CN117095896A - 一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用,解决现有细胞外囊泡分离方法所存在的成本高、步骤繁琐、耗时长、得率低以及纯度低的不足之处。该微纳米磁珠为结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯纳米材料,能够吸附样本中的细胞外囊泡,在外加磁场的作用下,可以诱导磁珠和细胞外囊泡结合的复合物的定向运动,利用对特定尺寸大小的粒子的吸附从而将细胞外囊泡从样品中分离出来,且分离条件温和,能够确保提取细胞外囊泡的完整性。
Description
技术领域
本发明属于生物分离技术领域,具体涉及一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用。
背景技术
细胞外囊泡是细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的模型囊泡,包含了复杂RNA和蛋白质,比如:外泌体。1983年,细胞外囊泡首次于绵羊网织红细胞中被发现,在当时被认为是细胞排泄废物的一种方式。2007年,人们发现鼠的肥大细胞分泌的细胞外囊泡可以被人的肥大细胞捕获,并且其携带的mRNA可以被翻译成蛋白质;并且细胞外囊泡所转移的microRNA同样具有生物活性,能够在进入靶细胞后调节细胞中mRNA的水平,它还能够通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。细胞外囊泡所体现出的广阔的应用前景,引发研究人员的研究热情。
但由于细胞外囊泡多分布在复杂的体液环境中,如血液、尿液、唾液等,且体积小、数量少,细胞外囊泡的分离纯化是一道难题。目前,可用于有效分离细胞外囊泡的方法有以下几种:超速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、超滤法、磁珠免疫法、色谱法。
其中,超速离心法是细胞外囊泡分离的金标准方法,利用分离物质的沉降系数差异大将细胞碎片、蛋白等除去,然后以100000×g超速离心分离70min得到所需的细胞外囊泡;但该方法耗时长、依赖于昂贵设备,此外超速离心过程可能导致大量细胞外囊泡的丢失,降低得率,因而需要改进细胞外囊泡提取方法,降低提取所需成本和时间。
密度梯度离心法是在超速离心力作用下,使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层,是一种区带分离法,此法获得的细胞外囊泡纯度较高,但步骤繁琐、耗时。
沉淀法是将溶剂添加到溶液中来改变某些组分的极性和溶解度,从而使它们沉淀到溶液中,但会对细胞外囊泡的纯度有影响。
超滤法是利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离,便可获得细胞外囊泡,简单高效,且不影响细胞外囊泡的生物活性,但存在纯度不高的问题。
磁珠免疫法是用包被抗标记物抗体的磁珠与细胞外囊泡囊泡孵育结合,细胞外囊泡表面有其特异性标记物,因而可将细胞外囊泡吸附并分离出来,具有特异性高、操作简便,不影响细胞外囊泡形态完整等特点,但是效率低,不利于下游实验,难以广泛普及。
色谱法则是将样品添加到色谱柱的一端,使其吸附和溶解在固定相上,然后使用冲洗剂将样品从固定相上分离,但需要特殊的设备,且会降低得率。
鉴于上述细胞外囊泡分离方法或多或少存在问题,本发明研究团队认为有必要探究一种更加有效的细胞外囊泡分离方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有细胞外囊泡分离方法所存在的成本高、步骤繁琐、耗时长、得率低以及纯度低的不足之处,提供了一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用。
为实现上述发明目的,本发明所提供的技术解决方案是:
一种微纳米磁珠,其特殊之处在于:以片状磁性氧化石墨烯为基底,其结合位点上结合有二甲双胍,尺寸为10-50μm。
上述微纳米磁珠的制备方法,其特殊之处在于,包括以下步骤:
1)制备磁性氧化石墨烯
1.1)将单层氧化石墨烯(可选择工业用)分散在乙二醇中,得到氧化石墨烯溶液;
1.2)向步骤1.1)得到的氧化石墨烯溶液中加入三氯化铁、乙酸钠和聚乙二醇8000,混合搅拌后,加热进行反应(高温高压反应);
1.3)待步骤1.2)反应结束后离心收集产物,并用乙醇和水(超纯水、去离子水均可)依次磁吸洗涤,真空干燥得到磁性氧化石墨烯;
2)制备微纳米磁珠
将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,超声分散后将溶液冷却(冷却有助于后续偶联反应的进行),加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC),混合搅拌后,再加入二甲双胍,升温并搅拌进行反应,反应结束后采用丙酮和水(超纯水或去离子水均可)依次洗涤,真空干燥制得微纳米磁珠,即结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯。
步骤1)中采用单层氧化石墨烯和乙二醇具有优良的分散性,通过步骤1)方法制备得到的磁性氧化石墨烯能够兼备良好的分散性和亲水性,并且不影响后续配体的结合,有利于得到配体分布均匀的微纳米磁珠。
进一步地,步骤1.2)中,所述单层氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1∶20-80,优选范围为1∶30-40,优选值为1∶35;
所述单层氧化石墨烯和三氯化铁的质量比为1∶2-10,优选范围为1∶4-5,优选值为1∶4;
所述单层氧化石墨烯和聚乙二醇8000的质量比为1∶1-5,优选范围为1∶2-3,优选值为1∶2;
按照优选范围制备出的磁性氧化石墨烯的分散性和磁性效果均更好,优选值效果更加优异。
进一步地,步骤1.2)中,混合搅拌至少1小时;
混合搅拌后将反应器皿(特氟龙高温高压反应釜)置于鼓风干燥箱中进行反应,反应温度为180-200℃,反应至少6小时。
进一步地,步骤2)中,将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中,超声分散后将溶液冷却至0-5℃(可采用冰浴进行冷却),超声反应至少1小时。
进一步地,步骤2)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC),混合搅拌后,反应至少2小时,对磁性氧化石墨烯进行活化;再加入二甲双胍,升温至95-100℃,搅拌反应至少24小时。
进一步地,所述磁性氧化石墨烯和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的质量比为1∶10-30,优选范围为1∶10-15,优选值为1∶13;
所述磁性氧化石墨烯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC的质量比为1∶15-30,优选范围为1∶20-25,优选值为1∶22,更有利于后续反应。
所述磁性氧化石墨烯和二甲双胍的质量比为1∶10-45,优选范围为1∶30-40,优选值为1∶35;
上述方法中所使用的氧化石墨烯、乙二醇、乙酸钠、三氯化铁、聚乙二醇8000、DMF、NHS、EDC、二甲双胍、丙酮都可以是自行制备或者购买的试剂。
同时,本发明提供了上述微纳米磁珠或上述方法制备的微纳米磁珠在捕获目标细胞外囊泡及制备细胞外囊泡提取产品中的应用。
一种细胞外囊泡提取试剂盒,其特殊之处在于:包括微纳米磁珠和洗脱液;
所述微纳米磁珠用于从样品中捕获目标细胞外囊泡,其为上述微纳米磁珠或上述方法制备的微纳米磁珠;
所述洗脱液用于将所述结合物分离,得到纯化的细胞外囊泡。
进一步地,所述洗脱液采用纯水,最好是pH为7-8,呈弱碱性的纯水,该洗脱条件温和,即不影响细胞外囊泡,也能达到分离条件。
一种细胞外囊泡提取方法,其特殊之处在于,包括以下步骤:
S1.差速离心进行样本预处理
先采用过滤膜(比如:使用0.22μm的过滤膜)除去样本(如血液、尿液、唾液等)中的细菌等较大物质;再通过差速离心,去除细胞碎片和蛋白(利用样本中各个物质沉降系数的差别,先使用低速离心除去细胞碎片,再使用高速离心除去蛋白,比如:3000g离心15min;17000g离心30min);
S2.磁珠法提取细胞外囊泡
S2.1在预处理后的样本中加入前述微纳米磁珠或前述方法制备的微纳米磁珠,室温静置10min,使用磁场进行分离;
S2.2收集S2.1分离后的固体,分散于洗脱液中,超声10min后,磁分离收集滤液,得到细胞外囊泡。
亦或S2中,直接使用前述的试剂盒提取细胞外囊泡。
本发明的原理:
本发明设计了一款新的微纳米磁珠,其为结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯纳米材料。本发明先通过水热法制备磁性氧化石墨烯,再使用NHS和EDC对磁性氧化石墨烯上的羧基进行活化,之后通过偶联反应将二甲双胍结合在磁性氧化石墨烯上,得到微纳米磁珠。在纳米尺度下,该微纳米磁珠利用限域效应能够吸附样本中特定大小的细胞外囊泡,在外加磁场的作用下,可以诱导磁珠和细胞外囊泡结合的复合物的定向运动,利用磁吸附从而将磁珠和细胞外囊泡的复合物从样品中分离出来,且分离条件温和,能够确保提取细胞外囊泡的完整性。本发明在细胞外囊泡的提取过程中将差速离心法与磁珠法进行相结合,降低了对超速离心设备的要求,避免对昂贵设备的依赖,操作简单,耗费时间减少,能够实现高效分离。
本发明的优点:
1.采用本发明方案提取细胞外囊泡,能够获取30-500nm的细胞外囊泡;该方案中使用的结合了二甲双胍的磁性氧化石墨烯纳米材料,其成本低、制备快速,磁性较强,能够在30s内完全与溶液分离,并且可以通过磁吸进行回收利用。
2.本发明方案中将差速离心法和磁珠法相结合,简化细胞外囊泡提取步骤、缩短了提取所需要的时间,且磁珠和细胞外囊泡分离简单,同时避免提取过程中对昂贵设备的需求,在细胞外囊泡提取领域具有良好应用前景。
3.采用本发明中制备的微纳米磁珠或者细胞外囊泡提取试剂盒提取细胞外囊泡,能够高效富集细胞外囊泡,大幅提升细胞外囊泡的得率和纯度。
附图说明
图1为本发明提取细胞外囊泡的粒径图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述:
以下实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂、生物材料、检测试剂盒,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
微纳米磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)磁性氧化石墨烯制备
1.1)将单层氧化石墨烯溶于乙二醇溶剂中,加入特氟龙高温高压反应釜中,超声分散5min;
1.2)按照氧化石墨烯和三氯化铁质量比为1∶3,将三氯化铁溶于溶液中;按照氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1∶20,将乙酸钠溶于溶液中;按照氧化石墨烯和聚乙二醇8000的质量比为1∶1,将聚乙二醇8000溶于溶液中,混合搅拌2h后,将反应釜转移到鼓风干燥箱中200℃高温反应6h;
1.3)待反应结束后离心转速10000rpm收集产物,并用乙醇和超纯水磁吸洗涤三次,60℃真空干燥得到磁性氧化石墨烯。
2)结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯制备
将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解于DMF溶剂中,超声处理1h,将溶液冷却至0℃;按照磁性氧化石墨烯和NHS的质量比为1∶12,将NHS加入溶液中;按照磁性氧化石墨烯和EDC的质量比为1∶15,将EDC加入溶液中,混合搅拌2h;按照磁性氧化石墨烯和二甲双胍的质量比为1∶10,将二甲双胍加入溶液中;将溶液升温至100℃,混合搅拌24h;反应结束后用丙酮和超纯水依次洗涤三次,真空干燥制得结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯,即目标微纳米磁珠。
实施例2
微纳米磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)磁性氧化石墨烯制备
1.1)将单层氧化石墨烯溶于乙二醇溶剂中,加入特氟龙高温高压反应釜中,超声分散5min;
1.2)按照氧化石墨烯和三氯化铁质量比为1∶10,将三氯化铁溶于溶液中;按照氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1∶80,将乙酸钠溶于溶液中;按照氧化石墨烯和聚乙二醇8000的质量比为1∶5,将聚乙二醇8000溶于溶液中,混合搅拌2h后,将反应釜转移到鼓风干燥箱中200℃高温反应6h;
1.3)待反应结束后离心转速10000rpm收集产物,并用乙醇和超纯水磁吸洗涤三次,60℃真空干燥得到磁性氧化石墨烯。
2)结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯制备
将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解于DMF溶剂中,超声处理1h,将溶液冷却至0℃;按照磁性氧化石墨烯和NHS的质量比为1∶25,将NHS加入溶液中;按照磁性氧化石墨烯和EDC的质量比为1∶30,将EDC加入溶液中,混合搅拌2h;按照磁性氧化石墨烯和二甲双胍的质量比为1∶40,将二甲双胍加入溶液中;将溶液升温至100℃,混合搅拌24h;反应结束后用丙酮和超纯水依次洗涤三次,真空干燥制得结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯,即目标微纳米磁珠。
实施例3
微纳米磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)磁性氧化石墨烯制备
1.1)将单层氧化石墨烯溶于乙二醇溶剂中,加入特氟龙高温高压反应釜中,超声分散5min;
1.2)按照氧化石墨烯和三氯化铁质量比为1∶4,将三氯化铁溶于溶液中;按照氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1∶35,将乙酸钠溶于溶液中;按照氧化石墨烯和聚乙二醇8000的质量比为1∶2,将聚乙二醇8000溶于溶液中,混合搅拌2h后,将反应釜转移到鼓风干燥箱中200℃高温反应6h;
1.3)待反应结束后离心转速10000rpm收集产物,并用乙醇和超纯水磁吸洗涤三次,60℃真空干燥得到磁性氧化石墨烯。
2)结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯制备
将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解于DMF溶剂中,超声处理1h,将溶液冷却至0℃;按照磁性氧化石墨烯和NHS的质量比为1∶13,将NHS加入溶液中;按照磁性氧化石墨烯和EDC的质量比为1∶22,将EDC加入溶液中,混合搅拌2h;按照磁性氧化石墨烯和二甲双胍的质量比为1∶35,将二甲双胍加入溶液中;将溶液升温至100℃,混合搅拌24h;反应结束后用丙酮和超纯水依次洗涤三次,真空干燥制得结合二甲双胍的磁性氧化石墨烯,即目标微纳米磁珠。将制得磁珠在水中分散后,不会在底部形成沉淀,可见其具有良好分散性。
实施例4
提取细胞外囊泡,步骤如下:
S1差速离心进行样本预处理
样本用0.22μm过滤膜除去细菌;3000g离心15min;17000g离心30min,在无菌PBS中重悬;
S2磁珠法提取细胞外囊泡
在步骤S1中所得的样本中加入100μL微纳米磁珠,室温静置10min,使用磁场进行分离;收集固体并分散于洗脱液中,超声10min,磁分离收集滤液得到细胞外囊泡。
实施例5
电镜观察所得细胞外囊泡
在实施例4的基础上将所得细胞外囊泡提取液取10μL滴加到铜网上,室温吸附10min,用滤纸吸去多余的液体。然后向铜网上滴加10μL 2%的磷钨酸溶液,在室温下染色处理2min,用滤纸吸去多余的液体,将铜网在室温下晾干。设置观察电压120kV,透射电镜观察,观察到所得细胞外囊泡粒径统一,粒径分布如图1所示,粒径为0-500nm的占比>90%,粒径较大的颗粒可能与颗粒之间的黏附有关。
实施例6
WB鉴定提取细胞外囊泡
在实施例4基础上,对提取的细胞外囊泡蛋白进行鉴定。
将提取的细胞外囊泡经10%SDS-Page胶电泳分离后,采用电转膜法将SDS-Page胶中的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中,37℃封闭1h,利用TBST清洗PVDF膜。配置一抗杂交液,将PVDF膜浸入杂交液中室温振荡孵育1h,TBST洗膜5次,每次10min。配置HRP标记的二抗杂交液,将TBST清洗后的PVDF膜浸入二抗杂交液中,于室温振荡孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min。将清洗后的PVDF膜置于干净的保鲜膜上,将ECL显色液均匀滴在PDVF膜面上,室温避光孵育5min,利用仪器进行曝光和成像,细胞外囊泡表面标志蛋白CD9、CD63为阳性,证明细胞外囊泡提取成功。
由此可见,通过本发明制备的微纳米磁珠以及利用其在捕获目标细胞外囊泡及制备细胞外囊泡提取产品中的应用,能够提升细胞外囊泡的得率和纯度。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内,可轻易想到各种等效的修改或替换,这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种微纳米磁珠,其特征在于:以磁性氧化石墨烯为基底,其结合位点上结合有二甲双胍。
2.权利要求1所述微纳米磁珠的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备磁性氧化石墨烯
1.1)将单层氧化石墨烯分散在乙二醇中,得到氧化石墨烯溶液;
1.2)向步骤1.1)得到的氧化石墨烯溶液中加入三氯化铁、乙酸钠和聚乙二醇8000,混合搅拌后,加热进行反应;
1.3)待步骤1.2)反应结束后离心收集产物,并用乙醇和水依次磁吸洗涤,真空干燥得到磁性氧化石墨烯;
2)制备微纳米磁珠
将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,超声分散后将溶液冷却,加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,混合搅拌后,再加入二甲双胍,升温并搅拌进行反应,反应结束后洗涤、真空干燥制得微纳米磁珠。
3.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于:
步骤1.2)中,所述单层氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1∶20-80;
所述单层氧化石墨烯和三氯化铁的质量比为1∶2-10;
所述单层氧化石墨烯和聚乙二醇8000的质量比为1∶1-5。
4.根据权利要求2或3所述所述制备方法,其特征在于:
步骤1.2)中,混合搅拌至少1小时;
反应温度为180-200℃,反应至少6小时。
5.根据权利要求4所述所述制备方法,其特征在于:
步骤2)中,将步骤1)得到的磁性氧化石墨烯溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,超声分散后将溶液冷却至0-5℃,超声至少1小时。
6.根据权利要求5所述所述制备方法,其特征在于:
步骤2)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,混合搅拌后,反应至少2小时;再加入二甲双胍,升温至95-100℃,搅拌反应至少24小时。
7.根据权利要求6所述所述制备方法,其特征在于:
步骤2)中,所述磁性氧化石墨烯和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶10-30;
所述磁性氧化石墨烯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为1∶15-30。
所述磁性氧化石墨烯和二甲双胍的质量比为1∶10-45。
8.权利要求1所述微纳米磁珠或权利要求2-7任一所述方法制备的微纳米磁珠在捕获目标细胞外囊泡及制备细胞外囊泡提取产品中的应用。
9.一种细胞外囊泡提取试剂盒,其特征在于:包括微纳米磁珠和洗脱液;
所述微纳米磁珠用于从样品中捕获目标细胞外囊泡,其为权利要求1所述微纳米磁珠或权利要求2-7任一所述方法制备的微纳米磁珠。
10.一种细胞外囊泡提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.差速离心进行样本预处理
先采用过滤膜除去样本中的细菌;再通过差速离心,去除细胞碎片和蛋白;
S2.磁珠法提取细胞外囊泡
S2.1在S1得到的细胞外囊泡培养液中加入权利要求1所述微纳米磁珠或权利要求2-7任一所述方法制备的微纳米磁珠,室温静置,使用磁场进行分离;
S2.2收集S2.1分离后的固体,分散于洗脱液中,超声后,磁分离收集滤液,得到细胞外囊泡。
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