CN108226483A - 一种das检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DAS检测试剂盒及其制备方法和应用，属于医学检验领域。本发明提供的DAS检测试剂盒的制备方法，能通过简单的制备步骤和常见的试剂，快速的制备出检测DAS的检测试剂盒，通过该制备方法制备的检测试剂盒，具有检测灵敏度高、特异性强的特点，DAS的检测试剂盒应用到检测DAS中，可以得到较为精确的结果，可以有效的避免漏检和误检。

Description

一种DAS检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体而言，涉及一种DAS检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
DAS分子式为C14H30N4O2，分子量286.41，是一种多胺的二乙酰基衍生物，在体内由鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶作用生成。是多胺代谢途径中非常重要的一环，在现在生命科学或医学研究过程中，多胺代谢研究是不可缺少的一部分。在生物体内，无论是植物、细菌还是动物，所有细胞的体内的多胺都是十分重要，最普遍也是有重要生理功能的多胺是腐胺，尸胺，亚精胺，精胺等.多胺有促进某些组织生长的作用，对于膜的正常维持也起着重要的作用.关于它们的作用机制还不甚清楚.它们带有正电荷的氨基使它们和带有负电的磷酸基的DNA和RNA结合，促进植物细胞以及动物细胞中DNA的转录和RNA的翻译；它们能和膜上的蛋白质或磷脂结合，使膜保持其稳定性。而近几年的研究过程中发现，二乙酰精胺在动物体内细胞异常增殖时，DAS含量会有一个明显的提升过程。
目前国内外基于二乙酰精胺的检测均属于传统常规检测方法，如ELISA、生化法、HPLC、免疫层析等等，无论检测的方便性还是检测的灵敏性，已有的检测方法均存在较大的弊端，无法做到二者兼备。要么是方便性有了，准确性差，要么是准确性有了，操作复杂。高灵敏度检测方法的缺失对二乙酰精胺指标的研究带来了诸多的不便。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种DAS检测试剂盒的制备方法，通过本制备方法能快速的制备出检测结果较好的检测试剂盒。
本发明的第二目的在于提供一种DAS检测试剂盒，该检测试剂盒能较好的、且精确的检测出DAS，具有较高的精确性和灵敏度。
本发明的第三目的在于提供上述的DAS检测试剂盒在DAS检测中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种DAS检测试剂盒的制备方法，DAS检测试剂盒的制备方法包括制备第一检测试剂、第二检测试剂和显色试剂；
将3-6mL浓度为1-3mg/mL的DAS抗体溶液与0.8-1.5mL1×的PBS混合缓冲液混合，并加入浓度为0.8-1.1mol/L的乙二胺溶液，经过透析得到浓度为0.8-1.3mg/mL的DAS抗体乙二胺溶液，由DAS抗体乙二胺溶液与NSP-SA-NHS/DMF溶液混合反应加入pH为8.3-8.6的碳酸盐混合缓冲液，制得DAS-Ab-NSP溶液，将DAS-Ab-NSP溶液制成第一检测试剂；
将质量分数为2.1％-2.7％的羧基磁性微球液用柠檬酸缓冲液稀释，加入含甘氨酸的柠檬酸溶液和乙醇胺混合，用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液悬浮，制成微球悬浮液，将微球悬浮液与单乙酰精胺溶液混合沉淀并去上清，得到沉淀产物，将沉淀产物加入含有0.1％的BSA的9-14mmol/L的PBS溶液制成第二检测试剂；
显色试剂包括第一显色剂和第二显色剂；第一显色剂主要由0.07mol/L-0.12mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.08％-0.12％H2O2溶液制得；第二显色剂主要由0.2mol/L-0.29mol/L的NaOH溶液、体积分数0.8％-1.2％TWEEN20溶液和体积分数为0.8％-1.2％TritonX-100溶液。
一种DAS检测试剂盒，DAS检测试剂盒由上述的DAS检测试剂盒的制备方法制得。
上述的DAS检测试剂盒在DAS检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的DAS检测试剂盒的制备方法，能通过简单的制备步骤和常见的试剂，快速的制备出检测DAS的检测试剂盒，通过该制备方法制备的检测试剂盒，具有检测灵敏度高、特异性强的特点，DAS的检测试剂盒应用到检测DAS中，可以得到较为精确的结果，可以有效的避免漏检和误检。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的试剂盒灵敏性试验结果图；
图2为本发明实验例2提供的稀释线性结果图；
图3为本发明实验例3提供的信号强度对比实验结果图；
图4为本发明实验例3提供的稀释线性对比实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种DAS检测试剂盒及其制备方法和应用进行具体说明。
一种DAS检测试剂盒的制备方法，DAS检测试剂盒的制备方法包括制备第一检测试剂、第二检测试剂和显色试剂；
将3-6mL浓度为1-3mg/mL的DAS抗体溶液与0.8-1.5mL1×PBS混合缓冲液混合，并加入浓度为0.8-1.1mol/L的乙二胺溶液，经过透析得到浓度为0.8-1.3mg/mL的DAS抗体乙二胺溶液，由DAS抗体乙二胺溶液与NSP-SA-NHS/DMF溶液混合反应加入pH为8.3-8.6的碳酸盐混合缓冲液，制得DAS-Ab-NSP溶液，将DAS-Ab-NSP溶液制成第一检测试剂；
将质量分数为2.1％-2.7％的羧基磁性微球液用柠檬酸缓冲液稀释，加入含甘氨酸的柠檬酸溶液和乙醇胺混合，用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液悬浮，制成微球悬浮液，将微球悬浮液与单乙酰精胺溶液混合沉淀并去上清，得到沉淀产物，将沉淀产物加入含有0.1％的BSA的9-14mmol/L的PBS溶液制成第二检测试剂；
显色试剂包括第一显色剂和第二显色剂；第一显色剂主要由0.07mol/L-0.12mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.08％-0.12％H2O2溶液制得；第二显色剂主要由0.2mol/L-0.29mol/L的NaOH溶液、体积分数0.8％-1.2％TWEEN20溶液和体积分数为0.8％-1.2％Triton X-100溶液。
进一步地，本发明的较佳实施例中，1×PBS混合缓冲液主要由17mg-20mg的EDC和2.7mg-4.1mg的NHS溶解于1mL的1×PBS溶液制得。
进一步地，本发明的较佳实施例中，乙二胺溶液由1mL的1×PBS溶液稀释乙二胺得到。
进一步地，本发明的较佳实施例中，NSP-SA-NHS/DMF溶液由二甲基甲酰胺稀释NSP-SA-NHS得到，NSP-SA-NHS/DMF溶液的浓度为1.7mg/mL-2.1mg/mL。
进一步地，本发明的较佳实施例中，将DAS-Ab-NSP溶液制成第一检测试剂前还包括透析DAS-Ab-NSP溶液，透析液为0.1mol/L，pH＝6.3的PBS缓冲液，PBS缓冲液含有体积分数为0.1‰-0.5‰的proclin300；碳酸盐混合缓冲液含有体积分数为10％的赖氨酸和体积分数为5％的BSA溶液。
进一步地，本发明的较佳实施例中，加入含甘氨酸的柠檬酸溶液和乙醇胺混合前还包括加入质量分数为8％-11％的EDC溶液，避光保存12-19min；再加入EDC溶液室温保存8-15min；EDC溶液由EDC溶解于pH＝5.5的柠檬酸缓冲液制得。
进一步地，本发明的较佳实施例中，单乙酰精胺溶液由单乙酰精胺溶解于pH＝5.5的柠檬酸缓冲液制得。
进一步地，本发明的较佳实施例中，将微球悬浮液与单乙酰精胺溶液混合前，微球悬浮液中还加入有16-20mg的EDC和3.1-3.9mg的NHS。
一种DAS检测试剂盒，DAS检测试剂盒由上述的DAS检测试剂盒的制备方法制得。
上述的DAS检测试剂盒在DAS检测中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种DAS检测试剂盒的制备方法，该试剂盒的制备方法的具体步骤如下：
第一检测试剂的制备；
1.1称取20mg的EDC和4.1mg的NHS混合，加入到1mL的1×PBS溶液中，再加入6mL浓度为3mg/mL的DAS抗体溶液；
1.2用1mL1×PBS溶液稀释乙二胺得到浓度为1.1mol/L的乙二胺溶液；
1.3将步骤1.2中得到的乙二胺溶液与步骤1.1中的DAS抗体溶液混合，充分摇匀，并室温反应3h，得到DAS抗体混合溶液；
1.4将DAS抗体混合溶液用1×PBS溶液透析24h，得到DAS抗体乙二胺溶液；
1.5将DAS抗体乙二胺溶液用1×PBS溶液定容至10mL，浓度为1.3mg/mL的DAS抗体乙二胺稀释液；
1.6将NSP-SA-NHS用二甲基甲酰胺DMF稀释到2.1mg/mL，得到NSP-SA-NHS/DMF溶液；
1.7用228μL的NSP-SA-NHS/DMF溶液加入到DAS抗体乙二胺稀释液中，漩涡混匀并室温反应60min，再加入200μL的含有10％赖氨酸和5％BSA且pH＝8.5的碳酸盐缓冲液，得到DAS-Ab-NSP溶液；
1.8用pH＝6.3，0.1mol/L的含有体积分数为0.5‰的proclin300的PBS溶液做透析液，透析DAS-Ab-NSP溶液；
1.9用含0.1％BSA，pH＝6.3的PBS缓冲液定容至3L，制得第一检测试剂。
第二检测试剂的制备；
2.1取250μL，体积分数为2.7％，直径1μm的羧基磁性微球液，用pH＝5.5柠檬酸缓冲液稀释至1mL，超声处理1min；
2.2加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的11％的EDC溶液40μL，避光保存19min；再补充加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的11％的EDC溶液40μL，得到柠檬酸微球液；
2.3取1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的浓度为1mg/L的甘氨酸溶液加入到柠檬酸微球液中将羧基磁性微球悬浮，并在8℃下过夜处理；
2.4加入8μL乙醇胺混匀后进行沉淀反应并去上清，然后用pH＝5.5柠檬酸缓冲液冲洗3次；
2.5用pH＝5.5柠檬酸缓冲液悬浮至1mL，得到沉淀悬浮液；
2.6称取20mg的EDC和3.9mg的NHS，加入到沉淀悬浮液中；再称取2mg单乙酰精胺用1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液溶解后加入到沉淀悬浮液中，充分摇匀，室温反应3h，去上清，得到沉淀产物；
2.7将沉淀产物用12.5mL含有0.1％的BSA且浓度为14mmol/L的PBS溶液制成第二检测试剂。
显色试剂的制备包括第一显色剂和第二显色剂的制备；
第一显色剂主要由0.12mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.12％H2O2溶液制得；
第二显色剂主要由0.29mol/L的NaOH溶液、体积分数1.2％TWEEN20溶液和体积分数为1.2％Triton X-100溶液制得。
将第一显色剂与第二显色剂制成显色剂。
将第一检测试剂、第二检测试剂和显色剂制成DAS检测试剂盒。
实施例2
本实施例提供一种DAS检测试剂盒的制备方法，该试剂盒的制备方法的具体步骤如下：
第一检测试剂的制备；
1.1称取18mg的EDC和2.7mg的NHS混合，加入到1mL的1×PBS溶液中，再加入3mL浓度为3mg/mL的DAS抗体溶液；
1.2用1mL1×PBS溶液稀释乙二胺得到浓度为0.8mol/L的乙二胺溶液；
1.3将步骤1.2中得到的乙二胺溶液与步骤1.1中的DAS抗体溶液混合，充分摇匀，并室温反应3h，得到DAS抗体混合溶液；
1.4将DAS抗体混合溶液用1×PBS溶液透析24h，得到DAS抗体乙二胺溶液；
1.5将DAS抗体乙二胺溶液用1×PBS溶液定容至10mL，浓度为0.8mg/mL的DAS抗体乙二胺稀释液；
1.6将NSP-SA-NHS用二甲基甲酰胺DMF稀释到1.7mg/mL，得到NSP-SA-NHS/DMF溶液；
1.7用228μL的NSP-SA-NHS/DMF溶液加入到DAS抗体乙二胺稀释液中，漩涡混匀并室温反应60min，再加入200μL的含有10％赖氨酸和5％BSA且pH＝8.5的碳酸盐缓冲液，得到DAS-Ab-NSP溶液；
1.8用pH＝6.3，0.1mol/L的含有体积分数为0.4‰的proclin300的PBS溶液做透析液，透析DAS-Ab-NSP溶液；
1.9用含0.1％BSA，pH＝6.3的PBS缓冲液定容至3L，制得第一检测试剂。
第二检测试剂的制备；
2.1取250μL，体积分数为2.1％，直径1μm的羧基磁性微球液，用pH＝5.5柠檬酸缓冲液稀释至1mL，超声处理1min；
2.2加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的8％的EDC溶液40μL，避光保存12min；再补充加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的8％的EDC溶液40μL，得到柠檬酸微球液；
2.3取1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的浓度为1mg/L的甘氨酸溶液加入到柠檬酸微球液中将羧基磁性微球悬浮，并在5℃下过夜处理；
2.4加入8μL乙醇胺混匀后进行沉淀反应并去上清，然后用pH＝5.5柠檬酸缓冲液冲洗3次；
2.5用pH＝5.5柠檬酸缓冲液悬浮至1mL，得到沉淀悬浮液；
2.6称取16mg的EDC和3.1mg的NHS，加入到沉淀悬浮液中；再称取2mg单乙酰精胺用1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液溶解后加入到沉淀悬浮液中，充分摇匀，室温反应3h，去上清，得到沉淀产物；
2.7将沉淀产物用12.5mL含有0.1％的BSA且浓度为14mmol/L的PBS溶液制成第二检测试剂。
显色试剂的制备包括第一显色剂和第二显色剂的制备；
第一显色剂主要由0.07mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.08％H2O2溶液制得；
第二显色剂主要由0.2mol/L的NaOH溶液、体积分数为0.8％TWEEN20溶液和体积分数为0.8％Triton X-100溶液制得。
将第一显色剂与第二显色剂制成显色剂。
将第一检测试剂、第二检测试剂和显色剂制成DAS检测试剂盒。
实施例3
本实施例提供一种DAS检测试剂盒的制备方法，该试剂盒的制备方法的具体步骤如下：
第一检测试剂的制备；
1.1称取17mg的EDC和3.5mg的NHS混合，加入到1mL的1×PBS溶液中，再加入5mL浓度为2mg/mL的DAS抗体溶液；
1.2用1mL1×PBS溶液稀释乙二胺得到浓度为1mol/L的乙二胺溶液；
1.3将步骤1.2中得到的乙二胺溶液与步骤1.1中的DAS抗体溶液混合，充分摇匀，并室温反应3h，得到DAS抗体混合溶液；
1.4将DAS抗体混合溶液用1×PBS溶液透析24h，得到DAS抗体乙二胺溶液；
1.5将DAS抗体乙二胺溶液用1×PBS溶液定容至10mL，浓度为1mg/mL的DAS抗体乙二胺稀释液；
1.6将NSP-SA-NHS用二甲基甲酰胺DMF稀释到2.0mg/mL，得到NSP-SA-NHS/DMF溶液；
1.7用228μL的NSP-SA-NHS/DMF溶液加入到DAS抗体乙二胺稀释液中，漩涡混匀并室温反应30min，再加入200μL的含有10％赖氨酸和5％BSA且pH＝8.5的碳酸盐缓冲液，得到DAS-Ab-NSP溶液；
1.8用pH＝6.3，0.1mol/L的含有体积分数为0.3‰的proclin300的PBS溶液做透析液，透析DAS-Ab-NSP溶液；
1.9用含0.1％BSA，pH＝6.3的PBS缓冲液定容至3L，制得第一检测试剂。
第二检测试剂的制备；
2.1取250μL，体积分数为2.5％，直径1μm的羧基磁性微球液，用pH＝5.5柠檬酸缓冲液稀释至1mL，超声处理1min；
2.2加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的10％的EDC溶液40μL，避光保存15min；再补充加入用pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的10％的EDC溶液40μL，得到柠檬酸微球液；
2.3取1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液配制的浓度为1mg/L的甘氨酸溶液加入到柠檬酸微球液中将羧基磁性微球悬浮，并在2℃下过夜处理；
2.4加入8μL乙醇胺混匀后进行沉淀反应并去上清，然后用pH＝5.5柠檬酸缓冲液冲洗3次；
2.5用pH＝5.5柠檬酸缓冲液悬浮至1mL，得到沉淀悬浮液；
2.6称取17mg的EDC和3.5mg的NHS，加入到沉淀悬浮液中；再称取2mg单乙酰精胺用1mL的pH＝5.5柠檬酸缓冲液溶解后加入到沉淀悬浮液中，充分摇匀，室温反应3h，去上清，得到沉淀产物；
2.7将沉淀产物用12.5mL含有0.1％的BSA且浓度为14mmol/L的PBS溶液制成第二检测试剂。
显色试剂的制备包括第一显色剂和第二显色剂的制备；
第一显色剂主要由0.1mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.1％H2O2溶液制得；
第二显色剂主要由0.25mol/L的NaOH溶液、体积分数为1％TWEEN20溶液和体积分数为1％Triton X-100溶液制得。
将第一显色剂与第二显色剂制成显色剂。
将第一检测试剂、第二检测试剂和显色剂制成DAS检测试剂盒。
实验例1
本实验例利用实施例1-3提供的DAS检测试剂盒的检测灵敏性进行测试，本试验采用化学发光免疫分析仪进行。
本实验例中分别测试含有DAS浓度为0nmol/μL、2.5nmol/μL、5nmol/μL、10nmol/μL、12.5nmol/μL和15nmol/μL的6个样本；且同时进行三次平行试验，RUL1表示实施例1提供的DAS检测试剂盒、RUL2表示实施例2提供的DAS检测试剂盒和RUL3表示实施例3提供的DAS检测试剂盒。检测试验结果如表1所示，并根据测试结果得到测试值的曲线示意图如图1所示。
表1试剂盒的灵敏性测试结果
样本浓度nmol/μL RUL1 RUL2 RUL3 均值
0 328211 316132 320235 321526
5 150354 151453 149051 150286
10 80211 81661 81156 81009.33333
15 39201 40132 40610 39981
20 18621 18212 17967 18266.66667
25 8640 7987 8265 8297.333333
从表1可以看出实施例3提供的DAS检测试剂盒具有较好的检测灵敏性，3次测试结果没有出现较大波动。图1也可以看出检测常呈现一定是的线性关系。
实验例2
本实验例利用实施例1-3制备得到的DAS检测试剂盒测试梯度标准品测试产品稀释线性，测试标准品理论浓度为3nmol/μL、6nmol/μL、9nmol/μL、12nmol/μL、15nmol/μL和18nmol/μL的6个梯度浓度标准品样本，且进行了3次重复试验，RUL1表示实施例1提供的DAS检测试剂盒、RUL2表示实施例2提供的DAS检测试剂盒和RUL3表示实施例3提供的DAS检测试剂盒。检测结果如表2和图2所示。
表2线性测试结果
理论浓度 3nmol/μL 6nmol/μL 9nmol/μL 12nmol/μL 15nmol/μL 18nmol/μL
RUL1 3.11 5.93 9.21 11.98 15.33 17.73
RUL2 2.97 6.08 9.06 12.41 15.03 18.06
RUL3 3.06 6.12 9.14 12.17 14.89 18.45
平均值 3.046667 6.043333 9.136667 12.18666667 15.08333 18.08
偏差 0.015556 0.007222 0.015185 0.015555556 0.005556 0.004444
从表2和图2可以看出，实施例1-3提供的DAS检测试剂盒线性关系良好；以理论浓度值和实际检测得到的浓度值，得到稀释线性的方程为y＝1.0032x+0.00624，R2＝0.9999；可以看出实施例1-3提供的DAS检测试剂盒的检测准确性高，稀释线性良好。
实验例3
本实验例将实施例1-3制备的DAS检测试剂盒与常规DAS检测试剂对比。
常规DAS检测试剂制备，包括第一检测试剂制备：取离心管加入10mL浓度为1mg/mL的DAS抗体溶液，加入NSP-SA-NHS/DMF溶液228μL；涡旋混匀后室温反应30-60min。再加入200μL含10％赖氨酸、5％BSA的pH＝8.5的碳酸盐缓冲液；配置0.1M pH＝6.3的PBS缓冲液，含体积分数为0.3‰的Proclin300，作为透析缓冲液；将标记好的DAS-Ab-NSP溶液进行透析。透析后所得产物补充含0.1％BSA pH＝6.3的PBS缓冲液至体积为3L，作为为第一检测试剂。
第二检测试剂的制备：1、取250μL2.5％直径为1μm的羧基磁性微球也，用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液稀释至1mL，超声1min，加入10％EDC(pH＝5.5的柠檬酸缓冲液配置)40μL室温避光保存15min后，再补充40μL10％EDC室温保存10min去上清，得到沉淀；2、使用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液配置浓度为1mg/L的溶液；3、取2中柠檬酸缓冲液1mL加入到前述沉淀中，将微球悬浮，2-8℃过夜后加入2mg pH＝5.5的柠檬酸缓冲液体系的BSA偶联的单乙酰精胺，充分摇匀，室温反应3h。沉淀去上清，加入0.1％BSA的10mM PBS12.5mL，作为第二检测试剂。
分别测试含有DAS浓度为0nmol/μL、2.5nmol/μL、5nmol/μL、10nmol/μL、12.5nmol/μL和15nmol/μL的6个样本。实验结果如表3和图3所示。
表3对比实验数据
从表3和图3均可以看出，本专利制备试剂盒同传统化学发光试剂制备方式比较，信号强度提升4倍多。
同时检测标准品测试产品稀释线性，测试标准品理论浓度为3nmol/μL、6nmol/μL、9nmol/μL、12nmol/μL、15nmol/μL和18nmol/μL的6个梯度浓度标准品样本。检测结果如表4和图4的结果所示。
表4稀释线性对比实验结果
从表4和图4可以看出，实施例1-3提供的检测试剂盒的稀释线性要强于常规检测试剂；本发明的试剂盒提供的稀释线的方程为y＝1.0032x+0.0624，R2＝0.9999；而对比的常规检查试剂的线性方程为y＝0.9403x+0.2378，R2＝0.9999；可以看出本发明提供的试剂盒的稀释线性关系更为良好，稳定，检查结果将更为精确。
实验例4
本实验例利用实施例3提供的DAS检测试剂盒与实验例3制备的常规检测试剂对同一个超纯水样本进行20次测试。验证检测灵敏性。实验结果如表5所示。
表5灵敏性检测结果
从表5可以看出，实施例3提供的DAS检测试剂盒的检测下限要低于对比试剂检测下限，实施例3提供的DAS检测试剂盒检测灵敏度优于对比试剂。
实验例5
本实验例利用实施例3提供的DAS检测试剂盒与对比试剂连续测试同一对高低质控品10次。结果如表6所示。
表6精密性测试结果
从表6的数据可以看出，实施例3提供的DAS检测试剂盒的检测精密性要明显优于对比的常规试剂。
实验例6
本实验例利用实施例3提供的DAS检测试剂盒与现有技术方法ELISA、免疫层析、生化比浊法比较研究，方法采用相同抗体，除本方法外，其他方法竞争抗原均使用BSA偶联的完全抗原进行。检测结果如表7所示。
表7不同方法的检测对比结果
从表7可以看出，除用实施例3提供的DAS检测试剂盒灵敏度可以在0-25nm之间形成很好的信号梯度外，其他方法学无法在该范围确定校准曲线。
综上所述，本发明实施例提供的DAS检测试剂盒的制备方法可以制备出较好的DAS检测试剂盒；DAS检测试剂盒的特异性和较高的灵敏度，使用该DAS检测试剂盒应用于检测，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；检测结果具有较为准确的结果和可靠的数据，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DAS检测试剂盒的制备方法包括制备第一检测试剂、第二检测试剂和显色试剂；
将3-6mL浓度为1-3mg/mL的DAS抗体溶液与0.8-1.5mL1×PBS混合缓冲液混合，并加入浓度为0.8-1.1mol/L的乙二胺溶液，经过透析得到浓度为0.8-1.3mg/mL的DAS抗体乙二胺溶液，由所述DAS抗体乙二胺溶液与NSP-SA-NHS/DMF溶液混合反应加入pH为8.3-8.6的碳酸盐混合缓冲液，制得DAS-Ab-NSP溶液，将所述DAS-Ab-NSP溶液制成所述第一检测试剂；
将质量分数为2.1％-2.7％的羧基磁性微球液用柠檬酸缓冲液稀释，加入含甘氨酸的柠檬酸溶液和乙醇胺混合，用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液悬浮，制成微球悬浮液，将所述微球悬浮液与单乙酰精胺溶液混合沉淀并去上清，得到沉淀产物，将所述沉淀产物加入含有0.1％的BSA的9-14mmol/L的PBS溶液制成所述第二检测试剂；
所述显色试剂包括第一显色剂和第二显色剂；所述第一显色剂主要由0.07mol/L-0.12mol/L的HNO3溶液和质量分数为0.08％-0.12％H2O2溶液制得；所述第二显色剂主要由0.2mol/L-0.29mol/L的NaOH溶液、体积分数0.8％-1.2％TWEEN20溶液和体积分数为0.8％-1.2％Triton X-100溶液制得。
2.根据权利要求1所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述1×PBS混合缓冲液主要由17mg-20mg的EDC和2.7mg-4.1mg的NHS溶解于1mL的1×PBS溶液制得。
3.根据权利要求1所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述乙二胺溶液由1mL的1×PBS溶液稀释乙二胺得到。
4.根据权利要求3所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述NSP-SA-NHS/DMF溶液由二甲基甲酰胺稀释NSP-SA-NHS得到，所述NSP-SA-NHS/DMF溶液的浓度为1.7mg/mL-2.1mg/mL。
5.根据权利要求4所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述DAS-Ab-NSP溶液制成所述第一检测试剂前还包括透析所述DAS-Ab-NSP溶液，透析液为0.1mol/L，pH＝6.3的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有体积分数为0.1‰-0.5‰的proclin300；所述碳酸盐混合缓冲液含有体积分数为10％的赖氨酸和体积分数为5％的BSA溶液。
6.根据权利要求1所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，加入所述含甘氨酸的柠檬酸溶液和乙醇胺混合前还包括加入质量分数为8％-11％的EDC溶液，避光保存12-19min；再加入所述EDC溶液室温保存8-15min；所述EDC溶液由EDC溶解于pH＝5.5的所述柠檬酸缓冲液制得。
7.根据权利要求6所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述单乙酰精胺溶液由单乙酰精胺溶解于pH＝5.5的柠檬酸缓冲液制得。
8.根据权利要求7所述DAS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述微球悬浮液与单乙酰精胺溶液混合前，所述微球悬浮液中还加入有16-20mg的所述EDC和3.1-3.9mg的所述NHS。
9.一种DAS检测试剂盒，其特征在于，所述DAS检测试剂盒由如权利要求1-8任一项所述的DAS检测试剂盒的制备方法制得。
10.如权利要求9所述的DAS检测试剂盒在DAS检测中的应用。
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