技有限公司 | 一种双免疫磁珠分选试剂及其制备方法和在体液外泌体富集中的应用 |
| WO2022092352A1 (ko) * | 2020-10-29 | 2022-05-05 | 연세대학교 산학협력단 | 질병 특이적 엑소좀의 분리 방법 |
| CN114231523A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-03-25 | 西安交通大学 | 一种基于cd63抗体偶联磁珠的外泌体分离方法 |
| CN114487399A (zh) * | 2022-02-10 | 2022-05-13 | 上海交通大学 | 一种粒径与表面标志物联合分析的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 邱金戈;刘德武;孙宝丽;李耀坤;郭勇庆;邓铭;柳广斌;: "动物外泌体分离方法的研究进展", 中国生物工程杂志, no. 09, 15 September 2020 (2020-09-15), pages 36 - 42 * |
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